Imaging del calcio basato sulla fluorescenza nelle colture epiteliali primarie delle vie aeree umane utilizzando segmentazione cellulare automatizzata

Sommario

L'imaging a cellule vive della segnalazione del calcio viene ampiamente utilizzato per studiare la mobilitazione del calcio nelle linee cellulari stabili coltivate in monostrati. Questo protocollo descrive l'imaging di fluorescenza a cellule vive della segnalazione del calcio utilizzando coloranti di cellule vive su tessuti complessi e primari, e utilizza anche software di apprendimento automatico per quantificare simultaneamente l'intensità di fluorescenza di migliaia di singole cellule, semplificando così le analisi.

Abstract

La segnalazione del calcio è fondamentale in una moltitudine di processi biologici, rafforzando la necessità di sviluppare metodi per studiare il flusso di calcio nei tessuti primari. Lo studio della segnalazione del calcio a risoluzione unicellulare nelle colture epiteliali primarie complesse è impegnativo e quindi rimane scarsamente studiato. Questo studio presenta metodi adattati per monitorare la segnalazione del calcio vivo nelle colture epiteliali primarie delle vie aeree e nuovi approcci per analisi basate su machine learning. Utilizzando colture epiteliali primarie delle vie aeree derivate dal paziente, differenziate all'ALI (interfaccia aria-liquido) caricate con un colorante indicatore fluorescente estrinseco, la mobilizzazione del calcio è stata misurata a risoluzione cellulare singola utilizzando un microscopio epifluorescente. Abbiamo sviluppato un software innovativo che utilizza la segmentazione cellulare basata su machine learning per assegnare intensità di fluorescenza a cellule distinte nel tempo. Nel complesso, l'impianto di imaging adattato e il software consentono un approccio rapido e imparziale all'analisi delle singole cellule nelle colture epiteliali primarie. Il protocollo passo dopo passo presentato qui consentirà lo studio futuro del calcio nelle singole cellule e nei tipi cellulari che costituiscono le colture epiteliali primarie.

Introduzione

I cambiamenti nella mobilitazione intracellulare del calcio dettano una vasta gamma di processi cellulari, inclusi cambiamenti nell'espressione genica e la modulazione delle risposte immunitarie^{innate 1,2}. I livelli di calcio intracellulari possono essere alterati tramite il rilascio da riserve di calcio intracellulari, come il reticolo endoplasmatico eⁱ mitocondri ^1,2,3. L'afflusso extracellulare di calcio nello spazio intracellulare può anche alterare il calcio citosolico sia attraverso il trasporto passivo che^{attivo 2}. L'imaging cellulare vivente della mobilizzazione del calcio viene analizzato principalmente da coloranti intracellulari o coloranti codificati geneticamente, GCaMP (Multimer/Proteina attivata dal calcio verde⁾⁴. Comuni in letteratura sono i coloranti coniugati con AM (acetossimetil), che permettono al colorante di penetrare nella membrana ^plasmatica 5,6,7,8. All'ingresso nella cellula, la parte AM viene spezzata da esterasi intracellulari endogene, e il colorante acquisisce una carica negativa, intrappolandolo nello spazio^{citosolico 9}. Grazie a questa carica acquisita, il colorante può essere pompato via dai canali anionici organici residenti nella membrana plasmica. Pertanto, viene aggiunto il probenecide, un inibitore dei trasportatori di efflusso di anioni organici, per prevenire l'efflusso cellulare del colorante e mantenere il segnale citosolico^{ottimale 10,11}. Gli studi impiegano comunemente Fura-2 AM, un colorante ratiometrico, e Fluo-4AM, un colorante intensitometrico, per analizzare la segnalazione del calcio su linee cellulari stabili coltivate in un monostrato. Questo studio utilizza un protocollo adattato per l'imaging epifluorescente di colture multistrato coltivate all'interfaccia aria-liquido utilizzando il colorante calcio intensitometrico recentemente sviluppato, Cal-520 AM, che presenta una sensibilità aumentata rispetto a Fluo-4 AM. Pertanto, è adatto a visualizzare in modo robusto segnali sottili a risoluzione cellulare singola provenienti da colture epiteliali primarie complesse. La letteratura attuale è ricca di immagini vivi del calcio delle risposte di massa da linee cellulari stabili. Tuttavia, è ormai noto che in vivo i tessuti costituiscono un paesaggio cellulare diversificato che supporta diversi ruoli specifici per tipo cellulare nel mantenimento dell'omeostasi^tissutale 12,13,14,15. Nonostante questa conoscenza comune, i meccanismi con cui distinti tipi cellulari coordinano i segnali del calcio e regolano l'omeostasi degli ioni calcio restano sconosciuti. Pertanto, i metodi qui presentati permetteranno il rilevamento da parte di singola cellula della segnalazione calcica e miglioreranno la portata delle analisi a valle nei tessuti primari delle vie aeree.

Stiamo sfruttando i nostri modelli di coltura epiteliale primaria precedentemente pubblicati e rigorosamente validati dell'epitelio nasale umano come strumento per visualizzare il calcio citosolico di cellule vive in un modello^{biologicamente rilevante} 16,17,18. In breve, le cellule epiteliali sono isolate dalle spazzole nasali del paziente e vengono coltivate su una membrana semipermeabile su un poglio trans, sospesa all'interno di un pozzo di coltura per mantenere un'interfaccia aria-liquido (ALI). Questa interfaccia, abbinata a mezzi specializzati, è stata rigorosamente testata utilizzando tecniche ortogonali per la presenza di diversi tipi^cellulari 16,17,18. Inoltre, è stato dimostrato che i metodi attuali sono traducibili in colture bronchiali primarie che vengono coltivate in modo simile alle nostre colture nasali^{primarie 19}.

Questo articolo introduce un metodo adattato per misurare e analizzare la segnalazione del calcio vivo a risoluzione cellulare singola in queste colture epiteliali primarie delle vie aeree. Queste colture multilivello sono difficili da visualizzare con la microscopia; Tuttavia, l'attuale configurazione ci permette di concentrarci in modo affidabile su singoli strati all'interno delle colture multistrato, permettendoci di rilevare la mobilitazione del calcio da questi specifici strati. Questa configurazione presenta diversi vantaggi, in quanto non richiede un sistema di perfusione, spesso costoso e difficile da adattare a meno che non vengano impiegati microscopi specializzati. È stata utilizzata la microscopia a epifluorescenza, che offre una risoluzione temporale migliorata rispetto all'imaging confocale. L'uso di diodi a emissione luminosa (LED) minimizza la fototossicità rispetto ai sistemi confocali basati su laser. Nel protocollo qui presentato sono utilizzati coloranti intensiometrici estrinseci poiché consentono cambiamenti rapidi e relativi del calcio in tutta la popolazione cellulare e sono compatibili con la maggior parte dei sistemi di microscopia a fluorescenza. Questo è vantaggioso rispetto ai coloranti ratiometrici comuni, che richiedono eccitazione ultravioletta profonda (UV) che non è disponibile su molti microscopi. Inoltre, GCaMP richiede trasfezione o trasduzione, che rafforza la tecnica per immagini più mirate del calcio in specifici tipi cellulari. A causa delle basse efficienze di trasduzione e trasfezione nelle colture epiteliali primarie, la tecnica è poco adatta al monitoraggio dell'intera popolazione cellulare.

Inoltre, questo studio ha sviluppato un software innovativo e specializzato basato su machine learning che consente la segmentazione di singola cellula basata su colorazione nucleare viva. Il software è quindi in grado di registrare i valori di intensità di fluorescenza per ogni cella nel tempo. Inizialmente è stata impiegata una linea cellulare epiteliale stabile (Calu-3) per l'ottimizzazione del metodo. Successivamente, questi metodi sono stati tradotti per studiare la mobilizzazione del calcio a singola cellula nelle colture epiteliali primarie. Variabili come la concentrazione del colorante di calcio e del probenecide, il tempismo dei passaggi di incubazione e l'impostazione per immagini sono state ottimizzate. Qui, la segnalazione del calcio viene registrata a una frequenza di 0,2 fps (fotogrammi al secondo), adatta per monitorare la segnalazione del calcio. Il frame rate può essere aumentato per misurare transitori di calcio più^{rapidi 20}. Le variabili ottimali sono state quindi applicate e ulteriormente ottimizzate in colture nasali primarie più complesse.

Protocollo

I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Mantenimento e coltivazione delle celle Calu-3

1. Mantenere le cellule Calu-3 in fiaschette T-25 in medi di coltura EMEM integrati con 20% FBS e 1% penicillina/estreptomicina. Preriscalda il substrato e cambialo in giorni alterni (5 mL/fiaschetta).
2. Quando le cellule sono confluenti al 70% nella fiaschetta, aspira il substrato nella fiaschetta.
3. Lava la fiaschetta con 5 mL di soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS).
4. Aggiungi 1 mL di Triple direttamente alle celle per 10-15 minuti a 37 °C, 5% di CO₂. Assicurarsi che tutte le cellule si siano staccate dal fondo della fiaschetta e siano dissocate in una sospensione a singola cellula.
5. Neutralizza la reazione con 4 mL di mezzo di coltura fresca (passo 1.1), poi mescola bene le cellule con una pipetta sierologica per garantire una semina uniforme.
6. Placca le celle su una piastra a 96 pozzi con una confluenza del 90%-100% (circa 40.000 celle/pozzo).
   1. Per seminare i pozzi, aggiungere 200 μL/pozzo di sospensione a celle ben miscelate.
   2. Lascia che le celle si attacchino alla piastra a 96 pozzi durante tutta la notte.
7. Cambia il mezzo ogni giorno (200 μL/pozzo) fino a quando non è pronto per gli esperimenti.
8. Lascia 2-5 giorni dopo la confluenza all'interno dei pozzi per iniziare la sperimentazione prima di condurre esperimenti per permettere la differenziazione.

2. Protocollo per il carico delle celle Calu-3 con Cal 520 AM o Fluo-4 AM

ATTENZIONE: Fluo-4 AM e Cal-520 AM sono disciolti in DMSO, considerato pericoloso. Probenecide è elencato come un rischio acuto. Si prega di indossare guanti e camice da laboratorio quando maneggi sostanze chimiche per evitare il contatto con la pelle. Smaltire tutte le sostanze chimiche nei contenitori designati per i rifiuti chimici.

1. Il giorno dell'esperimento, rimuovere il substrato dai pozzi pipettando e lavando le cellule due volte (200 μL/pozzo) in un tampone di calcio preriscaldato (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM_{MgCl 2}, 2 mM_{CaCl 2 e} 10 mM Hepes, regolato a pH 7,38 (NaOH) 291 mOsm), per rimuovere le cellule morte.
2. Incubare cellule con 200 μL/pozzo di un cocktail di 3 μM Cal-520 AM, 2,5 mM di probenecido e colorazione nucleare Hoechst 1:5000 in tampone di calcio (passo 2.1) per 1 ora in un incubatore impostato a 37°C e 5% di CO₂.
   1. Per gli esperimenti Fluo-4 AM, incubare cellule con 200 μL/pozzo di un cocktail di 3 μM Fluo-4 AM, 2,5 mM di probenecide e colorazione nucleare di Hoechst 1:5000 in tampone di calcio (passo 2.1) per 1 ora a 37 °C e 5% di_CO2.
      NOTA: Tieni i tubi di colorante al buio coprendoli con carta stagnola.
3. Durante l'incubazione, preparare la thapsigargin in tampone di calcio (passo 2.1). Regolare le concentrazioni intermedie di stock per garantire le corrette concentrazioni finali all'interno del pozzo.
   NOTA: Qui, si aggiungono 50 μL di farmaco a 100 μL del buffer di calcio esistente. Pertanto, fu preparato uno stock intermedio 3x di 6 μM.
4. Dopo 1 ora, aspirare il colorante pipettando e lavare via il colorante extracellulare con tampone di calcio (passo 2.1) due volte (200 μL/pozzo).
5. Dopo i lavaggi, aggiungere 100 μL/pozzo di probenecide da 2,5 mM diluito in tampone di calcio (passo 2.1) per mantenere il colorante nello spazio citoplasmatico.
6. Avvolgi il piatto in carta stagnola per proteggerlo dalla luce. Le cellule sono ora pronte per l'immagine.

3. Preparazione della microscopia per la linea cellulare stabile Calu-3

1. Utilizzando il microscopio a epifluorescenza dotato di un SuperFluor Object, una sorgente luminosa solida stabile e una fotocamera a fluorescenza CMOS (dimensione di 6,5 μm pixel). L'intensità di illuminazione è impostata a 500 mW.
2. Posizionare la piastra di celle sul palco usando l'adattatore a piastre a 96 pozzi. Usando Brightfield, concentrati sullo strato cellulare a basso ingrandimento per trovare il monostrato di celle (usa l'obiettivo dell'aria 5-10 volte).
   NOTA: Questo passaggio è opzionale, ma utile per ottenere un'attenzione iniziale sullo strato cellulare in modo efficiente.
3. Una volta identificato lo strato cellulare, usa Brightfield e passa a un ingrandimento più alto (obiettivo 20x aria) e rifocalizza sullo strato cellulare.
   NOTA: Assicurati di mettere a fuoco correttamente il monostrato con Campo Luminoso; I confini delle celle dovrebbero essere chiari.
4. Identifica il segnale del colorante di calcio usando il GFP (LED da 475 nm). Assicurarsi che la potenza del LED sia compresa tra il 5% e il 10% per evitare il fotosbiancamento, e il tempo di esposizione sia adeguato per visualizzare il segnale verde di base senza sovrasaturare il segnale, tipicamente tra 300 e 500 ms.
   NOTA: Per garantire la riproducibilità e persino il carico di coloranti, analizza qualitativamente lo strato cellulare; La maggior parte delle celle dovrebbe mostrare la stessa luminosità. Concentrati sui campi visivi con poche cellule morte, che fluoresceranno intensamente prima che venga aggiunto qualsiasi stimolante. L'intensità relativa di fluorescenza di base può essere misurata utilizzando Fiji (passo 7.9). La variazione di fluorescenza di base tra cellule dovrebbe essere vicina al 10%-15% se il colorante è stato caricato in modo uniforme (passo 7.9).
5. Identifica la colorazione nucleare Hoechst usando il LED DAPI (405 nm). La potenza dei LED dovrebbe essere tra il 2% e il 5% con un tempo di esposizione compreso tra 50 e 100 ms.
   NOTA: Se le cellule sono a fuoco, i nuclei dovrebbero apparire con contorni netti. Assicurati che il segnale nucleare non raggiunga la saturazione, poiché i nuclei possono interferire con il canale verde.

4. Acquisizione di video live sul calcio

1. Avvia un video live con un intervallo di 1 frame ogni 5 secondi (0,2 fps) per una durata di 10 minuti.
   NOTA: Cattura ogni canale fluorescente (DAPI 405 nm e GFP 475 nm) in ogni fotogramma.
2. Una volta iniziato il video, lascia una lettura di base di 5 minuti prima di aggiungere gli agonisti.
3. Utilizzando una pipetta P200, aggiungere 50 μL di thapsigargin a una riserva intermedia 3x al pozzo contenente 100 μL di probenecide da 2,5 mM in tampone di calcio (passo 2.1). Sospezioni delicatamente 1-2 volte all'interno del pozzo per garantire che il farmaco venga distribuito uniformemente. Continua a leggere per 5 minuti dopo l'aggiunta del thapsigargin.
   NOTA: La fase di aggiunta del farmaco è fondamentale; La punta della pipetta non dovrebbe entrare in contatto con la piastra per spostare il piano di messa a fuoco. Invece, fai galleggiare la punta della pipetta in modo che entri solo in contatto con il buffer all'interno del pozzo. Se i farmaci vengono miscelati troppo vigorosamente, le cellule possono staccarsi dalla placca e interferire con il segnale.
   NOTA: Assicurati di prendere nota del frame in cui il farmaco viene aggiunto per l'analisi a valle.
4. Salva il video e l'istantanea scattata prima dell'esperimento. Procedi all'analisi dei dati.

5. Protocollo per il carico delle celle delle vie aeree primarie con Cal 520 AM o Fluo-4 AM

1. Il giorno dell'esperimento, rimuovere il materiale basolaterale dal pozzo trans e lavare due volte i lati apicale e basolaterale dell'inserto utilizzando 750 μL di basolaterale e 300 μL apicale del tampone di calcio (passo 2.1).
2. Incubare le cellule con 600 μL basolaterale e 200 μL apicale dei coloranti Cal-520 AM o Fluo-4 AM per 1 ora a 37 °C e 5% di_CO2. Prepara il colorante nello stesso modo delle cellule Calu-3, per Cal-520 AM, 3 μM Cal-520 AM, 2,5 mM probenecide e 1:5000 Hoechst nel tampone di calcio (passo 2.1). Per Fluo-4 AM, 3 μM Fluo-4 AM, 2,5 mM di probenecide e 1:5000 Hoechst nello stesso tampone di calcio.
3. Durante il periodo di incubazione, preparare la thapsigargin a un stock intermedio di 3× per una concentrazione finale di 2 μM (stock intermedio di 6 μM).
4. Successivamente, aspirare il colorante e lavare le cellule due volte con 300 μL di apical e 750 μL di buffer basolaterale contenente calcio (passo 2.1).
5. Dopo i lavaggi, aggiungere 100 μL di apicale e 500 μL di basolaterale di 2,5 mM di probenecide in tampone di calcio (passo 2.1).
6. Mantenendo il cambio ben all'interno della piastra di alluminio, avvolgi la piastra nella carta stagnola. Le cellule sono ora pronte per l'imaging.

6. Preparazione della microscopia per gli inserti nasali primari

1. Procura una piastra di Petri con fondo di vetro adatta per l'imaging, pinzette e nastro adesivo sottile. Assicurati che la piastra di Petri sia pulita pulendola rapidamente con etanolo al 70% e lasciandola asciugare completamente.
2. Posizionare la piastra di Petri con fondo di vetro all'interno del piccolo adattatore circolare per il microscopio a epifluorescenza.
3. Con una pinzetta, posiziona con cura l'inserto al centro della ciotola con fondo di vetro.
   NOTA: Fai attenzione a non rovesciare il tamponetto, che è posizionato nel compartimento apicale dell'inserto.
4. Per evitare che l'inserto si muova durante l'aggiunta di farmaci, usa del nastro adesivo per fissare la parte superiore della plastica dell'inserto ai lati del piatto con fondo di vetro.
5. Posizionare l'adattatore con l'inserto attaccato al palco del microscopio e iniziare mettendo a fuoco sulle celle usando l'obiettivo del campo chiaro d'aria 10x.
6. Identifica il segnale del colorante di calcio usando il GFP (LED da 475nm). Assicurarsi che la potenza del LED sia compresa tra il 5% e il 10% per evitare lo sbiancamento fotografico, e il tempo di esposizione sia adeguato per visualizzare il segnale verde di base senza sovrasaturarlo, tipicamente tra 300 e 500 ms.
   NOTA: Si prega di consultare la NOTA sotto il passo 3.4 per garantire un corretto carico di colorante di calcio.
7. Identifica la colorazione nucleare Hoechst usando il LED DAPI (405 nm). La potenza dei LED dovrebbe essere tra il 2% e il 5% con un tempo di esposizione compreso tra 50 e 100 ms.
   NOTA: Se le cellule sono a fuoco, i nuclei dovrebbero apparire con contorni chiari e definiti. Concentrati sullo strato più apicale delle cellule. Regola l'asse z del microscopio per identificare il piano focale più alto dove le cellule rimangono a fuoco nitido. Assicurarsi che i nuclei non raggiungano la saturazione del segnale, poiché il segnale nucleare può interferire con il canale verde.
8. Per acquisire il video live sul calcio, segui i passaggi 5.1-5.4. Durante la fase di aggiunta del farmaco, aggiungi al centro dell'inserto e risospendi lentamente usando una pipetta P200.
   NOTA: Assicurati di prendere nota del frame in cui il farmaco viene aggiunto per l'analisi a valle.

7. Analisi utilizzando il software delle Fiji

1. Apri l'applicazione Fiji e seleziona File \ Open, carica il file video e, nella finestra pop-up risultante, mantieni tutte le impostazioni predefinite.
2. Se desiderato, sotto Immagine \ Regola \ Luminosità/Contrasto, modifica la luminosità e il contrasto dei diversi canali di fluorescenza per avere la visuale più ottimale delle celle.
3. Per facilitare il tracciamento delle cellule, unisci i canali di colorazione nucleare o campo chiaro usando Image \ Colour \ Merge Channels e seleziona i file appropriati per ciascun singolo canale nel pop-up.
4. Per tracciare cellule specifiche basandosi sui confini cellulari e sulla colorazione nucleare, usa Analizza \ Strumenti \ ROI Manager e spunta sia la visualizzazione di tutte le etichette sia nel pop-up risultante.
5. Traccia con cura le celle usando lo strumento di selezione a mano libera e premi t per aggiungere una cella.
   NOTA: Assicurati che le celle siano tracciate in tutti e 4 gli angoli e al centro del video.
6. Una volta che tutte le celle sono state tracciate correttamente, nella scheda aperta con tutti i ROI, clicca su Più \ Multi Misura e premi OK sul pop-up risultante.
7. Copia l'intero foglio nel pop-up risultante intitolato Risultati in un file Excel.
   NOTA: Il foglio risultante avrà 6 sottotitoli (Area1, Mean1, Min1, Max1, IntDen1, RawIntDen1) per ogni ROI con un valore numerico dopo ciascuno, che corrisponde alla rispettiva cella tracciata. Il valore importante per l'analisi a valle sarà la media di ogni ROI.
8. Per monitorare la variazione tra l'intensità di fluorescenza, calcola la fluorescenza media durante la linea di base per ciascuna cellula e calcola la varianza percentuale. Gli esperimenti hanno tipicamente una varianza tra il 20% e il 30%.
   
9. Normalizzare tutte le letture dividendo i valori medi di intensità per la prima lettura della base per ciascuna delle cellule tracciate.
10. Crea una colonna aggiuntiva per il tempo in secondi, con il primo frame corrispondente al frame 0 e i punti temporali successivi che aumentano di 5, corrispondendo all'intervallo di 0,2 fps.
11. Copia i dati in un software di analisi e grafica e genera una curva di variazione della fluorescenza rispetto alla linea di base nel tempo.
    NOTA: Per generare grafici di massimi a singola cella, usa la funzione =MAX() in Excel per trovare il frame in cui si raggiunge la massima intensità di fluorescenza per ogni cella e traccia usando GraphPad Prism.

8. Analisi utilizzando la Calcium Suite

1. Usando Fiji, apri il file video e segui i passaggi 8.1 e 8.2.
2. Una volta ottimizzati i canali nucleare e verde per la visione, duplica un singolo fotogramma del video cliccando su Immagine \ Duplica. Nel pop-up risultante, deseleziona lo stack Duplicate Hyper. All'interno dello stesso pop-up, sotto canali, tipo 1. Salvalo come file immagine PNG.
3. Ripeti il passo 9.2 e sotto canali, tipo 2.
   Unisci le due immagini seguendo il passaggio 8.3. Carica l'immagine nella Cell-Pose GUI (Interfaccia Grafica Utente) per generare una maschera cellulare.
4. Carica l'immagine nella GUI di Cell-pose e segmenta usando la colorazione nucleare (Canale 1) e le colorazioni citoplasmatiche (Canale 2) selezionando il modello Cyto3.
5. Salva l'immagine come file PNG, poi apri il file PNG a Fiji e convertilo in file TIFF.
   NOTA: L'interfaccia grafica della posizione cellulare produce un file PNG in bianco e nero.
6. Apri sia il file della maschera che quello video nella Calcium Suite trascinando e rilasciando, poi clicca su Analizza dati per generare un grafico scaricabile, oltre a un file di .csv scaricabile contenente valori di intensità normalizzati e grezzi per tutte le cellule conteggiate dal software.

Risultati

Per misurare la mobilizzazione del calcio nelle cellule vive, le cellule Calu-3 o colture nasali primarie differenziate vengono incubate con un colorante intracellulare. Il cambiamento relativo del segnale dipendente dal calcio è misurato come un aumento della mobilitazione del calcio sia dalle riserve intracellulari di calcio sia dallo spazio extracellulare nel citosol. Un aumento sostenuto del calcio nel citosolo è rappresentato da un aumento della fluorescenza dopo che il thapsigargin...

Discussione

Questo articolo ha presentato metodi per analizzare la segnalazione del calcio a singola cellula in colture nasale e bronchiali primarie vive, nonché in una linea cellulare epiteliale stabile. Sia i cal-520 AM che i Fluo-4 AM sono indicatori utili del calcio in entrambi i configurazioni. Il Cal-520 AM è più sensibile poiché ha una resa quantistica superiore di 0,75 rispetto a Fluo-4 AM di 0,16 e un'affinità leggermente superiore per il calcio (il Kd del Cal-520 AM è 320 nM e il Fluo-4 AM...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
piastra a 24 pozzi	Thermofisher	142475
inserti transwell a 24 pozzi	Corning	CLS3470-48EA
Micropiastre in polistirene nero trasparente a 96 pozzi a 96 pozzi	Corning	3603
Cal-520 AM	AAT Bioquest	21130	Attribuito e conservato a -20&grad; C, sciolto nel DMSO
Software per la Suite del Calcio	Il codice può essere richiesto contattando il nostro gruppo di laboratorio
EMEM, 1xs	Wisent	320-005-CL	Conservato a 4°Deg; C
Siero fetale bovino	Wisent	080-450	Attribuito e conservato a -20&grad; C
Fluo-4 AM & nbsp;	AAT Bioquest	20550	Attribuito e conservato a -20&grad; C, sciolto nel DMSO
HEPES	Bioshop	HEP001.5	Conservato a temperatura ambiente
Hoechst	Thermofisher	H3570	Conservato a 4°Deg; C
Linea cellulare dell'adeoncarcinoma colorettale epiteliale umano	ATCC	HTB-55
Cloruro di magnesio	Sigma	7786-30-3	Conservato a temperatura ambiente
Micropiatto 35mm, fondo di vetro basso	Ibidi	80137	Conservato a temperatura ambiente
Soluzione penicillina-streptomicina	Wisent	450-200-EL	Conservato a 4°Deg; C
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Wisent	3111-010-CL	Conservato a temperatura ambiente
Cloruro di potassio	Sigma	7447-40-7	Conservato a temperatura ambiente
Probenecid	Thermofisher	P36400	Attribuito e conservato a -20&grad; C, solubile in acqua e nbsp;
Cloruro di sodio	Bioshop	SOD004	Conservato a temperatura ambiente
Thapsigargin	Thermofisher	T7458	Attribuito e conservato a -20&grad; C sciolto in DMSO
Enzima Triple Express (1X), fenolo rosso	Thermofisher	12605010	Conservato a 4°Deg; C