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Articolo metodologico

Un modello di trapianto endovenoso neonatale per la valutazione delle attività immunitarie precoce contro le cellule tumorali

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DOI:

10.3791/69478

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26 giugno 2026

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1Michael Cuccione Childhood Cancer Research Program, BC Children's Hospital Research Institute, 2Department of Pediatrics, University of British Columbia

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo dimostra l'iniezione temporale nelle vene per la somministrazione endovenosa di cellule tumorali pediatriche ai topi neonatali, consentendo una modellazione precisa e riproducibile delle risposte immunitarie precoce contro il cancro. Il metodo consente di valutare l'impatto degli interventi, come l'immunomodulazione o la terapia, quando applicati durante il periodo neonatale.

Abstract

Più della metà di tutti i tumori pediatrici si avvia in utero, con la progressione verso la malattia manifesta che prosegue durante il periodo neonatale. Sebbene le immunoterapie ora offrano nuove opzioni di trattamento per molti bambini con cancro, come l'immunità nella prima età influenzi la progressione del cancro e la risposta terapeutica rimane incompletamente compreso. Affrontare questa lacuna richiederà la valutazione degli interventi terapeutici durante il periodo neonatale, quando le risposte immunitarie differiscono fondamentalmente da quelle della tarda infanzia e dell'età adulta.

Qui descriviamo un modello di trapianto neonatale che si integra con l'imaging bioluminescente in vivo per indagare l'impatto della modulazione immunitaria precoce sulla cancro pediatrico.

L'iniezione nella vena temporale di cellule marcate con luciferasi derivate da due tumori in utero ha raggiunto l'ingrazione tumorale riproducibile in riceventi sintetici di 1–2 giorni fa, senza mortalità procedurale e con un alto successo procedurale confermato dall'imaging bioluminescente. Utilizzando la modulazione immunitaria guidata dall'infezione come variabile sperimentale, mostriamo poi che l'infezione intraperitoneale con citomegalovirus muro cinque giorni dopo il trapianto comporta una netta riduzione del carico della leucemia linfoblastica acuta (ALL), ma non del neuroblastoma (NB). Questa piattaforma consente lo studio delle differenze specifiche per cancro in risposta alla modulazione immunitaria nei primi anni di vita e sottolinea l'importanza del contesto tumorale nel modellare le interazioni immune-tumori nella prima infanzia.

Collettivamente, questa metodologia fornisce una piattaforma versatile e altamente riproducibile per analizzare i meccanismi immunitari neonatali rilevanti per l'immunosorveglianza del cancro, la modulazione immunitaria guidata da infezioni e l'intervento terapeutico. Oltre a ALL e NB, questo approccio può essere adattato a ulteriori neoplasie pediatriche e strategie immunomodulatrici, supportando studi meccanicistici e valutazioni precliniche degli interventi oncologici nella fase precoce della vita.

Introduzione

I recenti progressi nell'immunoterapia hanno migliorato notevolmente i risultati per alcuni pazienti oncologici, eppure la loro applicazione ottimale nei bambini piccoli richiede una comprensione approfondita di come il sistema immunitario in via di sviluppo identifichi ed eradica le cellule tumorali. Sebbene circa il 50% dei tumori infantili abbia origine in utero, inclusa la leucemia linfoblastica acuta a cellule B (B-ALL) e NB, le evidenze crescenti suggeriscono che gli eventi postnatali influenzano in modo critico l'evoluzione della malattia e l'esitoclinico 1,2.

Le risposte immunitarie neonatali differiscono quantitativamente e qualitativamente da quelle degliadulti 3. In assenza di un'immunità adattiva completamente sviluppata, la protezione dei neonati si basa fortemente sugli anticorpi materni e dalle cellule immunitarie innate. Questi effettori innati, tuttavia, sono funzionalmente meno efficienti rispetto ai loro omologhi adulti a causa dell'ipo-reattività intrinseca delle cellule e dell'attivazione aumentata delle vie immunosoppressive, rendendo i neonati particolarmente suscettibiliall'infezione 4,5,6. Tuttavia, l'impatto di queste caratteristiche sulla capacità del sistema immunitario immaturo di adottare risposte antitumorali efficaci rimane poco compreso.

Modellare l'immunità anticancro nella prima età richiede la somministrazione precisa e riproducibile di cellule tumorali e modulatori immunitari o patogeni durante la breve finestra postnatale, quando la funzione immunitaria è limitata. L'iniezione nella vena temporale è un metodo di somministrazione endovenosa neonatale (IV) che meglio soddisfa questi requisiti e offre un alto successo procedurale, bassa mortalità, stress da gestione minimo e compatibilità con interventi sequenziali, come la sfida infecciosa o la somministrazioneterapeutica 7,8,9,10.

In questo studio, abbiamo sviluppato e modificato tecniche di parto endovenoso neonatale precedentemente validate e la versatilità dell'imaging bioluminescente in vivo per descrivere un modello di trapianto volto a studiare l'impatto delle infezioni precoci sulla progressione delle cellule tumorali pediatriche. Questo approccio consente la somministrazione endovenosa di cellule B-ALL o NB marcate con luciferasi a cuccioli di 1–2 giorni, seguita da una modulazione immunitaria tramite somministrazione intraperitoneale (i.p.) del citomegalovirus murino (mCMV) al giorno postnatale 7 (P7). La progressione del cancro è stata successivamente valutata 10 giorni dopo l'infezione (P17).

Sebbene l'accesso alla vena temporale sia limitato a una finestra postnatale limitata (P0–P3), questa metodologia migliora la riproducibilità e il controllo sperimentale, offrendo una piattaforma versatile per indagare l'influenza dei meccanismi immunitari precoci sulla sorveglianza immunotumorale, sulle interazioni infezione–cancro e sulle risposte all'immunoterapia. Inoltre, questo approccio supporta l'efficiente homing delle cellule trapiantate, permettendo così l'istituzione riproducibile di modelli di malattie per indagini meccanicistiche.

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Protocollo

Tutte le procedure (Figura 1) sono state condotte in conformità con le linee guida del Canadian Council on Animal Care e sono state approvate dal Comitato per la Cura degli Animali dell'Università della British Columbia (protocollo A23-0169).

1. Generazione di cellule leucemiche marcate con luciferasi

  1. Isolamento delle cellule leucemiche da topi leucemici Eμ-Ret
    1. Anestetizzare i topi in una camera di induzione da 1 L con isoflurano al 5% e 1 L·min-1 ossigeno fino a raggiungere un piano chirurgico profondo (perdita del riflesso di raddrizzamento e respirazione lenta e regolare).
    2. Una volta confermata l'anestesia profonda, si interrompe l'isoflurano e si somministra anidride carbonica (CO₂) a una portata elevata (3–4 volte il tasso di spostamento graduale standard; ad esempio, 6-8 L·min per una camera da 10 L) senza trasferire l'animale tra le camere. Mantieni l'esposizione alla CO₂ per almeno 5 minuti dopo la cessazione della respirazione per garantire la morte.
    3. Ventila e recupera i gas di scarto prima di aprire la camera.
    4. Confermare la morte per assenza di battito cardiaco e respirazione, poi eseguire una lussazione cervicale come metodo fisico secondario secondo l'istituzione.
    5. Trasferire la carcassa in un armadietto di biosicurezza, riconfermare la morte, registrare sesso e peso corporeo e spruzzare l'esterno con etanolo al 70%.
    6. Fai un'incisione addominale mediana, rifletti la pelle e la parete peritoneale, e scindi la milza in un PBS sterile da 5 mL.
    7. Dissezionare tibia e femori da entrambe le gambe, rimuovendo tessuto in eccesso, e rimuovere la milza in condizioni sterili. Trasferire immediatamente la milza in una soluzione sterile e gelida di Fosfato Tamponato (PBS) da 5 mL per preservare la vitalità cellulare.
    8. Processa la milza.
      1. Omogeneizzare il tessuto della milza in 1 mL di tampone di lisi per globuli rossi (RBC) a 1× (usare 2 mL per la milza > 200 mg). Incubare per 2–3 minuti a temperatura ambiente.
      2. Tempre la lisi aggiungendo 10 mL di PBS + 2% di siero bovino fetale (FBS) (tampone FACS), filtrare attraverso un colino da 40 μm e centrifugare a 350 × g per 5 minuti a 4 °C.
      3. Sospezione del pellet per la milza in un buffer FACS da 5 mL.
    9. Processa il midollo osseo.
      1. Elimina entrambe le epifisi e risciacquo ogni osso con un tampone FACS da 1 mL utilizzando una siringa da 1 mL dotata di un ago calibro 29 in un tubo da 15 mL.
      2. Centrifugare la sospensione cellulare, scartare il sovrantantante e risospendere le cellule in 1 mL di tampone di lisi a 1× globuli rossi, incubare per 2 minuti a RT, temprare la lisi aggiungendo 10 mL di tamponamento FACS, filtrare attraverso un filtro da 40 μm e centrifugare a 350 × g per 5 minuti a 4 °C.
      3. Scartare il sovrantantante e risospendere il pellet BM in un buffer FACS da 1 mL pipettando su e giù.
      4. Vortice delicatamente e filtra attraverso un colino da 40 μm se necessario.
      5. Risospendere 0,5 × 10^6 cellule leucemiche in medi di coltura cellulare da 200 μL (ad esempio il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco) integrato con FBS al 20% e interleucina-7 (IL-7; 250 pg·mL-1).
        Punto di pausa: Tieni le sospensioni delle celle sul ghiaccio fino a 2 ore prima di tingere.
  2. Trasduzione lentivvirale delle cellule leucemiche:
    1. Seminare cellule stromali derivate dal midollo osseo murino a 1 × 10^5 cellule per pozzo in una piastra a 24 pozzi 24 ore prima della trasduzione per consentire l'aderenza e raggiungere una confluenza del 70–80%.
    2. Cellule leucemiche a placche (0,5 × 10^6 cellule in un volume finale di 200 μL) in una lamina a 24 pozzoli trattata senza coltura tissutale.
    3. Aggiungere un vettore lentivirale autoinattivante (SIN) che codifica un rapporto di doppia fusione costituito da luciferasi rosso coleottero clic (CBR) e proteina fluorescente verde potenziata (eGFP), alimentato da un promotore costitutivo dell'ubiquidina, con la molteplicità di infezione (MOI): 10–20, titolo virale: ≥ 1 × 10^8 TU·mL-1 (unità di trasduzione per millilitro) in un volume finale di trasduzione di 200 μL insieme al polibrene (8 μg·mL-1; Sigma, H9268-5G).
      ATTENZIONE: La polibrene è citotossica ad alte concentrazioni. Non superare 8 μg·mL-1. Maneggiare il lentivirus sotto contenimento di Biosafety Level 2 (BSL-2).
    4. Sigilla la piastra con parafilm e centrifuga a 1.200 × g per 20 minuti a temperatura ambiente (RT).
    5. Dopo la spinoculazione, trasferire le cellule leucemiche trasdotte su uno strato monomatico stromaico e coltura per 24 ore a 37 °C, 5% CO₂ in DMEM + 20% FBS + IL-7 (250 pg·mL-1) per supportare la sopravvivenza cellulare e l'espressione del reporter.
      NOTA: Gli antibiotici possono essere aggiunti dopo 24 ore se necessario, ma devono essere evitati durante la trasduzione virale.
    6. Dopo 24 ore, raccogliere cellule leucemiche non aderenti e lavare due volte con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS), 350 × g per 20 minuti a 4 °C, per rimuovere virus residui e polibrene.
    7. Risospendere le cellule in PBS sterile a 1 × 10^7 cellule·mL-1 per il trapianto.
      Punto di pausa: Dopo il lavaggio, le cellule possono essere mantenute nella stessa condizione di coltura fino a 48 ore prima del trapianto, se necessario.
  3. Trapianto in topi adulti NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)
    1. Usa topi NSG di 4–6 settimane come ricevitori.
    2. Riscalda il topo per 5 minuti usando un tappetino riscaldante o una lampada termica per dilatare le vene caudali.
    3. Trattieni il topo usando un contenitore acrilico.
    4. Iniettare 1 × 10^6 cellule in PBS sterile da 100 μL tramite vena caudale laterale utilizzando una siringa di insulina calibro 29. Nessuna anestesia richiesta (a meno che non sia richiesta dalle linee guida istituzionali)
    5. Applica una pressione delicata sul punto di iniezione per prevenire sanguinamento.
      ATTENZIONE: Evitare l'estravasamento. Un'iniezione endovenosa riuscita non provoca gonfiore visibile.
    6. Monitorare i topi due volte a settimana per lo sviluppo della malattia.
  4. Ordinamento delle celle leucemiche GFP+
    1. All'insorgenza della malattia, prelevare le mie o la milza da topi leucemici con NSG.
    2. Preparare una sospensione a cella singola come descritto sopra.
    3. Cellule di colorazione con colorante di vitalità (7-AAD).
    4. Utilizzare il Filtraggio Cellulare Attivato dalla Fluorescenza (FACS) per selezionare le cellule leucemiche GFP+.
    5. Per l'ordinamento si utilizza un classificatore di celle ad alta velocità e segui la strategia di gating di scatter frontale (FSC) vs side scatter (SSC) → escludere i detriti, FSC-A vs FSC-H → selezionare singoletti, colorante di vitalità negativo → selezionare cellule vive, gate GFP+ → isolare cellule leucemiche reporter-positive.
    6. Raccogliere le cellule ordinate in tubi contenenti DMEM + 20% FBS. Purezza obiettivo post-smistamento: ≥ 95% di celle GFP+.
      Punto di pausa: Le celle ordinate possono essere conservate sul ghiaccio fino a 2 ore prima della crioconservazione.
  5. Criopreservazione delle celle smistate
    1. Risospendere le cellule selezionate a 5 × 10^6 cellule/mL in un mezzo congelante contenente 90% FBS e 10% dimetilsolfosida (DMSO).
    2. Aliquota 1 mL per crioviale e posizionare le fiale in un contenitore congelante a base di isopropanolo e conservare a −80 °C durante la notte (12–18 ore).
    3. Trasferire le fiale in azoto liquido (LN₂) per la conservazione a lungo termine.
      ATTENZIONE: Il DMSO è tossico e facilmente assorbibile attraverso la pelle. Maneggia con i guanti e lavora velocemente.
      Punto di pausa: Le cellule possono essere conservate a lungo termine in azoto liquido fino all'uso in esperimenti di trapianto neonatale.

2. Generazione di cellule NB marcate con luciferasi

NOTA: I topi transgenici TH-MYCN sviluppano tumori NB spontanei e sono stati mantenuti secondo protocolli di cura animale istituzionali approvati. Il vettore lentivirale utilizzato è lo stesso descritto nella Sezione 1.2.

  1. Prelievo del tumore e dissociazione tissutale
    1. Eutanasia i topi portatori di tumori TH-MYCN secondo le linee guida approvate per la cura degli animali.
    2. Prelevare tumori NB sottocutanei o addominali in condizioni sterili.
    3. Pesa il tessuto tumorale e trita in frammenti di ~1–2 mm usando forbici sterili.
    4. Trasferire il tessuto in circa 5 mL di buffer digestionale per ogni 0,5 g di tessuto tumorale in un tubo conico da 15 mL, composto da DMEM, Dossiribonucleasi I (DNasi I; 50–100 U·mL-1) e miscela enzimatica a base di collagenasi (concentrazione finale di 10 μg·mL-1 ).
    5. Incubare a 37 °C in un incubatore a 150 giri/min per 30 minuti.
      ATTENZIONE: I reagenti digestivi enzimatici possono causare irritazione della pelle e degli occhi. Indossa guanti e protezione per gli occhi.
    6. Dopo la digestione, pipetta delicatamente su e giù per dissociare ulteriormente il tessuto. Filtrare la sospensione attraverso un filtro a 70 μm in un tubo nuovo.
    7. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente (20–22 °C).
    8. Scartare il supernatant e risospendere il pellet in DMEM integrato con il 10% di FBS.
    9. Eseguire la lisi dei globuli rossi utilizzando il buffer di lisi RBS come precedentemente descritto nella Sezione 1.1.
    10. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti e risospendere il pellet in 10 mL di DMEM ad alto contenuto di glucosio integrato con FBS al 10% e 50 μM di 2-mercaptoetanolo.
      ATTENZIONE: Il 2-mercaptoetanolo è tossico e volatile. Esegui la maneggezione in una cappa chimica.
      Punto di pausa: Le cellule possono essere mantenute sul ghiaccio per un massimo di 1 ora prima della trasduzione.
  2. Trasduzione lentivirale
    1. Pellet 2 × 10^6 cellule NB a 300 × g per 5 minuti e rimuovi completamente il soprandante.
    2. Risospendere la pellet cellulare direttamente in un vettore lentivirale concentrato a 14 μL (stesso vettore descritto nella Sezione 1.2; titolo virale ≥ 1 × 10^8 TU·mL-1, MOI approssimativo: 10–20).
    3. Incubare la miscela cellula-virus per 5 minuti a 37 °C in un incubatore umidificato (% CO₂).
    4. Aggiungere 200 μL di DMEM ad alto contenuto di glucosio + 10% di FBS e continuare l'incubazione per 2 ore a 37 °C, 5% CO₂.
      ATTENZIONE: I vettori lentivirali devono essere maneggiati in condizioni BSL 2.
    5. Lavare le cellule trasdotte quattro volte con DMEM ad alto contenuto di glucosio per rimuovere il virus residuo.
    6. Contare le cellule vitali usando l'esclusione blu di tripano.
      IMPORTANTE: Tieni sempre la preparazione della matrice sul ghiaccio per prevenire la gelificazione prematura.
  3. Impianto sottocutaneo nei topi NSG
    1. Sospendere le cellule a 5 × 10^6 cellule per 100 μL in una preparazione della matrice a membrana basale fredda (matrice extracellulare ridotta con fattore di crescita).
    2. Anestetizzare topi NSG di 6–8 settimane (vedi Sezione 1.1) usando isoflurano inalato (2–3% di ossigeno).
    3. Miscela cella-matrice in una siringa da 1 mL pre-raffreddata dotata di ago calibro 27.
    4. Iniettare 5 × 10^6 cellule con un volume totale di 100 μL sottocutaneamente nella regione del fianco.
    5. Monitorare i topi fino al recupero completo dall'anestesia.
      NOTA: Iniettare immediatamente dopo aver miscelato con la matrice per evitare la solidificazione all'interno della siringa.
    6. Lascia che i tumori crescano fino a ~1 cm di diametro.
  4. Ordinamento delle celle
    1. Prelevare tumori e generare sospensioni monocellulari come descritto nelle Sezioni 2.1–2.2.
    2. Arricchire le cellule marcate con luciferasi tramite FACS basandosi sull'espressione di GFP, seguendo la strategia di gating descritta nella Sezione 1.4.
    3. Esegui due cicli di selezione consecutivi per ottenere ≥ purezza positiva al 95% di GFP.
  5. Crioconservazione
    1. Cellule selezionate per criopreservazione come descritto nella Sezione 1.5.
      Punto di pausa: Le cellule possono essere conservate a lungo termine in azoto liquido per futuri esperimenti di trapianto.

3. Preparare la sospensione cellulare per l'iniezione della vena temporale

  1. Lo scongelamento ha preservato rapidamente cellule leucemiche marcate con luciferasi o cellule NB in un bagno-maria a 37 °C finché non rimane un piccolo cristallo di ghiaccio.
  2. Disinfettare immediatamente l'esterno della fiala con il 70% di etanolo, poi trasferire il contenuto in 9 mL di mezzo DMEM preriscaldato + 10% FBS in un tubo conico da 15 mL.
  3. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C, aspirare il soprantantante e risospendere il pellet in PBS sterile e gelido.
  4. Determina la vitalità usando l'esclusione del blu di tripano e un emocitometro (o contatore cellulare automatico). Usa solo sospensioni con ≥ 80% di vitalità.
  5. Fai passare la sospensione della cella attraverso un colino da 40 μm per rimuovere i grumi.
    ATTENZIONE: Gli ammassi cellulari aumentano le iniezioni fallite e le lesioni tissutali.
  6. Regolare la concentrazione per preparare 20 μL per neonato contenente 1 × 10^4 cellule leucemiche (per il trapianto leucemico), oppure 5 × 10^4 cellule NB (per il trapianto di NB).
  7. Tieni la sospensione cellulare sul ghiaccio e mescola delicatamente subito prima di caricare la siringa per mantenere l'omogeneità.
    Punto di pausa: Tieni le cellule sul ghiaccio fino a 2 ore prima dell'iniezione se la vitalità rimane ≥ 80%.

4. Iniezione nella vena temporale (cuccioli P1–P2)

NOTA: L'iniezione neonatale nella vena temporale può essere eseguita senza anestesia. Tuttavia, l'immobilizzazione ipotermica breve è comunemente utilizzata per ridurre i movimenti e migliorare la precisione dell'iniezione. L'uso dell'immobilizzazione ipotermica non è consentito da alcuni comitati istituzionali per la cura degli animali - i ricercatori devono consultare il comitato istituzionale competente prima di eseguire questa procedura. Se approvati dalla tua istituzione, i seguenti passaggi sono efficaci per l'immobilizzazione ipotermica.

  1. Prepara un piccolo contenitore fodetratto con un tovagliolo sterile e raffreddalo sul ghiaccio.
  2. Mettere i cuccioli (giorno postnatale 1–2; P1–P2) sul tovagliolo all'interno del contenitore per l'immobilizzazione ipotermica per 2–3 minuti fino a quando il movimento spontaneo non si riduce notevolmente.
    IMPORTANTE: Non permettere ai cuccioli di entrare in contatto diretto con il ghiaccio (usa sempre il contenitore e la barriera per tovaglioli).
  3. Carica 60 μL della sospensione a celle in una siringa di vetro da 100 μL e fissa un ago da 30 gauge. Espelle la sospensione di nuovo nel tubo per riempire il volume morto della siringa e dell'ago. Una volta che il volume morto è stato preparato, aspirare 20 μL di sospensione della cella per l'iniezione, assicurandosi che non ci siano bolle d'aria. Utilizzare topi BALB/c e TH-MYCN come destinatari rispettivamente delle cellule leucemiche e NB.
  4. Prepara un palco trasilluminato posizionando una fonte di luce fredda sotto una piattaforma in plexiglass.
  5. Indossa occhiali ingranditori (o usa uno stereomicroscopio) per visualizzare il sito di iniezione.
  6. Posiziona un tovagliolo sterile con un foro centrale sul palco e posiziona il cucciolo in modo che la vena temporale sia visibile.
  7. Metti un piccolo pezzo di plastilina (pasta modellabile) accanto alla testa del cucciolo per aiutare a stabilizzare l'ago durante l'iniezione.
  8. Inserire il bisello a ago nella vena temporale visibile e iniettare lentamente la sospensione cellulare, osservando il riempimento vascolare per confermare il successo della somministrazione endovenosa.
  9. Dopo l'iniezione, applica una pressione delicata sul sito di iniezione usando un cotton fioc sterile. Posiziona il cucciolo su una superficie di recupero riscaldata (circa 37 °C, ad esempio un cuscinetto riscaldante a bassa temperatura con una barriera per asciugamani) finché il movimento normale e la colorazione rosa non ritornano.
  10. Monitorare il cucciolo per 5–10 minuti dopo il recupero, poi riportarlo alla diga.
    ATTENZIONE: Evita di surriscaldarti durante il recupero. Usa uno strato barriera e monitora continuamente.
  11. Risciacquo subito la siringa con PBS, poi con una soluzione detergente per la siringa, e concludi con etanolo al 70%.

5. Preparazione e infezione del virus

  1. Eseguire tutte le procedure che coinvolgono il citomegalovirus murino (mCMV) sotto contenimento BSL-2 in conformità con le approvazioni istituzionali per la biosicurezza e la cura degli animali.
  2. Maneggiare le scorte di virus in un armadietto di sicurezza biologica certificato Classe II e eseguire le infezioni animali nelle aree di procedura BSL-2 designate.
  3. Svolgere la preparazione e la gestione del virus in un armadietto di sicurezza biologica certificato Classe II e eseguire le infezioni animali nelle aree di procedura BSL-2 designate.
  4. Indossa DPI appropriati, tra cui camice da laboratorio o camice usa e getta, guanti e protezione per gli occhi. Considera tutti i materiali contenenti virus (siringhe, biancheria da letto, gabbie e superfici) come potenzialmente contagiosi.
  5. Riduci al minimo l'uso di oggetti pungenti e smalti immediatamente gli aghi in contenitori approvati per quelli per i prodotti biologici taglienti. Decontamina superfici di lavoro e attrezzature dopo l'uso. Smaltire tutti i rifiuti solidi e liquidi come rifiuti biopericolosi secondo le procedure istituzionali.
  6. Infettare i topi a P7 (5–6 giorni dopo il trapianto di cellule leucemiche).
  7. Scongela un virus aliquota sul ghiaccio, mescola delicatamente per inversione e lascia sul ghiaccio durante la preparazione. Evitare cicli ripetuti di congelamento-disgelo (usa aliquote monouso).
  8. Preparare mCMV a 2 × 10^5 unità formative di placca (PFU)/mL in PBS e iniettare i pup intraperitonealmente (i.p.) con 1 × 10^4 PFU in PBS da 50 μL usando un ago da 30 gauge. Iniettare nel quadrante inferiore destro dell'addome con un angolo ridotto per evitare gli organi addominali.
    ATTENZIONE: il mCMV è infettivo (BSL-2). Utilizzare un contenimento e una decontaminazione appropriati.
  9. Annota l'identificazione animale, l'età, il gruppo sperimentale, la dose del virus, il volume e i dettagli delle iniezioni.

6. Imaging bioluminescenza (BLI)

NOTA: Eseguire BLI a P7 (5–6 giorni dopo l'iniezione cellulare e prima dell'infezione) e a P17 (10 giorni dopo l'infezione) come descritto di seguito.

  1. Sciogliere la D-Luciferina in PBS a 10 μg·μL-1. Filtrare sterilizzando con un filtro da 0,22 μm, aliquota, e conservare a −20 °C protetto dalla luce.
    ATTENZIONE: La D-luciferina è fotosensibile. Minimizza l'esposizione alla luce durante la preparazione e l'uso.
  2. Iniettare D-luciferina i.p. a 50 μL per cucciolo usando un ago calibro 30.
  3. Anestetizzare i cuccioli con isoflurano (induzione 3–4%, mantenimento 1,5–2%) in ossigeno (0,8–1,0 L·min-1). Mantenere la temperatura corporea su un palcoscenico di imaging riscaldato (circa 37 °C).
    ATTENZIONE: L'isoflurano è un anestetico volatile. Usa un vaporizzatore e un sistema di recupero approvati.
  4. Inserire i cuccioli anestetizzati in un sistema di imaging per piccoli animali (dettagli dello strumento forniti nella Tabella dei Materiali).
  5. Acquisire immagini bioluminescenti e a raggi X utilizzando impostazioni di esposizione costanti 10 minuti dopo l'iniezione di D-luciferina (impostazioni BLI: tempo di esposizione 120 s per immagini P7 e 30 s per P17, binning B4 per immagini P7 e B4 per immagini P17, campo visivo (FOV) 25, stop 1,2, altezza oggetto 1,5 e impostazioni raggi X: risoluzione alta, potenza alta).
    Punto di pausa: Memorizzare i file delle immagini immediatamente dopo l'imaging; L'analisi può essere completata successivamente.
  6. Analizza le immagini utilizzando un software di imaging BLI appropriato definendo le regioni di interesse (ROI) che comprendono l'intero corpo di ciascun mouse e quantificando la luce emessa come fotoni·s⁻1·cm⁻2·sr⁻1.
  7. Esportare valori quantificati del ROI per analisi statistiche a valle.

7. Prelievo di cellule leucemiche da topi trapiantati di cellule

  1. Prelevare cellule leucemiche e generare sospensioni a singola cellula come descritto nella Sezione 1.1.

8. Colorazione e acquisizione della citometria di flusso

  1. Contare le celle e le sospensioni centrifughe a 300 × g per 5 minuti a 4 °C e risospendere a 1 × 10^7 cellule·mL-1 nel buffer FACS.
  2. Trasferire 100 μL (1 × 10^6 celle) in tubi di citometria a flusso di polistirene.
  3. Aggiungi un anticorpo bloccante dei recettori Fc (anti-CD16/32; 1 μL per sondetto) e incuba per 5 minuti a temperatura ambiente.
  4. Preparare il master mix di anticorpi nel buffer FACS e aggiungere a ogni tubo CD19-FITC, BP1-PE, B220-APC e marcatori negativi per la linea di lignaggio (TER119-PerCP, CD3-PerCP, CD11b-PerCP), 1 μL di ciascun anticorpo per 1 x 10^6 cellule in un buffer FACS da 100 μL.
  5. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente al buio.
  6. Lavare con un tampone FACS da 5 mL, centrifugare e risospendere in un tampone FACS da 200 μL contenente 7-AAD (3 μL) e sfere di conteggio (6 μL; 6.000 sfere).
  7. Prepara controlli di compensazione singolarmente colorati utilizzando sfere o cellule di cattura di anticorpi e acquisisci controlli insieme a campioni sperimentali.
  8. Acquisire campioni su un citometro di flusso utilizzando le impostazioni standard del rivelatore FITC/PE/APC/PerCP e una portata media. Raccogli eventi fino ad acquisire 1.000 perline.
  9. Esportare file FCS e analizzarli utilizzando software di analisi di citometria a flusso (elencato nella Tabella dei Materiali) utilizzando la strategia di gating stabilita (Figura 2D).
  10. Calcola il numero assoluto di cellule per milza o midollo osseo usando le sfere di conteggio moltiplicando il numero di eventi target acquisiti a 1.000 perle per un fattore di scala di 6 (aggiunte 6.000 sfere), e normalizzando alla cellularità totale dell'organo in base alla frazione di cellule colorate (1 × 10^6 cellule).

9. Tracciare grafici e analisi statistica

NOTA: Generare grafici ed eseguire analisi statistiche per dati BLI e citometria di flusso utilizzando un pacchetto software statistico (elencato nella Tabella dei Materiali).

  1. Presenta i dati come media ± errore standard della media (SEM).
    NOTA: Nessun animale è stato escluso da questo studio.
  2. Per il BLI, confrontare separatamente i gruppi PBS e mCMV a P7 e P17 utilizzando test di Mann–Whitney non accoppiati, con la correzione di Holm–Šídák applicata per adeguare i confronti multipli tra i momenti temporali.
  3. Analizza i risultati della citometria a flusso utilizzando un test di Mann–Whitney a due code senza coppia.
  4. Definisci la significanza statistica come p < 0,05.

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Risultati

L'iniezione temporale nelle vene consente un efficiente rarrozione neonatale di leucemia e neuroblastoma
Per modellare l'impatto delle infezioni precoci sulla progressione del cancro pediatrico, cellule B-ALL marcate con luciferasi derivate da topi Eμ-Ret adulti leucemici o cellule NB derivate da topi Th-Mycn moribundi sono state somministrate per via endovenosa tramite la vena temporale in cuccioli sintetici di 1–2 giorni di vita. L'ingertamento riuscito è stato conf...

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Discussione

Comprendere come lo sviluppo immunitario precoce influenzi la progressione del cancro è essenziale per progettare strategie immunomodulatrici adeguate all'età. In questo studio, descriviamo una piattaforma di trapianto neonatale riproducibile che consente un controllo temporale preciso dell'ingerto delle cellule tumorali e della modulazione immunitaria durante una finestra critica di immaturità immunitaria postnatale. Combinando la somministrazione endovenosa mediata dalle vene temporali...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro fu sostenuto da sovvenzioni operative dei Canadian Institutes of Health Research a G.S.D.R. (MOP-126122). A.F. ha ricevuto una borsa di studio post-dottorato del Michael Cuccione Childhood Cancer Research Program (MC3RP).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
100µL, Microliter Syringe, Luer Tip Hamilton  80601 -
30 G Needle  BD  305106 -
7-AAD Biolegend 420404 - 
Ami-X imaging system Spectral Instruments Imaging - - 
anti-mouse B220- APC Biolegend 103212  -
anti-mouse CD19-FITC Biolegend 152404  -
anti-mouse CD3ε- PerCPBiolegend  100326 - 
anti-mouse Ly-51-PEBiolegend  108308 Anche chiamato BP1 
anti-mouse TER119- PerCP  Biolegend 116226 - 
anti-mouse/human CD11b- PerCP Biolegend 101230 - 
Aura software Spectral Instruments Imaging - versione 4.0.8
BD Accuri C6  BD- - 
BD Fortessa X-20  BD- - 
Cleaning solution Hamilton 18310  -
CountBright Absolute Counting Beads Invitrogen by Thermo Fisher Scientific 2770930 6 µL contiene 6000 perline 
D-Luciferin GoldBioeLUCK-1G- 
DMEMGibco11965092-
DNase ISigma1.13E+10-
Falcon 40µm Cell Strainer, Blue, Sterile, Individually Packaged FALCON 352340 - 
FBSGibcoA5256701- 
FlowJo software BD- v10.8
GeltrexTMThermo Fisher Scientific A1413202- 
GraphPad Prism software Dotmatics- v10.4.1
LE.5209 Cold light source Euromex -- 
Liberase™ TM Research GradeSigma5.4E+09-
NSG miceJackson Labrotary5557NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ
PolybreneSigmaH9268-5G-
Purified anti-mouse CD16/32 AntibodyBiolegend 101301- 
RBC Lysis Buffer (10X)Biolegend 420301- 

Riferimenti

  1. Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nat Rev Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
  2. Hwee, J., et al. A systematic review and meta-analysis of the association between childhood infections and the risk of childhood acute lymphoblastic leukaemia. Br J Cancer. 118 (1), 127(2018).
  3. Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
  4. Tsafaras, G. P., Ntontsi, P., Xanthou, G. Advantages and Limitations of the Neonatal Immune System. Front Pediatr. 8, 5(2020).
  5. Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune Responses in Neonates. Expert Rev Clin Immunol. 10 (9), 1171-1184 (2014).
  6. Levy, O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates. Nat Rev Immunol. 7 (5), 379-390 (2007).
  7. Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous Injections in Neonatal Mice. J Vis Exp. (93), e52037(2014).
  8. Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread Gene Delivery and Structure-Specific Patterns of Expression in the Brain after Intraventricular Injections of Neonatal Mice with an Adeno-Associated Virus Vector. J Virol. 75 (24), 12382-12392 (2001).
  9. Wasala, L. P., Hakim, C. H., Yue, Y., Yang, N. N., Duan, D. Systemic Delivery of Adeno-Associated Viral Vectors in Mice and Dogs. Methods Mol Biol. 1937, 281-294 (2019).
  10. Glascock, J. J., et al. Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular (ICV) and Intravenous (IV) Injection in Mice. J Vis Exp. (56), e2968(2011).
  11. Farrokhi, A., et al. Early-life infection depletes preleukemic cells in model of hyperdiploid B-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 144 (8), 809-821 (2024).
  12. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Anim. 40 (5), 155-160 (2011).
  13. Pavathuparambil, A. M. N., et al. Facial vein injection of human cells in severe combined immunodeficiency (SCID) neonatal mice. MethodsX. 5, 1281-1286 (2018).

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