Articolo metodologico

Approccio multimodale per valutare la rigenerazione ossea e le prestazioni dell'impalcatura

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DOI:

10.3791/69483

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13 febbraio 2026

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1Institute of Biomedical Sciences, Federal University of Rio de Janeiro, 2Department of Condensed Matter, Applied Physics and Nanoscience, Brazilian Center for Research in Physics, 3Alberto Luiz Coimbra Institute for Graduate Studies and Research in Engineering (COPPE), Federal University of Rio de Janeiro, 4Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM)

In questo articolo

Sommario

Proponiamo un protocollo per valutare la rigenerazione ossea a vari livelli gerarchici. Questo approccio multimodale consente un'analisi strutturale su diverse scale di lunghezza, affrontando efficacemente le sfide nella preparazione del campione. Fornisce inoltre un flusso di lavoro affidabile per valutare l'efficacia dei biomateriali nel promuovere la rigenerazione ossea.

Abstract

Il successo clinico di un impianto dipende in gran parte dalla sua capacità di promuovere la riparazione ossea e facilitare l'osteointegrazione. Sebbene siano stati fatti progressi significativi nella progettazione di nuove impalcatura, una valutazione approfondita del successo dell'impianto a varie scale di lunghezza ossea non è stata sufficientemente indagata. L'osso è un tessuto gerarchicamente organizzato, con una struttura intricata che spazia dall'organizzazione delle fibrille di collagene e la loro mineralizzazione a scala nanometrica e micrometrica fino all'organizzazione macroscopica dell'osso compatto e cancelloso. Questa organizzazione gerarchica è fondamentale per garantire la funzione ossea e le prestazioni meccaniche. In questo contesto, una valutazione completa degli effetti dei biomateriali sulla riparazione ossea su più scale di lunghezza è essenziale per valutare l'efficacia e la sicurezza dei materiali impiantati. Tuttavia, preparare campioni per analisi multimodali integrate rappresenta una sfida tecnica. In questo lavoro, presentiamo un protocollo progettato per valutare la rigenerazione ossea su vari livelli gerarchici e analizzare l'interfaccia tra l'osso appena formato e l'impalcatura impiantata. Questo approccio fornisce un metodo robusto per valutare l'efficacia delle impalcature nell'induzione della riparazione ossea. La combinazione di tecniche selezionate di imaging 3D e 2D è cruciale per una corretta valutazione del complesso tessuto mineralizzato che si forma durante il processo di guarigione ossea

Introduzione

L'osso è un tessuto complesso e gerarchicamenteorganizzato 1,2. Comprendere la sua organizzazione strutturale è essenziale per affrontare questioni fondamentali relative a come le cellule contribuiscano all'architettura tissutale e a come i cambiamenti strutturali influenzino la funzionemeccanica 3. In questo contesto, il rimodellamento osseo dopo un infortunio rimane un argomento centrale di indagine. La guarigione della frattura è un processo complesso a più stadi, che inizia con una risposta infiammatoria iniziale, seguita dall'angiogenesi e dalla differenziazione delle cellule progenitrici in condrociti e osteoblasti 4,5. Molto è stato dibattuto riguardo al ruolo dei biomateriali nello stimolare l'osteointegrazione, in particolare sulla biocompatibilità e sulla loro capacità di prevenire l'incapsulamentofibroso 6.

Un metodo comunemente adottato per valutare l'osteointegrazione stimolata dai biomateriali è la microscopia ottica, che consente sia analisi istologiche quantitative che qualitative. Questo approccio si è dimostrato un modo affidabile ed efficace per valutare il successo degli impiantiossei 7,8. Tuttavia, diverse questioni legate all'organizzazione gerarchica ossea non possono essere esplorate utilizzando un unico approcciodi imaging 3, in particolare quello istologico, che è limitato almeno in parte dalla restrizione di ingrandimento del metodo.

I progressi nell'imaging tridimensionale si sono dimostrati essenziali per comprendere l'organizzazione gerarchica delle ossa. Tecniche come la tomografia microcomputerizzata (microCT; sia radiazione sincrotrone che sorgenti convenzionali a raggi X di laboratorio)9,10,11, la microscopia elettronica a doppio fascio (FIB-SEM) associata alla tomografia slice-and-view 12,13,14 e la tomografia elettronica a trasmissione 15,16 hanno fornito nuove intuizioni sull'architettura ossea su molteplici scale.

Basandosi su diversi approcci di imaging 3D, è stato proposto un modello di organizzazione gerarchica ossea, che inizialmente identificò nove livelli distinti di organizzazione strutturaleossea. Questo schema è stato recentemente rivisto ed ampliato per includere circa 12 livelli gerarchici, servendo come prezioso riferimento per esplorare la relazione tra struttura e funzione nel tessutoosseo 2,17. È importante sottolineare che questo modello gerarchico proposto fornisce una base per valutare il successo della riparazione ossea dopo un infortunio. Valutare se il tessuto osseo rigenerato riproduce la struttura gerarchica nativa è uno standard chiave per valutare la qualità della guarigione ossea, soprattutto quando vengono utilizzati biomateriali all'interno del sito danneggiato.

Sebbene l'uso di tecniche di imaging multiple per studiare l'organizzazione ossea sia statodiscusso 6,7,18,19,20, poco è stato esplorato riguardo a un flusso di lavoro che integri diverse modalità di imaging per valutare l'organizzazione dei minerali ossei su più scale spaziali. Come detto, l'osso è un tessuto composito complesso, costituito da una fase organica (cellule, collagene e macromolecole) e una matrice mineralizzata. Dal punto di vista della preparazione del campione, questa complessità presenta sfide tecniche riguardo alla permeazione del solvente attraverso il campione, alla sezionazione di un campione duro e all'integrazione di diverse strategie di imaging sullo stesso campione.

L'innovazione chiave in questo lavoro è l'istituzione di un flusso di lavoro di imaging riproducibile, correlativo e multiscala utilizzando tecniche di imaging tridimensionale e complementari. Come illustrato nella Figura 1A, il flusso di lavoro è progettato in modo che lo stesso campione possa essere esaminato sequencialmente utilizzando diverse modalità di imaging. Poiché alcune di queste tecniche sono distruttive o richiedono la sezionazione, il flusso di lavoro segue un ordine che inizia con metodi non distruttivi e prosegue verso metodi che prevedono il taglio o la rimozione del materiale.

Questo flusso di lavoro di preparazione e analisi del campione è ampiamente applicabile a campioni duri o mineralizzati, inclusi ossa corticali e trabecolari, impalcature pre-impianto e la valutazione dell'interfaccia osso/biomateriali dopo l'impianto. Combinando modalità di imaging che coprono diversi campi visivi e intervalli di risoluzione (Figura 1B), il flusso di lavoro consente l'analisi dei campioni dalla scala centimetrica fino alle scale micrometriche e nanometriche. Sebbene la sequenza sia ottimizzata per supportare l'analisi correlativa di un singolo campione, ogni tecnica può essere applicata indipendentemente in base all'obiettivo sperimentale. Questo approccio consente una valutazione dettagliata dell'osteointegrazione dei biomateriali e della crescita ossea rigenerata nell'area di guarigione.

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Protocollo

I risultati presentati in questo protocollo sono stati ottenuti da una procedura sperimentale condotta in uno studioprecedente 21. Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida etiche del Comitato Etico per l'Uso e la Cura degli Animali Sperimentali presso l'Università Federale Fluminense, Brasile (CEUA/UFF: 779). Brevemente, 20 maschi di ratti Wistar del peso compreso tra 300 e 400 g sono stati assegnati casualmente in due gruppi: impianto sham e cHA-microsphere. Tutti gli animali furono sottoposti a interventi chirurgici in cui si creò un difetto di 2 mm nella diafisi tibiale. Il gruppo Sham ha servito come controllo dei coaguli per valutare la rigenerazione ossea in un difetto non critico, mentre il gruppo sperimentale ha ricevuto microsfere CHA37 impiantate nel sito del difetto. Dopo 7 e 21 giorni, gli animali sono stati soppressi con un'overdose di anestesia generale, e sono stati raccolti blocchi tibiali da ciascun gruppo e momento (7 e 21 giorni). La qualità ossea e l'estensione dell'osso appena formato sono state valutate tramite microscopia ottica e microtomotomotomografia.

1. Fissazione del campione e incorporamento della resina

  1. Immediatamente dopo l'eutanasia, rimuovere la tibia contenente il biomateriale impiantato e trasferirla in una fiala contenente soluzione fissativa di Karnovsky (2,5% glutaraldeide, 4% formaldeide in tampone cacodilato 0,1 M). Conserva il campione a -4 °C per almeno 1 giorno.
    NOTA: Prepara e maneggia il fissativo sotto una cappa per prevenire l'esposizione a sostanze volatili. Tutte le manipolazioni chimiche devono essere eseguite utilizzando dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati, e devono essere adottate ulteriori misure tecniche di sicurezza ogni volta che necessario.
  2. Trasferire il campione dal fissativo a una fiala contenente 0,1 M di tampone cacodilati. Mantieni il campione sotto una rotazione delicata, cambiando il buffer 2 volte a intervalli di 10 minuti. In questa fase, si possono tagliare i bordi del campione con una piccola sega per facilitare l'infiltrazione della resina. Quando si taglia il campione, si mantieni umido nel tampone cacodilato di 0,1 M per evitare che si secchi.
    NOTA: Tieni sempre il campione in un volume buffer almeno 2 volte il volume del campione. Questo dovrebbe essere seguito per tutte le soluzioni e le resine utilizzate in questo protocollo. Quando si maneggiano i componenti chimici sopra menzionati, lavora all'interno di una cappa e indossa i DPI appropriati. Raccogli la soluzione fissativa e i rifiuti del tamponamento cacodilato in contenitori chiaramente etichettati, chimicamente compatibili, con tappi adeguatamente montati. Segui le Procedure Operative Standard (SOP) istituzionali per lo stoccaggio e lo smaltimento sicuro dei rifiuti chimici pericolosi.
  3. Inizia il processo di disidratazione utilizzando concentrazioni crescenti di acetone (10%, 30%, 50%, 70%, 90% e 100%). Tieni il campione sotto rotazione per 30 minuti a ogni concentrazione. Ripeti il passo con acetone 100% anidro 3 volte.
    NOTA: Quando si maneggia l'acetone, lavora all'interno di una cappa e indossa DPI appropriati. Dopo averlo utilizzato, raccogli eventuali residui di solvente in contenitori di rifiuti chiaramente etichettati e chimicamente compatibili con tappi adeguatamente montati. Segui i protocolli standard istituzionali per lo stoccaggio e lo smaltimento sicuro dei rifiuti chimici pericolosi.
  4. Infiltrarsi con resina a sperone trasferendo il campione attraverso una serie di rapporti acetone-resina gradiati: 2:1, 1:1, 1:2, e infine resina pura. Ogni passaggio dovrebbe durare 12 ore ed essere eseguito a rotazione a temperatura ambiente. Dopo l'infiltrazione da acetone a resina graduale, cambiare la resina pura due volte. Infine, trasferire il campione in uno stampo contenente resina pura e polimerizzare il campione a 70 °C per 24 ore.
    NOTA: La resina è stata preparata secondo la scheda tecnica per ottenere una durezza media. Quando si maneggia la resina di sperone, lavora all'interno di una cappa e indossa DPI adeguati. Dopo l'uso, raccogliere eventuali residui in contenitori di rifiuti chiaramente etichettati e chimicamente compatibili con tappi adeguatamente montati. Segui i protocolli standard istituzionali per lo stoccaggio e lo smaltimento sicuro dei rifiuti chimici pericolosi.

2. Visualizzazione del campione tramite tomografia a raggi X microcomputerizzata (microCT)

NOTA: la microCT viene utilizzata per valutare il posizionamento dell'impianto e la rigenerazione ossea. Aiuta anche a identificare potenziali regioni di interesse per ulteriori analisi. Questo passaggio dovrebbe essere eseguito con il campione incorporato nella resina.

  1. Utilizzare un portacampioni fornito dal produttore come base, assicurandosi che il campione sia posizionato in modo sicuro per prevenire movimenti durante la scansione. Utilizzare materiali a bassa densità per il supporto, come polistirene, garze o tubi a microcentrifuga.
  2. Visualizza usando i seguenti parametri ottimali di scansione: tensione/corrente del tubo = 60 kV/133 mA; passo angolare = 0,33°; media frame = 5; dimensione voxel = 5 μm; modalità di rotazione = 180°. Per i campioni contenenti impianti metallici, si utilizza una rotazione di 360° e un filtro in alluminio da 0,5 mm.
    NOTA: Durante la rigenerazione ossea, lo spessore dell'osso intrecciato simile a un trabecolare rientra tipicamente nei limiti di risoluzione dell'imaging microCT convenzionale. Per quantificare accuratamente i parametri morfometrici convenzionali dell'osso trabecolare, come lo spessore, la separazione e il numero trabecolare, si raccomanda di utilizzare la dimensione voxel più piccola (5 μm come specificato). Se la Regione di Interesse (ROI) supera il Campo Visivo (FOV) a questa risoluzione nominale, si utilizza prima la funzione multiscan per tilare il ROI. Considera di aumentare la dimensione del voxel solo come ultima risorsa se il ROI non può essere catturato tramite multiscan.
  3. Dopo la scansione, i dati grezzi di acquisizione consistono in una serie di file immagine numerati. Eseguire la ricostruzione utilizzando il software fornito dal produttore, con particolare attenzione alla minimizzazione degli artefatti nella regione di interesse del campione.
    NOTA: È comune incontrare artefatti delle immagini lungo i bordi delle immagini, in particolare in aree che non verranno analizzate. Il volume finale può essere ritagliato utilizzando il software del produttore per eliminare queste regioni.
  4. Analizza il volume ricostruito utilizzando varie opzioni software di visualizzazione 3D, come Avizo, VGStudio Max, CTVox e Dragonfly22. Applica filtri digitali per le immagini per rimuovere artefatti. In questo caso, si utilizza il metodo della Denoising dei Mezzi Non Locali a questoscopo 19.
    NOTA: Non locale Means Denoising i valori di levigatura del filtro dovrebbero essere mantenuti il più bassi possibile, per non ostacolare i dettagli importanti dell'interfaccia.

3. Preparazione del campione per la microscopia ottica

  1. Seleziona la direzione di sezionamento del campione in base all'obiettivo sperimentale. La tibia può essere sezionata sia trasversalmente che longitudinalmente lungo l'asse lungo dell'osso. Utilizzare la sezione trasversale per produrre sezioni seriali che coprono l'intero volume del difetto. La sezionazione longitudinale è appropriata per valutare la rigenerazione ossea lungo la direzione dell'asse lungo. Tuttavia, questo approccio fornisce solo una singola sezione del difetto.
    1. Utilizzare un disco a sega diamantata a bassa velocità per sezionare il campione in fette da 1 mm, seguendo la strategia sperimentale.
      NOTA: Si consiglia di usare un disco diamantato con uno spessore compreso da 0,006 a 0,012 pollici. Le lame più sottili permettono tagli altamente precisi, con una perdita minima di materiale dovuta allo spessore della lama.
    2. Riempi il serbatoio del liquido finché il livello del liquido non copre il bordo inferiore della lama.
      NOTA: L'acqua distillata è adatta per i campioni di ossa. Tuttavia, se si prevede un riscaldamento eccessivo, come per campioni contenenti impianti metallici, si utilizza l'olio fornito dal produttore dell'apparecchiatura per riempire il serbatoio.
    3. Fissa il campione al portacampioni e fissalo al braccio dello strumento. Assicurati che il campione sia stabile e orizzontale rispetto alla superficie del disco. Usa le manopole di posizionamento per regolare la regione del taglio del campione al disco.
    4. Inizia a tagliare il campione usando impostazioni di velocità più alte (210 - 250 RPM) e applica una pressione bassa finché non si forma un'incavazione sul campione. Poi, riduci la velocità (a 93 - 124 RPM) per completare la sezionatura in modo fluido e prevenire eccessive vibrazioni.
    5. Ferma la sega immediatamente dopo il taglio. Regolare correttamente il sistema per assicurarsi che il taglio cessi non appena il campione viene staccato dal blocco originale.
  2. Esamina il campione usando uno stereomicroscopio. Si inizia con un ingrandimento basso (ad esempio, 5x-10x) per ispezionare l'intero campione, poi aumenta l'ingrandimento (ad esempio, 20x-40x) per selezionare la regione di interesse in base alla domanda scientifica. L'esatto intervallo di ingrandimento può variare a seconda dello strumento utilizzato. In questo lavoro, sono state selezionate per ulteriori analisi le regioni che mostrano una maggiore densità di interfacce tra l'osso appena formato e il biomateriale.
  3. Montaggio campione per diluire
    1. Monta il campione su un supporto per facilitare la corretta manipolazione durante la lucidatura. Se il campione è destinato esclusivamente all'analisi microscopica ottica, fissalo direttamente a un coperto di plastica usando la supercolla sul lato precedentemente lucidato.
      NOTA: Le vetri in plastica sono consigliate per la loro migliore adesione. Possono essere utilizzate anche vetrine in vetro (dopo un lavaggio approfondito con sapone neutro). Tuttavia, le vetrine in vetro aumentano il rischio di distacco del campione durante la lucidatura.
    2. Per i campioni che saranno ulteriormente analizzati con un approccio correlato, si monta su un insieme di tubi in alluminio a due parti. In questo protocollo fu sviluppato un assemblaggio di tubi in alluminio fatto in casa, composto da un cilindro interno solido con un diametro di 2,5 cm e un cilindro cavo esterno che fornisce supporto meccanico durante la lucidatura. Il campione è collegato al cilindro solido interno.
    3. Posizionare il cilindro interno in alluminio su una piastra calda e riscaldarlo a una temperatura adatta per la fusione della cera (tipicamente intorno a 60-70 °C, a seconda del tipo di cera utilizzata).
      NOTA: Anche la cera d'api è adatta. Quando maneggia la cera di montaggio, lavora all'interno di una cappa e indossa i DPI appropriati. Dopo l'uso, raccogliere i residui in contenitori di rifiuti chiaramente etichettati e chimicamente compatibili con tappi adeguatamente montati. Segui i protocolli standard istituzionali per lo stoccaggio e lo smaltimento sicuro dei rifiuti chimici pericolosi.
    4. Applica una piccola quantità di cera sulla superficie del cilindro e lascia che si scioglia completamente.
    5. Una volta fuso, posiziona il campione con la superficie di interesse sulla superficie coperta di cera e premi delicatamente per assicurare un contatto completo.
      NOTA: La superficie di interesse dovrebbe essere rivolta verso la superficie del cilindro in modo che l'assottigliamento venga eseguito sul lato opposto. Evita di usare cera in eccesso, poiché questo potrebbe portare a un montaggio irregolare e compromettere la qualità della lucidatura.
    6. Rimuovi il cilindro dalla piastra riscaldante e lascia che la cera si solidifichi a temperatura ambiente.
  4. Monitoraggio dello spessore del campione durante la lucidatura
    1. Per monitorare lo spessore del campione durante il processo di lucidatura, si utilizza la microscopia a riflessione a ingrandimenti da basso a intermedio (ad esempio, 10x-20x). Un diagramma che illustra la calibrazione del microscopio e la misurazione dello spessore del campione è mostrato nella Figura 2.
    2. Calibrare l'asse Z del microscopio con un coperchio standard, che di solito è spesso circa 150 μm. Segna un lato del foglio con un pennarello rosso e un'area adiacente sul lato opposto con un pennarello blu. Monta il copertino su un vetrino di vetro.
    3. Utilizzando la fine manopola di messa a fuoco e la scala micrometrica, metti a fuoco prima sulla superficie inferiore del coperto e poi sulla superficie superiore.
    4. Annota il valore di spostamento Z. Questo valore corrisponde allo spessore del coperchissone (circa 150 μm) e funge da riferimento.
    5. Durante la lucidatura del campione, si utilizza periodicamente questa calibrazione sull'asse Z per stimare lo spessore del campione senza rimuoverlo dal cilindro di alluminio.
      NOTA: Questa tecnica consente una stima rapida e non distruttiva dello spessore durante la lucidatura. In alternativa, il campione può essere rimosso dal supporto e misurato con un calibro digitale o un micrometro.
  5. Diluzione e lucidatura
    1. Inizia la lucidatura grossolana e intermedia usando carta vetrata con grana di 1200, 2500 e 4100. L'obiettivo di questo passaggio è ridurre lo spessore del campione a circa 0,15 mm eliminando irregolarità significative della superficie.
    2. Inizia con carta vetrata grana 1200, poi passa a grana 2500. Applica una leggera pressione durante questo processo. Periodicamente monitorare lo spessore del campione tramite microscopia a riflessione durante la lucidatura.
    3. Una volta raggiunto lo spessore desiderato, lucidare entrambi i lati del campione usando carta vetrata a grana 4100. La lucidatura può essere eseguita manualmente o con una macchina semiautomatica impostata su bassa velocità di rotazione. Pulisci accuratamente il campione con acqua distillata in modo continuo durante ogni fase di lucidatura.
      NOTA: Mantenere i campioni e le carte vetrate umide durante la lucidatura aiuta a ridurre il calore e previene la contaminazione superficiale causata dalle cartegge più ruvide.
    4. Per la lucidatura finale, applicare una piccola quantità di pasta diamantata (ad esempio 6 μm o 3 μm) su un panno da lucidatura montato su un disco lucidante. Seleziona la dimensione della particella della pasta diamantata in base alla rugosità superficiale del campione.
      NOTA: Una pasta da 6 μm è adatta per la lucidatura preliminare fine, mentre una pasta da 3 μm è consigliata per la lucidatura finale a specchio. Quando possibile, utilizzare entrambe le paste in sequenza ottiene i migliori risultati. Tuttavia, una lucidatura soddisfacente può ancora essere ottenuta utilizzando solo la pasta a 6 μm.
    5. Lucida delicatamente entrambi i lati del campione con la minima pressione. Utilizzare aria compressa o cotone per asciugare la superficie lucidata del campione prima delle indagini microscopiche.
    6. Per staccare il campione dal cilindro, riscalda la cera usando una piastra calda e pulisci eventuali residui di cera dal campione usando acetone anidro.
      NOTA: Quando si maneggiano cera da montaggio e acetone anidro, lavora all'interno di una cappa e indossa i DPI appropriati. Dopo l'uso, raccogliere i residui in contenitori di rifiuti chiaramente etichettati e chimicamente compatibili con tappi adeguatamente montati. Segui i protocolli standard istituzionali per lo stoccaggio e lo smaltimento sicuro dei rifiuti chimici pericolosi.
    7. Montare il campione tra una vetrina di vetro e un copertino usando olio a immersione come mezzo di montaggio e valutare l'orientamento delle fibre di collagene usando microscopia a luce polarizzata. Inizia con un basso ingrandimento (ad esempio, 5x-10x) per esaminare il campione e aumenta fino a un ingrandimento intermedio (ad esempio, 20x-40x) per identificare potenziali regioni per ulteriori esplorazioni tramite microscopia elettronica.
      NOTA: Per procedere con il flusso di lavoro correlativo e la successiva analisi del campione tramite microscopia elettronica a scansione, è consigliabile non sigillare il campione.

4. Preparazione del campione per la microscopia elettronica a scansione

  1. Rimuovi con attenzione il campione dal vetrino di vetro. Fai scorrere delicatamente il copertino dal vetrino usando una punta di pipetta. Usa carta filtrante per rimuovere l'eccesso di olio a immersione. Lava il campione con un sapone neutro. Effettua il lavaggio all'interno di un contenitore piccolo per evitare la perdita accidentale del campione.
    NOTA: Se l'olio a immersione residuo è ancora presente sul campione, pulire delicatamente la superficie usando un cotton fioc leggermente umido con etanolo al 70%.
  2. Lascia asciugare il campione all'aria su una carta filtrante. Aria compressa o cotone possono essere utilizzati anche per asciugare il campione. Una volta completamente asciutto, monta il campione su un moncone usando nastro adesivo di carbonio. Sputter con uno strato d'oro da 10 nm per evitare la carica durante l'imaging.
  3. Utilizzare il microscopio FIB-SEM a doppio fascio per esplorare il campione attraverso vari metodi.
    1. Nella modalità SEM (microscopia elettronica a scansione), utilizzando elettroni secondari o elettroni retrodiffusi, si valuta la morfologia del campione, il biomateriale e la nuova interfaccia ossea formata nelle regioni precedentemente selezionate dalla microscopia ottica.
    2. In modalità microscopia elettronica a fascio di ioni focalizzato (FIB-SEM), si eseguono la tomografia slice-and-view.
  4. In modalità SEM con il rivelatore secondario di elettroni, seleziona le aree precedentemente analizzate tramite microscopia a luce polarizzata e SEM per procedere con l'acquisizione della tomografia slice-and-view.
  5. Regola i parametri per il volume della trincea, la dimensione dei pixel e lo spessore della fetta in base alle caratteristiche di interesse. Nel nostro allestimento è stata effettuata la tomografia slice-and-view con un volume di trincea di 15 μm x 10 μm x 10 μm, una dimensione di pixel di 20 nm e uno spessore di taglio di 60 nm. Si raccomanda di utilizzare una dimensione voxel isometrica ogni volta che possibile per migliorare la qualità dell'imaging in tutte e tre le dimensioni (XYZ).
    NOTA: Questi parametri possono variare a seconda del sistema FIB-SEM specifico. Consulta l'operatore dell'apparecchiatura per determinare le condizioni ottimali in base alle tue esigenze analitiche e alle capacità del sistema.

5. Allineamento, elaborazione del filtro e segmentazione della tomografia slice-and-view FIB-SEM

  1. La tomografia slice-and-view genera una serie di immagini numerate in sequenza. Per procedere con l'allineamento, si converte la serie in un file MRC, comunemente chiamato stack.
  2. Eseguire la generazione di file MRC e l'allineamento dello stack immagini utilizzando il software IMOD.
    NOTA: Altri software, come Avizo e FIJI/ImageJ, offrono anch'essi plugin per l'allineamento dello stack. Per indicazioni dettagliate, consulta la documentazione specifica di ogni software. Inoltre, il lavoro di Peddie etal. 23. offre una panoramica degli approcci adottati durante l'allineamento dello stack.
  3. Per generare il file MRC, apri il terminale o il prompt dei comandi, naviga nella cartella contenente la sequenza delle immagini ed esegui il seguente comando: tif2mrc imagerootfile*.tif stackname.mrc
    1. Per le immagini che non sono in formato TIFF, usa invece raw2mrc. Aggiungi -g (ad esempio, tif2mrc -g) per convertire immagini RGB a 24 bit in scala di grigi a 8 bit. Questo ridurrà sostanzialmente il tempo di calcolo.
  4. Avvia Etomo dal terminale e seleziona l'opzione Allinea Sezioni Seriali. Segui la sequenza per allineare lo stack: (1) Caricare lo stack non allineato in un singolo frame. (2) Tabula di algino usando l'Allineamento Automatico Iniziale. (3) Crea una scheda Stack usando Make Aligned Stack, poi apri la stack allineata.
    NOTA: Questo processo può richiedere diversi minuti, a seconda della dimensione dello stack e delle prestazioni del sistema.
  5. Una volta completato, rivedi il risultato. Il file stack allineato sarà chiamato stackname_ali.mrc.
    NOTA: Questa procedura utilizza le impostazioni predefinite di sistema per l'allineamento dello stack. Tuttavia, i parametri relativi all'allineamento iniziale e alla generazione finale dello stack possono essere modificati in base alle preferenze dell'utente. Per indicazioni dettagliate, consulta la documentazione IMOD: https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.
  6. Esegui un filtraggio aggiuntivo delle immagini utilizzando il software Avizo. Apri la pila allineata e applica sequenzialmente i seguenti filtri: Filtro Fast Fourier Transform (FFT), disponibile nel plugin Sandbox Filter (seleziona l'opzione orientamento della striscia verticale, valore di tolleranza: 2), Assistente di correzione di ombreggiatura (regola la selezione della maschera per coprire tutta l'area d'ombra dell'immagine, usa il fattore di normalizzazione di 100), Equalizzazione dell'istogramma (configurazione predefinita) e Mezzi non locali (regola i valori a 5; 0.1; 10; 3).
    NOTA: Filtri equivalenti sono disponibili in altri software di analisi delle immagini. In FIJI/ImageJ, raccomandiamo la seguente sequenza: filtro FFT, Sottrazione di Fondo, Potenzia Contrasto Locale (CLAHE) e Filtro a Mezzi Non Locali.
  7. Procedi alla segmentazione delle immagini e al rendering 3D usando il software. Sono disponibili diverse strategie di segmentazione, tra cui la segmentazione manuale e la segmentazione basata su soglia. Strumenti aggiuntivi, come l'algoritmo Watershed, possono aiutare ad automatizzare il processo e ridurre il tempo necessario per la segmentazione.

6. Preparazione del campione per la microscopia elettronica a trasmissione

  1. Preparare le lamelle utilizzando microscopia elettronica a fascio di ioni focalizzati (FIB-SEM) per valutare l'interfaccia osso/biomateriale.
    NOTA: Se il biomateriale impiantato non è ceramico o metallico, come in questo studio, si possono preparare sezioni ultrasottili adatte alla microscopia elettronica a trasmissione (TEM) utilizzando un ultramicrotomo. Tuttavia, è importante notare che sezionare materiali mineralizzati può ridurre significativamente la durata del coltello diamantato.
  2. Dopo la colorazione delle sezioni ultrasottili per 20 minuti in una soluzione acquosa di acetato di uranyle al 5%.
    NOTA: Quando si maneggia l'acetato di uranyle, lavora all'interno di una cappa e indossa i DPI appropriati. Dopo l'uso, raccogli eventuali residui di solvente in contenitori di rifiuti chiaramente etichettati e chimicamente compatibili con tappi adeguatamente montati. Segui i protocolli standard istituzionali per lo stoccaggio e lo smaltimento sicuro dei rifiuti chimici pericolosi.
  3. Analizza le sezioni usando TEM. Per un'analisi completa, combina l'imaging con la diffrazione elettronica ad area selezionata (SAED), la spettroscopia a dispersione energetica dei raggi X (EDS) e la tomografia elettronica.

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Risultati

L'analisi iniziale dei campioni incorporati in resina viene eseguita tramite la tomografia microcomputerizzata (microCT). Questa tecnica non distruttiva facilita la visualizzazione 3D dell'intera area del difetto, consentendo sia analisi quantitative che qualitative del campione. Il contrasto nell'imaging microCT deriva principalmente dalle differenze di densità dei materiali presenti nel campione. La Figura 1 illustra l'analisi microCT di un difetto non cri...

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Discussione

Sono state impiegate diverse tecniche di imaging per indagare l'architettura ossea e valutare l'efficacia dei biomateriali nell'induzione dell'osteointegrazione 7,21,22,23,24. In questo protocollo, abbiamo stabilito un flusso di lavoro che incorpora microtomografia a raggi X, microscopia ottica e microscopia elettronica per an...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni agli autori provenienti dalle seguenti agenzie brasiliane: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq/Brasile) e Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). Ringraziamo LABNANO/CBPF e CENABIO/UFRJ per le strutture di microscopia elettronica. Il raffinamento del linguaggio e la revisione grammaticale sono stati eseguiti utilizzando ChatGPT (OpenAI, GPT-5.1, 2025). Tutte le modifiche sono state revisionate e verificate dagli autori.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acetone  Merck67-64-1
Cilindro in alluminiofatta in casan/a
Versione Avizo 2022.1ThermoFishern/asoftware per il filtraggio delle immagini, la segmentazione e la visualizzazione 3D
Acido cacodilico, sale di sodio, triidratoTed Pella18851polvere per Cacodylate Buffer. Prepara una soluzione stock di 0,2 M
Composto per lucidatura diamantata 3 e micro; Dimensione mTed Pella895-8
Composto per lucidatura diamantata 6 & micro; Dimensione mTed Pella895-9
Ruota a diamante x.006Tecnologia South BayDWH 3063
Ruota a diamante x.012Tecnologia South BayDWH 4122
Tessuto lucidante in feltroTed Pella816-20
Capsule a Incorporamento PiattoEMS70021
Sveglia di copertura in vetroKnitteln/a
Slide in vetroKnitteln/a
Glutaraldeide, 25% di grado EMTed Pella18426/18427
Sputter d'oro K550XEMITECHn/a
ImageJIstituti Nazionali di Salute (NIH)software per l'identificazione delle immagini, il filtraggio, la segmentazione e la visualizzazione 3D
IMOD versione 5.1Università del Coloradosoftware per l'illuminazione delle immagini, la segmentazione e la visualizzazione 3D
Macchina per la lucidatura e di lapaggioTecnologia South BayModello 910
Sega a ruota diamantata a bassa velocità  Tecnologia South BayModello 650
Kit di incassamento a bassa viscositàEMS14300Kit per la resina SPURR. Prepararsi secondo le specifiche della scheda tecnica  
Micro-CT Skyscan 1273 Brukern/a
Microscopio Jeol 2100F 200kV Jeoln/a
Microscopio Olympus BX51Olympusn/a
Microscopio Tescan Lyra3Tescann/a
Microscopio Zeiss AxioplanZeissn/aequipaggiato con una piastra lambda di primo ordine
Paraformaldeide, EM GradeSigmaP6148Polvere per soluzione di formaldeide. Prepara una soluzione azionaria del 16%
Carrello in plasticaExakt41500
Cera da montaggio QuickStick 135Tecnologia South Bayn/a
Carta vetrata  Grana 1200n/an/a
Carta vetrata  Grana 2500n/an/a
Carta vetrata  Grana di grana 4100n/an/a
Super CollaLoctiten/a
Refrigerante idrosolubile  Tecnologia South Bayn/a
Carta filtro Whatmann di grado 1sigmaWHA1001150

Riferimenti

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