Articolo metodologico

Imaging a superrisoluzione di cellule intere tramite DNA-PAINT su un disco confocale rotante con riassegnazione ottica dei fotoni

1.2K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/69531

⸱

6 gennaio 2026

 ,  ,  , 
1London Centre for Nanotechnology, University College London, 2Department of Chemistry, University College London

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo delinea la procedura per eseguire la microscopia di localizzazione a singola molecola profonda e intera cellula (SMLM) utilizzando un microscopio confocale a disco rotante con riassegnazione ottica dei fotoni, consentendo così l'imaging DNA-PAINT senza la necessità di ottica personalizzata o illuminazione complessa.

Abstract

La microscopia a localizzazione a singola molecola (SMLM) consente l'imaging su scala nanometrica delle strutture cellulari, ma è tipicamente limitata all'imaging vicino allo scorrimento di copertura a causa delle limitazioni della fluorescenza totale a riflessione interna (TIRF) e dell'illuminazione altamente inclinata e a foglio ottico (HILO). Qui viene presentato un protocollo che sfrutta un microscopio confocale a disco rotante dotato di riassegnazione ottica dei fotoni (SDC-OPR) per eseguire SMLM su intere cellule. Questo metodo consente l'imaging ad alta precisione con singola molecola su tutto il volume cellulare utilizzando l'accumulo di punti di DNA per l'imaging in topografia su scala nanometrica (DNA-PAINT) senza la necessità di ottica personalizzata o schemi di illuminazione complessi. Il protocollo fornisce una guida a passo a passo per configurare un microscopio a disco rotante disponibile commercialmente (ad esempio, CSU-W1 SoRA) per l'imaging SMLM, inclusi parametri di acquisizione ottimizzati per l'imaging profondo. I passaggi di preparazione del campione sono descritti per l'etichettatura dei bersagli intracellulari con sonde coniugate con DNA al fine di eseguire l'imaging DNA-PAINT, incluse strategie per l'imaging multicolore di diversi bersagli. L'acquisizione dell'immagine è seguita dalla localizzazione e ricostruzione di singole molecole utilizzando pacchetti software standard. Vengono inoltre discusse considerazioni critiche per minimizzare il background, ottimizzare la risoluzione laterale e garantire la qualità dell'imaging su tutta la profondità cellulare. Questo protocollo accessibile consente ai ricercatori di eseguire SMLM profondi a cellula intera utilizzando apparecchiature confocali standard, ampliando la gamma di questioni biologiche affrontabili tramite immagini a singola molecola oltre le regioni vicine alla membrana.

Introduzione

La microscopia a localizzazione a singola molecola (SMLM)1 è una famiglia di tecniche di super-risoluzione che raggiungono una risoluzione su scala nanometrica separando temporalmente l'emissione dei singoli fluorofori e localizzandoli con grande precisione. Un SMLM efficace richiede un alto rapporto segnale-rumore (SNR) per rilevare eventi a singola molecola, che tradizionalmente ne ha limitato l'uso a configurazioni ottiche che forniscono eccitazione intensa e localizzata. Le configurazioni più comuni sono la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)2 e l'illuminazione a lamina ottica altamente inclinata (HILO) 3. Il TIRF riduce la fluorescenza di fondo creando un campo evanescente che eccita selettivamente i fluorofori entro pochi nanometri dal coprigondino, sopprimendo così l'illuminazione fuori fuoco. Tuttavia, questa restrizione rende il TIRF inadatto per l'imaging di strutture biologiche più profonde, come gli organelli che si estendono nel dominio extracellulare. La microscopia HILO fornisce profondità di penetrazione maggiori, permettendo di ottenere immagini di diverse centinaia di nanometri sopra il substrato vetroso. Questo avviene a costo di un campo visivo (FOV)4 ridotto e di un'illuminazione irregolare con piani sempre più alti, limitandone l'applicabilità per strutture cellulari più grandi. Più recentemente, le tecniche di microscopia a foglio luminoso (LSM) come il foglio luminoso areticolo 5,6,7 e la microscopia di illuminazione a singolo piano a singolo obiettivo (soSPIM)8 hanno esteso la SMLM all'imaging volumetrico e su scala tissutale. Modellando il fascio di eccitazione in sottili e strutturati fogli luminosi, LSM ottiene la sezionazione ottica con riduzione dello sfondo e della fototossicità. SoSPIM cattura piani focali ortogonali all'asse di rilevamento in un'unica esposizione, consentendo immagini volumetriche rapide con risoluzione quasi isotropa. L'applicazione soSPIM ha dimostrato SMLM 3D in intere cellule e piccoli organelli (>20 μm di profondità) con risoluzione isotropa fino a 40 nm e con un fondo minimo fuorifuoco 9. Nonostante i loro punti di forza, questi metodi richiedono tipicamente campioni trasparenti, ottiche specializzate e allineamento complesso, e rimangono sensibili alle aberrazioni e alla diffusione ottica nei campioni più spessi.

La microscopia confocale offre un'alternativa rifiutando la luce fuori fuoco tramite l'uso di un foro stenopeico davanti al rivelatore, combinato con specchi a scansione delfascio 10. Questa capacità di sezionamento ottico consente immagini volumetriche profonde con alto SNR. In particolare, la microscopia confocale a disco rotante (SDC) combina la velocità e la rilevazione a largo campo dell'imaging convenzionale con la capacità di sezionamento dei sistemi di scansione puntuale. Questo si ottiene nella SDC convenzionale tramite l'incorporazione di un disco rotante con fori paralleli, spesso combinato con un array di microlenti allineato. Le microlenti raccolgono una parte sostanziale della fluorescenza emessa e la focalizzano attraverso i fori stenopeici, riducendo così il segnale di fondo. Questa configurazione offre una sezionamento ottico rapido senza la necessità di ottiche specializzate o preparazione aggiuntiva del montaggio del campione, rendendola una scelta robusta che può essere facilmente implementata e ottimizzata per l'acquisizione di immagini SMLM volumetricheprofonde 11.

In questo studio viene impiegata l'unità di scansione confocale a disco rotante CSU-W1 dotata di riassegnazione ottica dei fotoni (SDC-OPR). A differenza della SDC standard, SDC-OPR introduce un secondo array di microlenti che proietta i fotoni emessi su un modello12 a foro estenopeico complementare, per mitigare la diffusione e recuperare fotoni che altrimenti verrebbero scartati. Questa riassegnazione dei fotoni affina efficacemente la funzione di diffusione puntuale (PSF), migliorando la risoluzione laterale oltre quella della SDC convenzionale pur rifiutando la luce fuorifuoco 13. In particolare, l'array di microlenti SDC-OPR reindirizza i fotoni fuori asse verso i loro punti di origine più vicini, aumentando di fatto la luminosità di fluorescenza rilevata rispetto alla SDC standard. Inoltre, i benefici di risoluzione di SDC-OPR possono essere amplificati tramite deconvoluzione dell'immagine. Gli algoritmi di deconvoluzione iterativa affinano computazionalmente il PSF, riducono il background e migliorano il rapporto segnale-background senza richiedere modifiche alla configurazione ottica. Questo approccio combinato offre un vantaggio significativo in termini di precisione di localizzazione rispetto alla SDC standard per esperimenti di localizzazione a singolamolecola 14.

Qui viene presentato un protocollo robusto e riproducibile per la microscopia di localizzazione di singola molecola utilizzando un microscopio confocale a disco rotante dotato di riassegnazione ottica dei fotoni (SDC-OPR). Questo approccio combina la precisione su scala nanometrica di DNA-PAINT con la velocità, il campo di visione e la penetrazione in profondità dell'imaging a disco rotante. DNA-PAINT, un adattamento dell'accumulo di punti per l'imaging della topografia su scala nanometrica (PAINT)15, si basa sull'ibridazione transitoria di filamenti "imager" etichettati fluorescentmente con filamenti complementari di "docking" ancorati a bersagli molecolari. Questi eventi di legame reversibili generano segnali di fluorescenza stocastici che possono essere localizzati con precisione, permettendo la ricostruzione ad alta risoluzione dell'ultrastruttura cellulare. DNA-PAINT consente l'uso di fluorofori altamente fotostabili, fornisce una cinetica di legame sintonizzabile per un controllo preciso delle condizioni di imaging e mitiga il fotosbiancamento tramite il continuo rifornimento dei filamenti fluorescenti16.

Per garantire riproducibilità e specificità, l'approccio si basa su coniugati DNA-anticorpi personalizzati che collegano i filamenti di aggancio agli anticorpi secondari. Vengono presentati passaggi dettagliati di preparazione del campione, inclusa la coniugazione anticorpo-DNA, per supportare risultati sperimentali robusti. Il protocollo è convalidato su strutture cellulari ben caratterizzate come i complessi di pori nucleari (NPC)17 e i microtubuli in campioni fissi, fornendo un punto di riferimento per stimare l'accuratezza della ricostruzione. Le variazioni di risoluzione, quantificate tramite precisione di localizzazione come proxy, vengono ulteriormente valutate in funzione del campo visivo e della profondità di immagigine.

Inoltre, l'efficienza di questo flusso di lavoro per l'imaging multiplexato viene dimostrata utilizzando Exchange-PAINT18, una strategia che consente la visualizzazione sequenziale di più bersagli con lo stesso colorante e una singola sorgente laser basata su DNA-PAINT. Il flusso di lavoro Exchange-PAINT viene applicato all'imaging multicolore a super-risoluzione di mitocondri, microtubuli e NPC all'interno dello stesso campione.

Insieme, questo protocollo fornisce linee guida complete e note chiave sull'adattabilità sulla coniugazione anticorpi-DNA, preparazione del campione, condizioni di imaging e analisi dei dati, permettendo ai ricercatori di effettuare immagini riproducibili DNA-PAINT su SDC-OPR. Estendendo l'imaging ad alta risoluzione oltre i limiti di profondità e campo visivo degli approcci basati su TIRF, questo metodo amplia l'applicabilità della SMLM a un'ampia gamma di contesti biologici.

Protocollo

I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione dei tamponi

  1. Preparazione del tampone del citoscheletro (CB):
    1. Prepara 10 mM di MES (pH 6,1) con 150 mM di NaCl, 5 mM di EGTA, 5 mM di D-glucosio e 5 mMdi MgCl 2 in 1x soluzione tampone di fosfato filtrata (PBS).
    2. Conserva a 4 °C e filtra prima dell'uso.
  2. Preparazione del stock di 40x protocatechuic acido (PCA):
    1. Sciogli 154 mg di PCA in 10 mL di acqua distillata e filtrata.
    2. Regola il pH a 9,0 con NaOH.
    3. Aloqui e conservare a -20°C per un massimo di 6 mesi.
      NOTA: Se qualche aliquota appare marrone, scartala, poiché indica ossidazione.
  3. Preparazione dello stock 100x protocatechuate-3,4-dioxygenasi (PCD):
    1. Prepara una soluzione al 50% di glicerolo con 50 mM di KCl, 1 mM EDTA e 100 mM di Tris buffer.
    2. Sciogliere 2,2 mg di PCD in 3,4 mL di soluzione di glicerolo.
    3. Alocare e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
  4. Preparazione del calcio 100x Trolox:
    1. Sciogliere 50 mg di Trolox (6-idrossi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carbossilico) in 215 μL di metanolo finché la soluzione non diventa verde all'interno di una cappa chimica utilizzando l'attrezzatura di protezione personale (DPI) appropriata.
    2. Aggiungi 1,6 mL di acqua distillata e filtrata. Lascia che la soluzione diventi bianca e inizi a solidificarsi.
    3. Aggiungi 175 μL di 1M NaOH 1M. Lascia che la soluzione ricominci a diventare liquida.
    4. In volumi da 10 μL, si continua ad aggiungere 1 M di NaOH finché la soluzione non è completamente chiarita (circa 40 μL).
    5. Alocare e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi. La soluzione finale appare giallastro.
      NOTA: La soluzione finale 100x ha un pH di 11, ma una diluizione a 1x porta a un pH di 7-8.
  5. Buffer C+
    1. Prepara 1 mM EDTA, 500 mM NaCl e una soluzione Tween-20 allo 0,02% in 1x PBS.
    2. Regola il pH a 7,4 con HCl e/o NaOH secondo necessità.
    3. Supplemento opzionale di Trolox: Aggiungi i volumi necessari di stock di PCA (40x), PCD (100x) e Trolox (100x) per ottenere diluizioni 1x, lasciando la soluzione in equilibrio per 1 ora a temperatura ambiente (23 °C) prima di utilizzarla.
      NOTA: Prepara una nuova settimana. Se usi Trolox, usalo entro 4 ore dal mixaggio.
  6. Tamponi immunocoloranti (paraformaldeide PFA, glicina e tritone):
    1. Per una preparazione PFA al 4% da un'ampola da 10 mL al 16% di PFA:
      1. All'interno di una cappa chimica, apri con cura l'ampola.
      2. Decantare 10 mL di PFA al 16% in un tubo centrifugo conico da 50 mL.
      3. Esegui una diluizione 1:4 in 1x PBS per ottenere il 4% di PFA, aggiungendo con attenzione ~30 mL di PBS 1x filtrato al 16% di PFA decantato, così il volume finale è di ~40 mL.
      4. Applicare in tubi microcentrifughe da 1 mL e conservare a -20 °C fino a quando necessario.
    2. Per 60 mM di glicina in preparazione PBS:
      1. Pesa 225 mg di glicina in un tubo centrifugo conico da 50 mL.
      2. Aggiungi 50 mL di PBS 1x filtrato.
      3. Vortice finché non è completamente miscelato e filtrato.
      4. Conserva a 4 °C fino a quando è necessario.
    3. Per la preparazione al Triton X-100 allo 0,1%:
      1. Per prima cosa, prepara un materiale di lavoro al 10% di Triton X-100 diluendo 1 mL di Triton X-100 al 100% in 9 mL di PBS 1x filtrato (volume finale = 10 mL), pipetta e mescola lentamente per evitare il sovrappeso di bolle. Conserva a 4 °C fino a quando è necessario.
      2. Dal materiale di lavoro al 10%, aggiungere 0,1 mL di Triton X-100 al 10% a 9,9 mL di PBS 1x filtrato per il stock finale allo 0,1%, mescolare di nuovo lentamente. Conserva a 4 °C fino a quando è necessario.

2. Coniugazione anticorpo-DNA

  1. Concentrare l'anticorpo utilizzando un'unità di filtro centrifugo a ultrafiltrazione da 100 kA:
    1. Lavare un'unità di filtro centrifugo ultrafiltrante da 100 kDa con 100 μL di PBS 1x filtrato per 30 minuti a 14.000 x g, 4 °C.
    2. Aggiungere 100 μL di anticorpi con 200 μL di PBS filtrato 1x all'unità di filtro centrifugo a 100 kDa precedentemente lavata, centrifugare per 30 minuti a 14.000 x g, 4° C. Assicurarsi che la concentrazione di anticorpi sia superiore a 1,5 mg/mL dopo la concentrazione con il filtro centrifugo a ultrafiltrazione. Con questo metodo, il filtro centrifugo a ultrafiltrazione di solito concentra l'anticorpo di ~3 volte.
    3. Inverti l'unità di filtro centrifugo a ultrafiltrazione da 100 kDa in un tubo pulito, gira per 6 minuti a 1000 x g, 4 °C. Questo è l'anticorpo concentrato nel PBS.
    4. Misurare il volume dell'anticorpo concentrato (1 o 2 μL) per calcolare la nuova concentrazione e eseguire uno spettro di assorbimento UV-Vis con uno spettrofotometro UV-Vis a microvolume. Imposta lo sfondo su 1x PBS e salva gli spettri.
  2. Ridurre il filamento di aggancio del DNA tiolato:
    1. Sciogliere 7,7 mg di DTT pre-pesato in 100 μL di acqua filtrata e trasferire in un tubo fresco.
    2. Aggiungere 100 μL di 3 mM EDTA in 1x PBS al tubo originale di DTT, vortice e trasferire allo stesso tubo come passo 2.2.1, ottenendo 200 μL di 250 mM DTT in 1,5 mM EDTA in 1x PBS.
    3. Dissolvere il filamento di aggancio del DNA tiolato in PBS filtrato 1x per una concentrazione finale di 1 mM. Registra uno spettro UV-Vis della soluzione del filamento di aggancio del DNA (diluita a 10 μM in 1x PBS) e salvala usando lo spettrofotometro UV-Vis a microvolume.
    4. Mescolare 13 μL di DNA tiolato (1 mM) con 30 μL di DTT (250 mM), agitare per 2 ore a temperatura ambiente (23 °C).
      NOTA: Conservare eventuali filamenti di aggancio di DNA non utilizzati rimanenti in aliquote da 13 μL a -20 °C per reazioni future.
  3. Coniugazione degli anticorpi con il crosslinker:
    1. Sciogliere il crosslinker maleimide-PEG2-succinimidile ester in DMSO a 10 mg/mL (23,5 mM). Conserva aliquote da 10 μL a -20 °C fino a quando necessario.
    2. Mescola l'anticorpo concentrato dello step 2.1 con un eccesso molare di 20 molari del crosslinker. Incubare per 90 minuti, scuotendo a 4 °C.
  4. Purificare il filtraggio anticorpi-crosslinker con una colonna di desalinizzazione di spin da 7,0 KDa contenente resina di esclusione di dimensione (taglia di peso molecolare di 7 kA):
    1. Rimuovi la chiusura inferiore della colonna di desalinizzazione da rotazione da 7,0 kDa e allenta il tappo. Mettilo in un tubo microcentrifuga a basso legame proteico. Centrifugare per 1 minuto a 1500 x g, 4 °C.
      NOTA: Segna l'inclinazione della resina dopo la prima rotazione. Per tutti gli usi successivi della colonna, posizionare l'inclinazione direttamente verso l'esterno sulla centrifuga. Applica campioni e lavaggi al centro ed evita il contatto con il letto di resina.
    2. Aggiungi 300 μL di PBS 1x filtrato al filtro a colonna di desalinizzazione da spin da 7,0 kDa, allenta il tappo e centrifuga per 1 minuto a 1500 x g, 4 °C. Ripeti altre due volte.
      NOTA: Lasciare la colonna di desalinizzazione dello spin da 7,0 KDa con 300 μL di 1x PBS fino a quando la reazione anticorpi-reticulatore non è pronta; Non lasciare che la colonna si secchi.
    3. Rimuovere gli ultimi 300 μL di lavaggio PBS centrifugando nuovamente per 1 minuto a 1500 x g, 4 °C.
    4. Applicare la soluzione di reticolatore anticorpale al centro del letto di resina, a goccia. Inserire la colonna di desalinizzazione a spin da 7,0 kDa in un tubo microcentrifuga pulito, centrifugare per 2 minuti a 1500 x g, 4 °C. Il prodotto anticorpi-reticolatore si trova ora nel tubo della microcentrifuga; Tieni a 4 °C o sul ghiaccio.
  5. Purificare la miscela DNA-DTT con colonne di spin desalinizzanti con Sephadex G-25 (resina di esclusione di dimensioni per la purificazione del DNA):
    1. Vortice le colonne di spin desalinizzanti (purificazione del DNA) in modo che la resina sia distribuita uniformemente. Rimuovi la chiusura inferiore e allenta il tappo, e mettila in un tubo pulito per microcentrifuga.
    2. Centrifuga desalinizza le colonne di spin (purificazione del DNA) a 735 x g per 1 minuto per rimuovere il buffer di stoccaggio.
    3. Posiziona colonne di spin desalinizzanti (purificazione del DNA) in un tubo microcentrifugo fresco e aggiungi lentamente la miscela DNA/DTT al centro della resina. Centrifuga a 735 x g per 2 minuti. Il DNA purificato e ridotto sarà ora nel tubo della microcentrifuga.
  6. Combina DNA e prodotti anticorpi reticolanti:
    1. Aggiungi il DNA ridotto al prodotto anticorpo-reticolatore a un eccesso di 10 molari di DNA:anticorpo. Mescola il DNA purificato con il prodotto anticorpi reticolante immediatamente dopo la purificazione. Questo impedisce al DNA di rilegarsi.
    2. Incubare durante la notte, tremando, a 4 °C.
      NOTA: Mescola DNA e anticorpi nel tardo pomeriggio e purificali immediatamente la mattina seguente. L'incubazione prolungata di DNA e anticorpi può portare a alti rapporti DNA:anticorpi.
  7. Rimuovere il DNA in eccesso con un'unità di filtro centrifugo a ultrafiltrazione da 100 kDa la mattina seguente:
    1. Lavare l'unità di filtro centrifugo a ultrafiltrazione da 100 kDa con 300 μL di PBS filtrato 1x per 30 minuti a 14.000 x g, 4 °C.
    2. Aggiungere la miscela DNA-anticorpi con 300 μL di PBS filtrato 1x all'unità di filtro centrifugo a ultrafiltrazione da 100 kDa e centrifugare per 30 minuti a 14.000 x g, 4 °C.
    3. Inverti l'unità di filtro centrifugo a ultrafiltrazione in un tubo pulito, gira per 6 minuti a 1000 x g, 4 °C. Questo è il prodotto concentrato in PBS.
    4. Diluire il prodotto a 100 μL in PBS 1x filtrato.
    5. Registrare uno spettro UV-Vis del prodotto (1 o 2 μL) utilizzando lo spettrofotometro UV-Vis a microvolume, con uno sfondo di 1x PBS, e salvare gli spettri.
    6. Misura la concentrazione finale e il rapporto DNA:anticorpi dagli spettri. Si osserva uno spostamento del picco di assorbenza dell'anticorpo da 280 nm a 260 nm, dovuto all'assorbimento extra del DNA. Usa il passo 2.8 per determinare la concentrazione e il rapporto DNA:anticorpi.
    7. Conserva il prodotto nelle condizioni di conservazione originali dell'anticorpo utilizzato. Se congela, evita i cicli di congelamento-disgelo.
  8. Calcolare il rapporto DNA:anticorpi dagli spettri UV-Vis:
    1. Dagli spettri del DNA puro (10 μM in 1x PBS), misurare i valori di assorbanza a 260 nm (Equazione 1) e 280 nm (Equazione 2). Dividi questi per la concentrazione di DNA (10 μM) per trovare i coefficienti molari di assorbimento del DNA (Equazione 3 e Equazione 4).
    2. Ripeti per l'anticorpo per trovare Equazione 5 e Equazione 6, ricordandosi di dividere per la concentrazione di anticorpo usato per gli spettri.
    3. Dagli spettri del prodotto, l'assorbimento a 260 nm e 280 nm dipende sia dall'assorbanza del DNA che dall'anticorpo:
      Equazione 7
      Equazione 8
      Dove cDNA e cAb sono rispettivamente le concentrazioni di DNA e anticorpi all'interno del prodotto finale. Risolvi queste equazioni simultaneamente per trovare la concentrazione molare sia del DNA che degli anticorpi all'interno del prodotto. Calcola il rapporto DNA:anticorpo usando queste concentrazioni.
      NOTA: La concentrazione dell'anticorpo per il primo spettro può essere calcolata misurando il volume di anticorpo rimasto dopo la filtrazione con l'unità filtrante centrifuga di ultrafiltrazione a 100 kDa e confrontandolo con il volume originale (con concentrazione nota) dell'anticorpo utilizzato.

3. Coltura cellulare

  1. Cellule HeLa Kyoto mEGFP-Nup107.
    1. Prepara un stock di mezzo di coltura cellulare, il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di Penicillina/Streptomicina (P/S), e conservalo a 4 °C. Preriscalda il substrato 30 minuti prima dell'uso in un bagno d'acqua a 37 °C. A seconda delle condizioni di lavoro, si consiglia di aliquotare e filtrare la quantità necessaria per prevenire la contaminazione.
    2. Cellule semi a 2 x 105 cellule/mL in 7 mL di mezzo DMEM integrato preriscaldato in fiaschette T25. Posizionare le fiaschette cellulari in un incubatore adatto a 37 °C e al 5% di CO2 .
    3. Assicurarsi il passaggio ogni 48-72 ore per evitare sovraffollamento.
      1. Prendi la fiaschetta T25 contenente la cultura confluente e aspira il mezzo dalla fiaschetta.
      2. Pipett 1 mL di Tripsina EDTA (TE), garantendo una copertura completa inclinando delicatamente la fiaschetta. Incubare a 37 °C per 7 minuti per permettere il distacco cellulare dalla fiaschetta.
      3. Aggiungi 2 mL di materiale DMEM integrato e tritura.
      4. Trasferire la sospensione della cella in un tubo centrifugo conico da 15 mL con ulteriori 7 mL di mezzo DMEM integrato.
      5. Centrifuga a 400 x g per 5 minuti. Controlla attentamente la formazione dei pellet sul fondo del tubo senza disturbarlo.
      6. Aspirare il substrato e risospendere il pellet cellulare in mezzo DMEM integrato.
      7. Seme 2 x 105 cellule/mL in una nuova fiaschetta T25 contenente 7 mL di mezzo preriscaldato. Incubare a 37 °C e 5% diCO2.
        NOTA: Se non si è sicuri della densità cellulare, si può utilizzare un emocitometro per determinare il conteggio cellulare. Si consiglia iniziare con una risospensione di pellet da 1 mL prima del conteggio.
  2. Celle U2OS CRISPR mEGFP-Nup96
    1. Prepara un supporto al 10% FBS e un P/S dell'1% al 5A di McCoy, come previsto dal passo 3.1.1.
    2. Cellule semi a 2 x 105 cellule/mL in 7 mL di mezzo McCoy's 5A integrato in fiaschette T25. Incubare a 37 °C e 5% diCO2.
    3. Passaggio ogni 48 ore per mantenere la crescita della coltura sotto l'80% di confluenza:
      1. Aspirare il substrato dalla fiaschetta e lavare delicatamente la coltura aderente con 2 mL di PBS filtrato pre-riscaldato (37 °C).
      2. Aspirare PBS e aggiungere 2 mL di Accutasi, inclinando lentamente la fiaschetta per garantire una copertura completa, poi incubare a 37 °C per 7 minuti.
      3. Aggiungi 2 mL di media McCoy's 5A integrata e tritura.
      4. Aggiungere 7 mL di substrato alla sospensione della cella e trasferirlo in un tubo centrifugo conico da 15 mL o 50 mL per la centrifugazione. Centrifuga a 400 x g per 5 minuti e controlla la formazione dei pellet sul fondo del tubo.
      5. Risospendere il pellet cellulare in un supporto 5A di McCoy integrato.
      6. Seminare a 2 x 105 cellule/mL in una nuova fiaschetta T25 con 7 mL di mezzo preriscaldato. Incubare a 37 °C e 5% diCO2.
        NOTA: Riscaldare tutte le soluzioni aggiunte alle cellule a 37 °C in un bagno d'acqua o di perline. Per l'Accutasi, riscaldare solo 2 mL di aliquote per non più di 5 minuti per evitare il degrado.

4. Immunocolorazione di Nup96, mitocondri e microtubuli

  1. Preparazione delle celle U2OS mEGFP-Nup96
    1. Seguendo i passaggi descritti nel passo 3.2, aspirare il substrato dalla fiaschetta T25 e lavare delicatamente le cellule aderite con 2 mL di PBS filtrato 1x.
    2. Aspirare PBS e aggiungere 2 mL di Accutasi, inclinare lentamente la fiaschetta su e giù e incubare a 37 °C per 7 minuti per favorire il distacco cellulare.
    3. Aggiungi 2 mL di media McCoy's 5A integrata e tritura.
    4. Sospensione a cella superiore con 7 mL di mezzo McCoy's 5A integrato e trasferiscilo in un tubo centrifugo conico da 15 mL o 50 mL prima di centrifugare a 400 x g per 5 minuti. Ancora una volta, controlla la formazione dei pellet sul fondo del tubo.
    5. Risospendere il pellet cellulare in un supporto 5A di McCoy integrato.
    6. Le cellule di seme a 1 x 105 cellule/mL in microvedi a 8 pozzi e incubano nell'incubatore cellulare (37 °C, 5% CO2) durante la notte.
      NOTA: Inserire le cellule dei semi 24 ore prima delle procedure di fissazione e immunocolorazione, per consentire l'aderenza.
  2. Immunocolorazione delle cellule U2OS mEGFP-Nup96 per l'imaging Nup96
    1. Dopo l'incubazione notturna, sostituire il mezzo McCoy's 5A nelle microslide a 8 pozzi con PBS 1x filtrato. In rapida successione, aspira il PBS e aggiungi la soluzione di fissazione al 4% di PFA preriscaldata (37 °C) in una cappa chimica.
    2. Lascia che le cellule si fissino per 30 minuti a temperatura ambiente (23 °C), preferibilmente all'interno della cappa chimica, prima che il PFA venga lavato e i rifiuti vengano scartati. Ora tutti i passaggi possono essere eseguiti a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione.
    3. Rimuovi la soluzione fissante al 4% di PFA e lava il vetrino 3x 3 minuti con 1x PBS.
      ATTENZIONE: Utilizzare il PFA in una cappa chimica mentre si indossa DPI appropriati.
    4. Dopo la fissazione, permeabilizza la membrana cellulare aggiungendo lo 0,1% di Triton X-100 in una soluzione PBS 1x. Lascia riposare per 5 minuti, poi lava 3 x 3 minuti con 60 mM di glicina in 1x PBS, per ridurre l'autofluorescenza residua di PFA.
      NOTA: La soluzione di permeabilizzazione Triton è estremamente sensibile al tempo e potrebbe alterare l'integrità della struttura cellulare se lasciata riposare troppo a lungo.
    5. Aggiungi il 5% di BSA in 1x PBS per 1 ora al buio, per bloccare le cellule prima dell'immunocolorazione.
    6. Prepara 20 nM del nanocorpo anti-GFP coniugato con DNA in soluzione bloccante (5% di BSA in 1x PBS) per prevenire il blocco del legame aspecifico. Incubare il vetrino con la miscela di nanocorpi per 1 ora a temperatura ambiente (23 °C), poi lavare i filamenti di DNA non legati per 3 x 3 minuti con PBS filtrato 1x.
      NOTA: Punto di pausa: Dopo fissazione, blocco e aggiunta di anticorpi, i campioni possono essere conservati a 4 °C durante la notte. Questo punto di pausa è incluso principalmente per il tempo necessario per la preparazione del campione, piuttosto che per essere una stretta necessità del protocollo. L'imaging può procedere immediatamente dopo questi passaggi, se preferibile.
  3. Immunocolorazione delle cellule U2OS mEGFP-Nup96 per l'imaging mitocondriale e microtubulare
    1. Dopo l'incubazione notturna, sostituire simultaneamente il mezzo DMEM nei microvetri a 8 pozzi con 200 μL di glutaraldeide allo 0,3% e 0,25% di Triton X-100 nel tampone dello scheletro (CB) e lasciare per 2 minuti per la prefissazione.
    2. Sostituire la soluzione di prefissazione con un tampone citoscheletro (CB) integrato con glutaraldeide al 2%. Lascia agire per 10 minuti per fissare le cellule, poi lava il vetrino 3 x 3 minuti con 60 mM di glicina in PBS, come nel passo 4.2.4.
      ATTENZIONE: Usare glutaraldeide in una cappa chimica mentre si indossa i DPI appropriati.
    3. Aggiungi DNA di spermatozoi di salmone tosati al 3% di BSA in 1x PBS per 1 ora al buio, per bloccare le cellule prima dell'immunocolorazione.
    4. Aggiungere 5 μg/mL di antitubulina coniugata con DNA (coniugata come descritto sopra), per l'imaging dei microtubuli, e/o 1:200 di anticorpo TOM20, per l'imaging dei mitocondri, in un dosso di BSA al 2% per 2 ore a temperatura ambiente (23 °C). Lava 3 x 3 minuti con 1 PBS.
    5. Aggiungi 25 nM di IgG anti-coniglio sdAb coniugato con DNA e incuba per 1 ora a temperatura ambiente (23 °C). Lava 3 x 3 minuti con 1 PBS.
      NOTA: Punto di pausa: Dopo fissazione, blocco e aggiunta di anticorpi, i campioni possono essere conservati a 4 °C durante la notte. Questo punto di pausa è incluso principalmente per il tempo necessario per la preparazione del campione, piuttosto che per essere una stretta necessità del protocollo. L'imaging può procedere immediatamente dopo questi passaggi, se preferibile.
  4. Preparazione delle celle HeLa Kyoto mEGFP-Nup107
    1. Aspirare il mezzo dalla fiaschetta T25 delle cellule HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 e lavare delicatamente la fiaschetta con 2 mL di PBS 1x filtrato.
    2. Aspirare PBS e aggiungere 2 mL di tripsina EDTA (TE) e inclinare lentamente la fiaschetta su e giù, incubare a 37 °C per 7 minuti.
    3. Aggiungi 2 mL di materiale DMEM integrato e tritura.
    4. Aggiungere la soluzione a celle a un tubo centrifugo conico da 15 mL con altri 7 mL di mezzo DMEM integrato e centrifugare a 400 x g per 5 minuti. Controlla la formazione dei pellet sul fondo del tubo.
    5. Risospendere la pellet cellulare in un supporto DMEM integrato.
    6. Cellule di semina a 1 x 105 cellule/mL in microslides a 8 pozzi.
      NOTA: Cellule seed 24 ore prima dell'imaging.
  5. Immunocolorazione di HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 per microtubuli
    1. Dopo l'incubazione notturna, sostituire simultaneamente il mezzo DMEM nei microvetri a 8 pozzi con 200 μL di glutaraldeide allo 0,3% e 0,25% di Triton X-100 nel tampone dello scheletro (CB) e lasciare per 2 minuti per la prefissazione.
    2. Sostituisci la soluzione di prefissazione con glutaraldeide al 2% in CB e lascia lasciare per 10 minuti per la fissazione cellulare. Lava 3 x 3 minuti con 60 mM di glicina in 1x PBS.
      ATTENZIONE: Utilizzare glutaraldeide in una cappa chimica mentre si indossa i DPI appropriati.
    3. Aggiungi il 5% di BSA in 1x PBS per 1 ora al buio, per bloccare le cellule prima dell'immunocolorazione.
    4. Aggiungere 5 μg/mL di antitubulina coniugata con DNA (coniugata come descritto sopra), per l'imaging microtubulare al 5% di BSA in 1x PBS per 2 ore a temperatura ambiente (23 °C). Lava 3 x 3 minuti con 1 PBS.
      NOTA: Punto di pausa: Dopo fissazione, blocco e aggiunta di anticorpi, i campioni possono essere conservati a 4 °C durante la notte. Questo punto di pausa è incluso principalmente per il tempo necessario per la preparazione del campione, piuttosto che per essere una stretta necessità del protocollo. L'imaging può procedere immediatamente dopo questi passaggi, se preferibile.
    5. NOTA: Quando si lavora con anticorpi alternativi o linee cellulari, si regolano i fattori di diluizione per l'anticorpo o nanocorpo accoppiato al DNA secondo le raccomandazioni del produttore.
  6. Preparazione per l'imaging
    NOTA: Questo passaggio è comune a tutti i protocolli di immunocolorazione.
    1. Aggiungere nanoparticelle d'oro da 90 nm diluite 1:2 in acqua deionizzata direttamente in ogni pozzo, utilizzando il volume completo del pozzo. Incubare per 5 minuti per consentire una futura correzione della deriva durante l'imaging. Lava i pozzi 3 volte con 1 coppia di sopporti (PBS).
    2. Per l'imaging Nup96, aggiungi il filo dell'imager desiderato a 1 nM in C+ buffer integrato con 1x Trolox, 1x PCA e 1x PCD.
    3. Per Exchange-PAINT di mitocondri e/o microtubuli, aggiungere il primo filamento di imager desiderato a 1 nM solo in C+ buffer. Dopo aver effettuato l'imaging del primo round, lavare accuratamente ma con attenzione il campione dopo il primo round di imaging per rimuovere tutti i filamenti residui dell'imager senza muovere il campione. Di solito, con 5 lavaggi e 30 secondi di attesa tra una cosa e l'altra, è sufficiente. Poi aggiungi il secondo filo dell'imager a 1 nM solo nel buffer C+ per il secondo ciclo di immagini.

5. Configurazione e parametri di imaginging: microscopia di localizzazione a singola molecola

NOTA: Le immagini mostrate in questo protocollo sono state acquisite presso la struttura di microscopia a super-risoluzione LMCB presso l'University College London, Regno Unito, utilizzando un microscopio confocale a disco rotante disponibile commercialmente, dotato di una telecamera sCMOS e operato tramite il software NIS-Elements.

  1. Usa un sistema confocale a disco rotante con eccitazione multifocale e una telecamera sCMOS.
  2. Avvia il sistema 30 minuti prima dell'immagini: accendi il microscopio, la telecamera e i laser, poi accendi il computer. Aspetta che il software NIS-Elements si carichi completamente.
  3. Seleziona la modalità di imaging appropriata in NIS-Elements: disco rotante confocale standard o SDC-OPR SoRA super-resolution, prima di impostare i parametri di acquisizione.
  4. Scegli l'obiettivo di immersione in olio Apo NA 1.49 60× per l'imaging SDC o SDC-OPR per massimizzare la rilevazione di eventi a singola molecola e migliorare la post-elaborazione.
  5. Seleziona l'ingrandimento appropriato (1×, 2.8× o 4×) in base all'obiettivo, alle impostazioni della fotocamera e al campione da studiare. Regola il binning della fotocamera di conseguenza: 1× binning per un ingrandimento di 1×, 2× binning per 2,8× e 4× binning per 4×. Per questa configurazione, questo corrisponde a dimensioni effettive dei pixel di 108 nm per 1× (senza binning) o 4× (4× binning), e 78 nm per 2,8× (binning 2×). Il binning è necessario per ottenere dimensioni di pixel adatte alla SMLM, approssimativamente corrispondenti alla deviazione standard PSF (tipicamente 100-150 nm)19,20.
    NOTA: Ingrandimenti più alti (2,8× o 4×) aumentano la densità di potenza del laser, migliorando l'uniformità dell'illuminazione. Questo riduce il campo visivo, quindi il binning deve essere regolato proporzionalmente (cioè, binning 2× per un ingrandimento 2,8×; binning 4× per un ingrandimento 4×) per mantenere la dimensione dei pixel.
  6. Imposta il tempo di esposizione per l'acquisizione di DNA-PAINT e sincronizzalo con la velocità di rotazione del disco rotante (regolabile dal pad CSU-W1). Assicurati che la velocità di rotazione sia un multiplo del tempo di esposizione, oppure premi il pulsante Sync per corrispondere automaticamente ai giri compatibili più vicini. Controlla lo schermo per artefatti di strisce, perché questo indica impostazioni non sincronizzate. Per gli esperimenti presentati qui, è stato utilizzato un tempo di esposizione di 300 ms.
    NOTA: La velocità di rotazione dei dischi SoRa potenziati da microlenti SDC e di sincronizzazione impatta sul profilo di eccitazione del fascio, influenzando la distribuzione media della densità di potenza sull'area illuminata. Per questo motivo, potrebbero essere necessari tempi di esposizione più alti rispetto ai sistemi TIRF.
  7. Configura la lunghezza d'onda del laser, la potenza e la ruota dei filtri (NIS-Elements suggeriranno un filtro appropriato). La lunghezza d'onda del laser sarà determinata dallo spettro del colorante dell'imager.
    NOTA: In questo lavoro è stato utilizzato Cy3B, che viene eccitato in modo ottimale con un laser a 561 nm. Cy3B offre il miglior rapporto segnale-background per DNA-PAINT, rendendolo la scelta preferita per questa applicazione.
  8. Regola la potenza del laser tramite il pad laser (0%-100%). Per l'imaging DNA-PAINT, imposta il laser alla potenza massima (100%). Per questo sistema, questo corrisponde a 1,75 mW (≈ 65 W/cm 2) misurati dopo l'obiettivo per l'ingrandimento 4×, 3 mW (≈ 50 W/cm 2) per 2× e 5 mW (≈ 15 W/cm 2) per 1×.
    1. Per registrare la potenza dopo l'obiettivo, si utilizza un misuratore laser calibrato e posiziona il sensore sul palco del microscopio il più vicino possibile al punto in cui dovrebbe trovarsi il piano del campione. Fai attenzione a evitare il contatto con l'obiettivo obiettivo. Registra l'alimentazione per ogni configurazione utilizzata.
  9. Applica una goccia di olio a immersione sull'obiettivo pulito 60× Apo NA 1.49.
  10. Fissa il campione preparato (dai passaggi 4.2-4.5) sul palco usando un adattatore per lo stadio. Questo è importante per minimizzare la deriva durante l'acquisizione dell'immagine e per prevenire movimenti durante gli scambi di buffer, in particolare negli esperimenti multicolore.
  11. Passa alla modalità campo chiaro all'interno del metodo di imaging selezionato e concentrati sul piano vetro usando le nanoparticelle come riferimento. Attiva il Sistema di Messa a Uoco Perfetto (PFS). Il PFS o un sistema simile per mantenere la messa a fuoco durante tutto il tempo di acquisizione è cruciale perché la deriva nella direzione assiale non può essere corretta tramite post-elaborazione.
    NOTA: La Nikon PFS mantiene il campione a fuoco nitido monitorando e regolando continuamente la distanza tra un piano di riferimento fisso e il piano focale del campione utilizzando un obiettivo offset e un rivelatore a linea CCD. Operando indipendentemente dall'acquisizione dell'immagine, il sistema corregge la deriva di messa a fuoco in tempo reale (~millisecondi).
  12. Con PFS attivo, seleziona il piano di imaging di interesse. Per le celle U2OS mEGFP-Nup96 o celle HeLa Kyoto mEGFP-Nup107, si utilizza il segnale 488 GFP degli NPC etichettati con GFP per identificare la cella più piatta e determinare il piano focale ottimale. Utilizzare una bassa potenza laser (~10% della potenza massima laser) durante questo passaggio per evitare il fotosbiancamento.
  13. Definisci il nome e il percorso di salvataggio dell'esperimento. Spunta la casella Tempo per impostare intervallo, durata e numero di loop. Per l'acquisizione continua, impostare l'intervallo su Nessun ritardo e inserire solo il numero di anelli, che corrisponde al numero totale di fotogrammi.
    NOTA: Assicurati che la casella PFS in basso sia selezionata, poi premi Run. Il software fornirà automaticamente una durata stimata dell'esperimento e salverà i dati al completamento. Per fermare l'esperimento prima che finisca, premi Termina per salvare il progresso corrente, oppure Annulla per terminare l'esperimento senza salvare.
  14. Per la prima proteina, acquisire 17.000-20.000 frame con un tempo di integrazione di 300 ms.
    NOTA: La concentrazione del filamento dell'imager deve essere ottimizzata in questa fase per garantire che i segnali a singola molecola non si sovrappongano, fornendo comunque sufficienti localizzazioni per la ricostruzione. Questo processo è simile a un'acquisizione SMLM tipica, in cui la concentrazione dell'imager viene regolata per ottenere un numero sufficiente di eventi per la ricostruzione minimizzando la sovrapposizione. La concentrazione ottimale dipende dalla struttura che si sta visualizzando. Ad esempio, strutture altamente marcate come i microtubuli richiedono tipicamente concentrazioni più basse nell'imager (inferiori a 1 nM).
  15. Rimuovi delicatamente il tampone di imaging per la proteina successiva usando una pipetta, facendo attenzione a non disturbare il campione. Durante il monitoraggio del campione con la telecamera del microscopio, aggiungere con attenzione 200 μL di tampone C+ senza l'imager per lavare il primo colorante.
  16. Ripeti questo passaggio finché non sarà rilevabile alcun segnale di fluorescenza dalla prima soluzione del DNA imager (tipicamente 5 lavaggi).
  17. Aggiungi una seconda soluzione per l'imager e controlla che vengano rilevati di nuovo eventi a singola molecola.
  18. Acquisire 17.000-20.000 frame con un tempo di integrazione di 300 ms per la seconda proteina.
  19. Ripeti i passaggi 5.14-5.18 per ogni proteina aggiuntiva da fotografare.
  20. Per l'imaging 3D, acquisire z-stack con una distanza di 0,5-1 μm sull'intera altezza della cella. Questo è stato fatto con uno specifico protocolloJOB 21 progettato per il software di acquisizione (elementi NIS) che registra un video di un numero predefinito di fotogrammi in specifiche posizioni z , mantenendo il PSF per tutto il tempo di acquisizione.
    NOTA: Il pacchetto software, insieme a istruzioni utente dettagliate, è fornito all'interno del protocolloJOB 21. È inclusa anche una descrizione completa del LAVORO. Il software, chiamato "MultiZ_DNAPaint.bin", può essere scaricato dalla scheda Materiali della pubblicazione. Per eseguire il JOB, scarica questo File e importalo nell'Esploratore JOBS di NIS-Elementi, seguendo le istruzioni passo dopo passo fornite.

6. Elaborazione e analisi delle immagini

NOTA: Le immagini sono state inizialmente processate tramite deconvoluzione utilizzando un software compatibile, seguite dall'analisi di localizzazione a singola molecola utilizzando il software Picasso sviluppato dal laboratorioJungmann 16.

  1. Apri gli stack di immagini ND2 nel software AR NIS-Elements.
  2. Per le immagini 2D, seleziona Deconvoluzione 2D. Per le immagini 3D, ripeti questa procedura per ogni singolo z-stack.
  3. Scegli la deconvoluzione cieca, un foro effettivo di 0,01, e imposta il livello di rumore su Rumore rumoroso. Successivamente, si inseriscono l'eccitazione e la velocità di emissione del laser, qui rispettivamente 560 nm e 571 nm. Altri parametri vengono ottenuti automaticamente dai metadati ND2 per fornire una stima approssimativa della funzione di dispersione dei punti (PSF) dell'immagine sorgente.
  4. Specifica il numero di iterazioni (qui, 12), seleziona Crea nuovo documento e premi Deconvolve. Salva il file risultante dopo l'elaborazione.
    NOTA: L'algoritmo migliora iterativamente la qualità dell'immagine eseguendo operazioni di convoluzione che affinano il PSF fino a raggiungere la convergenza o il numero specificato di iterazioni. Si raccomanda l'ispezione visiva dell'immagine deconvolta. È necessario regolare il numero di iterazioni a seconda dei vincoli computazionali e della qualità dell'immagine.
  5. Carica la pila di immagini deconvolute nel modulo Picasso Localize.
  6. Dalla barra dei menu, seleziona Analizza → parametri e inserisci i parametri specifici della fotocamera secondo le specifiche del produttore. Per la camera sCMOS utilizzata in questo studio (Hamamatsu ORCA-Fusion BT): guadagno EM: 1, Baseline: 100, Sensibilità: 0,23 (fattore di conversione, elettroni/conteggi), Efficienza quantistica: 0,95 (a seconda della lunghezza d'onda di eccitazione utilizzata).
    NOTA: L'efficienza quantistica non viene utilizzata dalla versione 0.6.0 di Picasso ed è mantenuta solo per compatibilità retroattiva.
  7. Imposta la lunghezza del lato della scatola a 7. La lunghezza della scatola viene determinata usando la formula [6 × σPSF + 1], dove σPSF è la deviazione standard del PSF. Questa ottimizzazione migliora la precisione di localizzazione, migliorando la risoluzione dell'immagine ricostruita.
  8. Seleziona la dimensione del pixel appropriata per la configurazione di imaging, come previsto dal passaggio di sezione 5.5.
  9. Successivamente, scegli un Gradiente Minimo Net adatto (ad esempio, ~1000, a seconda del campione) e abilita Anteprima per visualizzare le localizzazioni rilevate. Ispezionare i risultati e regolare la soglia di gradiente secondo necessità per minimizzare i rilevamenti di sfondo e garantire una localizzazione accurata.
  10. Dalla barra del menu, seleziona Analizza → Localizza (Identifica e adatta) per iniziare l'identificazione dei punti e l'inserimento di tutti i fotogrammi del film. Dopo la competizione, questo processo salva automaticamente un file .hdf5 e .yaml.
    NOTA: .hdf5 memorizza la posizione di localizzazione di ogni adattamento gaussiano e altri parametri. .yaml salva informazioni sul video e sulla procedura di analisi e può essere ispezionato tramite un editor di testo.
  11. Carica il file .hdf5 nel modulo Picasso Render per visualizzare la mappa di localizzazione ricostruita ed eseguire la correzione della deriva.
  12. In Picasso Render, seleziona Postprocess → Undrift di RCC. Inserisci un valore di segmentazione, partendo da 1000. Al completamento, apparirà il grafico di deriva calcolato xy. Ripetere il processo in sequenza con valori di segmentazione più bassi (ad esempio, 500, poi 250), osservando miglioramenti graduali nella deriva temporale.
    NOTA: La correzione della deriva può essere eseguita utilizzando nanoparticelle come marcatori fiduciali; tuttavia, quando si imaging piani elevati, il segnale delle nanoparticelle potrebbe non essere visibile. In questi casi, viene applicata solo la correzione di deriva da correlazione incrociata ridondante (RCC).
  13. Assicurati di salvare il file corretto per deriva, selezionando File → Salva Localizzazioni prima di chiudere la finestra di Render di Picasso.
  14. Carica il file corretto per deriva dal passaggio 6.13 nel modulo Picasso Filter per ulteriori passaggi di post-elaborazione, imponendo soglie sulle metriche di qualità della localizzazione a singola molecola, come: (i) Precisione di localizzazione (lpx, lpy); (ii) larghezze PSF (sx, sy); (iii) Conteggio dei fotoni; e (iv) eventuali criteri aggiuntivi per rimuovere rumore, eccezioni o macchie poco risolte.
    NOTA: lpx e lpy (precisione di localizzazione in x e y) stimano l'incertezza nella posizione localizzata lungo gli assi x e y sono calcolati sulla base del limite inferiore di Cramér-Rao (CRLB).
  15. Per filtrare una proprietà, seleziona la rispettiva colonna nell'intestazione della tabella e scegli Grafica → Istogramma dal menu.
    NOTA: Selezionando due colonne si traccia un istogramma 2D.
  16. Per filtrare per un intervallo di proprietà specifico, clicca e trascina attraverso la regione desiderata all'interno di un istogramma 1D o 2D. La regione selezionata apparirà ombreggiata di verde e qualsiasi evento di localizzazione con valori al di fuori di questo intervallo sarà immediatamente escluso dalla lista di localizzazione.
  17. Filtrare i dati per fotoni, sx, sy, lpx e lpy, mantenendo solo l'intervallo centrale della distribuzione di ciascun parametro per garantire la conservazione delle localizzazioni più affidabili.
    NOTA: La parte centrale della distribuzione di larghezza PSF è tipicamente compresa tra 0,4 e 1,2 × dimensione del pixel. Escludere le distribuzioni secondarie spesso causate da segnali sovrapposti o punti poco risolti.
  18. Salva i dati filtrati selezionando File → Salva dal menu.
  19. Ripeti il processo dal passaggio 6.1-6.18 per tutti i video scattati per ogni soluzione di imager.
  20. Apri il file filtrato nel modulo Rando di Picasso. L'intensità in questa immagine super-risolta rappresenta il numero di localizzazioni. Il contrasto può essere modificato selezionando Visualizza → Impostazioni di visualizzazione e modificando il valore della densità massima.
  21. Per salvare l'immagine super-risoluzione di un singolo canale, seleziona "Precisione Localizzazione Individuale" dalla sezione Sfocatura. Una barra di bilancia può essere aggiunta anche dalla sezione Bilancia.
  22. Per salvare l'immagine super-risoluzione di tutti i canali, apri tutti i file .hdf5 elaborati. Il colore di ogni canale può essere cambiato selezionando Visualizza → File dal menu.
  23. Allinea tutti i canali selezionando i canali post-processing → Align.
  24. Seleziona File → Esporta Immagine Completa per salvare un'immagine o un file .png → Esporta la Vista Corrente per uno zoom specifico dell'immagine.
    NOTA: Utilizzare pratiche coerenti di denominazione e documentazione dei file per la riproducibilità. Il software Picasso aggiunge automaticamente un suffisso a ogni file salvato. Le metriche Cramer Rao Lower Bound e basate sul vicino più prossimo (NeNA)22 possono essere estratte selezionando Visualizza → Mostra informazioni dal menu. Il NeNA quantifica la distribuzione spaziale dei fluorofori localizzati valutando la distanza euclidea tra localizzazioni vicine. Mentre il CRLB fornisce un limite teorico inferiore per la precisione di localizzazione basato su statistiche fotoniche e rumore di fondo, il NeNA offre una stima sperimentale della precisione di localizzazione derivata direttamente dal dataset stesso. Per questo motivo, il NeNA è ampiamente utilizzato in SMLM come misura complementare al CRLB, poiché cattura non solo i limiti teorici ma anche influenze pratiche come la correzione della deriva, gli errori di adattamento e la variabilità sperimentale. La metrica NeNA è estratta dal modulo Picasso Render. Il CRLB dell'adattamento a singola molecola viene utilizzato per determinare i valori di precisione di localizzazione informati (σSMLM). Il valore riportato è la media tra σx e σy, per tutte le localizzazioni, che sono il valore modale della distribuzione della precisione di localizzazione in x e y, rispettivamente.

Risultati

Per dimostrare le capacità di imaging super-resolution del sistema SDC-OPR (Figura 1A), la sua risoluzione in piano è stata valutata eseguendo esperimenti di imaging DNA-PAINT (Figura 1B) su complessi di pori nucleari (NPC), che costituiscono una struttura biologicadi riferimento 17. La Figura 1C mostra un'immagine rappresentativa DNA-PAINT SDC-OPR della nucleoporina 96 (Nup96), contrassegnata con proteina fluorescente verde monomerica potenziata (mEGFP) e marcata con nanocorpi anti-GFP coniugati con DNA, nelle cellule U2OS. I pannelli ingranditi rivelano la sottostruttura NUP, e la Figura 1D mostra proteine Nup96 accoppiate (indicate da frecce) coerenti con la simmetria 8 volte attesa dei pori nucleari. Nella Figura 1E, la distanza euclidea tra le coppie Nup96 è stata misurata allineandole e tracciando l'istogramma della sezione trasversale dell'immagine sommata (n = 16 coppie). L'analisi ha rivelato una separazione picco-picco di (13 ± 2) nm (Figura 1E), in accordo con i risultati dei modelli EM così come con l'imaging HILO eTIR 23. Ogni adattamento di picco mostrava una deviazione standard di 4 nm, confermando l'alta precisione di localizzazione (σSMLM = 3,3 nm, NeNA = 4,4 nm) ottenuta usando DNA-PAINT su SDC-OPR. È importante notare che questa precisione è stata mantenuta su tutto il campo visivo a 53 × 53 μm², eccezionale per sistemi a base confocale.

Per dimostrare la capacità di imaging multicolore, Nup96, mitocondri e microtubuli nelle cellule U2OS sono stati marcati con DNA per l'acquisizione tramiteExchange-PAINT 18. Questa tecnica impiega filamenti ortogonali di DNA imager coniugati a un singolo fluoroforo, permettendo a tutti i bersagli di essere eccitati con la stessa sorgente laser (Figura 2A). Invece di acquisire segnali simultaneamente, li separa su round di imaging sequenziali, facilitando un'integrazione diretta in qualsiasi sistema commerciale SDC-OPR. La Figura 2B mostra Nup96 in blu etichettato con un nanocorpo anti-GFP, i mitocondri in rosso con un anticorpo anti-TOM20 secondario e i microtubuli in verde con un anticorpo primario anti-α-tubulina. In particolare, l'eccezionale precisione di localizzazione a singola molecola ottenuta per l'imaging Nup96 a colore singolo è stata preservata su tutti i target nell'esperimento multi-bersaglio, fornendo valori di precisione di localizzazione di 3,9 nm per il NPC, 4,0 nm per la α-tubulina e 3,3 nm per i mitocondri (Figura 2B pannelli 1, 2 e 3).

Per l'imaging di grande campo visivo, i microtubuli nelle celle HeLa venivano rimasti utilizzando vari ingrandimenti disponibili sul sistema SDC-OPR, combinati con diverse impostazioni di binning della fotocamera per mantenere dimensioni dei pixel tra 78 nm e 108 nm (Figura 3). La Figura 3A mostra il citoscheletro microtubulare di 10 cellule HeLa, con colori che rappresentano la precisione di localizzazione. A un ingrandimento di 1×, la precisione media della localizzazione è visibilmente inferiore rispetto a ingrandimenti più elevati (Figura 3B-D), con maggiore variabilità osservata. Ciò è dovuto alla riduzione della densità di potenza laser sul campo campo di visione più ampio, dove il profilo di illuminazione gaussiano diventa evidente, portando a una diminuzione della precisione verso i bordi del campo visivo. Tuttavia, raggiungere una precisione di localizzazione media di 9,5 nm su un ampio campo visivo di 211 × 211 μm² è impressionante per sistemi basati su confocali e consente un'indagine ad alta risoluzione sull'eterogeneità biologica.

Infine, la possibilità di richiamare cellule intere è dimostrata acquisendo immagini DNA-PAINT della rete di microtubuli in cellule HeLa fisse con un volume confocale di ~500 nm di spessore e 1 μm z-step utilizzando il massimo ingrandimento del sistema (FOV 4×, 53 × 53 μm²). La Figura 4A presenta le immagini di ricostruzione a singola molecola per ciascun piano z, insieme alla corrispondente precisione di localizzazione e ai valori di NeNA. Inoltre, una visualizzazione 3D a colori della rete di microtubuli nella cella HeLa è fornita nella Figura 4C. Con l'aumentare della profondità, il numero di fotoni rilevati diminuisce a causa della diffusione e delle aberrazioni ottiche, con conseguente riduzione della precisione di localizzazione sia per le precisioni di localizzazione derivate dal Cramér-Rao Lower Bound (CRLB) (Figura 4A, a destra) sia per quelle calcolate utilizzando la metrica NeNA. Tuttavia, l'elevato livello di raccolta dei fotoni possibile dal sistema SDC-OPR consente σSMLM ≤ 10 nm per una profondità di imaging fino a 9 μm con distribuzioni ristrette. Infatti, le strutture microtubulari filamentose a doppia parete erano chiaramente risolte a varie profondità: vicino all'interfaccia coverslip-cella, in posizioni assiali intermedie e nella parte superiore della cella, con distanza picco-picco tra 30 nm e 40 nm (Figura 4C), coerente con i valoririportati 24. Questi risultati evidenziano la capacità dell'SDC-OPR di fornire immagini ad alta risoluzione su ampi FOV e su tutta l'altezza delle cellule.

Figura 1
Figura 1: Microscopia di localizzazione a singola molecola in piano di diversi campioni cellulari e imaging multicolore a super-risoluzione. (A) Schema del sistema Spinning Disk Confocal con Optical Photon Reassignment (SDC-OPR), con un array di microlenti progettato per massimizzare la raccolta di fotoni. (B) Schema del DNA-PAINT: I filamenti di DNA marcati fluorescente, noti come filamenti di imager, si ibridano transitoriamente con sequenze di DNA complementari (filamenti di aggancio) che sono ancorati all'anticorpo/nanocorpo che prende di mira la proteina di interesse. Questi eventi di legame di breve durata generano segnali di fluorescenza che appaiono come lampeggiamenti stocastici. (C) Immagine rappresentativa DNA-PAINT sul sistema SDC-OPR utilizzando un ingrandimento di 4× del NPC delle celle U2OS. La capacità ad alta risoluzione è dimostrata nell'inset, dove i singoli NPC sono chiaramente risolti. (D) SDC-OPR-enhanced DNA-PAINT consente la visualizzazione di singoli NPC, dove frecce bianche evidenziano coppie di proteine caratteristiche Nup96 all'interno dell'architettura dei pori. (E) Distribuzione delle misurazioni di distanza tra i dimeri Nup96 (n=16 coppie) all'interno di singole unità di simmetria NPC. Questa cifra è stata modificata da Zaza et al.14. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 2
Figura 2: Exchange-PAINT per l'imaging multicolore utilizzando un microscopio SDC-OPR. (A) Schema di Exchange-PAINT di tre bersagli fotografici in sequenza. Tre bersagli proteici sono stati marcati con anticorpi funzionalizzati dal DNA, frammenti Fab o nanocorpi. I filamenti dell'imager Cy3B sono stati rimasti sequencialmente per tipo di filo, con passaggi di lavaggio tra i colpi di immagini. (B) Imaging a scambio tricolore (Exchange-PAINT) di cellule U2OS utilizzando microscopia SDC-OPR con ingrandimento 4×, mostrando microtubuli (rossi; etichettati con anti-α-tubulina coniugata con DNA), mitocondri (verdi; nanocorpi di DNA mirati a TOM20), e NPC (blu; Nup96 con marchio mEGFP e nanocorpi di DNA anti-GFP). Barra della scala: 5 μm. La regione zoomata enfatizza la risoluzione migliorata ottenuta dal sistema SDC-OPR, concentrandosi su (1) mitocondri, (2) microtubuli e (3) NUP. Barre di scala = 1 μm. Questa cifra è stata modificata da Zaza et al.14. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Imaging DNA-PAINT all'interno di grandi FOV su un microscopio SDC-OPR. Immagini microtubulari DNA-PAINT (marcatura anti-α-tubulina) acquisite a ingrandimenti multipli: (A) ingrandimento 1× e 1 binning (FOV di 211 × 211 μm²), (B) binning 2,8× e 2 binning (FOV di 76 × 76 μm²), (C) ingrandimento 4× e 4 binning (FOV di 53 × 53 μm²). Il colore rappresenta la precisione di localizzazione da 0 a 16 nm nel caso di ingrandimento 1x e da 0 a 4 nm negli altri. (D) Precisione di localizzazione misurata a diverse distanze (in μm) dal centro del campo campo per ingrandimenti di 1× (rosso), 2,8× (giallo) e 4× (verde). Questa cifra è stata modificata da Zaza et al.14. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Imaging DNA a cellula intera - PAINT. (A) Sinistra. Imaging volumetrico dei microtubuli nelle cellule HeLa tramite DNA-PAINT acquisito tramite SDC-OPR a ingrandimento di 4×, mostrando sezioni assiali da z = 0 a 9 μm (passi di 1 μm). Ogni piano mostra la posizione z , la precisione di localizzazione e la metrica NeNA. Barre di scala: 5 μm (xy). Giusto. Precisione di localizzazione rispetto alla profondità di penetrazione per tutti i piani. (B) Rendering 3D della rete di microtubuli sulla stessa cella HeLa come in (A). Il colore rappresenta la profondità di penetrazione da 0 a 9 μm. (C) Immagini ingrandite di piccole regioni evidenziate da ciascuna profondità di penetrazione indicate in (A). Questa cifra è stata modificata da Zaza et al.14. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

La microscopia a fluorescenza a super-risoluzione ha superaperto la barriera della diffrazione, migliorando drasticamente la risoluzione spaziale. Tuttavia, la sua ampia adozione nella ricerca biologica affronta sfide continue. In particolare, i compromessi tra campo visivo, risoluzione e profondità di penetrazione rendono difficile ottimizzare tutti e tre i fattori contemporaneamente. Queste sfide sono state affrontate utilizzando le capacità combinate della SMLM e della microscopia confocale a disco rotante, potenziate dalla riassegnazione ottica dei fotoni (SDC-OPR). Integrando array di microlenti in una configurazione SDC standard, come reso possibile dal sistema commerciale SDC-OPR, la raccolta dei fotoni fu aumentata mentre la dimensione effettiva dei fori veniva ridotta, portando a un significativo miglioramento della risoluzione. Rispetto alla SDC standard, il sistema SDC-OPR ha mostrato un netto miglioramento nella potenza di risoluzione, distinguendo con successo le caratteristiche separate da 10nm 14 nel piano focale, mentre la SDC standard poteva risolvere solo distanze superiori a 20nm 11. Questa maggiore capacità di risoluzione sottolinea il vantaggio della riassegnazione dei fotoni per ottenere separazioni su scala molecolare. In particolare, la precisione di localizzazione laterale sotto i 2 nm è stata raggiunta nel piano focale (z = 0 μm), con la precisione laterale che rimaneva sotto i 10 nm a profondità fino a 9 μm, combinata con un campo campo visivo altamente adattabile di 53 × 53 μm² o 76 × 76 μm². Anche con un ampio FOV di 211 × 211 μm², il sistema offriva una impressionante precisione media di localizzazione in piano di 9,5 nm. Questi risultati evidenziano la capacità del sistema di ottenere immagini ad alta risoluzione in intere cellule.

Per quanto riguarda le reazioni di accoppiamento per i diversi anticorpi utilizzati, il protocollo deve essere seguito attentamente per garantire un rapporto ottimale tra anticorpi e DNA. Superare questo rapporto può ridurre la precisione di localizzazione e influire negativamente sulle misurazioni quantitative, come quelle effettuate inqPAINT 25. Pertanto, è fondamentale verificare il rapporto utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis a microvolume, garantendo un rapporto finale 1:1 tra DNA e anticorpi.

Un passaggio fondamentale per ottenere immagini di alta qualità e super-risoluzione dei microtubuli è la corretta fissazione. I metodi convenzionali di fissazione che si basano esclusivamente su alte concentrazioni di PFA spesso disturbano le strutture dei microtubuli. Invece, l'uso del glutaraldeide (GA) da solo o in combinazione con PFA migliora significativamente la conservazionestrutturale 26,27.

Per un'imaging ottimale, un obiettivo ad alta apertura numerica (NA) è essenziale per massimizzare la raccolta di fotoni per ogni singolo evento di molecola. Nel sistema commerciale SDC-OPR, la potenza del laser è intenzionalmente inferiore rispetto ai microscopi TIRF convenzionali usati per SMLM per minimizzare lo sbiancamento del campione. Sebbene DNA-PAINT elimini le preoccupazioni di fotosbiancamento e potrebbe teoricamente impiegare una potenza laser maggiore, i sistemi commerciali attuali impongono limitazioni, rendendo necessari tempi di esposizione più lunghi rispetto all'illuminazione TIRF. Inoltre, poiché l'illuminazione in SDC-OPR è confocale, le molecole non vengono continuamente eccitate durante l'esposizione. Di conseguenza, sono necessari tempi di esposizione più lunghi rispetto all'illuminazione continua del TIRF; In questo studio è stato utilizzato un tempo di esposizione di 300 ms. Tuttavia, a seconda dei requisiti di risoluzione di un dato esperimento, possono essere impiegati tempi di integrazione più brevi (ad esempio, 150-200 ms) con una perdita minima di risoluzione28.

Ottimizzare la concentrazione del filamento dell'imager è un passo fondamentale per garantire che i segnali a singola molecola rimangano ben separati, pur generando abbastanza localizzazioni per una ricostruzione accurata. Questa regolazione è analoga alle acquisizioni standard SMLM, dove l'equilibrio tra densità di eventi e sovrapposizione del segnale è accuratamente controllato. La concentrazione ottimale dell'imager dovrebbe essere regolata per ogni diverso bersaglio. Ad esempio, per i microtubuli, si raccomanda una concentrazione iniziale del filo dell'imager inferiore a 1 nM, con aggiustamenti effettuati secondo necessità.

Mantenere una messa a fuoco stabile durante acquisizioni prolungate è fondamentale, poiché la deriva assiale (z) non può essere corretta dopo l'elaborazione. La deriva laterale (xy) può essere compensata tramite RCC o marcatori fiduciali. In questa configurazione, il Sistema di Messa a Fuoco Perfetto (PFS) del microscopio garantisce stabilità della messa a fuoco per ore di immagini.

In sintesi, l'integrazione di SMLM con SDC-OPR offre una potente piattaforma per immagini ad alta risoluzione in profondità all'interno di intere celle, superando i tradizionali compromessi tra risoluzione, profondità e campo visivo. Tuttavia, per realizzare appieno le capacità del sistema, è essenziale un'attenzione meticolosa alle condizioni sperimentali, dalla coniugazione e fissazione degli anticorpi alle impostazioni di acquisizione e all'elaborazione dei dati. Ogni fase, dalla preparazione del campione alla correzione della deriva, svolge un ruolo fondamentale nel ottenere dati affidabili e ad alta precisione. Con un'attenta ottimizzazione dei protocolli, questo approccio offre una soluzione robusta e versatile per l'imaging quantitativo su scala nanometrica in campioni biologici complessi. Questo protocollo dovrebbe aiutare la comunità ad adottare la microscopia di localizzazione a singola molecola e a ottenere immagini super-risolte da piani campionari difficili da raggiungere utilizzando l'illuminazione convenzionale TIRF o HILO. Entrambi gli obiettivi sono facilitati utilizzando microscopi commerciali tipici che si trovano negli impianti di microscopia di tutto il mondo.

Per quanto riguarda altre applicazioni e future, il metodo è applicabile sia a campioni di cellule intere sia a campioni di tessuto più complessi a profondità di imaging maggiori, come dimostrato in studiprecedenti 14. A differenza degli approcci che richiedono la sezionazione fisica, questa tecnica consente l'imaging volumetrico dei tessuti intatti, preservando l'architettura nativa e minimizzando i reperti introdotti dalla sezione fisica. L'uso di sonde di affinità più piccole, come i nanocorpi, migliora ulteriormente la penetrazione del tessuto rispetto agli anticorpi a tutta lunghezza, permettendo una marcatura più uniforme su campioni spessi. Questo approccio apre la strada allo studio dell'organizzazione cellulare e delle distribuzioni molecolari in situ con maggiore fedeltà. Oltre a queste applicazioni, la strategia si presta anche a screening ad alto rendimento di nanostrutture e assemblaggi biomolecolari, permettendo indagini sistematiche sull'eterogeneità strutturale e sulla funzione. Inoltre, sviluppi recenti nel DNA-PAINT hanno prodotto sonde di imaging auto-estinguenti, basate sia su interazioni dye-quencher chesu interazioni dye-dye 29,30,31, che riducono efficacemente i segnali di fondo, aumentano l'intensità di fluorescenza e migliorano la risoluzione spaziale, consentendo tassi di acquisizione più rapidi. L'integrazione di queste sonde fluorogeniche nel framework SDC-OPR ha il potenziale di aumentare ulteriormente sia la velocità di imaging che la risoluzione. Combinando questi progressi con i punti di forza del sistema SDC-OPR, potrebbe ampliarne l'applicabilità a campioni biologici più complessi, stabilendo la piattaforma come uno strumento flessibile per la mappatura dettagliata di strutture cellulari e molecolari in una vasta gamma di tessuti.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata finanziata dall'Human Frontier Science Program Organization (HFSP) tramite una borsa post-dottorato interdisciplinare presso CZ (LT0025/2023-C) e dall'Engineering and Physical Sciences Research Council per supportare M.T. (EP/R513143/1 e EP/W524335/1) e O.P.L.D (EP/R513143/1 e EP/T517793/1). S.S riconosce anche la Royal Society tramite una borsa di studio Dorothy Hodgkin (DHF\R1\191019 e DHF\R\251006). Questo lavoro è stato inoltre sostenuto da sovvenzioni della Chan Zuckerberg Initiative (2023-321188) e del BBSCR (BB/Y513064/1) a S.S.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
(±)-6-Idrossi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-acido carbossilicoMerck 238813-5GTrolox
3,4-Diidrossibenzoico & nbsp;Merck 37580-25G-FPCA
60 e volte; Obiettivo Apo NA 1.49Nikon
7.0 KDA colonna di desalinizzazione di spin contenente resina di esclusione di dimensione  Fisher Scientific Ltd89882Colonne di Desalinizzazione Zeba Spin per il passo 2.4
Accutasi - Mezzo di distacco delle cellule enzimaticheCellula promozionaleC-41310
Alpaca sdAb (1H1) anti-GFP abbinato a DNA personalizzato (sdAB-5'-TCCTCCTCCTCCT-3')Fotonica di massaProdotto personalizzatoNanocorpi anti-GFP per Drosophila
Alpaca sdAb (1H1) anti-GFP accoppiato con DNAFotonica di massaMASSIVE-TAG-Q-FAST anti-GFP - F3Nanocorpi anti-GFP per NUP
Anti-alfa tubulina (YL1/2)Thermo Fisher ScientificMA1-80017
Anti-coniglio IgGFotonica di massaMassive-sdAB-FAST 2-Plex, Secondario sdAB F2
Anti-TCRζ (6B10.2)BioLegend644102
Albumina sierica bovinaMerck A4503-10GBSA
Tubo centrifugo conico 15 mLFisher Scientific Ltd17705004
Tubo centrifugo conico 50 mLVWR International734-0448
CSU-W1 SoRaNikonMicroscopio SDC-OPR
Desalinizzazione delle colonne di spin con Sephadex G-25 (resina di esclusione di dimensioni per purificazione del DNA) e nbsp;Fisher Scientific Ltd11743309Marchio: Cytiva. Colonne G-25 per il passo 2.5
D-glucosioMerck G8270-1KG
Media DMEMThermo Fisher Scientific11965092
DMSO, AnidroThermo Fisher ScientificD12345
DTT  (Dithiothreitol)Thermo Fisher Scientific15976082
EDTAThermo Fisher Scientific15575020
EGTAMarck324626
Siero bovino fetaleThermo Fisher ScientificA5256701
GlutaraldeideServa2311402
GliceroloMerck G5516-500ML 
GlicinaMP Biomedici219482580
Maleimide-PEG2-succinimidyl Merck 746223-50MG
Media 5A di McCoyFisher Scientific Ltd16600082
MES (2-(N-morfolino)acido etanosolfenonico)MerckM3671-50G
MetanoloFisher Scientific Ltd32213-25L
MgCl2Fisher Scientific Ltd10418464
Tubi microcentrifughe 0,5 mLFisher Scientific Ltd11508232
Tubi microcentrifughe 1,5 mLEppendorf10509691 
Spettrofotometro UV-Vis a microvolumeThermo Fisher ScientificND-ONE-WNanodrop
NaCl2Sigma-AldrichS6546-1L 
Nanoparticelle 90 nm - OroCitodiagnosticaG-90-100
Fotocamera CMOS Orca Fusion-BTHamamatsu
Penicillina-StreptomicinaThermo Fisher Scientific15070063P/S
Soluzione salina tamponata con fosfato (soluzione 1x)Fisher Scientific Ltd11530546PBS
Pierce 16% formaldeide (w/v), senza metanoloFisher Scientific Ltd11586711PFA
Cloruro di potassio Merck   P9541-500G
Protocatechuato 3,4-Diossigenasi  Merck P8279-25UN PCD
Sodio  IdrossidoFisher Scientific Ltd12963614
Anticorpo TOM20AbcamAb186735
Tampone trisVWR InternationalA4577.1000
Triton  X-100   VWR International1086031000
Preadolescente-20Merck P9416-50ML
Unità di filtrazione centrifuga a ultrafiltrazione, MWCO 100 kDaMerck UFC510024Produttore: Amicon Ultra
μ-Slide 8 Pozzo Alto Fondo di vetroIbidiIB-80807
μ-Slide VI 0.5 Fondo di vetroIbidiIB-80607

Riferimenti

  1. Lelek, M., et al. Single-molecule localization microscopy. Nat Rev Methods Primers. 1 (1), 39(2021).
  2. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  3. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nat Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  4. Vignolini, T., Capitanio, M., Caldini, C., Gardini, L., Pavone, F. S., et al. Highly inclined light sheet allows volumetric super-resolution imaging of efflux pumps distribution in bacterial biofilms. Sci Rep. 14 (1), 12902(2024).
  5. Kim, J., et al. Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals. Nat Methods. 16 (9), 853-857 (2019).
  6. Ghosh, A., et al. Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy. Science. 387 (6730), eadq4510(2025).
  7. Wäldchen, F., et al. Whole-Cell imaging of plasma membrane receptors by 3D lattice light-sheet d STORM. Nat Commun. 11 (1), 887(2020).
  8. Zagato, E., et al. Microfabricated devices for single objective single plane illumination microscopy (SoSPIM). Opt express. 25 (3), 1732-1745 (2017).
  9. Galland, R., et al. 3D high-and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nat Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
  10. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. 236, Springer Science & Business Media. (2006).
  11. Schueder, F., et al. Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT. Nat Commun. 8 (1), 2090(2017).
  12. Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Opt Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
  13. York, A. G., et al. Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing. Nat Methods. 10 (11), 1122-1126 (2013).
  14. Zaza, C., et al. Super-resolution imaging in whole cells and tissues via DNA-PAINT on a spinning disk confocal with optical photon reassignment. Nat Commun. 16 (1), 4991(2025).
  15. Jungmann, R., et al. Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami. Nano Lett. 10 (11), 4756-4761 (2010).
  16. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).
  17. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super-resolution microscopy. Nat Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  18. Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
  19. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  20. Ober, R. J., Ram, S., Ward, E. S. Localization accuracy in single-molecule microscopy. Biophys J. 86 (2), 1185-1200 (2004).
  21. Tetley, R., Vaughan, A., Zaza, C. NIS-Elements JOB for DNA-Paint Acquisition at Serial Z-Planes. , (2025).
  22. Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141, 629-638 (2014).
  23. Schlichthaerle, T., et al. Direct visualization of single nuclear pore complex proteins using genetically-encoded probes for DNA-PAINT. Angew Chem. 131 (37), 13138-13142 (2019).
  24. Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification. Nat Commun. 10 (1), 1268(2019).
  25. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  26. Whelan, D. R., Bell, T. D. M. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5 (1), 7924(2015).
  27. Xie, Z., et al. Quantitative characterization of microtubule ultrastructure based on single-molecule localization microscopy. Cytoskeleton. , (2025).
  28. Steen, P. R., et al. The DNA-PAINT palette: A comprehensive performance analysis of fluorescent dyes. Nat Methods. 21 (9), 1755-1762 (2024).
  29. Kessler, L. F., et al. Self-quenched fluorophore-DNA labels for super-resolution fluorescence microscopy. J Phys Chem B. 128 (28), 6751-6759 (2024).
  30. Kessler, L. F., et al. Self-quenched fluorophore dimers for DNA-PAINT and STED Microscopy. Angew Chem Int Ed. 62 (39), e202307538(2023).
  31. Chung, K. K. H., et al. Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging. Nat Methods. 19 (5), 554-559 (2022).

Ristampe e permessi

Tag

Imaging DNA PAINTlocalizzazione di singole molecoleimaging di cellule intereimaging multicoloremarcatura intracellulareimaging cellulare profondoricostruzione dell immagine
Imaging a superrisoluzione di cellule intere tramite DNA-PAINT su un disco confocale rotante con riassegnazione ottica dei fotoni
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.