Articolo metodologico

Determinazione della biomassa microbica nel suolo tramite Digital Droplet PCR (ddPCR)

DOI:

10.3791/69467

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24 aprile 2026

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1Geography, Faculty of Environment, Science and Economy, University of Exeter

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio presenta un metodo rapido ddPCR per quantificare la biomassa microbica del suolo e i rapporti fungini-batterici. Sebbene il carbonio microbico derivato da ddPCR mostri solo una correlazione debole con le stime di fumigazione del cloroformio, il metodo fornisce un approccio molecolare sensibile e scalabile per valutare l'abbondanza microbica senza ulteriori campionamenti del suolo o l'uso di sostanze aggressive.

Abstract

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Il suolo rappresenta il più grande serbatoio terrestre di carbonio organico, ma più di 133 Gt di carbonio sono stati persi nei suoli negli ultimi due secoli. Una quantificazione accurata della biomassa microbica del suolo, in particolare funghi e batteri, i principali decompositori che guidano il ciclo del carbonio e dei nutrienti, è essenziale per comprendere il funzionamento ecologico e la salute del suolo. Gli approcci convenzionali, inclusi l'estrazione da fumigazione con cloroformio e l'analisi PLFA, sono limitati da elevati requisiti di campionamento e incertezze legate alla conversione dei marcatori biochimici in stime della biomassa microbica. Qui presentiamo un flusso ottimizzato per quantificare l'abbondanza batterica e fungina tramite digital droplet PCR (ddPCR) mirando ai geni 16S e 18S rRNA. Il metodo consente la quantificazione assoluta delle copie geniche microbiche, la conversione in numeri cellulari tramite correzione del numero di copie geniche e la successiva stima del carbonio microbico. Abbiamo applicato questo protocollo a suoli di cinque sistemi agricoli distribuiti globalmente che differiscono per texture, uso del suolo e contenuto di materia organica. Le stime derivate da ddPCR sono state confrontate con le stime convenzionali di fumigazione del cloroformio del carbonio da biomassa microbica. ddPCR ha fornito una quantificazione ad alta risoluzione dell'abbondanza microbica e ha prodotto stime più ampie e sensibili dei rapporti F:B tra i tipi di suolo rispetto al sequenziamento del genoma completo. Sebbene il MBC derivato da ddPCR abbia mostrato solo una debole correlazione con i valori di fumigazione del cloroformio, questo metodo offre un approccio molecolare efficace per valutare la biomassa microbica e indicatori ecologici come il rapporto F:B. Questo protocollo fornisce una strategia riproducibile e scalabile per integrare misure di abbondanza microbica con analisi composizionali al fine di avanzare nella valutazione della salute del suolo.

Introduzione

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Il suolo è il più grande serbo di carbonio organico terrestre, trattenendo più carbonio della vegetazione e del carbonio atmosfericomessi insieme 1. Negli ultimi 200 anni sono stati persi oltre 133 gigaton (Gt) di carbonio dai suoli, e gli sforzi in corso per ripristinare e mantenere le scorte di carbonio del suolo sono vitali per la salute globaledel suolo 2. Data l'immensa capacità di accumulo di carbonio dei suoli, determinare con precisione i principali contributori a queste scorte di carbonio è fondamentale3. I microbi svolgono un ruolo fondamentale nel ciclo dei nutrienti all'interno del suolo, e la biomassa microbica rappresenta una componente significativa del carbonio organico del suolo (SOC)3. Funghi e batteri sono i principali decompositori negli ambienti del suolo ed essenziali nei cicli biogeochimici di questiecosistemi 4,5. Nel suolo dominato dai batteri, la decomposizione della materia organica e la mineralizzazione dei nutrienti sono molto più rapide rispetto a un5 a maggioranza fungina. Il rapporto fungino-batterico (F:B) viene sempre più impiegato come indicatore della salute delsuolo 6,7; pertanto, una valutazione accurata sia dei funghi che dei batteri è fondamentale.

Le stime della biomassa microbica nei suoli spesso si basano su trattamenti chimici dirompenti, come la fumigazione concloroformio 8. Altri approcci mirano selettivamente alla comunità microbica attiva attraverso tecniche come la respirazione indotta dal substrato o l'analisi degli acidi grassi fosfolipidi (PLFA) 9. L'analisi PLFA è stata ampiamente utilizzata per valutare la composizione della comunità microbica e stimare il rapporto F:B. Tuttavia, una significativa variazione nella dimensione cellulare tra diverse specie fungine e batteriche introduce incertezza nella conversione delle concentrazioni di PLFA in rapporti F:B basati su biomassa o popolazioni, rendendo tali stime potenzialmente inaffidabili10. Altri metodi, come la citometria a flusso, possono essere utilizzati per aumentare la capacità del campione al fine di determinare l'abbondanza batterica nei suoli; tuttavia, la loro accuratezza può essere ridotta a causa di particelle non microbiche che presentano dimensioni, forma e caratteristiche autofluorescente simili aimicrorganismi 11. La fumigazione con cloroformio richiede una quantità relativamente grande di terreno (>10 g) per stimare la biomassa microbica, mentre un campione di 500 mg di terreno è sufficiente per i metodi basati sul DNA quando si effettuano estrazioni con kit commerciali. Un precedente confronto tra metodi basati sul DNA e la fumigazione con cloroformio ha mostrato che, sebbene entrambi gli approcci fossero in grado di stimare la biomassa microbica, usarli insieme ha fornito una valutazione più robusta della biomassamicrobica del suolo 12.

Le valutazioni delle comunità microbiche sono una metrica poco utilizzata della salute del suolo che ha il potenziale di trasformare il modo in cui misuriamo e comprendiamo isuoli 13. Gli approcci di metabarcoding sono convenzionalmente usati per determinare la comunità microbica del suolo, con abbondanze batteriche relative valutate amplificando regioni del gene 16S rRNA, mentre i taxa fungini sono mirati utilizzando il gene rRNA 18S o la regione14 dello spaziatore interno trascritto (ITS). Gli approcci di metabarcoding per i funghi possono basarsi su diverse regioni genomiche bersaglio, influenzando la diversità e l'abbondanza delle specie fungine identificate. La lunghezza ITS disomogenea tra le specie fungine può favorire un'amplificazione e un sequenziamento preferenziali, quindi una stima errata della loro abbondanza, portando a una valutazione errata delle comunitàfungine 15. I primer Fungiquant sono stati sviluppati per colpire specifiche regioni variabili all'interno del gene 18S rRNA che mostrano una copertura completa di funghi diversi e specificità rispetto ad altrieucarioti 16.

La maggior parte dei batteri e dei funghi possiede più di una copia del gene target, il che porta a stime distorte del conteggio cellulare. Inoltre, i funghi spesso hanno cellule multinucleate con numeri variabili di nuclei percellula 6. Vi è una notevole variazione del numero di copie del gene rRNA sia all'interno che tra i gruppi tassonomici, tipicamente inferiori a 15 copie nei procarioti, e stimate che varino tra 28 e 511 per il fungo17. A causa di questa variazione, le tecniche molecolari utilizzate per analizzare le strutture delle comunità microbiche sono considerate semi-quantitative, poiché possono distorcere la stima dell'abbondanza relativa delle specie in una comunità18. I numeri di copie geniche misurate (GCN) vengono regolarmente convertiti in abbondanze cellulari utilizzando la media stimata del GCN nel gruppo tassonomicodi interesse 18,19,20.

Alcuni studi hanno utilizzato approcci metagenomici, poiché offrono diversi vantaggi rispetto al metabarcoding, tra cui l'eliminazione del bias di amplificazione e la capacità di esaminare l'intera comunità microbica in modocompleto 21. Inoltre, consentono il confronto simultaneo delle composizioni fungine e batteriche, nonché delle loro relazioni traloro 22. In generale, la RT qPCR è comunemente impiegata per rilevare il contenuto microbico e la funzione23. La qPCR presenta limitazioni rispetto alla Digital Droplet PCR (ddPCR) per la quantificazione assoluta, a causa della sua sensibilità agli inibitori, poiché richiede uno standardesterno 24.

ddPCR è una tecnologia rivoluzionaria che si basa sulla suddivisione delle singole reazioni di amplificazione in gocce separate. Il modello viene successivamente amplificato tramite PCR in ogni singola goccia come reazione separata. ddPCR ha una bassa sensibilità agli inibitori enzimatici, una precisione, ripetibilità, sensibilità e stabilità nella quantificazione batterica e fungina rispetto aqPCR 25. Inoltre, è un metodo utilizzabile per la quantificazione assoluta di batteri e funghi nelsuolo 5. Poiché ddPCR si basa sullo stesso DNA estratto utilizzato per valutare i cambiamenti composizionali microbici, i dati di abbondanza di ddPCR possono essere collegati direttamente ai dati di composizionedelle comunità 26 e utilizzati per quantificare la biomassa microbica del suolo.

Questo studio fornisce una metodologia per la quantificazione di funghi e batteri nei suoli utilizzando la PCR digitale a gocce (ddPCR). Questo metodo ottimizzato è stato applicato a suoli provenienti da cinque diverse località globali e usi del suolo. Le località dei campioni sono state selezionate per comprendere un ampio spettro di proprietà del suolo, condizioni ambientali e pratiche di gestione, permettendo così la valutazione della robustezza e della generalità del nostro approccio in contesti diversi. Questi dati hanno permesso di determinare il rapporto F:B come bioindicatore molecolare della qualità ecologica del suolo. Infine, è stato effettuato un confronto della biomassa microbica stimata tra i dati microbici ddPCR e i metodi convenzionali di fumigazione con cloroformio.

Protocollo

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Uno schema generale di questi protocolli è mostrato nella Figura 1. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Campionamento del suolo

  1. Raccogliere campioni compositi di terreno superficiale (0–20 cm) da cinque località globali, con tre campioni da punti selezionati casualmente all'interno di un'area di 25 m da ciascuna posizione.
    NOTA: Tutti i campioni sono stati raccolti da sistemi agricoli rappresentativi dell'uso regionale del suolo in cui si trovavano. La texture del suolo è stata caratterizzata utilizzando la diffrazione laser, misurata con un analizzatore laser per la dimensione delle particelle (Tabella 1). I campioni sono stati trasportati a temperatura ambiente e conservati a 4 °C fino a ulteriori analisi.

2. Estrazione del DNA

NOTA: Esegui l'estrazione del DNA utilizzando un kit di estrazione del DNA del suolo seguendo le istruzioni del produttore. La temperatura ambiente per tutti i passaggi era di 20 °C.

  1. Fai girare brevemente il tubo di battitura delle perle da 2 mL per assicurarti che le perle si siano depositate sul fondo. Aggiungi 100 mg di terra e 800 μL di Solution CD1. Vortice per mescolare brevemente.
  2. Omogeneizzare accuratamente i campioni utilizzando un omogeneizzatore a mulino a perline, con campioni lisati per 40 s a 6 m s−1.
  3. Centrifuga un tubo per battere le perle per la lisi meccanica delle cellule a 15.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente.
  4. Trasferire il sovrandanzante in un tubo pulito da 2 mL per microcentrifuga.
    NOTA: Il soprandatante potrebbe ancora contenere particelle di suolo.
  5. Aggiungi 200 μL di Soluzione CD2 e vortice per 5 secondi.
  6. Centrifuga a 15.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente.
  7. Trasferire fino a 700 μL di sovrantato in un tubo pulito da 2 mL per microcentrifuga, evitando il pellet. Il pellet dovrebbe essere visibile.
  8. Aggiungi 600 μL di Solution CD3 e vortice per 5 secondi.
  9. Carica 650 μL di lisato su una colonna di spin e centrifuga a 15.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente.
  10. Scartare il flusso e ripetere il passo 2.9 per assicurarsi che tutto il lisato sia passato attraverso la colonna di spin.
  11. Metti la colonna di centrifuga in un tubo di raccolta pulito da 2 mL.
  12. Aggiungi 500 μL di Solution EA alla colonna di rotazione. Centrifuga a 15.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente.
  13. Scartare il flusso e rimettere la colonna di rotazione nello stesso tubo di raccolta da 2 mL.
  14. Aggiungi 500 μL di Soluzione C5 alla colonna di spin. Centrifuga a 15.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente.
  15. Scartare il flusso attraverso e posizionare la colonna di rotazione in un nuovo tubo di raccolta da 2 mL.
  16. Centrifuga fino a 16.000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente.
  17. Inserisci la colonna di rotazione in un nuovo tubo di eluzione da 1,5 mL.
  18. Aggiungere 50–100 μL di Soluzione C6 al centro della membrana bianca del filtro.
  19. Centrifuga a 15.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente. Scartare la colonna di rotazione e conservare l'eluto a -20 °C.

3. Quantificazione del DNA purificato

NOTA: Il DNA purificato è stato quantificato utilizzando un fluorometro e un kit di analisi a doppio filamento (dsDNA) Broad Range (BR) seguendo le istruzioni del produttore.

  1. Prepara una soluzione funzionante utilizzando un rapporto tampone 199:1 tra tampone e reagente.
  2. Aggiungere 10 μL di ogni standard di DNA a 190 μL della soluzione operativa.
  3. Aggiungere 1–20 μL di DNA purificato a 180–199 μL di soluzione di lavoro. Il volume finale dovrebbe essere di 200 μL. Vortice e incubare campioni standard e di DNA a temperatura ambiente per 2 minuti.
  4. Analizza gli standard prima dei campioni di DNA sul fluorometro utilizzando le istruzioni sullo schermo.

4. Scelta dell'innesco

  1. Per l'analisi dei microrganismi del suolo, si selezionano primer specifici in base a riferimenti rilevanti. Per i batteri, sono stati utilizzati primer 16S rRNA25,27, e per i funghi, primer 18SrRNA 16.
  2. Eseguire l'amplificazione utilizzando il master mixaggio PCR in tempo reale basato su colorante (qPCR) e un ciclatore termico. Le sequenze di primer sono fornite nella Tabella 2.

5. Quantificazione microbica tramite ddPCR

  1. Scongelamento e vortice, tutti reagenti sul ghiaccio.
  2. Impostare la reazione ddPCR come segue: 0,1 μL (10 μM) in direzione avanti e 0,1 μL (10 μM) inversa 16S o 18S primer, 10 μL ddPCR Evagreen Supermix, 0,5 ng DNA X μL, usando acqua senza nucleasi (NFW) per regolare il volume finale di reazione a 22 μL. Crea un controllo negativo aggiungendo NFW invece del modello per ogni colonna.
  3. Metti il DG8 nel portacartucce.
  4. Inserire un totale di 20 μL della miscela di reazione nei pozzi di campione della cartuccia.
  5. Aggiungi 70 μL di olio per la generazione di gocce per Evagreen nella cartuccia ben etichettata come 'olio'.
  6. Inserisci la cartuccia nel generatore di gocce e copri la cartuccia con una guarnizione.
  7. Trasferire 40 μL delle gocce generate su una piastra a 96 pozzi (semi-gonnata) per l'amplificazione PCR.
  8. Sigilla la piastra a 96 pozzi usando il sigillante per piastre (temperatura, 180 °C per 5 secondi).
  9. Utilizza le seguenti condizioni di ciclaggio con un coperchio riscaldato impostato a 105 °C.
    NOTA: (a) Batteri: 98 °C per 5 minuti, 40 cicli di; 94 °C per 30 secondi, 61 °C per 60 secondi, 5 minuti a 4 °C, 10 minuti a 98 °C. (b) Funghi: 95 °C per 5 minuti, 40 cicli di; 95 °C per 30 secondi, 55 °C per 1 minuto, 72 °C per 30 secondi, 5 minuti a 4 °C e 5 minuti a 90 °C.
  10. Trasferire la piastra a 96 pozzi sul lettore di placche.
  11. Valutare la concentrazione di copia di ciascun pozzo utilizzando la versione 1.2 di QuantaSoft. Regolare la soglia di ampiezza per separare gocce negative e positive.
  12. Calcola il numero di copie geniche per ogni ng di DNA nella reazione moltiplicando le copie/μL per il volume finale della reazione (20 μL) e dividendo per il totale del DNA del modello in ingresso nella reazione come segue: (copie μL-1 x volume di reazione) / DNA totale in ingresso nella reazione.
  13. Calcolare il totale delle copie geniche per ogni ng di DNA estratto moltiplicando le copie geniche per ng per il DNA totale estratto (ng) come segue: (copie geniche per ng x DNA totale estratto).
  14. Calcola le copie geniche per grammo dividendo le copie geniche totali per ng di DNA estratto in base alla quantità di peso secco del terreno lavorato nell'estrazione (g), come segue:
    copie geniche per grammo = (copie geniche totali per NG di DNA estratto / grammo di peso secco del suolo (GDW) del suolo lavorato durante l'estrazione).
  15. Calcola il conteggio cellulare per gdw convertendo le copie geniche usando il numero medio di copie geniche (GCN) seguendo l'equazione:
    Numero cellulare = copie geniche per grammo / Copie medie geniche cellula-1).
  16. Converti i numeri cellulari in carbonio microbico della biomassa (MBC) usando la seguente equazione:
    MBC per 16S (mg C g-1 suolo) = cellule gdw-1 × (100 fg cella-1) × 10−15 (g fg-1) × 103(mg g-1)28
    MBC per 18S (mg C g-1 suolo) = celle gdw-1 × (6 fg cella-1) x 10−12 (g fg-1) × 103 (mg g-1)29
    Il processo completo è spiegato nella Figura 2.
    NOTA: La copia media del gene 16S rRNA (media ± SD) per 46 phylabatterici 20 è stata calcolata e utilizzata come fattore di correzione per i batteri, con un valore finale di 2,48. Per i funghi, il numero di copie geniche è stato calcolato con un fattore di correzione di 113 secondo Lofgren et al.17. Il carbonio della biomassa microbica (MBC) è stato stimato a partire dai conteggi cellulari derivati da ddPCR, utilizzando contenuti cellulari assunti di 100 fg per cellulabatterica 28 e 6 pg per cellulafungina 29.

6. Analisi molecolare del suolo tramite sequenziamento del genoma completo

  1. Prepara la libreria di sequenziamento seguendo il protocollo Oxford Nanopore Technologies SQK-NBD114, utilizzando il Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) (vedi Tabella dei Materiali). Assicurati di utilizzare un codice a barre, fornito nel kit, per ogni campione.
  2. Sequenzia la libreria preparata utilizzando una cella di flusso Oxford Nanopore Technologies R10.4.1.
  3. Esegui la basecalling in MinKnow durante l'esecuzione di sequenziamento selezionando il modello super accuracy (SUP) e selezionando il taglio del codice a barre "ON". Versione Dorado: 0.7.2+9ac85c6.
  4. Eseguire la classificazione tassonomica delle letture di sequenze di DNA utilizzando il classificatore tassonomico Kraken2 (v2.1.3)30 rispetto al database NCBI di proteine non ridondanti (nr), confidenza 0,05.
  5. Ispeziona i file di rapporto Kraken2 per classificazioni totali di batteri e funghi.
  6. Calcola l'abbondanza relativa di batteri e funghi per ogni campione.

7. Stima del carbonio della biomassa microbica del suolo tramite fumigazione del cloroformio

  1. Pesa i campioni di terra fresca in teglie pre-pesate e asciuga in forno a 105 °C per 24 ore.
  2. Calcola il contenuto di umidità del suolo sottraendo il peso del suolo secco dal peso del suolo fresco e dividendo la differenza per il peso del suolo fresco.
    Contenuto di umidità (%) = (W bagnato –W secco)/ Wsecco) × 100
  3. Usa il contenuto di umidità per calcolare la materia secca del terreno.
    Materia secca (%) = 100 – Contenuto di umidità (%)
  4. Aggiungi 5 g di terreno a due tubi centrifughe individuali da 50 mL, etichettati come non fumigati e fumigati.
  5. Aggiungere un totale di 25 mL di 0,5 MK 2SO4 al tubo etichettato non fumigato.
  6. Agitare i campioni non fumigati in uno shaker orbitale per 1 ora a temperatura ambiente.
  7. Aggiungere 2 mL di cloroformio privo di etanolo direttamente nel terreno nei tubi etichettati come fumigati. Chiudere e fissare i coperchi con parafilm e incubare al buio per 24 ore a temperatura ambiente.
  8. Centrifuga il campione non fumigato per 10 minuti a 2.500 x g a temperatura ambiente.
  9. Estinta il soprantantante dal campione non fumigato, filtra attraverso un filtro di cellulosa da 0,45 μm e conserva a -20 °C.
  10. Rimuovere i coperchi dai campioni fumigati e sfiatare nella cappa per 2 ore, poi eseguire l'estrazione K2SO4 (ripetendo i passaggi 5-9) e conservare a -20 °C.
  11. Misura la concentrazione di carbonio dell'estratto sia per campioni 'fumigati' che 'non fumigati', utilizzando un analizzatore di carbonio organico totale.
  12. Calcolare il carbonio della biomassa microbica (MBC) usando la seguente equazione: MBC = (Contenuto di C Fumigato-Contenuto di C non fumigato)/0,45. Normalizzare per il suolo secco per grammo.

8. Stima del contenuto di materia organica del suolo

  1. Asciuga un crogiolo di porcellana in un forno a convezione a 105 °C per 30 minuti, poi pesalo dopo il raffreddamento a 20 °C (WC).
  2. Metti fino a 2 g di terra nel crogiolo essiccato e pesa di nuovo.
  3. Asciugare i campioni di terreno nel crogiolo riempito in un forno a convezione a 105 °C per 24 ore.
  4. Metti in un essiccatore sigillato per raffreddare e pesare di nuovo (WS).
  5. Preriscalda un forno a soffiamento a 550 °C, poi metti il crogiolo contenente il terreno nel forno per 4 ore.
  6. Rimuovi il crogiolo con la terra dalla fornace e mettilo in un essiccatore per raffreddarlo.
  7. Pesa il crogiolo con terra (WA).
  8. Misura la percentuale di SOM calcolando la differenza di peso secco del suolo prima e dopo l'incubazione a 550 °C.
    SOM LOI = [(W S –W A)/(WS –W C)] × 100

Risultati

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I campioni di suolo sono stati raccolti in cinque località e il contenuto di sostanza organica del suolo è stato determinato tramite perdita all'accensione. I contenuti di materia organica nel suolo variavano dal 3,38% al 10,34% in ciascuno dei suoli utilizzati nello studio (Tabella 1). Estrazioni di DNA sono state effettuate su ciascun campione di suolo in triplice, con rese di DNA risultanti che variavano da 32 ng a 4.590 ng per grammo di terreno secco (Figura 3A).

La concentrazione di DNA differiva significativamente tra i suoli con contenuto variabile di materia organica (ANOVA unidirezionale p < 0,0001, R2=0,97). Il suolo con il contenuto organico più basso, il suolo A, non mostrava la concentrazione di DNA più bassa. Tuttavia, il suolo E, che aveva il contenuto organico più alto, aveva una concentrazione significativamente maggiore di DNA proveniente da tutti gli altri suoli (A–D, p < 0,0001), mentre il suolo B aveva il livello più basso, differendo significativamente da A e D (p < 0,05). Il protocollo ddPCR è stato eseguito su DNA purificato da ciascuno dei campioni di suolo utilizzando i primer per i geni rRNA 16S e 18S. Il numero di copie geniche per grammo di peso secco del suolo per ciascuno dei geni 16S (Figura 3B) e 18S rRNA (Figura 3C) è stato determinato utilizzando la ddPCR. In tutti i campioni di suolo, c'erano meno copie del gene 18S rRNA rispetto al gene 16S rRNA. I test post-hoc di Tukey hanno rivelato che il suolo B aveva il minor numero di copie dei geni rRNA 16S e 18S, con una media di 8,8 x 10copie 7 e 4,6 x 10 6 geni, rispettivamente, per grammo di terreno asciutto. Il suolo E differiva significativamente da tutti gli altri suoli e mostrava il maggior numero di copie dei geni rRNA 16S e 18S con rispettivamente 4,4 x 109 e 2,5 x 10 copiegeniche 9, per grammo di terreno secco. Le copie fungine nei suoli A–D non differivano significativamente tra loro, mentre le copie batteriche nel suolo D differivano significativamente da B ed E.

Il sequenziamento full genome shotgun (WGS) è stato impiegato su DNA purificato da ciascun campione di suolo, e le classificazioni tassonomiche sono state effettuate utilizzando Kraken2 rispetto al database nr NCBI. Il numero totale di letture di sequenze di DNA classificate contro batteri e funghi è stato utilizzato per calcolare il rapporto fungo:batterico (F:B) per ciascun suolo e confrontato con i rapporti fungo:batterico calcolati dal numero di copie geniche stimate da ddPCR (Figura Supplementare 1). I valori del rapporto F:B ottenuti con ddPCR variavano da 0,022 a 0,66 su tutti i campioni di suolo ed erano superiori a quelli ottenuti tramite il sequenziamento dell'intero genoma. La media più alta di F:B è stata osservata nel suolo E, con un F:B di 0,56 per ddPCR e 0,038 per i metodi WGS. Inoltre, è stata identificata una gamma più ampia di valori F:B nei campioni di suolo usando ddPCR piuttosto che WGS. Inoltre, è stata osservata una correlazione positiva tra il rapporto F:B determinato dal metodo ddPCR e i dati WGS (r = 0,59, R2 = 0,35, p = 0,019), come mostrato nella Figura Supplementare 1.

Un numero medio di copie geniche per batteri e funghi è stato utilizzato per convertire le copie geniche calcolate nel numero di cellule batteriche e fungine nei campioni originari (Figura Supplementare 2). Questi dati sono stati combinati per stimare il numero totale di cellule microbiche nel suolo (Figura 3D) e differivano significativamente tra i suoli (ANOVA unidirezionale p < 0,0001). L'analisi di confronto a pari di Tukey ha mostrato che il contenuto microbico più alto è stato osservato nel suolo E, mentre il contenuto microbico più basso è stato trovato nei campioni raccolti dal suolo B, differendo significativamente da A, D ed E.

La fumigazione con cloroformio è stata eseguita su ciascun campione di suolo in triplicata per stimare il carbonio totale della biomassa microbica (MBC) in ciascun campione (Figura 4A). Tra 3,6 e 9,6 mg di carbonio per grammo di terreno asciutto sono stati identificati nei suoli utilizzati, senza differenze significative osservate tra ciascun campione (ANOVA unidirezionale p = 0,266). Un contenuto medio di carbonio per cellule batteriche e fungine è stato utilizzato per convertire il numero di cellule microbiche stimato da ddPCR in un totale stimato di carbonio microbico da biomassa. Queste stime derivate dalla ddPCR sono state confrontate con il metodo di fumigazione con cloroformio (Figura 4B). Per valutare la relazione tra la MBC misurata tramite fumigazione con cloroformio e il metodo ddPCR, è stata condotta una correlazione di Pearson (n = 15). È stata trovata una correlazione positiva tra i due metodi (r = 0,43, R2 = 0,18, p-valore = 0,05). Gli outlier del suolo E, caratterizzati dal più alto contenuto di materia organica, probabilmente hanno contribuito in modo sproporzionato a questo risultato marginalmente significativo (Figura 4B).

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Figura 1: Una panoramica della lavorazione dei campioni di suolo. La figura illustra i metodi molecolari che utilizzano il DNA del suolo per la quantificazione microbica e i metodi convenzionali per misurare biomassa microbica, carbonio e materia organica del suolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Diagramma di flusso del processo di conteggio cellulare dalle copie ddPCR sia per 16S che per 18S, fino alla stima finale del carbonio della biomassa microbica, che mostra i passaggi 5.11–5.16 del protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Quantificazione microbica del suolo. (A) La concentrazione media di DNA purificata da ciascun campione di suolo. (B) Numero medio totale di copie del gene 16S rRNA per grammo di peso secco del suolo usando ddPCR. (C) Numero medio totale di copie del gene 18S rRNA per grammo di peso secco del suolo usando ddPCR. (D) Numero medio totale di cellule microbiche per grammo di peso secco tra i campioni di suolo. Tutte le barre di errore mostrano l'errore standard della media. Sono stati eseguiti un ANOVA unidirezionale e il successivo test post-hoc di Tukey per confronti a coppie, e le differenze significative sono mostrate tramite display a lettere compatte (soglia di significanza = 0,05). I campioni sono ordinati dal più basso al più alto percentuale di OM%. Origine del suolo (OM%) A: Paesi Bassi (3,38), B: Iraq (5,14), C: Cina (6,41), D: Regno Unito (8,19) ed E: Regno Unito (10,34). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Carbonio della biomassa microbica misurato tramite estrazione da fumigazione con cloroformio e stime cellulari basate su geni. (A) MBC estratto tramite fumigazione con cloroformio - disposto da un contenuto di materia organica basso a alto. Le barre di errore mostrano l'errore standard della media. Sono stati eseguiti un'ANOVA unidirezionale e il successivo test post-hoc di Tukey per confronti a coppie, e le differenze significative sono mostrate tramite display compatto con lettere (soglia di significanza = 0,05). (B) MBC stimato dall'abbondanza cellulare (gdw -1) derivato dal numero di copie del gene ddPCR e convertito in carbonio biomassa, rappresentato con materia organica totale per lo stesso campione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

EsempioOrigine del suolopHPercentuale di umiditàMateria Organica%TextureUso del suolo
ATexel, Paesi Bassi7.1619.043.38Terra sabbiosaOrticoltura
BNajaf, Iraq7.588.335.14Fango limosoRiso
CJiangxi, Cina4.118.456.41Fango limosoSesamo/Semi di colza
DCambridge, Regno Unito6.8121.88.19Fango limosoGrano
EExeter, Regno Unito5.4420.2710.34Fango limosoPrateria

Tabella 1: Proprietà fisiochimiche e caratteristiche di utilizzo del suolo di cinque campioni di suolo (A–E), per la determinazione della biomassa microbica.

BersaglioBPAvantiRetromarciaRiferimento
16S rRNA1805′- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG5′- ATTACCGCGGCTGCTGG(Le Geay et al., 2024; Ovreås et al., 1997)
18S rRNA3515′-GGRAAACTCACCAGGTCCAG5′-GSWCTATCCCCAKCACGA(Liu et al., 2012)

Tabella 2: Coppie di primer selezionate per colpire il gene rRNA 16S e 18S utilizzando il ddPCR.

Figura supplementare 1: Una correlazione tra il rapporto F:B per tutti i campioni di suolo, determinato dal metodo ddPCR e WGS. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Numero di cellule in diversi campioni di suolo misurato utilizzando il metodo ddPCR che mira: (A) batteri; e (B) funghi. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

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I microbi del suolo sono i principali decompositori negli ecosistemi terrestri e svolgono un ruolo essenziale nel ciclo dei nutrienti e nell'immagazzinamento del carbonio nel suolo. Nonostante l'importanza dei microbi del suolo, quantificarne accuratamente l'abbondanza assoluta tramite metodi basati su copie geniche è una sfida. Ciò è dovuto a molti fattori, come il numero variabile di geni bersaglio in diverse specie. Questo studio dimostra come la biomassa microbica del suolo possa essere quantificata usando ddPCR mirando a procarioti ed eucarioti utilizzando le rispettive regioni codificanti del gene rRNA 16S e 18S. Il più alto rapporto F:B nel suolo E è stato osservato, dove questo campione aveva anche la percentuale più alta di materia organica. Il secondo rapporto F:B è stato osservato nel campione C, correlato all'elevata acidità di questi suoli. Questo era previsto per i campioni C ed E, poiché la crescita fungina aumenta con pH31 più basso. Il sequenziamento del genoma completo è stato eseguito sugli stessi estratti di DNA utilizzati per i metodi ddPCR. È stato confrontato il rapporto F:B tra WGS e ddPCR. Il rapporto F:B calcolato dai dati WGS è stato inferiore per tutti i campioni analizzati rispetto al rapporto F:B calcolato dai dati ddPCR. Tuttavia, la tendenza complessiva del rapporto F:B tra i campioni era visivamente comparabile tra i due metodi. Questo ha prodotto rapporti F:B più elevati sui campioni del suolo rispetto al sequenziamento del genoma completo e ha dimostrato una maggiore variabilità del rapporto F:B tra diversi tipi di suolo. Il rapporto F:B più basso osservato dai dati WGS è probabilmente causato dalle differenze nella dimensione del genoma tra funghi e batteri, e le sequenze fungine potrebbero essere sottorappresentate senza l'arricchimento32. Inoltre, nonostante il suolo A abbia il contenuto di sostanza organica più basso, non ha mostrato il minor numero di copie microbiche e di carbonio da biomassa microbica, evidenziando che il contenuto di materia organica non è sempre direttamente correlato con la biomassa microbica. In particolare, le tendenze osservate tra la concentrazione di DNA originario (Figura 3A) e le cellule microbiche totali (Figura 3D) erano visivamente simili, suggerendo che la concentrazione di DNA sia un buon indicatore della biomassa microbica.

ddPCR consente una quantificazione accurata del numero di copie geniche all'interno dei campioni di suolo, e questo metodo può essere utilizzato per stimare il totale delle cellule microbiche. Tuttavia, ci sono limitazioni da considerare. Il numero di copie dei geni rRNA 16S e 18S varia ampiamente tra i taxamicrobici 23. Di conseguenza, l'uso di un singolo fattore di correzione per il numero di copie genetiche può portare a una sovrastima o sottostima dell'abbondanza microbica in uncampione 33. Questa limitazione può essere affrontata incorporando conoscenze pregresse della comunitàmicrobica 18, utilizzando dati di sequenziamento dell'intero genoma e applicando correzioni appropriate del numero di copie geniche rappresentative del specifico microbiota del suolo. Sebbene i metodi molecolari forniscano ancora una stima piuttosto che un conteggio esatto, offrono una previsione più accurata dell'abbondanza microbica. Quando combinato con i dati sulla composizione delle comunità, questo approccio consente interpretazioni che vanno oltre la sola abbondanza relativa19,34.

Il carbonio della biomassa microbica (MBC), stimato tramite fumigazione con cloroformio, non ha mostrato differenze significative tra i campioni analizzati, anche se sono stati osservati alti gradi di variazione nei MBC tra i campioni A–D. Al contrario, sono state rilevate differenze significative nel conteggio totale delle cellule microbiche misurate con il metodo ddPCR, indicando che questo approccio molecolare può fornire una risoluzione maggiore rispetto alle tecniche convenzionali. Tuttavia, calcolare il carbonio della biomassa microbica a partire dal numero cellulare microbico presenta le sue limitazioni. La variabilità nella dimensione cellulare può influenzare la conversione del numero di copie cellulari in biomassa. Analogamente all'uso di un singolo fattore di conversione per il numero di copie geniche, l'uso di un singolo fattore di conversione per il contenuto di carbonio batterico e fungino può portare a una sovrastima o sottostima del carbonio della biomassa microbica.

Inoltre, i metodi basati sul DNA possono essere particolarmente problematici rispetto a suoli che mostrano grandi differenze nel grado di dominanza tra batteri e funghi. Sia la resa del DNA che il GCN possono essere influenzati dalla scelta del metodo di estrazione del DNA e dal design del primer35,36, rendendo difficili i confronti tra laboratori37. Inoltre, sia il metodo GCN che quello di produzione del DNA possono essere vulnerabili a sovrastima a causa del cosiddetto "DNA reliquia", cioè DNA in organismi morti o legato a argille14,38. Sebbene i metodi ddPCR abbiano mostrato maggiore precisione e ripetibilità, alcuni svantaggi includono processi complessi, costi elevati e l'uso di coloranti per DNA non specifici nell'uso della chimicaEvagreen 5. Questo può creare falsi positivi deboli, rendendo difficile separare gocce positive da negative, e un leggero errore di soglia potrebbe influire sul rapporto F:B quando le copie geniche sono abasso 14. Per aumentare il numero di campioni processabili con questo metodo ddPCR, l'automazione con robotica per la gestione dei liquidi può essere utilizzata per estrazioni di DNA e configurazionedella reazione 39. Inoltre, il nuovo sistema ddPCR consente una multiplexazione più ampia, generando gocce per 96 campioni simultaneamente.

È importante notare che tutte le misurazioni della biomassa microbica sono stime e coinvolgono fattori di conversione generalizzati per determinare inumeri 37. Pertanto, i confronti tra i metodi devono essere effettuati con cautela, poiché non si sa quali siano i più accurati. Nonostante ciò, i metodi di estrazione per fumigazione del cloroformio sono stati ampiamente utilizzati negli ultimi decenni, basandosi sui vapori di cloroformio per fumigarare il suolo. Ciò ha sollevato molte preoccupazioni a causa della sua tossicità per l'uomo e per l'ambiente, nonché della sua efficacia nel lisare cellule microbiche delsuolo 40. Inoltre, la fumigazione con cloroformio può portare a una sovrastima del MBC prodotto da fonti non viventi, come i residuivegetali 41. Infine, questo metodo si basa anche su quantità relativamente elevate di terreno rispetto ad altri metodi molecolari che richiedono quantità molto basse di terreno (<500 mg).

Questo studio fornisce prove che i metodi basati su ddPCR per misurare la biomassa microbica del suolo su una gamma di suoli sono robusti e non sono influenzati da diversi tipi di suolo e potenziali inibitori. Il successo di questo metodo è influenzato dal campione di DNA originario e, di conseguenza, garantire una purificazione efficace del DNA dai campioni è fondamentale. Questo metodo mostra potenziale per la rilevazione e quantificazione microbica in vari tipi e texture del suolo, integrando i metodi esistenti per la stima della biomassa microbica e consentendo applicazioni future preziose nel monitoraggio della salute e della scalabilità del suolo per la sorveglianza regionale o globale del microbioma.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano l'assenza di conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo la Dott.ssa Nina Lindstrom-Friggens, la Dott.ssa Liz Cressey, la Dott.ssa Joanna Zaragoza-Castells, Angela Elliott, la Dottoressa Kees Jan van Groenigen e il Prof. Iain Hartley. Vorremmo anche ringraziare i proprietari terrieri per aver fornito i suoli per questo studio. Questa ricerca è stata finanziata da Shell Research Ltd (CW648947-PT34767). I dataset generati durante l'attuale studio sono disponibili nel repository NCBI Sequence Read Archive PRJNA1305539.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Bettersizer S3 Plus Bettersize, CinaBT-803
CentrifugaTermoscientifica SL16 
Cloroformio ThermoScientificL14759. AU & nbsp;
ddPCR Piastre a 96 pozziBio-Rad, Watford, Regno Unito12001925
ddPCR Olio per Lettore di Gocce  Bio-Rad, Watford, Regno Unito1863004
Essiccatore Davisil
Portacartucce DG8Bio-Rad, Watford, Regno Unito1863051
Cartucce DG8 per generatore di gocce QX200/QX100Bio-Rad, Watford, Regno Unito1864008
Guarnizioni DG8 per generatore di gocce QX200/QX100Bio-Rad, Watford, Regno UnitoQ33265
DNeasy Power Soil pro kit & nbsp;Qiagen, Germania47017
Kit di analisi a doppio filamento (dsDNA) Broad Range (BR)Invitrogen, GermaniaQ33230
FastPrep-24 5G MP Biomedicals, Regno Unito116005500
GridION Oxford Nanopore Technologies, Regno UnitoGRD-MK1CAPX
K2SO4Merck, Regno Unito7778-80-5
Perle magnetiche Mag-BindOmega Bio-tek, USAM1378-01
Cella di flusso MinIONOxford Nanopore Technologies, Regno UnitoFLO-MIN114
Caldaia ovattataCarbolite AAF1100
Kit nativo di codice a barre 24Oxford Nanopore Technologies, Regno UnitoSQK-NBD114.24
Sigillatura termica per piastre PCR, stagnola, perforabili  Bio-Rad, Watford, Regno Unito1814040
Sigillante per piastre PCR PX1Bio-Rad, Watford, Regno Unito1814000
Fluorometro a QubitInvitrogen, GermaniaD33226
Sistema PCR digitale a gocce QX200Bio-Rad, Watford, Regno Unito1864001
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixBio-Rad, Watford, Regno Unito186-4033
QX200 Olio per la generazione di gocce per EvaGreen & nbsp;Bio-Rad, Watford, Regno Unito1864005
QXDx Generatore di Gocce Bio-Rad, Watford, Regno Unito12001049
SENSOQUEST LABCYCLER Geneflow, Germania1120280125

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jobbágy, E. G., Jackson, R. B. The vertical distribution of soil organic carbon and its relation to climate and vegetation. Ecol Appl. 10 (2), 423-436 (2000).
  2. Sanderman, J., Hengl, T., Fiske, G. J. Soil carbon debt of 12,000 years of human land use. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (36), 9575-9580 (2017).
  3. He, Y., Li, J., Siemann, E., Li, B., Xu, Y., et al. Plant invasion increases soil microbial biomass carbon: meta-analysis and empirical tests. Glob Change Biol. 31 (3), e70109(2025).
  4. de Menezes, A. B., Richardson, A. E., Thrall, P. H. Linking fungal-bacterial co-occurrences to soil ecosystem function. Curr Opin Microbiol. 37, 135-141 (2017).
  5. Wang, D., et al. ddPCR surpasses classical qPCR technology in quantitating bacteria and fungi in the environment. Mol Ecol Resour. 22 (7), 2587-2598 (2022).
  6. Djemiel, C., et al. Biogeographical patterns of the soil fungal:bacterial ratio across France. mSphere. 8 (5), e0036523(2023).
  7. Bailey, V. L., Smith, J. L., Bolton, H. Fungal-to-bacterial ratios in soils investigated for enhanced C sequestration. Soil Biol Biochem. 34 (7), 997-1007 (2002).
  8. Vance, E. D., Brookes, P. C., Jenkinson, D. S. Microbial biomass measurements in forest soils: the use of the chloroform fumigation-incubation method in strongly acid soils. Soil Biol Biochem. 19 (6), 697-702 (1987).
  9. Frostegård, Å, Bååth, E., Tunlio, A. Shifts in the structure of soil microbial communities in limed forests as revealed by phospholipid fatty acid analysis. Soil Biol Biochem. 25 (6), 723-730 (1993).
  10. Cao, Z., Li, D., Han, X. The fungal to bacterial ratio in soil food webs, and its measurement. Acta Ecol Sin. 31 (20), 6050-6058 (2011).
  11. Frossard, A., Hammes, F., Gessner, M. O. Flow cytometric assessment of bacterial abundance in soils, sediments and sludge. Front Microbiol. 7, 903(2016).
  12. Joergensen, R. G., et al. A hitchhiker’s guide: Estimates of microbial biomass and microbial gene abundance in soil. Biol Fertil Soils. 60 (4), 457-470 (2024).
  13. Fierer, N., Wood, S. A., Bueno de Mesquita, C. P. How microbes can, and cannot, be used to assess soil health. Soil Biol Biochem. 153, 108111(2021).
  14. Laine, M. B., Taipale, S. J., Tiirola, M. Comparison of methods for assessing fungi-to-bacteria ratio of soil. Biol Fertil Soils. 61 (5), 941-954 (2025).
  15. De Filippis, F., Laiola, M., Blaiotta, G., Ercolini, D. Different amplicon targets for sequencing-based studies of fungal diversity. Appl Environ Microbiol. 83 (17), e00905-e00917 (2017).
  16. Liu, C. M., et al. FungiQuant: A broad-coverage fungal quantitative real-time PCR assay. BMC Microbiol. 12, 255(2012).
  17. Lofgren, L. A., et al. Genome-based estimates of fungal rDNA copy number variation across phylogenetic scales and ecological lifestyles. Mol Ecol. 28 (4), 721-730 (2019).
  18. Angly, F. E., et al. W. CopyRighter: A rapid tool for improving the accuracy of microbial community profiles through lineage-specific gene copy number correction. Microbiome. 2 (1), 11(2014).
  19. Kembel, S. W., Wu, M., Eisen, J. A., Green, J. L. Incorporating 16S gene copy number information improves estimates of microbial diversity and abundance. PLoS Comput Biol. 8 (10), e1002743(2012).
  20. Pan, P., Gu, Y., Sun, D. L., Wu, Q. L., Zhou, N. Y. Microbial diversity biased estimation caused by intragenomic heterogeneity and interspecific conservation of 16S rRNA genes. Appl Environ Microbiol. 89 (5), e0210822(2023).
  21. Chacón-Vargas, K., Torres, J., Giles-Gómez, M., Escalante, A., Gibbons, J. G. Genomic profiling of bacterial and fungal communities and their predictive functionality during pulque fermentation by whole-genome shotgun sequencing. Sci Rep. 10 (1), 15115(2020).
  22. Bahram, M., et al. Metagenomic assessment of the global diversity and distribution of bacteria and fungi. Environ Microbiol. 23 (1), 316-326 (2021).
  23. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology: Application of Q-PCR in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).
  24. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  25. Le Geay, M., Mayers, K., Küttim, M., Lauga, B., Jassey, V. E. J. Development of a digital droplet PCR approach for the quantification of soil micro-organisms involved in atmospheric CO2 fixation. Environ Microbiol. 26 (6), e16666(2024).
  26. Hansen, P. M., Semenova-Nelsen, T. A., Platt, W. J., Sikes, B. A. Recurrent fires do not affect the abundance of soil fungi in a frequently burned pine savanna. Fungal Ecol. 42, 100852(2019).
  27. Ovreås, L., Forney, L., Daae, F. L., Torsvik, V. Distribution of bacterioplankton in meromictic Lake Saelenvannet, as determined by denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified gene fragments coding for 16S rRNA. Appl Environ Microbiol. 63 (9), 3367-3373 (1997).
  28. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (12), 6578-6583 (1998).
  29. Cheng, J. Y. W., Chan, C. K., Lee, C. T., Lau, A. P. S. Carbon content of common airborne fungal species and fungal contribution to aerosol organic carbon in a subtropical city. Atmos Environ. 43 (17), 2781-2787 (2009).
  30. Wood, D. E., Lu, J., Langmead, B. Improved metagenomic analysis with Kraken 2. Genome Biol. 20 (1), 257(2019).
  31. Rousk, J., Brookes, P. C., Bååth, E. Contrasting soil pH effects on fungal and bacterial growth suggest functional redundancy in carbon mineralization. Appl Environ Microbiol. 75 (6), 1589-1596 (2009).
  32. Xie, Z., Canalda-Baltrons, A., d’Enfert, C., Manichanh, C. Shotgun metagenomics reveals interkingdom association between intestinal bacteria and fungi involving competition for nutrients. Microbiome. 11 (1), 275(2023).
  33. Větrovský, T., Baldrian, P. The variability of the 16S rRNA gene in bacterial genomes and its consequences for bacterial community analyses. PLoS One. 8 (2), e57923(2013).
  34. Doyle, B., et al. Absolute quantification of prokaryotes in the microbiome by 16S rRNA qPCR or ddPCR. Nat Protoc. 20, 3471-3476 (2025).
  35. Frostegård, A., et al. Quantification of bias related to the extraction of DNA directly from soils. Appl Environ Microbiol. 65 (12), 5409-5420 (1999).
  36. Lee, E., Lim, H. J., Son, A. Discrepancies in qPCR-based gene quantification and their dependencies on soil properties, inhibitor presence, and DNA extraction kit types. RSC Adv. 15 (25), 19656-19664 (2025).
  37. Buell, Z. W., et al. Interrelationships among methods of estimating microbial biomass across multiple soil orders and biomes. Soil Biol Biochem. 208, 109844(2025).
  38. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nat Microbiol. 2 (3), 16242(2016).
  39. Child, H. T., et al. Automated environmental metagenomics using Oxford nanopore sequencing. BMC Genomics. 26 (1), 835(2025).
  40. Paliaga, S., Laudicina, V. A., Muscarella, S. M., Said-Pullicino, D., Badalucco, L. Comparison of different methods for estimating microbial biomass in biochar-amended soils. Soil Biol Biochem. 203, 109733(2025).
  41. Setia, R., Verma, S. L., Marschner, P. Measuring microbial biomass carbon by direct extraction: comparison with chloroform fumigation-extraction. Eur J Soil Biol. 53, 103-106 (2012).

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