Esecuzioni a piastra singola di test di stress Mito e glicolisi utilizzando cellule aderenti o non aderenti

Sommario

Questo studio presenta protocolli ottimizzati per eseguire simultaneamente un'analisi metabolica in tempo reale dei test di stress Mito e glicolisi sulla stessa placca. Le procedure sono personalizzate sia per cellule aderenti (BMDM) che per cellule non aderenti (linfociti), consentendo una valutazione accurata, riproducibile e parallela della funzione mitocondriale e glicolitica delle cellule di interesse.

Abstract

L'analisi metabolica in tempo reale fornisce misurazioni senza etichettatura della respirazione mitocondriale e della glicolisi, permettendo ai ricercatori di collegare il metabolismo energetico cellulare ai meccanismi delle malattie e alle risposte terapeutiche in diversi campi. Quando si confronta il metabolismo energetico tra diversi topi, altri animali, esseri umani o cellule sotto trattamenti differenti, è fondamentale effettuare misurazioni in un'unica prova per garantire risultati accurati e affidabili. Inoltre, il disegno sperimentale deve considerare il tipo cellulare da analizzare, ad esempio se sono aderenti, come i macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM), o non aderenti, come i linfociti. Pertanto, è stato sviluppato un protocollo che consente l'esecuzione simultanea dei test di Mito Stress e di Glicolisi Stress sulla stessa placca, nonostante i test richiedano iniezioni di farmaci distinti e programmi analitici. Protocolli di gestione separati sono stati ottimizzati per l'analisi sia di cellule altamente aderenti (ad esempio, BMDM) sia di cellule "fluttuanti" non aderenti (ad esempio, cellule T e altri linfociti). Qui vengono presentati protocolli dettagliati per condurre questi saghi in modo efficiente e riproducibile.

Introduzione

L'Analizzatore XF Seahorse è uno strumento unico che consente la misurazione in tempo reale della respirazione mitocondriale e della glicolisi in molti tipi cellulari. Quantificando simultaneamente il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR), questa tecnologia consente una dissezione precisa delle vie bioenergetiche in condizioni fisiologiche o di stress. La sua versatilità lo ha reso indispensabile in diversi ambiti di ricerca, tra cui cancro¹,^{neuroscienze 2},^{immunologia 3},^{invecchiamento 3, 4,5} e scoperta di farmaci⁶, dove la riprogrammazione metabolica è un segno distintivo della progressione della malattia e della risposta terapeutica. Collegando la bioenergetica funzionale ai fenotipi^{cellulari 7,8}, l'analisi fornisce una potente piattaforma per scoprire meccanismi, identificare vulnerabilità metaboliche e valutare gli effetti degli interventi genetici o farmacologici.

In molte discipline, il confronto degli effetti immediati di farmaci, piccole molecole, citochine o composti naturali sul metabolismo cellulare è meglio effettuato in condizioni sperimentali identiche, con la stessa placca, lo stesso tempo di incubazione, parametri ambientali e ora del giorno. Di conseguenza, questo approccio consiste nel placcare cellule con trattamenti diversi o background genetici sulla stessa piastra e analizzare simultaneamente per più parametri metabolici. Questa strategia garantisce il confronto più accurato tra i cambiamenti legati a farmaci o genetiche nel metabolismo energetico cellulare.

Molti tipi cellulari si comportano in modo diverso in coltura. I linfociti rimangono in sospensione e non si attaccano mai alla^{placca 9}, i macrofagi aderiscono fortemente, rendendoli difficili da trasferire, e le cellule tumorali proliferano rapidamente ma a velocità variabili a seconda della linea. Queste differenze presentano sfide per l'analisi metabolica in tempo reale; Pertanto, ogni tipo cellulare nell'esperimento richiede un protocollo personalizzato.

Questo articolo fornisce protocolli passo dopo passo per eseguire questi saghi utilizzando analisi metaboliche in tempo reale, garantendo efficienza e riproducibilità. Questi protocolli possono essere applicati a tutte le versioni di analizzatori disponibili sul mercato.

Protocollo

I topi sono stati curati secondo le procedure descritte nel protocollo del National Institutes of Health and Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il Meharry Medical College. Questa istituzione è accreditata dall'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International e rispetta la Politica del Servizio di Sanità Pubblica per il trattamento e l'uso degli animali da laboratorio in condizioni prive di patogeni. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Ottimizzazione per la densità cellulare

NOTA: Ogni tipo cellulare presenta caratteristiche metaboliche uniche e una notevole variazione di dimensioni. Entrambi i fattori sono fondamentali per determinare il numero appropriato di celle da caricare per ogni pozzo e ottenere risultati ottimali. Prima di eseguire un primo saggio sperimentale, si prepara e si fa eseguire una piastra di prova con le celle di interesse scelte placcate a densità variabili.

1. Per le cellule aderenti (ad esempio, cellule tumorali), si testano le densità di semina che variano da 20.000 a 100.000 cellule per pozzo. Per cellule altamente metaboliche e/o di grandi dimensioni (ad esempio, cellule tumorali umane o fibroblasti), l'ottimizzazione della densità inizia da 10.000 cellule o meno per pozzo.
2. Per le cellule non aderenti (ad esempio, linfociti), ottimizzare la densità di semina nell'intervallo di 100.000–500.000 cellule per pozzo. Per tutti i tipi di cellule, si punta a un monostrato monocellulare uniforme per ottenere risultati ottimali (vedi la Figura 1 per esempio la disposizione delle lastre dei campioni).
3. Esegui il test di stress di Mito (come di seguito). I dati di questo test preliminare possono essere utilizzati per determinare la densità cellulare ottimale per l'esperimento principale. Seleziona la densità che mostra la maggiore differenza tra le condizioni del saggio.
   NOTA: Questo protocollo non si applica all'analisi di campioni 3D (ad esempio, sferoidi cellulari, organoidi). Tuttavia, può essere modificato per tenere conto dello spessore del campione e della superficie irregolare.

2. Preparazione per il saggio

1. Il giorno prima dell'esecuzione del saggio, solleva delicatamente la cartuccia del sensore dalla piastra di utilità e aggiungi 200 μL di acqua senza RNAasi/DNAse in ciascun pozzo della piastra di servizio, poi abbassa la cartuccia del sensore nella piastra di utilità finché i sensori non sono completamente immersi nell'acqua.
   NOTA: Il livello dell'acqua deve essere sufficientemente alto da garantire che i sensori siano completamente sommersi durante la notte, poiché i fluorofori a cartuccia del sensore non funzioneranno se non idratati correttamente. Se si utilizza un XF Hydrobooster per idratare la cartuccia, la cartuccia può essere messa direttamente in soluzione calibrante ed escludendo la fase di idratazione dell'acqua.
2. Posiziona la cartuccia sensore idratata/piastra di utilità in un incubatore a 37 °C_CO-less 2-less per tutta la notte. Per evitare l'evaporazione dalla piastra si applica anche un contenitore con acqua doppiamente distillata nell'incubatrice.
3. Il giorno del saggio, rimuovere la cartuccia sensore/piastra utility dall'incubatore senza CO₂ e rimuovere delicatamente la cartuccia sensore dalla piastra di servizio, posizionando la cartuccia con il lato sensore rivolto verso l'alto sul banco.
4. Scartare l'acqua dalla piastra di servizio, asciugare con un shak per eliminare eventuali gocce sciolte, aggiungendo 200 μL di soluzione calibrante XF in ciascun pozzo.
5. Riposiziona delicatamente la cartuccia del sensore nella piastra di utilità in modo che i sensori siano completamente immersi nella soluzione calibrante, e rimettila nell'incubatore a 37 °C_CO-2-less.

3. Preparazione dei media per il saggio

1. Preparazione media per Mito Stress:
   1. In un tubo da 50 mL, aggiungere quanto segue a 45 mL di mezzo RPMI XF: 500 μL di piruvato di sodio 100x (concentrazione finale: 1 mM), 500 μL di 100x L-glutamina (concentrazione finale: 2 mM) e 550 μL di soluzione di glucosio al 45% (concentrazione finale: 25 mM)
2. Regola il pH a 7,4. Riempi con XF RPMI medium fino a un volume finale di 50 mL. Conserva il mezzo preparato in un bagno-maria o a secco a 37 °C prima dell'uso.
3. Preparazione dei mezzi per il test di glicolisi:
   1. In un tubo da 50 mL, aggiungi 250 μL di 100x L-glutamina a 45 mL di medium XF RPMI.
4. Regola il pH a 7,4, poi riempi con un medium XF RPMI fino a un volume finale di 50 mL. Tieni il mezzo preparato in un bagno d'acqua o a secco a 37 °C prima di usarlo.
   NOTA: Il pH sia del mezzo per il test Mito Stress che quello per la glicolisi deve essere ricalibrato a 7,4 dopo l'aggiunta di integratori che modificano il pH, poiché anche piccole deviazioni possono influenzare significativamente i risultati del saggio.

4. Lavaggio delle cellule e cambio del materiale prima dell'analisi

NOTA: La fase di lavaggio delle microplacche di coltura cellulare XFe96/XF Pro varierà a seconda dell'utilizzo dei tipi di cellule aderenti o non aderenti. Si prega di consultare il passo 9, Cellule aderenti (cellule tumorali, cellule BMDM primarie) e cellule non aderenti (cellule T e altri linfociti), per determinare il metodo di lavaggio migliore per il tipo cellulare utilizzato.

1. Rimuovere 160–180 μL di materiale di crescita da ogni pozzo utilizzando un multi-pipettore, lavorando una riga/colonna alla volta per evitare l'asciugatura delle cellule. Evita di toccare il fondo dei pozzi.
2. Utilizzando un pipetman a punta singola, rimuovere i restanti 20–30 μL dai pozzi, evitando di toccare lo strato cellulare sul fondo del pozzo.
3. Aggiungere 180 μL di substrati per il saggio di glicolisi o mito stress (vedi passo 3) in ciascun pozzo, seguendo la disposizione della Figura 1. Per evitare di disturbare lo strato cellulare, si dispensa delicatamente il substrato lungo la parete laterale di ciascun pozzo finché tutti i pozzi non sono pieni. Entrambi i test sono sulla stessa placca.
   NOTA: I pozzi che non contengono celle e che controllano i pozzi devono essere riempiti con mezzi per il saggio.
4. Inserire la micropiastra in un incubatore a 37 °C CO-2-less per 40–45 minuti prima di iniziare il test e iniziare a preparare i farmaci.

5. Preparazione del farmaco e caricamento della cartuccia

ATTENZIONE: Alcuni farmaci (FCCP, Antimicina A/ Rotenone, Oligomicina) sono pericolosi e devono essere gestiti con cautela. Sono necessarie misure appropriate per proteggere il personale; Questi includono l'uso di guanti e altri dispositivi di protezione individuale (DPI), nonché lo smaltimento di materiali in un contenitore o contenitore di rifiuti chimici approvato dall'istituzione.

NOTA: La concentrazione ottimale di FCCP/oligomicina dipende dal tipo cellulare e, prima del saggio, è titolata empiricamente quando si lavora con cellule particolarmente sensibili. Le concentrazioni finali possono variare per i farmaci a seconda del tipo cellulare. Prepara farmaci e materiali per il test freschi il giorno dell'uso. Non congelare né riutilizzare. La preparazione del farmaco per il saggio può essere completata entro questo periodo di 45 minuti per ottenere risultati ottimali.

1. Utilizzando i mezzi preriscaldati per il saggio Mito Stress and Glycolysis del passaggio 3, diluire i composti secondo la Tabella 1 e/o la Tabella 2 alle concentrazioni appropriate per ciascun tipo cellulare. Prepara ogni composto in un tubo separato da 15 mL (se si usano tutti e sei i composti, saranno necessari sei tubi).
2. Rimuovere la cartuccia sensore/piastra di utilità dall'incubatore_2-less CO a 37 °C e rimuovere il coperchio, posizionando con cura la guida di carico XF fornita con il kit, la guida di caricamento XF corrispondente alla porta iniettore (Guida A per la porta A) saldamente sopra la parte superiore della cartuccia sensore (vedi Figura 2).
3. Utilizzando un pipettor multicanale e un serbatoio di reagente per ogni farmaco, aggiungi lentamente il volume necessario alla corrispondente porta (vedi Tabella 1 e Tabella 2 per il volume). Tieni il pipettor fermamente verticale durante il carico dei farmaci (vedi Figura 2).
4. Cambia o riutilizza dopo aver sciacquato e asciugato accuratamente la guida di carico secondo necessità per ogni porta (Porto A, B, C e D) e scarta le punte delle pipette dopo ogni caricamento.
   NOTA: Le punte delle pipette devono adattarsi saldamente alla porta guida, ma non troppo strette, perché le punte della pipetta potrebbero rimanere bloccate nella guida! Si consiglia di testare le punte/pipettor utilizzate sulle guide prima di caricare i composti per evitare scarichi di campioni in modo errato.
5. Dopo aver caricato tutti i composti nelle rispettive porte, rimuovere la guida, confermare visivamente che tutte le porte siano piene e fissare la cartuccia con il suo coperchio. I farmaci dovrebbero corrispondere al test in ogni parte della stessa lastra (Figura 1).
   NOTA: Le concentrazioni finali raccomandate per lo stress mito sono 1 μM oligomicina, 1 μM FCCP e 0,5 μM Rotenone/Antimicina; per glicolisi, 10 mM di glucosio, 1 μM di oligomicina e 50 mM di 2-DG.

6. Installazione dell'analizzatore Seahorse XFe96

1. Accendi l'analizzatore e apri il software WAVE (vedi Figura 3).
2. Seleziona XF Mito Stress Test.
   NOTA: Finché vengono utilizzati i mezzi di prova e i composti appropriati, l'analizzatore può eseguire simultaneamente sia test mitocondriali che di glicolisi sulla stessa lastra utilizzando il test di stress XF Mito.
3. Seleziona il numero di 'Gruppi' in base alla configurazione della targa e etichetta ciascun gruppo. Procedi alla scheda successiva per assegnare i pozzi alla mappa delle placche (vedi la Figura 3). Entrambi i test vengono eseguiti sulla stessa placca.
4. Evidenzia i pozzi per ogni gruppo in base a come viene caricata la piastra piatta.
5. Regolare il programma in base al tipo di cellula e allo scopo sperimentale. Ad esempio, se l'allestimento include un gruppo preattivato prima dell'analisi o viene aggiunto un attivatore durante la corsa, estendi il tempo di incubazione in ogni ciclo per consentire l'attivazione.
6. Seleziona la scheda successiva, 'Esegui un analisi', e compila le informazioni secondo necessità per salvare il file dati.
7. Carica la cartuccia preidratata con i farmaci (dal passaggio 5) nella macchina quando indicato per l'inizializzazione. Il passaggio di inizializzazione indicherà se i sensori sono correttamente idratati e funzionanti.
8. Inizia il test e carica e scarica le lastre come indicato dalle indicazioni durante il programma.
   NOTA: Quando carichi la cartuccia o la micropiastra nell'analizzatrice, assicurati che tutti i coperchi siano rimossi! Mentre alcuni modelli analizzatori hanno una funzione di sicurezza che può rilevare i coperchi, i modelli precedenti no. Questo può danneggiare la macchina se il coperchio è intatto durante una rimonta della piastra.

7. Metodi di normalizzazione: (SRB) e conteggio nucleare (colorazione e imaging DAPI)

ATTENZIONE: Alcuni reagenti nel kit di analisi SRB sono corrosivi e bruciano se a contatto con la pelle. DAPI può causare una reazione allergica cutanea. Si raccomanda l'uso di guanti e altri DPI, così come lo smaltimento dei materiali in un contenitore o bidone di rifiuti chimici approvato dall'istituzione.

NOTA: Seleziona il metodo di normalizzazione in base alle caratteristiche e ai pretrattamenti delle cellule analizzate. Entrambi i metodi sono adatti nel confronto di cellule con diversi tassi di proliferazione, poiché entrambi tengono conto di tali variazioni. Tuttavia, se i trattamenti farmacologici inducono la senescenza, fermando la proliferazione aumentando al contempo la dimensione cellulare, la colorazione DAPI è l'approccio preferito di normalizzazione. La DAPI potrebbe non essere adatta a tipi cellulari in cui la colorazione nucleare è difficile da visualizzare (ad esempio, adipociti, eritrociti) oppure le cellule possono essere multinucleate (cioè, epatociti parenchimatici, miociti).

1. Per normalizzare le cellule utilizzando il saggio SRB (Sulfohodamina B Cell Cytoxicity Tay Kit) dopo un'analisi metabolica in tempo reale, si rimuove la piastra dalla macchina e si aggiunge 1/4 del volume del mezzo (ad esempio, 50 μL in 200 μL di mezzo di coltura) della Soluzione di Fissazione a ciascun pozzo.
   1. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora o durante la notte a 4 °C.
   2. Rimuovere la soluzione e lavare delicatamente i pozzi tre volte con 200 μL di acqua priva di RNasi/DNasi, facendo attenzione a non disturbare lo strato cellulare. Per la conservazione a breve termine (se necessario), sostituire il lavaggio finale con PBS e conservare a 4 °C.
   3. Per una normalizzazione immediata utilizzando il saggio SRB, rimuovere la soluzione di lavaggio e lasciare che la piastra si asciughi completamente all'aria a temperatura ambiente.
   4. Aggiungi 25 μL di soluzione SRB in ogni pozzo e tingi per 15 minuti a temperatura ambiente al buio oppure avvolgi la lastra in carta stagnola durante il periodo di incubazione.
      NOTA: La soluzione SRB è sensibile alla luce e questa parte dell'esperimento deve essere eseguita in un'area a scarsa luminosità.
   5. Rimuovi la soluzione per le macchie e aggiungi 100 μL di 1x Washing Solution per lavare ogni pozzo 2–3 volte.
   6. Lava il più rapidamente possibile per evitare lo sbiancamento e rimuovi le soluzioni il più possibile tramite aspirazione a vuoto.
   7. Aggiungi 100 μL di 1x Soluzione di Solubilizzazione in ogni pozzo e posiziona la piastra su uno shaker per 10 minuti a temperatura ambiente.
   8. Misurare la densità ottica (O.D.) a 565 nm su un lettore di piastre per determinare la densità del pozzo in base alla saturazione del colore (vedi Figura 3 per riferimento visivo).
   9. Esporta i dati dei valori O.D. come file Excel. Questo foglio di calcolo verrà incollato nel software WAVE per la normalizzazione (passo 8).
      NOTA: Se si osserva colore intenso (> O.D. 3,5) a causa di sovraccarico cellulare, può essere utilizzata una lunghezza d'onda subottimale (ad esempio, 490–530 nm) per riportare le letture nell'intervallo lineare dello strumento. Correggere il background sottraendo l'O.D. del controllo contenente solo il mezzo di coltura (pozzo di controllo di fondo) da tutte le letture dei campioni.
2. Per la colorazione DAPI, diluire la soluzione DAPI stock a 300 nM in 1x PBS.
   1. Lava ogni pozzetto della piastra cellulare 3 volte delicatamente con 200 μL 1x PBS.
      NOTA: Se ci sono celle non aderenti, centrifuga la piastra a 200 x g per 3 minuti senza freno, per assicurare che le celle siano sospese sul fondo di ogni pozzo dopo ogni fase di lavaggio.
   2. Fissare le cellule in PFA al 2%–4% diluito in 1x PBS per 10–15 minuti a temperatura ambiente.
   3. Lava ogni pozzetto della piastra cellulare 3 volte delicatamente con 200 μL 1x PBS.
   4. Aggiungere circa 150 μL di questa soluzione diluita di colorazione DAPI a ciascuno, assicurandosi che le celle siano completamente coperte in ogni pozzo.
   5. Incubare 1–5 minuti a temperatura ambiente in un'area a scarsa luce (o in una piastra di copertura in carta stagnola).
   6. Rimuovere la soluzione di macchia DAPI da ogni pozzo.
   7. Lava ogni pozzetto della piastra cellulare 3 volte delicatamente con 200 μL 1x PBS.
   8. Rimuovi eventuali PBS rimasti.
   9. Visualizza le celle a qualsiasi Eccitazione/Emissione tra 358–461 nm o sotto qualsiasi impostazione di filtro DAPI al microscopio.
   10. Esporta i dati dei valori di emissione come file Excel. Questo foglio di calcolo verrà incollato nel software WAVE per la normalizzazione (passo 8).

8. Analisi e normalizzazione dei dati

NOTA: Per l'analisi dei dati può essere utilizzato "Wave" o altri software. Il protocollo fornito è applicabile al software Wave.

1. Apri i risultati dell'analisi in Wave (vedi Figura 3). La normalizzazione viene eseguita utilizzando valori ottenuti dal file Excel generato dal lettore di micropiastre dopo la colorazione SRB (passo 7).
2. Clicca su "Normalizza".
3. Nella finestra aperta, scegli "seleziona tutto" seguito da "incolla" per incollare i dati copiati dal foglio Excel generato durante il passaggio di normalizzazione. Clicca su "Applica". Questa procedura normalizzava automaticamente tutti i dati sperimentali.
4. Per generare un report, clicca su "Esporta a", nel pannello che si apre a destra seleziona "XF Cell Mito Stress Test Report Generator." Salva il file generato. Durante l'analisi, selezionare solo i pozzi assegnati al Test di Stress di Mito (vedi Figura 3).
5. Per generare un report, clicca su "Esporta a"; nel pannello che si apre a destra, seleziona "XF Cell Glicolysis Stress Test Generator Report Generator." Salva il file generato. Durante l'analisi, selezionare solo i pozzi assegnati al Test di Sforzo per la Glicolisi (vedi Figura 3).

9. Cellule aderenti vs. non aderenti

NOTA: Le cellule aderenti e non aderenti differiscono per comportamento di crescita, attacco superficiale e necessità di manipolazione. Le cellule aderenti (ad esempio, cellule tumorali, BMDM) si attaccano alla superficie della coltura, quindi placcare e lavare non richiedono precauzioni particolari. Le cellule non aderenti (ad esempio, cellule T, altri linfociti) rimangono in sospensione e richiedono diversi metodi di centrifugazione, risospensione e placcatura. Comprendere queste differenze è fondamentale per una raccolta cellulare accurata, un trattamento farmacologico e una coerenza nel saggio.

1. Assicurarsi che tutte le cellule utilizzate per l'esperimento siano coltivate in un mezzo e in un recipiente di coltura cellulare scelto poco prima dell'esecuzione del saggio, ma poi trasferire sulla micropiastra per eseguire il saggio.
   NOTA: Sebbene il mezzo XF RPMI sia raccomandato per i tipi cellulari descritti in questo protocollo, per altri tipi di cellule si consulta il produttore per assicurarti che venga utilizzato il mezzo appropriato.
2. Per le cellule aderenti (cellule tumorali, cellule BMDM), si seminano le cellule nella micropiastra di coltura XFe96/XF Pro Cell Culture 4–5 ore prima del saggio a una densità cellulare ottimizzata (vedi passo 1) nel volume del mezzo di 200 μL e si collocano in un incubatore a 37 °C_CO2 .
   NOTA: Le cellule BMDM possono essere placcate fino a 24 ore prima del saggio, poiché non proliferano e mantengono la stessa densità cellulare. Per le cellule aderenti a rapida crescita, come le linee cellulari tumorali, si consiglia di placcare il giorno del test se non è necessario un trattamento aggiuntivo e di analizzarle non appena le cellule sono attaccate per evitare ulteriori sviluppi cellulari. Se questo design non è possibile, la normalizzazione in quantità/pozzo proteico o in numero/pozzo di nuclei è un passaggio necessario.
3. Assicurarsi che i pozzi d'angolo per ogni quattro angoli della micropiastra siano privi di celle ma pieni di mezzo, poiché questo viene misurato come i pozzi di controllo blank.
4. Dopo 3–5 ore di incubazione, osservare la micropiastra per assicurarsi che le cellule siano attaccate alla piastra a un livello uniforme sul fondo di ogni pozzo.
5. Se le cellule non sono ancora attaccate, la piastra può essere inserita nell'incubatore a 37 °C_CO2 per un tempo aggiuntivo fino a quando le cellule non sono completamente attaccate.
6. Successivamente, prepara la micropiastra con le cellule aderenti per il lavaggio come indicato nel passo 4 per procedere con il saggio.
7. Per le cellule non aderenti (cellule T e altri linfociti), ricoprire la micropiastra con poli-D-lisina prima di aggiungere le cellule alla placca.
   NOTA: Sebbene in questo protocollo sia consigliato un rivestimento con poli-D-Lisina, a seconda del tipo cellulare, un altro rivestimento a piastra (ad esempio collagene, fibronectina, gelatina) potrebbe essere più adatto. Se utilizzi un rivestimento alternativo, si prega di seguire le istruzioni del produttore.
8. Per rivestire la microplacca, preparare 2,5 mL di una soluzione di poli-D-Lisina da 20 μg/mL (diluizione 50x di 1 mg/1 mL di soluzione acquea) in 0,1 M bicarbonato di sodio, pH 8,0 (il bicarbonato fornisce il pH ottimale per l'adsorbimento adesivo). Questo passaggio può essere eseguito prima di eseguire il test o il giorno stesso del processo.
9. Applicare 25 μL della soluzione su ciascun pozzo della piastra e incubare sul banco o su un baldorino a piastra a temperatura ambiente per 20–30 minuti.
10. Aspirare o pipettare via eventuali residui di soluzione e lavare ogni pozzo due volte utilizzando 200 μL di acqua priva di RNAasi/DNAsi.
11. Aspettare che i pozzi siano asciutti (1–2 ore) prima di seminare le cellule sulla microplacca.
12. Successivamente, prepara la micropiastra con celle non aderenti per la fase di lavaggio centrifugando la piastra a 200 x g per 3 minuti senza freno, per assicurare che le celle siano sospese sul fondo di ogni pozzo.
13. Procedere al passo 4 e continuare il resto del test come menzionato nei passaggi 5–7.

Risultati

Questo protocollo combinato è stato sviluppato per consentire di eseguire entrambi gli saghi sulla stessa placca. Ad esempio, questo metodo è stato utilizzato per chiarire la segnalazione crosstalk mGluR1−TCR sulla competenza metabolica delle cellule T CD8+ durante^{l'attivazione 10}. Questo mirava a valutare l'impatto dell'inibizione di mGluR1 sulla transizione alla glicolisi e sui cambiamenti della respirazione mitocondriale, processi essenziali per il funzionamento ottimale delle cellule T, minimizzando al contempo il numero di cellule T utilizzate in ciascun esperimento. La stessa tecnica a piastra singola fu applicata efficacemente anche ad altri tipi cellulari, come i macrofagi derivati dal midollo osseo aderente (BMDM; Figura 4 e Figura 5), e alle cellule non aderenti, come le cellule mononucleari del sangue periferico umano (PMBC; Figura 3). È stato dimostrato che il blocco della segnalazione mGluR1 sulle cellule T CD8+ attivate influisce sulla produzione di energia mitocondriale e non mitocondriale. Al contrario, le cellule naïve non hanno mostrato cambiamenti significativi nei loro profili energetici metabolici (Figura 6A,B). Il test di Mito Stress delle cellule T CD8+ attivate ha mostrato una respirazione basale e massima elevata, oltre a una capacità di riserva respiratoria elevata (Figura 6C). Le cellule T trattate con CPCCOEt, un antagonista non competitivo che blocca la segnalazione a valle quando il glutamato si lega a mGluR1, avevano tassi di consumo di ossigeno (OCR) ridotti come le cellule naïve e hanno causato una diminuzione della produzione di ATP (Figura 6C). Il test di glicolisi ha inoltre mostrato che solo le cellule T CD8+ attivate non trattate producevano ATP tramite glicolisi, e il trattamento con CPCCOE mostrava un'attività metabolica paragonabile alla condizione di naïve (Figura 6D). Questi risultati confermano che la segnalazione di mGluR1 è essenziale per il corretto funzionamento delle cellule T CD8⁺ al momento dell'attivazione.

Figura 1: Questa figura illustra la panoramica della configurazione della placca della microplacca che include il saggio Mito Stress e Glicolisi nella stessa placca. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Caricamento della cartuccia del farmaco. (A) Una mappa dettagliata dei sensori e delle porte sul retro e davanti della cartuccia, che indica quale farmaco deve essere caricato in quale porta. (B) L'orientamento raccomandato delle guide sopra la cartuccia per il caricamento delle corrispondenti porte e la posizione consigliata per l'uso del pipettor multicanale sopra le guide. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Utilizzo del programma WAVE per eseguire e analizzare il saggio. (A) Il processo di implementazione del programma include la selezione del tipo di saggio, l'assegnazione dei gruppi, la creazione della mappa delle placche e la programmazione dei porti del farmaco. (B) L'ordine dei farmaci da caricare nelle corrispondenti porte dipende dal fatto che il campione sia Mito Stress o Glicolisi. (C) Un primo piano della colorazione SRB durante l'ultimo passaggio di normalizzazione. (D) Dopo la normalizzazione, i dati della lastra possono essere esportati separatamente sia come glicolisi che come test di stress Mito per la stessa placca. (E) I dati per lo stress di Mito possono essere selezionati modificando la selezione corrente solo per i campioni di stress di Mito. (F) I dati per la glicolisi possono essere selezionati modificando la selezione corrente solo per i campioni di glicolisi. I dati di esempio utilizzati in questa figura provengono da un'analisi delle cellule mononucleari del sangue periferico umano. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Esecuzione simultanea di Mito Stress eseguita sulla stessa placca. I macrofagi derivati dal midollo osseo derivati da topi WT e Tusc2 KO di 2 mesi sono stati sottoposti a entrambi i tipi di analisi. Le cellule sono state lasciate non trattate (sham) o stimolate con LPS (100 ng/mL) per 5 ore prima della placcatura (30.000 cellule/pozzo). I test di stress Mito e glicolisi sono stati eseguiti in parallelo per consentire un confronto accurato, come mostrato nella Figura 1. (A) Profili di Mito Stress per diversi tipi di cellule (WT e KO) e condizioni (ingenue e attivate), generati tramite software Wave. La normalizzazione è stata eseguita tramite colorazione con SRB come descritto nel passo 7. (B) Grafici a barre comparativi dei parametri analizzati in ciascun test. ^∗ p ≤ 0,05, ^∗∗p ≤ 0,005, test T dello studente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Esecuzione simultanea dei test di stress per glicolisi eseguiti sulla stessa placca. I macrofagi derivati dal midollo osseo derivati da topi WT e Tusc2 KO di 2 mesi sono stati sottoposti a entrambi i tipi di analisi. Le cellule sono state lasciate non trattate (sham) o stimolate con LPS (100 ng/mL) per 5 ore prima della placcatura (30.000 cellule/pozzo). I test di stress Mito e glicolisi sono stati eseguiti in parallelo per consentire un confronto accurato, come mostrato nella Figura 1. (A) Profili di stress della glicolisi per diversi tipi cellulari (WT e KO) e condizioni (ingenue e attivate), generati tramite software Wave. La normalizzazione è stata eseguita tramite colorazione con SRB come descritto nel passo 7. (B) Grafici a barre comparativi dei parametri analizzati in ciascun test. ^∗ p ≤ 0,05, ^∗∗p ≤ 0,005, test T dello studente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Test di stress mito e glicolisi su una singola piastra utilizzando cellule T CD8⁺ purificate da splenociti di topo. (A) Profili rappresentativi del test di stress mitocondriale confrontando le variazioni dipendenti dal farmaco nel tasso di consumo di ossigeno (OCR) delle cellule T CD8+ eseguite con gruppi di cellule T naïf, attivate e attivate + inibitori di mGluR1. (B) Profili rappresentativi del Test di Glicolisi che confrontano le variazioni dipendenti da farmaci nel Tasso di Acidificazione Extracellulare (ECAR) delle cellule T CD8+ eseguite su gruppi inibitori naivi, attivati e attivati + mGluR1. (C) Grafici a barre che mostrano cambiamenti quantitativi nei diversi parametri della respirazione mitocondriale delle cellule T CD8+ nei gruppi inibitori naïf, attivati e attivati + + inibitori. Le barre rappresentano la media ± SEM (n = 4). (D) Grafici a barre che mostrano cambiamenti quantitativi nei diversi parametri della glicolisi nelle cellule T CD8⁺ naïve, attivate e attivate + inibitori di mGluR1. Le barre rappresentano la media ± SEM (n = 4). ^∗p ≤ 0,05, ^∗∗ p ≤ 0,005, Test T dello studente. Questa figura è adattata da Aquino et ^al.10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

	Pozzo finale (μM)	Volume della soluzione di stock (μL)	Media Volume (uL)	Porta 10x (μM)	Volume aggiunto alla porta (μL)
Oligomicina Port A	0.5	150	2850	5	20
	1.5	450	2550	15	20
	2.5	630	1890	25	20
Port B FCCP	0.125	37.5	2962.5	1.25	22
	0.25	75	2925	2.5	22
	0.5	150	2850	5	22
	1	300	2700	10	22
	2	600	2400	20	22
Porto C Rotenone/Antimicina	0.5	300	2700	5	24

Tabella 1: Preparazione del composto per il caricamento delle cartucce sensori XFe96 per Mito Stress.

	Pozzo finale	Volume della soluzione di stock (μL)	Volume del Mezzo (μL)	Porta 10x	Volume aggiunto alla porta (μL)
Glucosio Port A	250 mM	100	2400		20
Oligomicina della porta B	0,5 μM	150	2850	5 uM	22
	1,5 μM	450	2550	15 uM	22
	2,5 μM	630	1890	25 uM	22
Porto C 2-DG	50 mM	3000	0	500mM	24

Tabella 2: Preparazione del composto per il caricamento delle cartucce sensori XFe96 per la glicolisi.

Discussione

Il protocollo qui presentato consente confronti accurati e affidabili di due principali vie di produzione di energia, la fosforilazione ossidativa (produzione mitocondriale di ATP) e la glicolisi anaerobica (produzione di ATP fuori dai mitocondri, senza necessità di ossigeno), e due diversi test di sforzo all'interno di un'unica esecuzione. Inoltre, il disegno sperimentale tiene conto del tipo di cellule da analizzare, consentendo una comprensione più ampia dell'analisi del metabolismo cellulare, minimizzando al contempo la quantità di campione e reagenti utilizzati.

Le differenze tra i test di Mito Stress e quelli di glicolisi eseguiti su protocolli di analisi metabolica in tempo reale progettati e venduti da Agilent, Inc. sono sostanziali. Questi due saghi richiedono medi di analisi distinti, farmaci specifici e diversi sistemi di strumenti. Il test da sforzo Mito utilizza mezzi di prova contenenti glucosio, L-glutamine e piruvato, mentre il test di glicolisi utilizza mezzi senza glucosio integrati solo con L-glutamina. I test vengono esaminati con diversi composti: Oligomicina → FCCP → Antimicina A + Rotenone per il test di sforzo Mito, e Oligomicina → glucosio → 2-DG per il test di sforzo della glicolisi. Di conseguenza, questi test vengono normalmente eseguiti su piastre separate in momenti diversi, poiché l'analizzatore metabolico in tempo reale può ospitare solo una piastra alla volta.

Per affrontare queste limitazioni, è stato sviluppato un protocollo combinato che consente di eseguire entrambi i saghi sulla stessa lastra utilizzando la configurazione del Mito Stress Test in un precedente articolo¹⁰. Sono fornite raccomandazioni per l'analisi di diversi tipi cellulari, incluse cellule immunitarie, tumorali, aderenti e cellule in sospensione. Queste linee guida possono essere applicate individualmente o in combinazione, offrendo flessibilità a seconda degli obiettivi dell'espertore e delle risorse disponibili.

La normalizzazione delle cellule tramite SRB Assay o DAPI consente anche maggiore flessibilità, nel caso di utilizzare più tipi cellulari con tassi di crescita/dimensione differenti ^9,11. Inoltre, poiché questa tecnica richiede una sola lastra per due sami, può essere combinata con una varietà di tipi di campione per misurare processi metabolici.

Fattori che influenzano il successo del metodo: (1) numero ottimale di cellule per pozzo; (2) attacco efficiente delle celle; e (3) un carico attento delle cartucce, poiché due set distinti di farmaci devono essere caricati in sezioni separate della cartuccia.

I vantaggi scientifici ed esperimentali del metodo includono il confronto diretto all'interno dello stesso contesto biologico. L'uso delle stesse cellule in condizioni di coltura identiche elimina la variabilità tra placche o scorrimenti e consente un confronto più accurato tra la funzione mitocondriale e glicolitica nello stesso campione. Include anche una visione integrata del metabolismo cellulare. Misurare sia la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) sia la glicolisi in parallelo fornisce un'istantanea completa del metabolismo energetico complessivo di una cellula e della sua flessibilità nel passare tra i percorsi. Questo saggio parallelo riduce anche la variabilità biologica. Le differenze nella densità di placcatura cellulare, nel numero di passaggio o nelle condizioni ambientali sono minimizzate poiché entrambi i test vengono eseguiti sulla stessa popolazione cellulare, il che porta a una migliore riproducibilità. Eseguire entrambi i test simultaneamente riduce la variabilità da una corsa all'altra causata dalla calibrazione delle cartucce del sensore, dai cambiamenti di temperatura o dalla preparazione del reagente.

I benefici tecnici di questa tecnica includono un aumento dell'efficienza combinando saggi, che fa risparmiare tempo, reagenti e consumabili a piastra, rendendola importante per studi su larga scala o ad alta produttività. Questo consente requisiti di campione più bassi. È necessaria una sola lastra cellulare, il che è vantaggioso quando si lavora con cellule primarie limitate o rare (ad esempio, linfociti, cellule derivate dal cervello). Si verifica una migliore normalizzazione tra i saggi poiché entrambi i test utilizzano la stessa placca, la normalizzazione (ad esempio, al contenuto proteico o al numero cellulare) ed è più coerente e affidabile. Con questa coerenza, la correlazione dei dati si migliora. L'abbinamento diretto dei parametri mitocondriali e glicolitici provenienti dallo stesso campione facilita la profilazione metabolica e le analisi statistiche.

L'unica limitazione nota di questa tecnica è che combinare due protocolli su una singola piastra riduce il numero di repliche del pozzo disponibili. Si raccomanda di limitare il numero di condizioni per piastra per garantire almeno 8 repliche di pozzo per condizione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubi centrifughe da 15 mL, imballati con tappo a vite, sterili, 500 tubi/unità	Genesee Scientific	21-408B
Punte per pipette Biologix-200 e mu; l Esteso (Zaino, Sterile)	Biologix USA	SKU 21-0200
BioTek Sinergia H1	BIOSPX
Microscopio a fluorescenza BZ-X700	Keyence
Corning  Serbatoi di reagenti sterili e usa e getta Costar	Fisher	4873
Soluzione D-(+)-glucosio al 45% in H2O	Sigma	G9769
DAPI, cloridrato	Thermofisher Scientific	D1306
Centrifuga Eppendorf 5810 R	Eppendorf
GenClone Siero Fetale Bovino Inattivato	Genesee Scientific	25-514H
L-Glutammina 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
Olympus Plastics 22-284, Olympus 1,7 ml Microtubi, trasparente, polipropilene sterile, a prova di ebollizione, ster, 50/sacchetto, 250 tubi per unità	Genesee Scientific	22-284
Olympus Plastics 28-108, tubi centrifughe conici da 50 ml, polipropilene sfuso, sterili, 20 sacchi da 25 tubetti, 500/unità	Genesee Scientific	28-108
Paraformaldeide 16% soluzione EM grade	Scienza della microscopia elettronica	15710
Poli-D-Lisina idrobromuro liofilizzato	Sigma	P6407
Bagno d'acqua Precision 180	Precision Scientific	51221060
Incubatore Precision Scientific GCA Modello 26	Thelco	51221091
QBI 120-095-671 Miscela di Penicillina/Streptomicina, 100x Miscela Pen/Streptococco, 10 x 10 mL/unità	Genesee Scientific	25-827
QBI PBS, 1x, senza Ca, Mg, Fenolo Rosso, 0,1 Sterile Filtrato	Genesee Scientific	25-507B
RPMI 1640, con L-Glutamina	Genesee Scientific	25-506
Seahorse XF RPMI medium, pH 7,4, 500 mL	Agilent	103576-100
Analizzatore Seahorse XFe96	Agilent
Seahorse XFe96/XF Pro FluxPak	Agilent	103792-100	include 18 cartucce sensori XFe96/XF Pro, 18 micropiastre di coltura cellulare XFe96/XF Pro, 1 bottiglia di Seahorse XF Calibrant Solution 500mL e 3 paia di guide di caricamento XF
Bicarbonato di sodio	Sigma	S6014
Piruvato di sodio (100mM) 100X	Gibco	11360-070
Test SRB (Kit di saggio Sulfurhodamina B)	Abcam	ab235935
Pipettor VWR Signature Ergonomic High Performance Multicanale	Avantor	89079-956
Kit di test di stress Mito per celle XF	Agilent	103015-100
Kit per il saggio XF glicolitico	Agilent	103344-100