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Articolo metodologico

Coltura ovarica neonatale del topo e quantificazione dei follicoli a montaggio intero: un approccio in vitro efficiente per studiare la regolazione dei follicoli primordiali

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DOI:

10.3791/69498

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19 dicembre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology, and Women's Health, University of Missouri School of Medicine, 2Division of Biological Sciences, University of Missouri

In questo articolo

Sommario

Questo studio presenta protocolli per la coltivazione postnatale delle ovaie del topo su inserti di membrana e per la quantificazione dei follicoli a montaggio intero in un ovario intero. I risultati hanno dimostrato che la gestione tecnica durante la coltura ovarica influisce significativamente sul conteggio dei follicoli primordiali, sottolineando l'importanza di mantenere la coerenza per minimizzare la variazione non biologica.

Abstract

Nei mammiferi femmine, i follicoli primordiali si formano durante lo sviluppo ovarico fetale e servono come unica fonte per il mantenimento della funzione ovarica adulta. I meccanismi alla base di come i follicoli primordiali si compongono, mantengono la dormienza, si attivano per lo sviluppo follicolare e subiscono la morte cellulare sono importanti per comprendere la fisiologia ovarica e le condizioni patologiche. Questo studio presenta un protocollo per la coltivazione delle ovaie topine postnatali su inserti di membrana, un approccio che consente la coltura e il trattamento farmaceutico di ovaie intate per un massimo di 10 giorni, a seconda dello stadio di sviluppo dell'ovaio. I cambiamenti nelle condizioni della coltura possono essere ottenuti trasferendo inserti contenenti ovaie coltivate tra pozzi su una placca, evitando così interferenze fisiche con i tessuti durante la coltura. Le ovaie P5 sono state isolate e coltivate su un inserto da 12 mm in una piastra a 24 pozzi, ad esempio. Ogni ovaio è stato separato all'interno di una goccia di mezzo DMEM/F12 integrato con FBS al 10%, 3 mg/mL di BSA, 10 mIU/mL FSH e antibiotico-antimicotico, e delicatamente stabilizzato sull'inserto di membrana. Il mezzo veniva cambiato ogni due giorni e la cultura veniva mantenuta per un totale di cinque giorni. Dopo la coltura, le ovaie sono state fissate al 4% di paraformaldeide per 2 ore e processate per la colorazione anticorpale completa del marcatore oovocitario DDX4. I follicoli sono stati stadiati e quantificati in base alla dimensione degli ovociti e alla morfologia nucleare delle cellule follicoli somatiche. I risultati hanno mostrato che il numero di follicoli primordiali in ciascun ovaio era significativamente influenzato dalla corretta posizione dei tessuti sull'inserto di membrana. Inoltre, differenze nel numero di ovaie su ciascun inserto possono introdurre variazioni non biologiche e dovrebbero essere evitate.

Introduzione

L'oogenesi è un processo altamente regolato e complesso che porta alla produzione di ovociti maturi. Nei mammiferi, l'oogenesi inizia nelle ovaie fetali, dove le cellule germinali primordiali (PGC) si differenziano in ovociti primari. Ogni ovocita primario è racchiuso da uno strato di cellule pregranulosae squamose, formando un follicolo primordiale. La maggior parte di questi follicoli primordiali diventa dormiente dopo la formazione, fungendo da riservaovarica 1,2,3. Nell'ovaio adulto, l'attivazione periodica dei follicoli primordiali per lo sviluppo follicolare, nota come follicogenesi, è essenziale per sostenere la produzione di ovociti maturi e ormoni steroidei ovarici 4,5. In assenza di segnali di attivazione, i follicoli primordiali umani possono rimanere immobiliari fino a 50 anni. La dormienza prolungata può contribuire a una riduzione della qualità degli ovociti, così come a un aumento del tasso di perdita dei follicoli primordiali nelle ovaieinvecchiate 6. I meccanismi alla base di come un specifico pool di follicoli si attiva mentre altri restano immobili e subiscono periodicamente morte cellulare restano questioni aperte.

Il processo di oogenesi è altamente conservato nei mammiferi, rendendo i topi un modello ideale per studiare l'oogenesidei mammiferi 7. Nei topi, la formazione del follicolo primordiale è completa entro il quarto giorno postnatale (P4). Una piccola proporzione di follicoli primordiali subisce uno sviluppo follicolare immediatamente dopo la loro formazione. Durante lo sviluppo dei follicoli, l'ovocita aumenta di dimensione grazie all'aumento dell'organogenesi e alla sintesi di mRNA eproteine 4. Le cellule della granulosa squamosa passano a cellule della granulosa cuboidale e diventanoproliferative 8. Questi follicoli in via di sviluppo crescono fino allo stadio ovulatorio intorno al giorno 21, quando le femmine raggiungono la pubertà. Questa fase dello sviluppo follicolare nelle ovaie postnatali è comunemente chiamata 'follicologenesi della prima onda'. Poiché la follicologenesi della prima ondata rispecchia da vicino il processo di sviluppo dei follicoli, le ovaie topina postnatali forniscono un modello ideale per studiare la regolazione dei follicoli primordiali e la follicogenesiovarica 9.

La classificazione dei follicoli ovarici si basa principalmente sulla morfologia nucleare delle cellule somatiche dei follicoli e sulla dimensione dell'ovocito. Nelle ovaie del topo, il follicolo primordiale dormiente è identificato da uno strato singolo di cellule pregranulosa squamose che racchiudono un ovocita primario, con un diametro di circa 20 μm. I follicoli in via di sviluppo possono essere classificati in primari, secondari, terziari e antrali. Il follicolo primario contiene un ovocita tipicamente superiore a 25 μm di diametro ed è circondato da un unico strato di cellule cuboidali della granulosa (Figura supplementare 1). Il follicolo secondario presenta due strati di cellule della granulosa, mentre il follicolo terziario è composto da tre o più strati di cellule della granulosa. Il follicolo antrale è più grande del follicolo terziario, contiene più strati di cellule della granulosa e possiede una cavità riempita di liquido nota come antrum. Con lo sviluppo dei follicoli, l'ovocita aumenta di dimensione, raggiungendo circa 80 μm al momento dell'ovulazione. Inoltre, i follicoli in via di sviluppo sono circondati da diversi strati di cellule sottili della teca, che si trovano all'esterno delle cellule dellagranulosa 10,11,12.

La dimensione relativamente piccola delle ovaie topo postnatali rende la coltura completa delle ovaie un approccio pratico per la ricerca. Questo metodo consente efficacemente lo studio dello sviluppo ovarico e follicolo all'interno di un ovaio intatto, poiché preserva i microambienti fisici e fisiologici minimizzando l'interferenza dei tessuticircostanti 12. Questo approccio consente esperimenti che sarebbero difficili da condurre in modelli in vivo. Esempi includono imaging dal vivo dello sviluppo ovarico, trattamenti multi-farmaco controllati nel tempo e l'analisi dell'attività secretoria ovarica tramite profilazione proteica dei mezzidi coltura 13,14. Inoltre, questo approccio può essere applicato per indagare l'effetto dei fattori secretori senza interazione diretta cellula-cellula attraverso esperimenti di co-cultura. In questi esperimenti, diversi tipi di tessuti possono essere posizionati su inserti di membrana separati all'interno di un mezzocondiviso 15. Inoltre, l'uso condizionale di ovarie di topo con knockout genetico in vitro potrebbe aiutare a chiarire i meccanismi chiave coinvolti nell'attivazione e nella crescita dei follicoli primordiali.

In questo articolo introduciamo metodi per la coltivazione delle ovaie topi postnatali utilizzando inserti di membrana e per la quantificazione del follicolo a montaggio intero in un'intera ovaia (Figura 1). Le tecniche illustrate qui includono 1) dissezione delle ovaie del topo neonatale, 2) coltura delle ovaie del topo neonatale, 3) cambiamento del substrato durante la coltura, 4) fissazione del tessuto e colorazione di anticorpi a montaggio completo, e 5) imaging tissutale e quantificazione dei follicoli. Inoltre, questo studio ha utilizzato la doxorubicina per indurre sperimentalmente la perdita del follicolo primordiale, fornendo un modello per indagare i meccanismi alla base della deplezione della riserva ovarica. I risultati hanno mostrato che il numero di ovaie per inserto e la loro posizione all'interno dell'inserto durante la coltura influenzavano il conteggio dei follicoli primordiali. Questo sottolinea l'importanza di mantenere una configurazione colturale coerente per prevenire variazioni non biologiche negli esiti sperimentali.

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Protocollo

Maschi e femmine CD-1 furono ospitati insieme in un rapporto 1:1 come coppie riproduttive. La data di nascita dei nuovi cuccioli era indicata come giorno postnatale 0. Tutti gli esperimenti con animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Missouri (numero di protocollo: 36647).

1. Reagenti e Media culturali

  1. Tutti i reagenti utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali. Prepara tutti i materiali e i materiali prima della coltura ovarica.
  2. Materiale di coltura: Produrre ~5 mL di substrato DMEM/F-12 integrato con 3 mg/mL di albumina bovina (BSA), siero fetale bovino al 10% (FBS) e 10 mIU/mL ormone follicolare stimolante (FSH).
    NOTA: I supporti devono essere preparati di nuovo aggiungendo le scorte di BSA (30 mg/mL), FBS e FSH (10 IU/mL) ai mezzi DMEM/F-12. Bilanciare il substrato in una piastra di Petri per circa 30 minuti in un incubatore al 5% di CO2 a 37 °C. Conserva i fondi a -20 °C e scongelali immediatamente prima dell'uso. Azioni aliquote in volumi appropriati per evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti delle scorte.

2. Coltura ovarica

  1. Eutanasia delle femmine di topi P5 decapitandola. Rimuovere le ovaie e il tessuto bursale attaccato usando forbici chirurgiche e pinzep. Posizionare le ovaie in una piastra di Petri da 60 mm con soluzione salina Dulbecco's phosphate-buffer (DPBS) pre-raffreddata contenente antibiotico-antimicotico (Figura 2A,B).
  2. Utilizzando un paio di siringhe per insulina (1 mL), sezionare e rimuovere il tessuto burso dall'ovaio sotto uno stereoscopio (Figura 2C,D). Trasferire le ovaie utilizzando una pipetta da 1 mL in una piastra di Petri da 30 mm contenente 3 mL di substrato colturale e posizionare la piastra in un incubatore aCO2.
    NOTA: Evita di toccare o stringere le ovaie. Effettuare incisioni pulite e uniformi attraverso la borsa ovarica utilizzando le siringhe per insulina per rilasciare l'ovaio. Pre-riempi la punta della pipetta con circa 50 μL di substrato, posiziona la punta della pipetta accanto all'ovaio e aspirala nella punta per il trasferimento.
  3. Sotto la cappa a flusso laminare, preparare la piastra posizionando 400 μL di mezzo e un inserto in ciascun pozzo (Figura 2E, E'). Il substrato si trova all'esterno dell'inserto e la membrana dell'inserto diventa opaca una volta immerso dal substrato.
  4. Per la coltura con trattamento Dox 24 ore, preparare un substrato contenente Dox a una concentrazione di 0,1 mg/mL fresco diluendo il stock Dox (10 mg/mL) con il substrato.
    NOTA: I media contenenti Dox devono essere smaltiti correttamente in conformità con le linee guida dei comitati istituzionali per la biosicurezza e la salute e sicurezza ambientale.
  5. Sotto stereoscopio, trasferire fino a tre ovaie a un inserto usando una pipetta da 1 mL (Figura 2F,G). Minimizza la quantità di materiale trasferito nell'inserto e rimuovi immediatamente qualsiasi materiale in eccesso dopo il trasferimento. Una volta che le ovaie sono state delicatamente inserite nell'inserto, si utilizza una pipetta da 200 μL per trasferire circa 200 μL di mezzo dal pozzo all'inserto, assicurandosi che la membrana sia completamente coperta dal mezzo. Trasferire il substrato di nuovo nel pozzo e centrare le ovaie sulla membrana. Riempi la punta della pipetta con materiale di coltura per evitare che l'ovaio venga risucchiato nella punta durante il centramento. Assicurarsi di lasciare uno spazio sufficiente tra le ovaie e che siano stabilizzate sull'inserto di membrana (Figura 2H), invece di rimanere sospese nel mezzo (Figura 2I). Fai attenzione a non toccare le ovaie e la membrana.
  6. In una coltura di 5 giorni, si cambia il mezzo ogni due giorni rimuovendo 200 μL di mezzo (la metà della quantità totale) dal pozzo e aggiungendo 200 μL di mezzo fresco di coltura al pozzo (Figura 2J).
  7. Per la coltura con trattamento farmacologico di 24 ore, trasferire l'inserto con ovaie in un nuovo pozzo con 400 μL di mezzo fresco dopo le prime 24 ore, seguendo i seguenti passaggi:
    1. Rimuovi l'inserto contenente le ovaie dal pozzo usando una pinza.
    2. Risciacquo brevemente il fondo dell'inserto immergendolo in una piastra da 60 mm con substrato fresco per la coltura.
    3. Tocca delicatamente il fondo dell'inserto su una piastra vuota da 60 mm per rimuovere il materiale in eccesso sull'inserto. Metti l'inserto nel pozzo con un materiale di coltura fresco.
      NOTA: Rimuovere il materiale in eccesso dall'inserto per assicurarsi che le ovaie siano stabilizzate sulla membrana immediatamente dopo il cambio di mezzo o il trasferimento dell'inserto.

3. Fissazione e immunocolorazione a montaggio intero

  1. Per fissare le ovaie coltivate, rimuovere l'inserto dalla piastra usando una pinza e inserirlo in una piastra di Petri da 60 mm contenente 5 mL di DPBS. Trasferire circa 100 μL di DPBS accanto alle ovaie e risospenderle usando una pipetta da 1 mL.
  2. Utilizzando una pipetta da 1 mL, trasferire le ovaie dall'inserto in un tubo Eppendorf da 1,5 mL. Rimuovere il DPBS dal tubo e aggiungere 500 μL di paraformaldeide al 4%. Fissa le ovaie a 4°C per 2 ore.
    NOTA: L'estremità della punta della pipetta potrebbe dover essere ampiata per evitare di danneggiare i tessuti se le ovaie sono troppo grandi per attraversarla.
  3. Lavare le ovaie fisse con 1 mL diPBST 2 (PBS, 0,1% Tween [v/v], 0,5% Triton [v/v]) almeno tre volte, 1 ora ciascuno su uno shaker rotante. Si raccomanda di lasciare i tessuti inPBST 2 durante la notte (12-16 ore) a 4 °C per migliorare la penetrazione degli anticorpi.
    NOTA: Questo può essere un punto di sosta; i tessuti possono essere conservati inPBST 2 fino a tre giorni prima dell'incubazione primaria degli anticorpi.
  4. Incubare le ovaie con elicase anti-dead-box 4 (DDX4) in 100 μL di tampone di diluizione degli anticorpi (1% BSA [w/v], 10% siero di asino [v/v], 0,1 M glicina, 0,1% Tween e 0,5% Triton in PBS) a una diluizione di 1/400 (2,3 μg/mL) a 4 °C per 12-16 ore.
  5. Il giorno successivo, rimuovere l'anticorpo primario e aggiungere 1 mL diPBST 2 alla sonda. Lava i fazzoletti almeno tre volte, 1 ora ciascuno su uno shaker rotante.
    NOTA: Questo può essere un punto di sosta; i tessuti possono rimanere inPBST 2 fino a tre giorni dopo l'incubazione primaria degli anticorpi.
  6. Diluire l'anticorpo secondario anti-coniglio AF488 a 1/500 di diluizione (1,5 μg/mL) inPBST 2. Incubare il tessuto con almeno 100 μL dell'anticorpo secondario diluito a 4 °C per 12-16 ore.
  7. Il giorno successivo, lava i tessuti in PBST2 almeno tre volte, 1 ora ciascuna su uno shaker rotante. Si consiglia di lavare i fazzoletti fino a 8 ore per ridurre lo sfondo. Assicurati di coprire i tubi con della stagnola per proteggerli dalla luce di questo passo avanti.
  8. Rimuovere PBST2 e aggiungere 100 μL di DAPI a una diluizione di 1/1000 (1 μg/mL) in PBS nel tube. Incubare i tessuti in DAPI per 30 minuti a temperatura ambiente.
  9. Lava le ovaie in PBST2 una volta per 30 minuti e montale su un vetrino microscopico con un distanziatore per immagini. Trasferire le ovaie al centro del distanziatore usando una pipetta da 1 mL e rimuovere l'eccesso diPBST 2. Aggiungi circa 5 μL del mezzo di montaggio antifade e posiziona un vetrino del microscopio sulla parte superiore dello distanziatore. Sigilla i bordi del distanziatore con uno smalto trasparente per la conservazione a lungo termine.
    NOTA: Prima di immaginare le slide, assicurati che lo smalto sia completamente asciutto e che non ci sia un mezzo di montaggio all'esterno del coperchio. Questi reagenti possono danneggiare gli obiettivi del microscopio. Inoltre, evita di usare un eccesso di supporto di montaggio, poiché le ovaie devono rimanere ferme durante l'imaging (imaging).
  10. Immagini le ovaie con un microscopio confocale a un ingrandimento 10x con una dimensione Z-step di 10 μm. Regola le impostazioni e usa la compensazione Z (guadagno di eccitazione) per visualizzare l'intero ovaio. Questo può essere fatto seguendo i seguenti passaggi:
    1. Regolare la potenza di eccitazione e il guadagno del rivelatore monitorando la saturazione del segnale tramite l'istogramma, poiché può variare tra i tessuti. Inizia con bassa potenza laser e aumenta gradualmente secondo le necessità.
    2. Per l'imaging delle regioni più profonde, abilita la compensazione Z per il rivelatore di guadagno, poiché l'intensità del segnale può diminuire con la profondità. Utilizzare una media dei frame di almeno 10 e abilitare la scansione X bidirezionale a una velocità di 600 Hz.
      NOTA: Con queste impostazioni, l'imaging non dovrebbe superare i 10 minuti per ovaio (~200 μm). La colorazione immunofluorescente intera delle ovaie con anti-DDX4 è tipicamente robusta e raramente fotosbianca.

4. Quantificazione dei follicoli

  1. Per quantificare i follicoli in ciascun ovaio, apri le immagini usando il software ImageJ. All'apertura, assicurati che la modalità colore sia selezionata come colorata e che i canali divisi siano selezionati nella casella sotto diviso in finestre separate. Seleziona l'immagine di interesse, poi usa lo strumento immagine/trasformazione/rotazione per posizionare l'ovaio simmetricamente nell'immagine.
    NOTA: Le immagini acquisite dal confocale possono essere visualizzate e analizzate in 3D utilizzando il software Imaris (Figura 3A,B) o il softwareImageJ 16.
  2. Usa lo strumento di analisi/strumenti/griglia per dividere l'ovaio in griglie (Figura 3C,C').
  3. Usa lo strumento plugin/analyze/cell counter per segnare tutte le griglie che coprono l'ovaio (Figura 3D, D', griglie segnate da 4). Di queste griglie, segna ogni due griglia in ogni riga per la quantificazione dei follicoli (Figura 3E, E', griglie contrassegnate da 8). Le griglie ai margini dell'ovaio che contengono meno di 10 ovociti non sono incluse per la quantificazione dei follicoli.
    NOTA: Inizializza il contatore delle celle e scegli i tipi di contatore che ritieni facili da leggere.
  4. Gli ovociti possono essere identificati dalla presenza di una struttura ad anello positiva a DDX4 che circonda un nucleo positivo per DAPI. I follicoli primordiali hanno ovociti di circa 20 μm di diametro circondati da cellule somatiche squamose. I follicoli in via di sviluppo hanno ovociti di diametro superiore a 25 μm e circondati da uno o più strati di cellule cuboidiali della granulosa (Figura supplementare 1).
  5. Contare i follicoli primordiali in ciascuna griglia segnata (come si vede nella Figura 3E,E' con il Tipo 8 contatore). Esamina i follicoli usando sezioni/stack ottici nella griglia, e segnali rispettivamente con lo strumento contatore cellulare. Assicurati di non contare due volte i follicoli primordiali su due sezioni/stack ottici consecutivi. Contare i follicoli in sviluppo in tutte le griglie contrassegnate con il tipo 4 contatore.
    NOTA: Usa l'opzione zoom per visualizzare e contare gli ovociti tra le pile.
  6. Calcola il numero di follicoli primordiali nell'intero ovaio (nf) moltiplicando il numero medio di follicoli primordiali per ogni griglia (nfgrid) per il numero di griglie che comprendono l'ovaio (ngrid). nf = griglia nf × ngrids.
    NOTA: Sono state effettuate analisi statistiche e i grafici sono stati generati utilizzando il software Prism 10.2.0 (GraphPad Software, versione 10, Inc., CA). Le differenze tra i gruppi sono state valutate utilizzando l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguita dal test di confronto multiplo di Tukey. La significatività statistica è stata considerata a p < 0,05. I dati sono presentati come la media ± l'errore standard (SE).

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Risultati

In questo articolo dimostriamo i metodi di coltura ovarica neonatale, colorazione anticorpale a montaggio intero, imaging confocale e quantificazione dei follicoli per valutare se il numero e la posizione delle ovaie nell'inserto durante la coltura influenzino l'esito sperimentale, in particolare i conteggi follicoli nell'ovaio. Abbiamo colturato ovaie con le seguenti configurazioni: una, due o tre ovaie per inserto per la coltura stabilizzata, e tre ovaie per inserto per la coltura galleggiante. Le ovaie sono state colt...

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Discussione

In questo studio, abbiamo dimostrato metodi per la coltura ovarica neonatale del topo e per la quantificazione dei follicoli ovarici a montaggio intero. L'approccio in coltura può sostenere i follicoli primordiali e in fase precoce in via vitro. Il metodo di quantificazione del follicolo a montatura completa richiede un trattamento tessutale minimo, il che fa risparmiare tempo e preserva l'integrità del tessuto, garantendo una quantificazione accurata del follicolo.

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Dichiarazioni

Non ci sono conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute of General Medical Sciences dei National Institutes of Health sotto il numero di premio R35GM158131. L'EADM è stata sostenuta dalla Lalor Foundation. Gli autori ringraziano con gratitudine il Nucleo Avanzato di Microscopia Leggera dell'Università del Missouri per il loro supporto e assistenza in questo lavoro

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastre di coltura cellulare a 24 pozziFisher scientific 09-761-146 
Alexa Fluor 488 Anti-Coniglio AsinoLaboratori di Immunoricerca Jackson711-546-152
Anti-Anti (100X)Gibco15240-062
Albumina Sirica BovinaSigma-AldrichA1470-25G
CD-1 IGS MouseLaboratori Charles River & nbsp;022Topi
Inserti in coltura cellulareMilliporePICM01250
Comfort Point Insulina con ago 1cc 28G x 1/2Esilio26027
DAPIThermo Scientific62248
DDX4 Rabbit mAbabcamab13840
DMEM/F12 (1:1) (1X)Gibco11320-033
Doxorubicina cloridrato  Sigma-AldrichPHR1789
DPBS (1X)Gibco14190-144
Siero bovino fetaleSigma-AldrichF0926-500ML
Fiji-ImageJNIH, USA (https://imagej.net/ij/)ImageJ 1.52p
Miscelatori Fisherbrand a Nutazione - Velocità variabileFisher scientific 88-861-043Shaker
Ormone follicolo-stimolanteSigma-AldrichF4021-10UG
Forma Steri-Cycle i160Thermo Scientifico e Commerciale;i160Incubatore CO2
GlicinaFisher scientific BP381-500
Imaris Oxford Instruments (https://imaris.oxinst.com/)Imaris 10.2
Leica TCS SP8Leica MicrosystemsSN 8100001409Confocale
Siero Normale per AsinoLaboratori di Immunoricerca Jackson017-000-121
Olympus SZ61Microscopi OlympusSZ61Stereoscopio
Paraformaldeide Fisher scientific 15714
Spacer per immagini SecureSealGrace Bio-Labs654002
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500ML
PREADOLESCENTI 20Sigma-AldrichP1379-500ML
Mezzo di montaggio antifade VECTASHIELDLaboratori VectorH-1000

Riferimenti

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