Un flusso di lavoro modulare per l'analisi quantitativa, strutturale e funzionale dei biofilm di Leptospira

Summary

Questo protocollo offre un flusso di lavoro modulare BSL-2 che combina saggi su biomassa cristallino-viola, cinetica a contrasto di fase in time-lapse, mappatura confocale 3D/matriciale, ultrastruttura SEM e un modulo di infezione da criceto in vivo per coltivare, quantificare, caratterizzare e indagare il ruolo funzionale del biofilm di Leptospira , consentendo la valutazione standardizzata dei mutanti e interventi anti-biofilm in laboratori.

Abstract

Qui presentiamo una suite integrata di protocolli per la coltivazione, il monitoraggio quantitativo, la caratterizzazione strutturale e funzionale dei biofilm delle specie di Leptospira nel tempo. Questo flusso di lavoro combina saghi micro-titolati al viola cristallino per misurare la biomassa biofilm in più punti temporali, con un approccio di frazionamento risolto nel tempo che distingue popolazioni batteriche attaccate (biofilm) e non attaccate (fase liquida), imaging a contrasto di fase in time-lapse per osservazione cinetica non distruttiva, microscopia a scansione laser confocale per generare ricostruzioni 3D complete con letture a sonde matriciali, e microscopia elettronica a scansione supportata da membrana per analisi ultrastrutturali. Parallelamente, dettagliamo una procedura standardizzata per la raccolta degli aggregati biofilm intatti e la loro preparazione per l'iniezione intraperitoneale nel modello del criceto siriano dorato suscettibile, consentendo una valutazione diretta della virulenza associata al biofilm in vivo insieme a controlli planctonici abbinati.

Ottimizzato per il ceppo patogeno Leptospira interrogans Manilae L495, ogni modulo è facilmente trasferibile ad altre specie di Leptospira e alle librerie mutanti per confrontare la capacità di formazione di biofilm. Insieme, questi moduli coordinati forniscono una solida base per lo screening delle strategie anti-biofilm, l'indagine dei determinanti genetici e la chiarezza del contributo dei biofilm alla persistenza e alla patogenesi dei Leptospira .

Introduction

I biofilm sono comunità microbiche strutturate in cui le cellule sono incorporate in una matrice di sostanza polimerica extracellulare (EPS) auto-secreta composta da polisaccaridi, proteine, acidi nucleici e^{lipidi 1}. Questa matrice fornisce stabilità meccanica, media l'adesione alle superfici e migliora la sopravvivenza microbica conferendo tolleranza a stress ambientali come la disidratazione, lo stress ossidativo e gli^{antimicrobici 2,3}. Nei batteri patogeni i biofilm facilitano la persistenza, l'evasione immunitaria e l'infezione^{cronica 4,5}.

Rispetto alle cellule planctoniche, che sono libere e metabolicamente più omogenee, le cellule associate al biofilm mostrano alterazioni nell'espressione genica, nei tassi di crescita e nell'attività^{metabolica 6}. Queste differenze conferiscono una maggiore tolleranza alle sfide ambientali, agli antibiotici e alle difese dell'ospite, consentendo al contempo comportamenti coordinati come il quorum sensing, la ritenzione dei nutrienti e l'organizzazione^{spaziale 7,8}.

La formazione di biofilm è stata ampiamente caratterizzata in organismi modello come Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Vibrio cholerae, che hanno plasmato collettivamente la nostra comprensione delle basi genetiche, strutturali e fisiologiche dello stile di vita biofilmato. Studi su Pseudomonas hanno rivelato che esosaccaridi e quorum sensing lavorano insieme per modellare complesse architetture biofilm^{tridimensionali 9,10}. La ricerca su Staphylococcus ha enfatizzato i ruoli delle proteine di superficie e del DNA extracellulare nel migliorare la coesione del biofilm e la tolleranza agli^{antibiotici 11,12}. Le indagini sulle specie di Vibrio hanno ulteriormente evidenziato la notevole diversità delle morfologie dei biofilm e il loro significato ecologico negli ambienti acquatici¹³. Collettivamente, questi sistemi hanno fornito un solido quadro concettuale e metodologico per la ricerca sui biofilm, rafforzato dai protocolli^{standardizzati 14} e dalle valutazioni critiche delle tecniche^{esistenti 15,16}, che insieme evidenziano la necessità di approcci armonizzati nell'indagine della formazione di biofilm in batteri meno studiati come Leptospira.

I membri del genere delle spirochete Leptospira, agenti causanti della leptospirosi, sono stati a lungo presunti prevalentemente planctonici. Studi recenti hanno dimostrato sperimentalmente la formazione robusta di biofilm su più specie¹⁷. Mentre alcuni studi suggeriscono la formazione di biofilm in contesti^{ambientali 18} e associati^{all'ospite 19}, altri hanno dimostrato sperimentalmente la capacità delle leptospire di formare biofilm nei tubuli renali di Rattus norvegicus²⁰ e nell'umore vitreo dei cavalli²¹, oltre a rilevare specie leptospirali all'interno dei biofilm^{ambientali 22,23}. Decifrare le condizioni e i meccanismi che governano i biofilm di Leptospira è quindi fondamentale per comprendere la trasmissione ambientale, la persistenza dei serbatoi e la patogenesi delle malattie^24,25.

I saggi esistenti sul biofilm di Leptospira sono frammentati, spaziando da osservazioni microscopiche^{qualitative 17,26} a colorazioni colorimetriche o viola cristallina^{finali 27,28}. Sebbene questi studi abbiano fornito preziose informazioni sulla formazione del biofilm, spesso mancano sia della risoluzione cinetica necessaria per monitorare la maturazione e dispersione del biofilm in tempo reale sia del contesto ultrastrutturale fornito dalla microscopia confocale o elettronica. Il monitoraggio continuo e l'analisi strutturale 3D sono considerati essenziali per catturare la natura dinamica della formazione e dispersione del^{biofilm 14,15}. Queste limitazioni ostacolano la comparabilità tra gli studi e limitano la valutazione sistematica dei fattori o degli interventi che influenzano la formazione e la dispersione dei biofilm, evidenziando la necessità di un flusso di lavoro standardizzato e multi-lettura che catturi sia la dinamica strutturale che funzionale dei biofilm Leptospirin modo riproducibile e completo.

Per colmare queste lacune, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro integrato e modulare che unifica sei letture complementari provenienti dalla stessa serie di cultura. Innanzitutto, un saggio microtitolato CV ad alto rendimento quantifica la biomassa attaccata in più momenti temporali. In secondo luogo, un saggio di frazionamento risolto nel tempo in piastre a 96 pozzi spartisce le popolazioni totali, in fase liquida (non attaccate o parzialmente staccate) e in fase aggregata (biofilm) tramite OD₄₀₅ per monitorarne l'evoluzione durante la formazione e la dispersione. Il termine fase liquida è qui usato per comprendere sia cellule planctoniche che cellule staccate, riconoscendo il continuum dinamico tra fenotipi di vita libera e associati alla^{superficie 29,30}. In terzo luogo, l'imaging a contrasto di fase in time-lapse fornisce una cinetica non distruttiva di adesione, motilità aggregata e coalescenza. In quarto luogo, la microscopia laser confocale (CLSM) produce ricostruzioni 3D complete con letture live/dead e a matrice di prova, consentendo una vitalità dipendente dalla profondità e la mappatura matriciale. Quinto, la microscopia elettronica a scansione supportata da membrana o copertura (SEM) risolve l'architettura extracellulare e la polarità baso-apicale ad alta risoluzione. Inoltre, è stato incorporato un modulo in vivo per valutare la virulenza utilizzando l'iniezione intraperitoneale di aggregati di biofilm nel modello suscettibile del criceto siriano dorato, un modello sensibile e ben consolidato per la leptospirosi 31,32,33. Questo approccio collega i fenotipi dei biofilm al potenziale patogeno, fornendo un contesto funzionale che integra le analisi in vitro.

Rispetto agli approcci monomodali, questa piattaforma offre diversi vantaggi: (i) letture quantitative sincronizzate (CV e OD frazionata) e strutturali (CLSM/SEM); (ii) monitoraggio cinetico non distruttivo dell'adesione precoce, crescita, maturazione e dispersione; (iii) vitalità 3D e caratterizzazione matriciale usando sonde mirate; (iv) visualizzazione ultrastrutturale dell'architettura della matrice extracellulare; e (v) valutazione funzionale diretta della virulenza associata a biofilm rispetto a quella planctonica in un modello di criceto suscettibile, ciascuno realizzabile con infrastruttura BSL-2 standard. Sfruttando formati multi-pozzo e substrati rimovibili in vetro o policarbonato, il flusso di lavoro supporta la replica degli schermi di variabili ambientali, composti antimicrobici o librerie mutanti, mantenendo al contempo sterilità, throughput e validazione incrociata tra moduli.

I laboratori focalizzati su ecologia, persistenza, interazioni ospite-patogeno o scoperta di anti-biofilm possono adottare moduli individuali o l'intera pipeline. Le risorse richieste sono limitate a un lettore di lastre, un microscopio rovesciato con controllo ambientale per il time-lapse, accesso a un microscopio confocale e a una struttura SEM, e strutture animali standard per il modello del criceto, consentendo un'ampia adozione e confronti riproducibili tra gli studi.

Protocol

Dichiarazione etica:
Questa ricerca è stata approvata dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Institut Pasteur della Nuova Caledonia e condotta secondo le linee guida stabilite dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Institut Pasteur di Parigi, e la Raccomandazione Europea 2007/526/CE. Numero di registrazione dell'Esperimento di Ricerca Animale: IPNC-2018-ARE-001

NOTA: Tutte le procedure che coinvolgono colture di Leptospira vive devono essere condotte in un laboratorio di biosicurezza livello 2 (BSL-2), in conformità con le linee guida istituzionali per la biosicurezza. Tutte le manipolazioni della coltura devono essere eseguite sotto un armadietto di sicurezza biologica per garantire la sicurezza dell'operatore e prevenire la contaminazione ambientale.

Il ceppo L495 di Leptospira interrogans serovar Manilae utilizzato in questo studio è stato originariamente ottenuto dalla collezione dell'Institut Pasteur (Parigi, Francia) ed è conservato presso l'Institut Pasteur della Nuova Caledonia. Per preservare la virulenza, il ceppo viene periodicamente riisolato da criceti infetti. Per tutti gli esperimenti in vitro , le colture non sono state mantenute oltre sei sottocolture dopo il recupero dall'ospite animale.

Tutte le procedure sugli animali devono essere eseguite in conformità con le linee guida istituzionali e approvate dai competenti Comitati di Cura e Uso degli Animali. Gli esperimenti dovrebbero rispettare le normative europee sul benessere animale (Direttiva UE 2010/63) e le raccomandazioni del Servizio Sanitario Pubblico, garantendo che l'uso degli animali sia giustificato sia regolamentato dal punto di vista etico.

1. Preparazione dell'inoculo batterico

1. Coltivare cellule di Leptospira spp. a 30 °C in mezzi^{EMJH 34} in condizioni aerobiche e senza scuotere in tubi di vetro a fondo piatto con tappo a vite fino a quando la coltura non raggiunge la fase logaritmica media. In queste condizioni, il ceppo serovaro di Manilae L495, L. interrogans e a basso passaggio regolarmente mantenuto in vivo tramite criceti, raggiunge tipicamente la densità cellulare appropriata entro 3-5 giorni. Assicurarsi che le colture raggiungano una O.D. di 0,2-0,4 a 405 nm (2 a 5 x 10⁸ cellule/mL) prima della diluizione in nuovi mezzi EMJH e verificare la motilità e l'assenza di aggregamenti tramite microscopia a campo scuro a ingrandimento 20x.
   NOTA: EMJH ha assorbenza intrinseca. Svuota lo spettrofotometro con EMJH sterile e sottrai questo valore da tutte le letture. L'inoculo può essere standardizzato sia misurando la densità ottica sia contando direttamente le cellule utilizzando una camera di Petroff-Hausser. Una diluizione 1:100 di una coltura a media logaritmia verificata produce tipicamente OD₄₀₅ = 0,02 (≈ 1 x 10⁶ cellule/mL). Mescola delicatamente per inversione; Non vortice.
2. Esaminare un'aliquota da 10 μL sotto microscopia a campo oscuro a ingrandimento 20x. Assicurati che ≥ il 90% delle cellule sia altamente mobile e che non siano presenti grumi visibili. Diluire la coltura a metà logaritmologa verificata 1:100 in EMJH fresco per ottenere OD₄₀₅ = 0,02 (≈ 1 x 10⁶ cellule/mL). Mescola delicatamente per inversione; Non vortice.
   NOTA: Un inoculo funzionante supporta tutti i saghi a valle dettagliati in questo protocollo (Figura 1). Preparare 36 mL per seminare una piastra da 24 pozzi (1 mL/pozzo) oppure 20 mL per seminare una piastra da 96 pozzi (200 μL/pozzo). Regola i volumi per corrispondere al numero di piastre necessarie.

Figura 1. Flusso di lavoro globale per l'analisi dei biofilm Leptospira . Le colture di Leptospira a crescita esponenziale vengono inizialmente valutate per la crescita e standardizzate tramite densità ottica. Le colture vengono poi distribuite in lastre contenenti vetro o membrana, micropiatti di microscopia o lastre da 96 pozzi. Il flusso di lavoro comprende sette moduli: (1) preparazione dell'inoculo; (2) colorazione viola cristallino per la quantificazione della biomassa; (3) imaging ultrastrutturale tramite SEM; (4) monitoraggio dinamico della biofilmazione tramite microscopia a contrasto di fase a time-lapse; (5) visualizzazione 3D tramite CLSM con colorazione viva/morta; (6) quantificazione risolta nel tempo delle frazioni attaccate e non attaccate durante la formazione del biofilm tramite densità ottica ; e (7) indagine sul ruolo funzionale del biofilm durante l'infezione nei criceti siriani. Questo approccio integrato consente un'analisi multimodale dello sviluppo, della struttura e della patogenicità dei biofilm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Quantificazione basata su viola cristallino dei biofilm su coprimenti o membrane

1. All'interno di un cappuccio di biosicurezza BSL2, si usano pinze sterili per posare un copertore di vetro sterile da 12 mm o una membrana policarbonatica idrofila sterile da 0,1 μm piatta sul fondo di ciascun pozzo in una piastra sterile a 24 pozzi con coperchio. Pre-ammollare la membrana/copertura di vetro per 2 ore a 30 °C con 1 mL di EMJH sterile.
   NOTA: Anche se non è essenziale, pre-ammollare il substrato in EMJH migliora l'umidimento e migliora leggermente l'adesione batterica.
2. Rimuovere la soluzione di ammollo e aggiungere 1,5 mL della sospensione batterica diluita (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ cellule/mL) in ciascun pozzo. Assicurati che il coperchio o la membrana rimanga ben posizionato in fondo.
3. Incubare la piastra a 30 °C in condizioni statiche in un'atmosfera umida, mantenuta posizionando una vassoia piena d'acqua all'interno dell'incubatrice per evitare l'evaporazione del mezzo di coltura. Per i ceppi a crescita lenta, si raccomanda un'incubazione di 3 settimane per permettere la formazione di un biofilm maturo e aderente.
4. Nel momento desiderato, rimuovere con cura quanta più coltura possibile da ogni pozzo senza disturbare il biofilm. Risciacquo delicatamente ogni pozzo con 1 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere le cellule residue non aderenti, mantenendo il copribolle piatto contro il fondo del pozzo per evitare il distacco di cellule fragili di biofilm. In queste condizioni, la crescita del biofilm avviene prevalentemente sulla superficie superiore dello slip di copertura, con una crescita minima sul lato inferiore, quindi il risciacquo senza sollevamento è sufficiente per arricchire le cellule attaccate alla superficie per le analisi a valle.
   NOTA: I biofilm sono estremamente fragili in questa fase e possono essere facilmente aspirati per errore. La pipettatura dovrebbe essere eseguita lentamente e con precisione lungo la parete del pozzo per evitare di disturbare il biofilm.
5. Fissare i campioni di biofilm aggiungendo 1 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% in PBS a 37 °C per 30 minuti. Rimuovi il fissativo e risciacqua con attenzione due volte con 1 mL di PBS.
   NOTA: Per la fissazione, una soluzione di formaldeide al 4% è stata preparata appena (stock senza metanolo al 16% diluito 1:4 in PBS) e scartata dopo l'uso, poiché la polimerizzazione in paraformaldeide riduce l'attività di reticolazione.
6. Aggiungi 1 mL di soluzione di Viola Cristallina (CV) allo 0,1% (p/v) in ogni pozzo e incuba a temperatura ambiente per 15 minuti, assicurandoti che la membrana o il copertura sia completamente coperta.
7. Scartare il colorante e risciacquare due volte con 1 mL PBS.
   NOTA: La violetta cristallina e il paraformaldeide (PFA) sono tossici e possono irritare la pelle e gli occhi. Indossa sempre i guanti e maneggia entrambi i prodotti con attenzione, preferibilmente in una cappa elettrica. Smaltire i rifiuti in contenitori designati per coloranti pericolosi o prodotti chimici secondo le linee guida istituzionali di sicurezza.
8. Inclina il piatto e svuota il liquido residuo. Asciugare i pozzi all'aria a temperatura ambiente finché il substrato non appare completamente asciutto (≥ 4 ore, preferibilmente durante la notte).
   NOTA: In questa fase, strutture a forma di punti o reticolate possono essere visibili sulla superficie del copertura o della membrana (Figura 2A).
9. Aggiungere un tampone di eluzione di 500 μL (50% etanolo, 50% acido acetico glaciale (vol/vol)) a ciascun pozzo. Incubare il piatto per 15 minuti. Pipetta su e giù per sciogliere completamente il viola cristallino legato al biofilm.
10. Trasferire 200 μL di ciascun campione in una micropiastra ottica a 96 pozzi e misurare l'assorbenza a 570 nm. Si sottrae un blank solo di substrato preparato lavorando un sottoveste o una membrana non inoculata tramite fissazione, colorazione CV, lavaggi ed eluzione per rimuovere il legaggio intrinseco/lo sfondo. Registra la deviazione media ± standard per almeno tre repliche tecniche. Diluire i campioni con il tampone di eluzione se l'assorbanza supera l'intervallo lineare dello spettrofotometro.

3. Visualizzazione del biofilm utilizzando microscopia elettronica a scansione (SEM)

1. All'interno di un cappuccio di biosicurezza BSL2, si usano pinze sterili per posare un copertore di vetro sterile da 12 mm o una membrana policarbonatica idrofila sterile da 0,1 μm piatta sul fondo di ciascun pozzo in una piastra sterile a 24 pozzi con coperchio. Pre-ammollare la membrana/copertura di vetro per 2 ore a 30 °C con 1 mL di EMJH sterile.
2. Rimuovere la soluzione di ammollo e aggiungere 1,5 mL della sospensione batterica diluita (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ cellule/mL) in ciascun pozzo. Assicurati che il coperchio o la membrana rimanga ben posizionato in fondo.
3. Incubare la lastra a 30 °C in condizioni statiche in un incubatore di controllo dell'umidità per evitare l'evaporazione del mezzo di coltura. Per ceppi a crescita lenta, si raccomanda un'incubazione di 3 settimane per permettere la formazione di un biofilm maturo e aderente
4. Nel momento desiderato, rimuovere con cura quanta più coltura possibile da ogni pozzo senza disturbare il biofilm.
5. Poi risciacqua delicatamente ogni pozzo con 1 mL di PBS sterile per rimuovere cellule residue non aderenti, mantenendo il copertura piatta contro il fondo del pozzo per evitare il distacco di fragili cellule biofilm. In queste condizioni, la crescita del biofilm avviene prevalentemente sulla superficie superiore dello slip di copertura, con una crescita minima sul lato inferiore, quindi il risciacquo senza sollevamento è sufficiente per arricchire le cellule attaccate alla superficie per le analisi a valle.
   NOTA: I biofilm sono estremamente fragili in questa fase e possono essere facilmente aspirati per errore. La pipettatura dovrebbe essere eseguita lentamente e con precisione lungo la parete del pozzo per evitare di disturbare il biofilm.
6. Aggiungere una soluzione di paraformaldeide al 4% (PFA) e glutaraldeide all'1% in tampone cacodilato di sodio (0,2 M, pH 7,4) direttamente nel pozzo per fissare il biofilm.
7. Incubare per 30 minuti a 37 °C, poi rimuovere il fissativo e risciacquare due volte il coperto o la membrana con PBS. Questo approccio preserva il biofilm attaccato alla superficie minimizzando il distacco, poiché la maggior parte della crescita del biofilm avviene sulla superficie superiore dello scorrimento nelle nostre condizioni.
   NOTA: Per la fissazione, una soluzione al 4% di formaldeide e all'1% di glutaraldeide è stata preparata appena (stock senza metanolo al 16% diluito 1:4 in buffer cacodilato di sodio) e scartata dopo l'uso, poiché la polimerizzazione in paraformaldeide riduce l'attività di reticolazione.
8. Immergi il substrato in tetrossido di osmio (OsO₄) all'1% diluito in PBS per 1 ora per aumentare il contrasto SEM. Risciacqua due volte con PBS.
9. Disidratare i campioni immergendoli sequencialmente in serie di etanolo graduato con concentrazioni crescenti: 25%, 50%, 70%, 90% e 100% (v/v), ciascuno per 10 minuti.
10. Aggiungi 500 μL di esamildisilazano e incuba per 5 minuti, poi sostituisci con un HMDS fresco e incuba altri 5 minuti. Rimuovere l'eccesso di HMDS e lasciare asciugare completamente il campione all'aria sotto la cappa fumi.
    NOTA: Glutaraldeide, PFA, cacodilato di sodio, tetwossido di osmio e esametildisilazano sono tossici e devono essere maneggiati sotto una cappa chimica con l'attrezzatura di protezione individuale appropriata.
11. Monta i campioni essiccati su tronchi SEM usando nastro di carbonio conduttivo a doppia faccia. Applica un rivestimento sottile (~10 nm) di oro o platino sui campioni con sputter, fornendo un contrasto elettronico sufficiente per l'imaging SEM. Ciò consente una visualizzazione ad alta risoluzione dell'architettura dei biofilm, inclusi i contatti cellula-cellula, la morfologia, la densità e l'eterogeneità della matrice extracellulare, senza la necessità di coloranti o coloranti aggiuntivi.
12. Carica i stumps nel SEM usando il supporto campione appropriato. Evacuare la camera durante la notte, quando possibile, per migliorare la qualità dell'immagine, poi acquisire immagini elettroniche secondarie a 5 - 15 kV e ingrandire adeguati per rivelare l'ultrastruttura del biofilm (Figura 2).

4. Imaging a contrasto di fase in time-lapse della biofilm in crescita

1. Pipetta 500 μL dell'inoculo operativo (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ cellule/mL; vedi Sezione 1) in una piastra sterile di vetro Hi-Q4 da 35 mm con fondo di vetro equipaggiata con un coperchio piano parallelo per eliminare la distorsione del menisco. Evita di introdurre bolle e chiudi subito la tetola.
   NOTA: La piastra Hi-Q4 con fondo di vetro da 35 mm contiene 4 aree di coltura distinte che possono essere utilizzate per visualizzare simultaneamente 4 condizioni diverse. Assegna un compartimento a un mezzo EMJH sterile come controllo negativo e gli altri 3 a repliche tecniche o a ceppi diversi/mutanti.
2. Posizionare la piastra sul palcoscenico ambientale di un microscopio rovesciato dotato di ottica a contrasto di fase, un motorizzato di trasmissione a fuoco (Biostation IMQ) e un involucro umidificato impostato a 30 °C e 95% di umidità relativa. Queste condizioni aiutano a minimizzare l'evaporazione durante l'imaging prolungato (fino a 8 giorni).
3. Avvia l'applicazione BioStation IMQ e, nell'interfaccia principale, apri la finestra Nuova Impostazione Time-lapse per accedere al pannello di configurazione. Prima di iniziare l'esperimento, verifica i parametri ambientali sul Display di Stato, assicurandoti che sia l'indicatore della Camera che quello della temperatura dell'acqua indichino Stabile per evitare deriva del telaio durante l'acquisizione.
4. Nella schermata Nuova impostazione Time-lapse, seleziona la scheda Live e configura i parametri di imaging nel pannello Condizioni di Osservazione scegliendo Contrasto di Fase (Ph) come filtro e impostando l'ingrandimento a 20 X.
5. In modalità Manuale, regola l'intensità della luce e il tempo di esposizione per ottimizzare il contrasto evitando la saturazione. Verifica questo usando il pulsante Saturation Control . Definisci quattro punti di acquisizione corrispondenti ai centri dei quattro compartimenti.
6. Posiziona il palco in modo sequenziale sopra ogni compartimento usando il Jog Dial o cliccando direttamente all'interno del Live Observation Image Display.
7. Affina la messa a fuoco con i pulsanti Focus e registra ogni posizione cliccando sul pulsante Time-lapse Experiment Point Registration . I punti registrati appaiono come fotogrammi blu numerati nel display di verifica dei punti di osservazione e sono confermati nella scheda dei punti.
8. Programma il calendario delle acquisizioni aprendo la scheda Time e cliccando su Nuovo per accedere alla finestra di dialogo Timelapse, dove il Ciclo di Acquisizione è impostato a 30 minuti e il Tempo Totale a 7 giorni.
9. Dopo aver cliccato su Applica, il software calcola automaticamente il numero di round di acquisizione. Attiva l'autofocus cliccando con il tasto destro sulla barra del titolo, selezionando Preferenze e abilitando la modalità AF per assicurarti di rifocalizzare in ogni posizione del livello. Verifica la coerenza delle impostazioni di esposizione, del guadagno e dell'intensità luminosa in tutti i punti, poi salva l'intera configurazione usando il pulsante Salva .
10. Inizia l'acquisizione cliccando su Inizia Time-lapse. Il software passa automaticamente alle Immagini Time-lapse, consentendo un monitoraggio continuo del progresso dell'acquisizione e della stabilità della camera durante i 7 giorni dell'esperimento. Tutte le immagini vengono salvate automaticamente in formato TIFF all'interno della cartella degli esperimenti creata dal software.
11. Elaborare e quantificare la serie di immagini importando gli stack di immagini in FIJI (Figura 3A, B, C).
12. Apri gli stack di immagini corrispondenti a ciascuna posizione tramite File > Import > Sequenza Immagini, assicurandoti che i fotogrammi vengano caricati in ordine cronologico.
13. Converti gli stack allineati in scala di grigi a 8 bit usando Image > Type > 8-bit per standardizzare l'intensità dei pixel.
14. Applica la soglia usando Immagine > Aggiusta > Soglia per isolare le regioni del biofilm batterico. Applica impostazioni di soglia coerenti su tutti i frame selezionando Applica, poi salva il risultato come maschera binaria usando Process > Binary > Make Binary.
15. Esegui la quantificazione con Analizza > Analizza le particelle, registrando parametri come area, percentuale di area e intensità media.
16. Esporta automaticamente i risultati di ogni frame in un foglio di calcolo tramite la finestra Risultati (File > Salva come > .csv) per l'analisi cinetica. Esprimi tutte le misurazioni come la proporzione dell'area di campo coperta dal biofilm (copertura superficiale).

5. Visualizzazione del biofilm utilizzando microscopia laser a scansione confocale (CLSM)

1. Inoculare 1,5 mL dell'inoculo operativo (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ cellule/mL; vedi Sezione 1) in un vaso sterile a fondo di vetro da 35 mm. Incubare staticamente in una scatola umidificata contenente un serbatoio d'acqua in un incubatore a 30 °C fino a raggiungere la fase di sviluppo desiderata (fino a 21 giorni).
2. Al momento scelto, aspira con cura il mezzo lentamente lungo la parete delle piatti senza disturbare il biofilm. Risciacqua una volta con 2 mL di PBS sterile per rimuovere le cellule planctoniche, facendo estrema attenzione a non staccarsi o disturbare il biofilm.
3. Prepara soluzioni di colorazione che richiedono incubazione con biofilm non fissi (vivi) (eseguiti prima della fissazione).
   1. Per la colorazione viva/morta, aggiungere 3 μL di colorazione fluorescente verde SYTO9 (1,67 mM) e 3 μL di ioduro di propidio (18,3 mM) a 10 mL PBS per creare una soluzione di colorazione. Aggiungi 200 μL della soluzione di colorazione direttamente sul biofilm formando batteri, poi incuba per 30 minuti a temperatura ambiente al buio, e risciacqua una volta in PBS.
   2. Il tracciante di cellule vive può anche essere usato per colorare le cellule prima della fissazione. Incubare cellule vive con un tracciatore CFDA/SE da 10 μM per 30 minuti. In alternativa, si può anche utilizzare la marcatura delle membrane con FM4-64 a una concentrazione di 5 μg/mL. Sciacquare una volta su PBS.
4. Fissare il biofilm aggiungendo 2 mL di soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS e incubare per 30 minuti a 37 °C. Rimuovi il fissativo e risciacqua due volte con PBS.
5. Aggiungi una goccia di mezzo antisfaccettante per coprire il biofilm ed evitare bolle.
6. Acquisire Z-stack su un microscopio confocale rovesciato dotato di un laser a luce bianca sintonizzabile (WLL) e di un obiettivo a immersione in olio HC PL APO CS2 63×/1.4 NA. Per CFDA/SE, imposta l'eccitazione a 488 nm e raccoglie l'emissione tra 500 e 550 nm, utilizzando un foro stenopeico di 1 unità di Airy (AU). Per FM4-64, imposta l'eccitazione a 561 nm e rileva l'emissione tra 630 e 700 nm, sempre con un foro stenopeico di 1 UA.
7. Acquisire pile Z a intervalli di 0,5-1,0 μm su tutto lo spessore del biofilm. Regolare la potenza del laser e il guadagno del rilevatore per massimizzare la gamma dinamica evitando la saturazione (<1% di pixel saturi).
8. Utilizzare la media di linea (2-4×) per migliorare il rapporto segnale-rumore e mantenere costanti tutti i parametri di imaging (potenza laser, larghezza di banda del rivelatore, dimensione dei fori stenopeici, velocità di scansione) costanti tra i campioni.
9. Salva gli stack di immagini come file a 12 bit ed esportali in formato .lif per analisi quantitativa in FIJI (ImageJ).
   NOTA: Prima dell'immaginione, assicurarsi che le impostazioni del microscopio (ad esempio, potenza laser, guadagno del rilevatore, dimensione del foro stenopeico) siano standardizzate utilizzando campioni di controllo colorati con gli stessi coloranti. Questo passaggio di calibrazione è essenziale per minimizzare la variabilità tra le acquisizioni e per consentire un confronto affidabile tra esperimenti.
10. Elaborare e quantificare gli stack di immagini confocali utilizzando FIJI dotato del plugin COMSTAT (o software equivalente di analisi 3D⁾¹⁰. Misura il biovolume, lo spessore medio e massimo, la copertura superficiale e i rapporti vivi/morti (o altre metriche predefinite). Esportare viste ortogonali rappresentative e proiezioni di massima intensità a scopo illustrativo (Figura 3D, E).

6. Quantificazione risolta nel tempo di frazioni attaccate e non attaccate durante la formazione di biofilm in saggi microtitolati a 96 pozzi

1. Inoculare 200 μL dell'inoculo operativo (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ cellule/mL; vedi Sezione 1) nei pozzi di una piastra a 96 pozzi. Incubare staticamente a 30 °C fino al momento desiderato (giorni 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17 o 21).
   NOTA: Gli effetti di bordo e l'evaporazione sono comuni quando si utilizzano piastre a 96 pozzi, specialmente se l'incubatore non ha controllo dell'umidità. Per minimizzare questi effetti, aggiungere 200 μL di acqua distillata sterile a tutti i pozzi periferici. Inoltre, le piastre venivano poste all'interno di una scatola umidificata contenente un serbatoio d'acqua, che viene poi posizionato all'interno dell'incubatrice per ridurre ulteriormente l'evaporazione e mantenere un'umidità costante tra i pozzi.
2. In ogni momento temporale, preparare tre tipi di campioni:
   1. Sospensione totale - Omogeneizzare l'intero contenuto di un pozzo contenente il biofilm pipettando delicatamente su e giù più volte, evitando la formazione di bolle. Questa frazione rappresenta la popolazione batterica totale, includendo sia le leptospire non attaccate sia quelle all'interno del biofilm semi-aderente. Questo passaggio di omogeneizzazione aiuta a disperdere gli aggregati cellulari che potrebbero interferire con le successive misurazioni di assorbimento.
   2. Fase liquida - Da un secondo pozzo, rimuovere con cura 180 μL del sovrantagente senza disturbare lo strato di biofilm. Trasferisci in un pozzo vuoto e aggiungi 20 μL di mezzo EMJH fresco. Pipetta delicatamente su e giù più volte per disperdere gli aggregati cellulari. Questa frazione rappresenta le cellule non attaccate presenti nella fase liquida, che possono includere sia leptospiche sospese liberamente sia aggregati di biofilm staccati.
   3. Biofilm - Nello stesso pozzo usato per il passaggio 2.2, risospensi il biofilm rimanente aggiungendo 180 μL di mezzo EMJH fresco e pipettando delicatamente su e giù più volte. Questa frazione corrisponde a leptospire all'interno del biofilm.
3. Misurare l'assorbanza di ogni sospensione a 405 nm utilizzando uno spettrofotometro, dopo aver verificato che ogni pozzo sia stato completamente omogeneizzato, e tracciare i valori per generare un grafico rappresentativo (Figura 4A).

7. Indagine sul ruolo funzionale del biofilm durante l'infezione dell'ospite

1. Inoculare 200 μL dell'inoculo operativo (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ cellule/mL; vedi Sezione 1) nei pozzi di una piastra a 96 pozzi. Incubare staticamente a 30 °C fino a raggiungere la fase di sviluppo desiderata (fino a 21 giorni).
2. Per determinare la concentrazione di inoculo, si dedicano pozzi specifici di "controllo biofilm" che saranno utilizzati solo per il monitoraggio della crescita e non per l'iniezione animale. Una volta che il biofilm è visibile macroscopicamente, si rimuovono delicatamente 180 μL di surrenatante da un pozzo di controllo senza disturbare il biofilm. Sostituire con 180 μL di mezzo EMJH fresco, risospendere con attenzione gli aggregati di biofilm senza generare bolle e misurare l'OD₄₀₅ per stimare la concentrazione batterica.
   NOTA: In linea di principio, lavare i pozzi prima della quantificazione potrebbe aiutare a rimuovere le cellule non aderenti. Tuttavia, poiché i biofilm Leptospira mostrano una debole adesione nelle piastre a 96 pozzi, il lavaggio comporterebbe una perdita incontrollata di materiale biofilm. Per questo motivo, la fase di risospensione è stata eseguita senza lavaggio preventivo per garantire la riproducibilità tra i pozzi e concentrazioni batteriche costanti.
   I pozzi di controllo con biofilm contengono tipicamente ~2 x 10⁸ leptospire, che è stato scelto come inoculo standard per gli esperimenti di infezione da criceto. Questa concentrazione definisce anche il numero target di leptospie planctoniche utilizzate come controlli. Quando inclusi, i controlli planctonici vengono preparati subculturalizzando appena Leptospira in mezzo EMJH in condizioni di agitazione a 30 °C per un massimo di 5 giorni, corrispondenti alla fase di crescita esponenziale medio-tarda che produce una densità cellulare simile.
3. Per l'inoculazione animale, usa pozzi separati per biofilm (non quelli di controllo). Rimuovere con attenzione 180 μL di soprantantante dai pozzi per eliminare la maggior parte delle leptospile in fase liquida.
4. Raccogliere gli aggregati rimanenti da 20 μL contenenti biofilm utilizzando una punta di pipetta da 200 μL per evitare di disturbare la struttura.
   NOTA: Il biofilm è fragile. Assicurati che gli aggregati siano visibili prima e dopo la raccolta. Prepara pozzi extra nel caso in cui sia necessaria la ripetizione.
5. Trasferire gli aggregati in una siringa pre-riempita con 300 μL di mezzo EMJH fresco. Lascia che gli aggregati si depositino per gravità.
6. Attacca un ago da 21 G ed espelle delicatamente l'EMJH in eccesso fino a raggiungere un volume finale di 200 μL. Assicurati che non rimangano bolle d'aria e che gli aggregati di biofilm rimangano visibili.
   NOTA: Aspettare che gli aggregati si stabilizzino minimizza la perdita durante la regolazione del volume. Prima dell'uso in vivo , verificare che gli aggregati rimangano intatti dopo il passaggio attraverso un ago da 21 G (Figura 4C, D).
7. Eseguire iniezione intraperitoneale di 2 leptospire da 10⁸ in mezzo EMJH da 200 μL.
   NOTA: Utilizzare criceti siriani dorati di 7-8 settimane (entrambi i sessi), mantenuti in condizioni abitative standard. Per controlli negativi, iniettare solo 200 μL di mezzo EMJH (un animale per replica).
8. Monitorare gli animali due volte al giorno per un massimo di 21 giorni per i segni clinici di leptospirosi (pelo arruffato, prostrazione e ridotta risposta alla stimolazione). Eutanasia immediatamente tramite inalazione di anidride carbonica se si osserva sofferenza e annota il momento dell'eutanasia come l'ora della morte.
9. Al giorno 21, soppressi tutti gli animali sopravvissuti.
   NOTA: Eseguire tre repliche biologiche indipendenti con colture preparate in date diverse. Ogni replica include due animali per ogni condizione e un animale con controllo negativo.

Results

Quando l'inoculo viene preparato correttamente, le colture entrano nella fase centrale logaritmica entro 3-5 giorni e mostrano valori OD₄₀₅ di ~ 0,2-0,4 con campi luminosi e altamente mobili alla microscopia a campo scuro (≥ 90% delle cellule mobili) e nessun grumo visibile. Le preparazioni subottimali si presentano come batteri lenti e motilità eterogenea in tutto il campo; tali colture spesso producono biofilm deboli e dovrebbero essere scartate. In pratica, confermare motilità e OD affiancata immediatamente prima della semina minimizza le run fallite. Stabilire queste porte di controllo qualità nella fase dell'inoculo è il miglior indicatore di successo nelle applicazioni a valle. Sebbene la metodologia fosse ottimizzata per L. interrogans serovar Manilae L495, le stesse procedure sono state applicate anche al ceppo Leptospira biflexa Patoc per dimostrare l'applicabilità tra specie. L. biflexa generalmente forma biofilm meno coesi e più sottili rispetto a L. interrogans, tuttavia la sequenza di sviluppo caratteristica e le caratteristiche strutturali rimangono rilevabili con adeguati aggiustamenti dei parametri. Includere entrambe le specie sottolinea quindi l'adattabilità del flusso di lavoro sia a Leptospira patogeni che saprofitici.

Dopo 21 giorni di incubazione statica a 30 °C in una camera umidificata (o il tempo appropriato per la specie di Leptospira utilizzata), i biofilm diventano visibili a occhio nudo sia sulle vetrine di vetro sia sulle membrane policarbonatiche idrofile. Una crescita riuscita produce modelli caratteristici di CV dopo 2-3 settimane, come impronte a forma di punti, ramificate o reticolate attaccate alla superficie (Figura 2A).

In una corsa tipica, L. interrogans di tipo selvatico Manilae L495 raggiunge ~ 50% di copertura superficiale entro la terza settimana, mentre i mutanti a basso biofilm si avvicinano a ~ 20% e fenotipi ad alto biofilm si avvicinano al ~ 70-80%, stabilendo un range dinamico pratico per lo screening. L'entità della formazione di biofilm può variare a seconda della specie e del ceppo di Leptospira ; ad esempio, il ceppo di L. biflexa Patoc sviluppa biofilm visibili più rapidamente, con studi precedenti che consideravano strutture già a 120 ore dopo l'inoculazione come biofilm^{maturi 35}.

La colorazione viola cristallina fornisce un metodo affidabile e riproducibile per quantificare la biomassa del biofilm. Nei biofilm ben sviluppati, la colorazione produce una colorazione viola intensa localizzata all'area del copertura o della membrana, indicando alti livelli di biomassa attaccata (Figura 2A). I segnali visivi durante le fasi di colorazione e solubilizzazione forniscono anche indicatori utili del successo del protocollo. Ad esempio, una distribuzione disomogenea del CV o una macchia pallida possono essere dovute a sottosemina, evaporazione o lavaggio aggressivo che stacca i primi biofilm.

Le letture di assorbanza a 570 nm riflettono la quantità di colorazione trattenuta e, di conseguenza, la densità relativa del biofilm (Figura 2B). Negli esperimenti rappresentativi, le colture di L. interrogans coltivate in condizioni ottimali mostrano letture OD₅₇₀ consistenti e riproducibili tra le repliche, riflettendo una formazione stabile di biofilm. Al contrario, grandi variazioni tra repliche si osservano spesso quando i campioni subiscono un pipetting eccessivo durante i cambi di mezzo, indicando una scarsa adesione o un distacco parziale di biofilm. Tale variabilità dovrebbe essere considerata un segno di problemi tecnici e i campioni interessati dovrebbero essere esclusi o il protocollo esaminato con attenzione. In particolare, L. biflexa Patoc forma biofilm più estesi sia su vetri di vetro che su membrane policarbonatiche in condizioni simili, cosa che si riflette in valori di assorbenza CV più elevati, dimostrando che il protocollo è adattabile ed efficace tra le specie di Leptospira .

Una preparazione efficace del SEM è in grado di rivelare depositi di matrice extracellulare già dal terzo giorno, seguiti da un'architettura fortemente polarizzata nei biofilm maturi: una faccia basale ruvida e canalizzata (spesso con > canali da 5 μm) che ancorano una struttura interna porosa, e una faccia apicale più liscia dove gli spirocheti sono intrecciati in una matrice densa (Figura 2C, D, E, F). I campi ad alto ingrandimento catturano frequentemente filamenti extracellulari ramificati e occasionali sporgenze simili a funghi; caratteristiche che corrispondono alle dinamiche di coalescenza osservate dal time-lapse (video supplementare 1). In preparamenti subottimali, possono essere osservati matrici collassate, caricamento e contorni cellulari indistinti, solitamente a indicazione di post-fissazione inadeguata, rivestimento conduttivo insufficiente o scarsa siccità. Quando sono evidenti polarità basale-apicale e canali pervasivi, le letture SEM si allineano strettamente con le stime confocali di spessore e porosità, confermando l'esecuzione efficace sia della preparazione che dell'imaging in modo efficace.

Nelle serie time-lapse efficaci, punti isolati compaiono entro 24-72 ore e si coalesciscono progressivamente in aggregati più grandi che si estendono sulla superficie prima che le limitazioni di spazio rallentino il loro movimento (Figura 3A, B, C). La segmentazione quantitativa produce un aumento monotono dell'area totale coperta, mentre i conteggi aggregati aumentano, raggiungono il picco e poi diminuiscono man mano che collisioni e fusioni dominano tra ~12 e 216 ore. Queste cinetiche (area in alto, aggregati in basso) indicano un'accrescimento attivo piuttosto che una semplice sedimentazione. Le corse fallite o al limite mancano di punti precoci, mostrano curve di area piatte nel tempo o soffrono di deriva di focus legata a temperatura/umidità instabili. Mantenere un ambiente stabilizzato a 30 °C con il 95% di umidità e usare l'autofocus in ogni momento di solito ripristina traiettorie chiare adatte al confronto di mutanti o trattamenti.

Gli stack Z rappresentativi dei biofilm maturi mostrano un'architettura multistrato, simile a schiuma, tipicamente superiore a 50 μm di spessore, con la maggior parte delle cellule che colora vive (SYTO 9-positivo) e occasionali vuoti centrali indicatori di riarrangiamenti collettivi durante la crescita (Figura 3D). Le sonde matriciali possono essere utilizzate per studiare la composizione della matrice: la WGA evidenzia epitopi polisaccaridici, il BOBO-3 marca l'abbondante DNA extracellulare e le colorazioni selettive per proteine contribuiscono poco al di fuori del segnale cellulare associato (Figura 3E). I risultati subottimali includono stack sottili o discontinui dominati da iodio di propidio, fotosbiancamento forte o impostazioni di guadagno incoerenti, ognuna delle quali mina la comparabilità quantitativa. Interpretare insieme spessore, biovolume e rapporti vivi/morto (mantenendo costanti potenza laser, guadagno del rivelatore e foro stenopeico in diverse condizioni) conferma lo stato di maturazione e supporta confronti diretti con l'ultrastruttura SEM e la biomassa CV.

Il processo di formazione del biofilm di Leptospira segue tipicamente fasi distinte, anche se tempi e valori esatti possono variare a seconda della specie o del ceppo. Utilizzando come riferimento il ceppo di L. interrogans Manilae L495, la progressione prevista in 21 giorni include una fase iniziale (giorni 0-3) in cui i batteri rimangono per lo più planctonici con un biofilm minimo (Figura 4A). A questo segue una fase di crescita esponenziale (giorni 3-7) durante la quale sia i batteri planctonici che quelli associati al biofilm aumentano, raggiungendo circa 9 x 10⁸ cellule/mL, accompagnati dalla formazione e dall'espansione degli aggregati di biofilm. Tra il giorno 7 e il 12, i batteri planctonici diminuiscono significativamente, mentre le cellule associate al biofilm raggiungono il picco, rappresentando circa l'80% della popolazione. Infine, durante la fase di maturazione (giorni 12-21), il numero di batteri del biofilm diminuisce senza un aumento delle cellule planctoniche, mentre la dimensione e la complessità del biofilm continuano a crescere. Osservando questa sequenza di variazioni, il protocollo cattura efficacemente lo sviluppo dinamico e la maturazione dei biofilm di Leptospira .

Quando eseguito correttamente, il protocollo di infezione utilizza inoculi contenenti ~2 x 10⁸ leptospire in 200 μL di EMJH, preparate da colture planctonice (5 giorni) o biofilm ben definite (21 giorni). Sebbene questi due tipi di coltura rappresentino stati fisiologici distinti, questa differenza è intenzionale, poiché l'esperimento mira a determinare se i biofilm di Leptospira — caratterizzati da una riduzione dell'attività metabolica e dalla differenziazione strutturale — mantengano la capacità di iniziare l'infezione. Questo contrasto è supportato da studi trascrivomici che mostrano grandi cambiamenti nell'espressione genica tra planctonico e biofilm Leptospira^35,36. Gli aggregati di biofilm vengono accuratamente raccolti per preservarne la struttura e rimanere intatti dopo il passaggio attraverso un ago da 21 G, come confermato prima dell'iniezione (Figura 4C, D). Dopo l'iniezione intraperitoneale, i criceti siriani dorati mostrano tipicamente segni clinici di leptospirosi entro 3-5 giorni (ad esempio, letargia, pelo arruffato, prostrazione). I controlli negativi iniettati con solo mezzo EMJH non mostrano segni di malattia. La progressione e la gravità dei segni clinici, così come il tempo per l'eutanasia, variano in base all'inoculo: i batteri planctonici spesso inducono sintomi più precoci e acuti, mentre gli aggregati derivati dal biofilm possono causare un'infezione ritardata ma persistente (Figura 4B). Il monitoraggio due volte al giorno per un massimo di 21 giorni permette di catturare l'intero corso della malattia.

Figura 2. Colorazione viola cristallina, quantificazione e imaging ultrastrutturale dei biofilm di Leptospira. (A) Colorazione viola cristallina (CV) dei biofilm coltivati su diversi substrati. La colorazione CV consente la visualizzazione dell'architettura del biofilm e dei modelli di attacco iniziali per diverse specie e substrati. i. L. interrogatori sul filtro in policarbonato; ii. L. biflexa su filtro in policarbonato; iii. L. interrogatori su copertura di vetro; iv. L. biflexa su copertura in vetro. (B) Esempio di formazione quantitativa di biofilm valutata tramite assorbanza CV (OD570 nm) nel tempo per L. interrogans e L. biflexa. Questa lettura cinetica cattura sia la dinamica precoce dell'adesione che quella di accumulo di biomassa, evidenziando differenze nella crescita del biofilm tra specie patogene e saprofite. Questa cifra è stata modificata rispetto^{a 27}. (C-E) Microscopia elettronica a scansione (SEM) dei biofilm di L. interrogans: (c) biofilm di 3 giorni fa che mostra la formazione precoce della microcolonia e la deposizione iniziale della matrice extracellulare; (d) biofilm di 14 giorni fa che mostra architettura matura con un'ampia organizzazione matriciale e tridimensionale; (e-f) Biofilm di 3 settimane fa che illustra la consolidazione strutturale e la maturazione della matrice su colture prolungate. Questa combinazione di colorazione CV, misurazioni quantitative OD e imaging SEM offre una panoramica completa dello sviluppo del biofilm, dall'attacco precoce all'organizzazione ultrastrutturale matura, permettendo il confronto diretto tra specie e durate di coltura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Visualizzazione della formazione di biofilm di Leptospira . Le immagini a contrasto di fase acquisite con una BioStation mostrano lo sviluppo del biofilm a (A) 48 h, (B) 96 h e (C) 144 h. (D) ricostruzione CLSM di un biofilm Leptospira che mostra il biovolume totale con fette ortogonali per la visualizzazione 3D. (E) Colorazione confocale di un biofilm maturo con DAPI (verde) e WGA (rosso), evidenziando cellule batteriche e componenti della matrice extracellulare. Questa cifra è stata modificata rispetto^{a 37}. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Quantificazione risolta nel tempo delle frazioni planctoniche e biofilm e valutazione funzionale dei biofilm di Leptospira . (A) Cinetica della formazione del biofilm misurata tramite assorbanza a 405 nm. Per ogni momento di tempo, sono state prese letture dal pozzo totale, dalla frazione di biofilm e dal sovrantantante contenente leptospire planctoniche, permettendo la distinzione tra batteri attaccati e batteri liberi. (B) Esempio di curve di sopravvivenza di criceti iniettati con aggregati di biofilm, leptospire planctoniche o controllo EMJH. Gli animali iniettati con biofilm mostrano una virulenza ridotta, alcuni sopravvivono a 21 giorni, mentre le leptospire planctoniche causano una mortalità rapida. (C-D) Validazione preliminare dell'integrità del biofilm: gli aggregati sono visibili nella siringa prima dell'iniezione (C) e rimangono intatti dopo il passaggio attraverso un ago da 21 G (D, frecce bianche), confermando che la struttura del biofilm è preservata durante la manipolazione. Questa cifra è stata modificata rispetto^{a 36}. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro modulare e integrativo per lo studio dei biofilm di Leptospira, integrando biomassa quantitativa (viola cristallina^)9,27, dinamiche (contrasto di fase time-lapse), composizione tridimensionale (microscopia laser confocale con sonde mirate⁾³⁸, ultrastruttura (microscopia elettronica a scansione) e valutazione funzionale (infezione da criceto). Utilizzando la stessa serie di colture tra i moduli, gli effetti batch vengono minimizzati e la validazione incrociata all'interno dell'esperimento è abilitata, particolarmente importante per le spirochete fragili e a crescita lenta. Ogni modulo completa gli altri: CV quantifica "quanto", time-lapse mostra "quanto velocemente", CLSM rivela "cosa c'è dentro", SEM risolve "come è costruito" e i test in vivo forniscono "prova di funzionamento". L'inclusione di L. biflexa dimostra adattabilità tra le specie, evidenziando una formazione di biofilm più rapida e densa e sottolineando la flessibilità^{metodologica 35}.

Il successo di ogni modulo dipende dalla qualità dell'inoculo e dallo stato fisiologico. Colture planctonice a metà logaritmia (3-5 giorni), altamente mobili e prive di aggregati, producono adesione riproducibile e sviluppo di biofilm. Dovrebbero essere utilizzati solo isolati a basso passaggio per garantire una formazione robusta di biofilm e una riproducibilità.

Il saggio CV ancorano il flusso di lavoro grazie alla sua velocità, scalabilità e throughput ^9,27. Consente uno screening rapido di mutanti, mezzi o composti anti-biofilm. Tuttavia, poiché i biofilm di Leptospira sono fragili ed eterogenei, una manipolazione delicata e la validazione delle repliche sono essenziali. La CV non può distinguere architetture compatte da quelle porose né rilevare la composizione matriciale — da qui il suo ruolo di porta di schermo per analisi strutturali più profonde.

L'imaging time-lapse colma questo divario rivelando la cinetica dei biofilm in tempo reale. Essa cattura l'emergenza, la coalescenza e l'immobilizzazione degli aggregati mobili, esponendo fenomeni transitori che gli saggi finali non raggiungono. La stabilità ambientale (temperatura, umidità, autofocus) è fondamentale. Queste registrazioni hanno dimostrato che anche quando la biomassa CV appare stabile, la dinamica può divergere — indicando riarrangiamenti strutturali o perdita di vitalità negli strati più profondi.

Il CLSM fornisce informazioni volumetriche e chimiche senza artefatti di^{disidratazione 39}. La colorazione viva/morta rivela gradienti di vitalità cellulare all'interno del biofilm, coerenti con segnalazioni di diffusione dell'ossigeno limitata e stratificazione metabolica ^6,40. Le lectine e i coloranti degli acidi nucleici espongono abbondanti motivi di DNA extracellulare e specifici glicani, permettendo la quantificazione e la caratterizzazione dei componenti della matrice^41,42. I dati CLSM rivelano frequentemente vuoti interni, riecheggiando i riarrangiamenti collettivi osservati nel^{time-lapse 38}. Tuttavia, le limitazioni includono la specificità della sonda, lo sbiancamento fotografico e la risoluzione assiale limitata dalla diffrazione; Pertanto, le impostazioni del microscopio e le prestazioni dei coloranti dovrebbero essere standardizzate e testate in anticipo per garantire risultati affidabili e comparabili tra gli esperimenti.

SEM offre una risoluzione ultrastrutturale^{complementare 43}. Nelle fasi iniziali, risolve aggregati nascenti; Alla maturità (≈ 15-21 giorni), rivela un'architettura polarizzata: uno strato basale ruvido e canalizzato per ancoraggio e scambio, e una superficie apicale^{più liscia e ricca di matrice 37}. Fissazione accurata, asciugatura dell'HMDS e correlazione con i dati confocali mitigano artefatti dovuti a disidratazione o collasso⁴⁴.

Insieme, questi quattro moduli permettono la validazione interna incrociata: quando CV, CLSM e SEM convergono, le conclusioni sono solide; Quando divergono, le discrepanze stesse sono informative — rivelando, ad esempio, un aumento della biomassa con ridotta vitalità o una biomassa invariata con composizione matriciale alterata.

Rimangono diverse limitazioni intrinseche. I biofilm di Leptospira sono eterogenei e delicati, rendendoli sensibili alla manipolazione e alla disidratazione. CV integra biomassa totale ma non la^{fattibilità 16}; Il CLSM non può superare i limiti^{ottici 38}; Il SEM rischia di preparare artefatti. La mortalità negli strati più profondi è prevista a causa dei gradienti di ossigeno⁶, ma questo bias è sistematico e comparabile in tutte le condizioni. La maturazione del biofilm raggiunge un plateau intorno ai 15-21 giorni, associato a firme trascrizionali di limitazione dei^{nutrienti 36}. Le fasi successive rimangono poco caratterizzate.

I saghi in vivo forniscono un contesto funzionale. L'iniezione di aggregati intraperitonealmente testa se le cellule derivate dal biofilm differiscono in virulenza o persistenza rispetto alle controparti planctonice. Sebbene l'inoculazione intraperitoneale non sia una via naturale, offre un modello comparativo^{controllato 36}. L'eterogeneità aggregata introduce una certa varianza, ma una gestione coerente e dimensioni dell'inoculo corrispondenti mitigano questa differenza. È importante notare che i tratti di persistenza del biofilm (ad esempio, tolleranza allo stress mediata da ECM) non si traducono necessariamente in una virulenza acuta aumentata, evidenziando il ruolo ecologico piuttosto che patogeno della formazione^{del biofilm 24}.

Il design modulare consente un uso scalabile. Per una selezione rapida, CV e time-lapse sono sufficienti. Per un'intuizione meccanicistica, CLSM e SEM aggiungono risoluzione compositiva e architettonica. I moduli possono integrare perturbazioni enzimatiche o chimiche (DNasi, glicosidasi), sonde alternative per glicani o acidi nucleici, o sistemi microfluidici per testare le risposte al flusso. Lo stesso inoculo può fornire analisi trascrisdemiche o proteomiche, collegando direttamente il fenotipo del biofilm alla regolazione (ad esempio, segnalazione c-di-GMP, risposta alla fame). Questo quadro comprende anche lo screening dei mutanti, i test di perturbazione ambientale e la valutazione di composti anti-biofilm o antivirulenze.

Questo flusso di lavoro integrato trasforma osservazioni isolate in una comprensione multidimensionale coerente dei biofilm di Leptospira. Combinando throughput (CV), dinamica (time-lapse), chimica e profondità (CLSM) e ultrastruttura (SEM), l'approccio cattura con fedeltà la natura mobile, porosa e polarizzata delle comunità Leptospira. Estendendo gli studi^precedenti 17,35,36, dimostra che la sperimentazione coordinata e modulare rivela fenomeni invisibili agli studi con un singolo metodo — come l'aumento della biomassa nonostante la diminuzione della vitalità, o la cinetica divergente tra specie. In definitiva, questo approccio supporta analisi comparative, riproducibili e funzionalmente rilevanti tra specie, mutanti e condizioni, fornendo una base per la microbiologia meccanicistica, la resilienza ecologica e la progettazione di strategie anti-biofilm.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 & micro; Membrana policarbonatica idrofila sterile m	it4ip	1000M25/861N101/13
Copertura sterile in vetro da 12 mm	SPL	330164
16% paraformaldeide (PFA) & nbsp;	Thermo Scientific	28908
Ago da 21G	BD Medicina	304432
Micropiastra a 24 pozzi	NUNC	143982
Vasto da 35 mm con fondo di vetro	Ibidi	81218-200
Antenna Hi-Q4 con fondo di vetro da 35 mm	Ibidi	81156
Micropiastra a 96 pozzi	NIDO	701001
Montaggio antifade medium & nbsp;	Biorad	29410
Rivestimento al carbonio	Leica Microsystem	Em ACE600
Tracciante CFDA/SE	Biolegend	423801
Adesivo carbone conduttivo	Scienza della microscopia elettronica	77816
Viola cristallino (CV)	Sigma	C3886
Microscopio a campo oscuro	Leica Microsystem	11888846	Leica DM4000 B equipaggiata con condensatore fiel scuro (cat. n° 11505142)
Etanolo	VWR Chemicals	83813.36
FM4-64	Invitrogen	T3166
Acido acetico glaciale	Supelco	1.00063
Soluzione glutaraldeide	Sigma-Aldrich	G5882
Esmetildisilazano	Acros Organics	120581000
Incubatore	Memmert	IN30
Microscopio confocale rovesciato	Leica Microsystem	Leica DMI6000 TCS SP8 X	Microscopio confocale SP8
Microscopio rovesciato dotato di ottica a contrasto di fase	Nikon	CELL-S2	BioStation IM-Q
Leptospira Base Media EMJH	Becton Dickinson	BD  279410	Medium EMJH per Leptospira
Terossido di osmio (OsO4)	Sigma	BCCG9181
Propidio ioduro	Biotium	40017
Microscopio elettronico a scansione	JEOL	JSM-IT300
Buffer cacodilato di sodio	Chimici Termoscientifici	15453149
Spettrofotometro Varioskan Lux	Thermo Scientific	VLBL00GD0
Soluzione salina sterile tamponata con fosfato	Biosolve	0016232301BS
Siringa (1 mL)	Chirana	CH03002L
SYTO9 colorazione fluorescente verde per acidi nucleici	Invitrogen	S34854