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Articolo metodologico

Isolamento primario, coltura e verifica fenotipica dei condrociti articolari del ginocchio di ratto

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⸱

DOI:

10.3791/69509

⸱

7 novembre 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Longfu Hospital, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive l'isolamento e la coltura dei condrociti articolari primari del ginocchio di ratto utilizzando la digestione enzimatica sequenziale. Il metodo produce condrociti con caratteristiche fenotipiche convalidate, fornendo ai ricercatori un approccio affidabile per le applicazioni di ricerca sulla cartilagine.

Abstract

Il danno alla cartilagine derivante da traumi, invecchiamento o condizioni infiammatorie rimane una sfida clinica significativa a causa della capacità rigenerativa intrinsecamente limitata del tessuto. I condrociti, essendo l'unico componente cellulare della cartilagine, sono responsabili del mantenimento della struttura e della funzione della matrice extracellulare, rendendoli essenziali per comprendere la fisiologia, la patologia e la rigenerazione della cartilagine. Il presente studio presenta un protocollo completo e standardizzato per l'isolamento, la coltura e la verifica fenotipica dei condrociti articolari primari di ratto dall'articolazione del ginocchio. La procedura utilizza ratti giovani e lattanti per garantire la massima vitalità cellulare e impiega la digestione enzimatica sequenziale con tripsina e collagenasi di tipo II per un'efficiente estrazione cellulare. Il fenotipo dei condrociti è verificato attraverso l'immunofluorescenza del collagene di tipo II, l'analisi citofluorimetrica e i saggi di stimolazione dell'interleuchina (IL)-1β per confermare l'identità cellulare e la risposta infiammatoria. Questo flusso di lavoro ottimizzato e riproducibile consente la generazione di colture di condrociti ad alta purezza adatte per lo screening di farmaci, le indagini meccanicistiche e le applicazioni di ingegneria tissutale, facendo progredire la ricerca sulla biologia della cartilagine.

Introduzione

La cartilagine è un tipo specializzato di tessuto connettivo che svolge molteplici funzioni cruciali, tra cui fornire supporto, ammortizzazione e assorbimento degli urti1. Svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento della stabilità strutturale e nel garantire la mobilità all'interno del sistema scheletrico 2,3. Lesioni meccaniche, alterazioni degenerative, infiammazioni o anomalie metaboliche possono causare danni alla cartilagine 4,5,6. A causa della sua intrinseca mancanza di vasi sanguigni e nervi, combinata con la limitata capacità proliferativa dei condrociti, la riparazione della cartilagine presenta sfide significative. Malattie come l'osteoartrite (causata da alterazioni degenerative e lesioni meccaniche) e l'artrite reumatoide (causata da risposte infiammatorie autoimmuni) possono causare danni irreversibili alla cartilagine, diminuendo notevolmente la qualità della vita dei pazienti 7,8,9. In quanto tipo di cellula esclusiva all'interno del tessuto cartilagineo, i condrociti sono responsabili di funzioni chiave come la secrezione e il mantenimento della matrice extracellulare, il supporto dello sviluppo scheletrico, la partecipazione all'ammortizzazione e alla riparazione articolare e la regolazione centrale della crescita e del metabolismo della cartilagine 10,11,12.

I condrociti sono confinati all'interno delle lacune della matrice avascolare, con conseguente capacità gravemente limitata per la propria proliferazione e riparazione tissutale13,14. Lo stato funzionale dei condrociti determina direttamente la salute del tessuto cartilagineo15. La disfunzione dei condrociti, causata dall'invecchiamento, dall'infiammazione, da traumi o da fattori genetici, provoca una diminuzione della sintesi della matrice e un aumento della degradazione16,17. Questo processo patologico provoca la degenerazione della cartilagine (come nell'osteoartrite), portando alla compromissione delle sue funzioni essenziali di supporto, ammortizzazione e lubrificazione. La limitata capacità rigenerativa della cartilagine è la ragione principale della sfida significativa nella sua riparazione e costituisce un'area di ricerca chiave nell'ortopedia moderna e nella medicina rigenerativa. L'attuale ricerca sulla cartilagine è diventata un obiettivo importante nel campo, con interventi basati su farmaci, ingegneria tissutale e terapia genica che richiedono l'isolamento dei condrociti per studi in vitro 18,19,20,21,22,23,24,25. Di conseguenza, l'isolamento e l'identificazione dei condrociti costituisce un passo fondamentale in molti approcci sperimentali. Sebbene le linee cellulari immortalizzate simili ai condrociti come SW1353 siano utilizzate come surrogati convenienti in alcuni studi, mancano dell'espressione di marcatori fenotipici critici, in particolare il collagene di tipo II, che è essenziale per l'autentica funzione dei condrociti e la formazione della matrice26. Pertanto, i condrociti primari rimangono il gold standard per la ricerca che richiede rilevanza fisiologica. Rispetto ai protocolli pubblicati in precedenza che richiedono più combinazioni di enzimi o un'ampia manipolazione meccanica, l'approccio semplificato alla digestione enzimatica riduce la complessità e il tempo di elaborazione rispetto ai metodi che richiedono più combinazioni di enzimi o un'ampia manipolazione meccanica. Inoltre, l'incorporazione di fasi di convalida complete garantisce un'identificazione coerente dei condrociti funzionali e migliora la riproducibilità tra esperimenti e laboratori.

I condrociti sono caratterizzati dalla loro secrezione di collagene di tipo II, mentre sotto stimolazione da fattori infiammatori, sintetizzano e rilasciano estensivamente metalloproteinasi della matrice (MMP)27. Pertanto, dopo l'isolamento dei condrociti, le cellule sono state identificate tramite immunofluorescenza del collagene di tipo II e la purezza dei condrociti è stata valutata utilizzando la citometria a flusso. E stimolati con interleuchina (IL)-1β per confermare la loro caratteristica sintesi e secrezione di metalloproteinasi della matrice. Questo studio descrive il processo di estrazione e caratterizzazione dei condrociti da topi neonati, stabilendo una base per successivi esperimenti relativi ai condrociti.

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Protocollo

L'uso di soggetti animali in questo studio è stato approvato dal comitato etico sperimentale per la cura e il benessere degli animali del China-Japan Friendship Hospital (n. zryhyy21-21-05-16). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Animali da esperimento e lavoro preparatorio

NOTA: La cartilagine delle articolazioni di ratti, conigli e esseri umani dopo l'artroplastica totale del ginocchio può essere utilizzata per l'isolamento dei condrociti. Tuttavia, a causa della loro maggiore vitalità, in questo studio sono stati utilizzati ratti lattanti per l'estrazione dei condrociti.

  1. Trasporta i ratti lattanti dall'impianto di produzione animale sperimentale al laboratorio utilizzando contenitori di trasferimento specializzati.
  2. Eutanasia dei ratti lattanti mediante asfissia da CO2 (seguendo protocolli istituzionalmente approvati) e sciacquare le loro superfici corporee con soluzione sterile.
  3. Immergere i ratti lattanti soppressi in etanolo al 75% per 10 minuti per disinfettare i contaminanti superficiali.
  4. Trasferire i ratti lattanti disinfettati in una cabina di biosicurezza e metterli in piastre di Petri sterili.
    NOTA: Un'accurata pulizia della superficie e l'immersione con etanolo nei ratti lattanti sono passaggi fondamentali per prevenire la contaminazione batterica o fungina, che può influire negativamente sugli esperimenti successivi.

2. Isolamento del tessuto cartilagineo articolare

NOTA: La cartilagine neonatale appare come uno strato traslucido, bianco-bluastro che copre l'epifisi ossea. Durante questa fase devono essere seguite rigorose tecniche asettiche per evitare contaminazioni che potrebbero compromettere gli esperimenti successivi.

  1. Isolare l'articolazione del ginocchio del ratto lattante utilizzando un bisturi e forbici oftalmiche, quindi rimuovere il tessuto cutaneo sovrastante.
  2. Trasferire l'articolazione del ginocchio sezionata in una nuova capsula di Petri sterile e sostituire il bisturi e le forbici oftalmiche.
  3. Prelevare la cartilagine articolare dall'articolazione del ginocchio utilizzando un bisturi, quindi tagliare accuratamente il tessuto connettivo circostante con le forbici oftalmiche.

3. Digestione del tessuto cartilagineo

NOTA: Utilizzare la tripsina per digerire i tessuti connettivi che circondano la cartilagine, seguita da collagenasi II allo 0,2% per la digestione della matrice cartilaginea.

  1. Aggiungere la cartilagine raccolta a 3 volumi di tripsina allo 0,25% e incubare in un agitatore termostatico a 37 °C agitando per 30 min.
  2. Terminare la digestione aggiungendo PBS contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS). Rimuovere i tessuti aderenti dalla cartilagine utilizzando le forbici oftalmiche. Centrifugare (4 °C, 500 × g, 5 min) ed eliminare il surnatante.
  3. Risospendere il tessuto cartilagineo in PBS, centrifugare (4 °C, 500 × g, 5 min) ed eliminare il surnatante. Ripetere questa fase di lavaggio 3 volte.
  4. Aggiungere lo 0,2% di collagenasi II al tessuto cartilagineo lavorato e digerire in un agitatore termostatico a 37 °C agitando per 4 ore.

4. Isolamento e coltura dei condrociti

NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili in una cappa di biosicurezza. I guanti sterili devono essere indossati durante la dissociazione meccanica del tessuto cartilagineo utilizzando uno stantuffo della siringa sul filtro cellulare per prevenire la contaminazione sperimentale. In condizioni di coltura standard, i condrociti primari richiedono in genere circa 2-3 giorni per raggiungere l'80%-90% di confluenza per il primo passaggio.

  1. Posizionare un colino cellulare da 200 μm su un piatto di coltura sterile e filtrare la sospensione di cartilagine digerita attraverso la rete.
  2. Macinare i frammenti di cartilagine residui sul colino utilizzando uno stantuffo per siringa sterile, quindi sciacquare il colino con un mezzo DMEM completo.
  3. Raccogliere tutti i filtrati, centrifugare (4 °C, 500 × g, 5 min) ed eliminare il surnatante.
  4. Risospendere il pellet in PBS, centrifugare (4 °C, 500 × g, 5 min) ed eliminare il surnatante.
  5. Risospendere le cellule in un terreno DMEM completo e trasferirle in un pallone di coltura T25.
  6. Incubare il matraccio in un'incubatrice umidificata (37 °C, 5% CO2).
  7. Cellule di passaggio a questa confluenza utilizzando tripsina-EDTA e subcoltura in un rapporto 1:2.

5. Colorazione con immunofluorescenza del collagene di tipo II per l'identificazione dei condrociti

NOTA: I condrociti aderenti sono caratterizzati da una morfologia fusiforme e poligonale. Tutte le analisi dei biomarcatori presentate in questo studio sono state eseguite utilizzando cellule al Passaggio 2. I condrociti al passaggio 3 iniziano a mostrare una dedifferenziazione più pronunciata, caratterizzata da uno spostamento verso una morfologia a forma di fuso, simile a quella dei fibroblasti e da una decelerazione del tasso di proliferazione. Questo cambiamento fenotipico diventa più evidente dopo il passaggio 4. Al passaggio 6, la stragrande maggioranza delle cellule adotta una forma allungata, simile a quella dei fibroblasti. Le diluizioni degli anticorpi sono state determinate in base alle raccomandazioni del produttore e convalidate dai nostri esperimenti preliminari per garantire una specificità e un'intensità del segnale ottimali.

  1. Seminare i condrociti in una piastra a 24 pozzetti e coltivare per 24 ore per consentire l'adesione cellulare.
  2. Scartare il terreno di coltura e lavare le cellule 3 volte con PBS (aggiungere PBS a ciascun pozzetto, incubare per 5 minuti, quindi aspirare).
  3. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 10 minuti, quindi lavare 3 volte con PBS.
  4. Permeabilizzare le cellule con Triton X-100 allo 0,3% (preparato in PBS) per 10 min.
  5. Lavare le cellule 3 volte con PBS, quindi bloccare con una soluzione bloccante priva di animali (150 μL/pozzetto, diluita al 5× in PBS) a temperatura ambiente per 1 ora.
  6. Rimuovere la soluzione bloccante e incubare con anticorpo primario (anti-Col II, diluizione 1:200) per una notte a 4 °C.
  7. Recuperare l'anticorpo primario e lavare le cellule 3 volte con PBS.
  8. Aggiungere l'anticorpo secondario IgG anti-coniglio coniugato Alexa Fluor 488 (diluizione 1:50) e incubare a 37 °C per 1,5 ore al buio.
  9. Rimuovere l'anticorpo secondario e lavare le cellule 3 volte con PBS.
  10. Montare con un mezzo antisbiadimento contenente DAPI e asciugare al buio per 10 minuti.
  11. Osserva e cattura immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita.

6. Analisi citofluorimetrica della purezza dei condrociti

NOTA: I condrociti sono caratterizzati dalla loro capacità di sintetizzare e secernere collagene di tipo II, che funge da marcatore definitivo per l'identificazione. La linea cellulare di condrosarcoma SW1353, pur mostrando alcune caratteristiche condrocitiche, manca della capacità di secrezione di collagene di tipo II e quindi funge da controllo negativo in questo esperimento.

  1. Digerire sia i condrociti che le cellule SW1353 utilizzando tripsina priva di EDTA.
  2. Neutralizzare la digestione con il terreno DMEM completo e risospendere le cellule in PBS.
  3. Incubare le cellule con la soluzione di fissazione/permeabilizzazione per 15 minuti, quindi aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio.
  4. Centrifugare (500 × g, 5 min), scartare il surnatante e incubare con 100 μL di anticorpo anti-collagene di tipo II (diluizione 1:100) per 15 min al riparo dalla luce, quindi aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio.
  5. Centrifugare (500 × g, 5 min), scartare il surnatante e incubare con Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG secondary antibody per 30 min al riparo dalla luce, quindi aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio.
  6. Centrifugare (500 × g, 5 min), scartare il surnatante, risospendere ciascun campione in un tampone di lavaggio da 200 μl e analizzare mediante citometria a flusso.

7. Stimolazione IL-1β dei condrociti

NOTA: La produzione di metalloproteinasi della matrice (MMP) in risposta alla stimolazione con IL-1β è una caratteristica distintiva dei condrociti. Pertanto, questo studio impiega la stimolazione dell'IL-1β per convalidare questa caratteristica fenotipica nei condrociti isolati.

  1. Digerire i condrociti dai fiaschi di coltura e risospendere in mezzo DMEM completo.
  2. Contare le cellule e regolare la concentrazione a 5 × 105 cellule/mL utilizzando il DMEM completo.
  3. Seminare le cellule in una piastra a 6 pozzetti (24 pozzetti in totale), con 12 pozzetti designati come gruppo di controllo in bianco e 12 pozzetti come gruppo di stimolazione IL-1β.
  4. Incubare la piastra in un incubatore per colture cellulari per 12 ore.
  5. Aggiungere 10 ng/mL di IL-1β al gruppo di stimolazione dopo la completa adesione cellulare.
  6. Raccogliere i surnatanti delle colture cellulari dopo 24 ore per l'analisi ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).
  7. Lavare le celle due volte con PBS.
  8. Lyse 6 pozzetti di controllo e 6 pozzetti stimolati con IL-1β con tampone RIPA per la successiva analisi Western blot.
  9. Estrarre l'RNA da 6 pozzetti di controllo e 6 pozzetti stimolati con IL-1β utilizzando TRIzol per l'analisi qPCR.

8. Analisi quantitativa della PCR in tempo reale (qRT-PCR)

NOTA: Tutti gli esperimenti relativi all'RNA sono stati eseguiti utilizzando materiali di consumo trattati con DEPC. In breve, le provette e i puntali sono stati immersi in DEPC allo 0,1% per 12 ore, sterilizzati in autoclave (121 °C, 20 min) per inattivare sia le RNasi che il DEPC residuo e asciugati in forno prima dell'uso.

  1. Aggiungere 1 mL di Trizol al pellet cellulare e omogeneizzare con un omogeneizzatore. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
  2. Aggiungere 0,2 mL di cloroformio e agitare energicamente per 30 s. Incubare a temperatura ambiente per 3 min.
  3. Centrifugare a 4 °C, 12.000 × g per 15 min. Trasferire la fase acquosa incolore in una nuova provetta da microcentrifuga e aggiungere un volume uguale di isopropanolo.
  4. Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Centrifugare a 4 °C, 12.000 × g per 10 min. Scartare il surnatante e conservare il pellet di RNA.
  5. Aggiungere 1 mL di etanolo pre-raffreddato al 75% al pellet di RNA. Agitare accuratamente e centrifugare a 4 °C, 12.000 × g per 5 min. Scartare il surnatante e conservare il pellet di RNA.
  6. Asciugare all'aria il pellet di RNA in una cabina di biosicurezza. Sciogliere l'RNA in 20 μL di acqua priva di RNasi.
  7. Misura la concentrazione e la qualità dell'RNA utilizzando uno spettrofotometro Nanodrop.
  8. Trascrivere inversamente l'RNA totale in cDNA utilizzando un kit di trascrizione inversa.
  9. Preparare la miscela di reazione contenente 1 μg di RNA totale, 4 μl di soluzione di cloruro di magnesio, 2 μl di miscela di dNTP, 0,5 μl di inibitore della RNasi, 0,6 μl di trascrittasi inversa AMV, 1 μl di primer casuali e acqua priva di RNasi per regolare il volume finale a 20 μl.
  10. Incubare la reazione a 42 °C per 15 minuti, quindi a 95 °C per 5 minuti. Raffreddare a 4 °C per 5 minuti, quindi diluire il cDNA con acqua priva di RNasi.
  11. Preparare la miscela di reazione PCR contenente 2 μL di cDNA, 10 μL di SYBR Green Real-time PCR Master Mix, primer diretti e inversi (Tabella 1) a una concentrazione finale di 0,2 μmol/L ciascuno e acqua priva di RNasi fino a un volume finale di 20 μL.
  12. Impostare le condizioni PCR come segue: pre-denaturazione a 95 °C per 1 minuto, seguita da 40 cicli di 95 °C per 15 s, 60 °C per 15 s e 72 °C per 45 s. Raccogliere i dati sulla fluorescenza durante la fase di estensione a 72 °C.
  13. Dopo la reazione, registrare i valori CT per ciascun campione e il riferimento interno. Calcolare i livelli di espressione relativi dei geni bersaglio utilizzando il metodo 2-ΔΔCT.

9. Saggio ELISA

NOTA: Preparare la soluzione di lavoro dell'anticorpo biotinilato e la soluzione di lavoro del coniugato enzimatico freschi prima dell'uso.

  1. Estrarre il kit ELISA dal frigorifero con 30 minuti di anticipo e lasciarlo equilibrare a temperatura ambiente.
  2. Preparare tutte le soluzioni necessarie secondo le istruzioni del kit.
  3. Aggiungere 100 μl di campioni o soluzioni standard (con concentrazioni variabili) nei pozzetti designati (i pozzetti zero contengono solo tampone di diluizione standard/campione). Sigillare la piastra con pellicola adesiva e incubare a 37 °C per 90 minuti (esclusi i pozzetti di controllo in bianco).
  4. Scartare il liquido e lavare ogni pozzetto con 350 μl di tampone di lavaggio. Incubare per 30 s, scartare il liquido e asciugare su carta assorbente spessa. Ripetere il lavaggio 4 volte.
  5. Aggiungere 100 μl di soluzione di lavoro per anticorpi biotinilati a ciascun pozzetto. Sigillare la piastra e incubare a 37 °C per 60 minuti (esclusi i pozzetti di controllo in bianco).
  6. Scartare il liquido e lavare ogni pozzetto 4 volte come descritto al punto 4.
  7. Aggiungere 100 μL di soluzione di lavoro coniugato enzimatico a ciascun pozzetto. Sigillare la piastra e incubare a 37 °C per 30 minuti (esclusi i pozzetti di controllo in bianco).
  8. Scartare il liquido e lavare ogni pozzetto 4 volte come descritto al punto 4.
  9. Aggiungere 100 μl di soluzione di substrato a ciascun pozzetto. Proteggere dalla luce e incubare a 37 °C per 15 min.
  10. Aggiungere 100 μl di soluzione di arresto a ciascun pozzetto, mescolare accuratamente e misurare immediatamente la densità ottica (OD) a 450 nm.
  11. Genera una curva standard utilizzando il software CurveExpert e calcola le concentrazioni del campione.

10. Analisi del Western blot

NOTA: Prima dell'esperimento, preparare il tampone per elettroforesi, il tampone di trasferimento, il TBST, il latte scremato al 5% e tagliare in anticipo la membrana in PVDF alla dimensione appropriata. Successivamente, catturare i segnali chemiluminescenti utilizzando un sistema di imaging a chemiluminescenza. Impostare lo strumento in modalità automatica o manuale per l'esposizione al gradiente, che in genere varia da 10 s a 5 min, per garantire che i segnali vengano acquisiti all'interno della gamma dinamica lineare ed evitare la saturazione dei pixel. Dopo l'acquisizione del segnale, selezionare l'immagine di esposizione in cui le bande target sono chiare e lo sfondo è basso per la successiva analisi quantitativa.

  1. Preparare il tampone di lisi RIPA (contenente l'1% di PMSF e l'1% di inibitore della fosfatasi) e aggiungere il tampone di lisi RIPA a un rapporto di 250 μl per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
  2. Lisi le cellule utilizzando un disgregatore a ultrasuoni (3 cicli, 7-10 s ciascuno) e incubare su ghiaccio per 30 minuti.
  3. Centrifugare il lisato a 4 °C, 12.000 × g per 10 minuti, quindi raccogliere il surnatante per la quantificazione delle proteine.
  4. Determinare la concentrazione proteica utilizzando il test dell'acido bicinconninico (BCA).
  5. Regolare le concentrazioni proteiche allo stesso livello utilizzando il tampone di lisi RIPA.
  6. Aggiungere il buffer di caricamento 5× ai campioni con un rapporto 4:1 (campione: buffer).
  7. Far bollire i campioni per 10 minuti, quindi centrifugare a 4 °C, 12.000 × g per 10 minuti e raccogliere il surnatante per l'elettroforesi.
  8. Assemblare il gel SDS-PAGE nella camera di elettroforesi e riempirlo con il tampone per elettroforesi fino a quando il pettine non è sommerso.
  9. Rimuovere il pettine, caricare i campioni nei pozzetti e aggiungere la scala delle proteine alle corsie di riferimento.
  10. Eseguire l'elettroforesi fino a quando il colorante blu di bromofenolo raggiunge il fondo del gel, quindi smontare l'apparecchio e recuperare il gel.
  11. Assemblare il "sandwich" di trasferimento ed eseguire il trasferimento a umido a tensione costante.
  12. Bloccare la membrana in PVDF con latte scremato al 5% in TBST per 1 ora a temperatura ambiente.
  13. Incubare con anticorpo primario diluito per una notte a 4 °C.
  14. Recuperare l'anticorpo primario e lavare la membrana con TBST (5 × 5 min).
  15. Incubare con anticorpo secondario coniugato HRP per 90 minuti a temperatura ambiente.
  16. Recuperare l'anticorpo secondario e lavare la membrana con TBST (5 × 5 min).
  17. Preparare la soluzione di substrato ECL e conservarla al riparo dalla luce.
  18. Applicare il substrato ECL sulla membrana e catturare i segnali chemiluminescenti utilizzando un sistema di imaging con esposizione a gradiente.
  19. Analizza le intensità delle bande utilizzando il software ImageJ e calcola i livelli di espressione proteica relativa per ulteriori analisi.

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Risultati

La colorazione in immunofluorescenza per il collagene di tipo II ha dimostrato che i condrociti isolati erano fortemente positivi (Figura 1A). L'analisi citofluorimetrica ha inoltre dimostrato che oltre il 98% delle cellule era positivo per il collagene di tipo II (Figura 1B), mentre le cellule di controllo SW1353 negative erano negative (Figura 1C). Dopo la stimolazione con 10 ng/ml di IL-1β per 24 ore, il Western blotting ha dimos...

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Discussione

Il protocollo qui descritto offre diversi vantaggi chiave per l'isolamento e la coltura dei condrociti articolari primari di ratto. L'uso di ratti lattanti è fondamentale per ottenere una resa e una vitalità cellulare ottimali, poiché la cartilagine degli animali giovani contiene condrociti più proliferativi e una matrice meno mineralizzata rispetto alla cartilagine adulta. Questa selezione dell'età migliora significativamente l'efficienza della digestione enzimatica e il successivo recu...

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Dichiarazioni

Gli autori non segnalano conflitti di interesse in questo lavoro.

Ringraziamenti

Questo studio è stato supportato dal National High-Level Hospital Clinical Research Funding e dall'Elite Medical Professionals Initiative del China-Japan Friendship Hospital (NO. ZRJY2025-QM05).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4% ParaformaldeideSolarbioP1110
5 e volte; Buffer di caricoSolarbioP1040
Alexa Fluor 488-coniugato anti-rabbit IgGZhongshan Jingqiao BiotecnologiaZF-0511
Soluzione di blocco senza animaliTecnologia di segnalazione cellulare15019
Anticorpo anti-collagene IIAbcamab34712
Kit per il saggio proteico sull'acido bicinconinico (BCA)SolarbioPC0020
Collagenasi IIYeasen Biotechnology40508ES60
Mezzo di montaggio fluorescente contenente DAPIZhongshan Jingqiao BiotecnologiaZLI-9556
Eagle Medium Modificato di DulbeccoSolarbio11995
Siero fetale bovino (FBS)SolarbioS9010
Peroxidasi di rafano (HRP) - Anti-Coniglio IgG ConiugatoZhongshan Jingqiao BiotecnologiaZB-2301
IL-1 e beta;Peprotech400-01B
MMP13 Rabbit mAbABclonaleA11148
MMP3 Rabbit mAbABclonaleA11418
Latte secco scrematoSolarbioD3840
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)SolarbioP1020
Membrana PVDFThermo Fisher Scientific88518
Rat MMP-13 ELISA KitNouvNBP3-06931
Rat MMP-3 ELISA KitNouvNBP3-06894
Kit di trascrizione inversaPromegaA3500
Buffer di lisi RIPASolarbioR0010
Acqua senza RNasiSolarbioR1600
SDS-PAGE GelEpizimaPG112
SYBR Mix Master PCR in tempo reale verdeToyoboQPK-201
Triton X-100SolarbioT8200
TRIZOLSolarbio15596026
TripsinaSolarbioT1320
Kit di substrato per chemiluminescenza ECL ultra-sensibileNCM BiotechP10300
β-Coniglio di actina mAbABclonaleAC026

Riferimenti

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