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Articolo metodologico

Generazione e caratterizzazione mediata da CRISPR/Cas9 di un ceppo Ent2*/CyO di Drosophila melanogaster

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DOI:

10.3791/69546

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7 agosto 2026

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1College of Traditional Chinese Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2Innovative Team for Medicinal Plant Resources and Breeding, Institute of Special Agricultural Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences

In questo articolo

Sommario

Il trasportatore di nucleosidi equilibrati 2 (ENT2) è una proteina transmembrana conservata coinvolta nel trasporto dei nucleosidi e nel metabolismo cellulare. In questo studio, è stato istituito un flusso di lavoro di editing genomica basato su CRISPR/Cas9 per generare un allele mirato a Ent2 in Drosophila melanogaster. Una linea eterozigote stabile Ent2*/CyO è stata costruita e mantenuta utilizzando una strategia di cromosomi bilanciatori. Questo lavoro descrive la progettazione, la generazione e la validazione molecolare della linea mutante, nonché la sua caratterizzazione fenotipica in diverse condizioni di temperatura. Il flusso di lavoro consolidato e il ceppo mutante forniscono un quadro pratico per studiare geni con fenotipi letali omozigoti e per indagare la variazione fenotipica associata alla temperatura in Drosophila.

Abstract

In questo studio, è stato utilizzato un approccio di editing genomico basato su CRISPR/Cas9 per introdurre mutazioni nel gene equilibrativo del trasportatore nucleosidico 2 (Ent2) in Drosophila melanogaster. Gli RNA guida che mirano alla regione codificante di Ent2 sono stati progettati e co-iniettati con l'mRNA di Cas9 in embrioni w1118. Gli alleli mutanti sono stati identificati tramite sequenziamento Sanger e mantenuti come linea eterozigote stabile Ent2*/CyO utilizzando un cromosoma bilanciatore. Successivamente, abbiamo valutato il peso corporeo, la capacità di arrampicata, il tasso di sopravvivenza e le attività della superossido dismutasi (SOD) e della catalasi (CAT) nelle moscerini della frutta rispettivamente a 22 °C e 25 °C. I risultati indicano che sia a 22 °C che a 25 °C, la lunghezza corporea e il peso delle moscerini della frutta Ent2*/CyO sono stati significativamente ridotti rispetto al w1118, e il loro sviluppo è stato ritardato. A 22 °C, la durata complessiva delle mosche Ent2*/CyO era leggermente più lunga rispetto a quella del W1118, mentre a 25 °C non si osservavano differenze significative. Per quanto riguarda la capacità locomotoria, le prestazioni di arrampicata delle mosche eterozigoti erano significativamente inferiori a quelle del w1118 a entrambe le temperature, con i maschi più gravemente colpiti. Inoltre, le attività enzimatiche antiossidanti di CAT e SOD nelle moscerini della frutta Ent2*/CyO sono state significativamente ridotte, indicando un chiaro compromissione della capacità antiossidante. Questi risultati descrivono il profilo fenotipico di una linea mutante Ent2 generata da CRISPR e dimostrano la fattibilità di combinare l'editing genomico con strategie di cromosomi bilanciatori in Drosophila. Questo studio fornisce un quadro metodologico e una risorsa genetica per future indagini sui geni associati al metabolismo e alle risposte ambientali.

Introduzione

Drosophila melanogaster rimane uno degli organismi modello più utilizzati per la genetica e la biologia dellosviluppo 1. È caratterizzato da un ciclo vitale breve, riproduzione rapida, strumenti di manipolazione genetica consolidati e un genoma completamenteannotato 2,3. Questa specie è ampiamente applicata in studi sulla funzione genica, la regolazione metabolica e l'adattabilitàambientale 4,5. I nucleosidi e i loro derivati come l'ATP sono centrali per la generazione di energia cellulare, la sintesi degli acidi nucleici e la trasduzione del segnale in Drosophila, riflettendo una regolazione metabolica conservata tra imetazoi 6. Le vie di segnalazione purinergica in Drosophila, che dipendono dai meccanismi extracellulari di trasporto di adenosina e nucleosidi, evidenziano il ruolo funzionale del movimento dei nucleosidi attraverso le membrane nel coordinare le risposte di energia e trasduzionedel segnale 7. Tra questi processi, il trasporto dei nucleosidi attraverso la membrana citoplasmatica è mediato principalmente dalla famiglia dei trasportatori di nucleosidi equilibrati (ENT), con DmENT2 che mostra attività di trasporto funzionale in Drosophila8.

La famiglia ENT comprende più sottotipi, tra cui ENT2 è un trasportatore nucleosidicotransmembrana 9 ampiamente studiato. Facilita il trasporto transmembrana indipendente dall'energia di vari nucleosidi purina epirimidinica 10,11. Nei mammiferi, ENT2 è un trasportatore bidirezionale espresso ubiquitarmente che facilita l'assorbimento cellulare di nucleosidi e nucleobasi di purina e pirimidina. Questa attività di trasporto contribuisce al recupero dei nucleotidi e aiuta a mantenere l'omeostasi metabolicacellulare 12. ENT2 media anche il trasporto di una varietà di farmaci derivati dai nucleosidi, estendendo la sua rilevanza funzionale oltre il movimento endogeno dei nucleosidi, evidenziandone la più ampia importanza fisiologicae clinica 13. Inoltre, ENT2 è stata implicata in disturbineurologici 14, metabolismotumorale 15, disfunzionevascolare 16 e metabolismo energetico cellulare negliesseri umani 17. Tuttavia, gli studi che affrontano i ruoli a livello di organismo di Ent2 in Drosophila restano limitati.

I ruoli di ENT2 nella crescita e sviluppo, nel metabolismo energetico, nelle prestazioni locomotorie e nella capacità antiossidante in condizioni di temperatura variabile non sono stati ancora pienamenteesplorati 18. La temperatura influisce fortemente sul tasso metabolico basale e sulla durata della vita in Drosophila, con temperature di allevamento più elevate che generalmente aumentano l'attività metabolica e riducono lalongevità 19. Questi cambiamenti dipendenti dalla temperatura nell'espressione genica possono influenzare le vie fisiologiche e quindi modificare gli effetti fenotipici di specifiche mutazionigeniche 20.

La proteina 9 (CRISPR/Cas9) a ripetizioni palindromiche corte e interspaziate regolarmente interspaziate e clusterizzate brevi (CRISPR/Cas9) è stata ampiamente applicata in Drosophila per varie operazioni di modifica genomica come knockout specifico del sito, la delezione, la sostituzione e l'introduzione del tag, dimostrandone efficienza eaffidabilità 21,22,23. Gli ultimi progressi indicano che gli editor di base derivati da CRISPR possono essere utilizzati anche per modifiche di base site-specific più fine in Drosophila, fornendo un nuovo strumento per mutazioni puntiformi e un controllo fenotipicopreciso 24. I metodi tradizionali di mutagenesi, inclusi la mutagenesi chimica e da radiazioni così come gli screening mediati dai trasposoni, possono generare mutazionigenetiche 25. Questi approcci sono spesso limitati dalla bassa efficienza e dall'alta casualità negli eventi di mutazione. Di conseguenza, i ricercatori devono selezionare un gran numero di individui per isolare alleli specifici diinteresse 26. CRISPR/Cas9 consente la scissione programmata diretta tramite RNA guida (gRNA) in sequenze di DNA specificate. Le rotture a doppio filamento risultanti vengono riparate tramite un'unzione non omologa delle estremità o riparazione diretta dall'omologia, generando mutazioni ereditarie definite e riducendo significativamente le mutazioni di fondo che potrebbero confondere l'analisifenotipica 27,28. Gli alleli mutanti generati tramite CRISPR/Cas9 possono essere mantenuti in uno stato eterozigote tramite collegamento con cromosomi bilanciatori, come Curly O (CyO)29. Questa strategia ha dimostrato di prevenire efficacemente la perdita degli alleli letali in forma omozigote nella genetica di Drosophila. Di conseguenza, supporta una valutazione fenotipica sistematica e a lungo termine, inclusi studi funzionali sotto temperature o condizioni ambientalivariabili 29,30. Il design semplice e l'elevata efficienza di CRISPR/Cas9 hanno significativamente accorciato il ciclo di costruzione dello strain e aumentato la stabilità del background genetico. Questo è particolarmente importante per studiare fattori ambientali a lungo termine come la risposta alla temperatura e l'omeostasi dello sviluppo.

Sulla base di queste fondamenta, il gene Ent2 in Drosophila melanogaster è stato eliminato utilizzando il sistema CRISPR/Cas9, e è stato stabilito un ceppo mutante eterozigote Ent2*/CyO ereditato in modo stabile. Il ciclo di sviluppo, il peso corporeo, la capacità locomotoria e le attività degli enzimi antiossidanti SOD e CAT sono stati valutati sistematicamente. Confrontando i fenotipi multidimensionali di w1118 e mosche mutanti in condizioni di temperatura variabili, questo studio mira a presentare una strategia riproducibile per generare e mantenere linee mutanti derivate da CRISPR e fornisce una caratterizzazione descrittiva dei fenotipi risultanti. Questo lavoro offre un quadro metodologico e una risorsa genetica utile per studi futuri che indagano i geni coinvolti nel metabolismo e nelle risposte ambientali.

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Protocollo

1. Progettazione di bersagli CRISPR/Cas9 per il gene Ent2

  1. Seleziona i siti CRISPR candidati negli esoni 2 e 5 di Ent2 (ID FlyBase: FBgn0263916) usando CHOPCHOP (v3)31 e il CCTop (v1.0)32.
  2. Il genoma di riferimento è stato definito come Drosophila melanogaster Release 6 (dm6) (Accession assemblaggio RefSeq: GCF_000001215.4). Successivamente, sono stati identificati i siti gRNA candidati. Infine, i siti identificati sono stati filtrati per ottenere i gRNA ottimali.
  3. Filtrare gli obiettivi per punteggio di specificità MIT ≥ 80 (CHOPCHOP), punteggio CFD ≤ 0,1 (CCTop), contenuto GC 40%–60% e distanza minima PAM.
  4. Classifica gli obiettivi con un punteggio ponderato (efficienza 50%, specificità 30%, ottimizzazione GC 20%) e scegli due gRNA.
  5. Aggiungere un "G" all'estremità 5′ di ogni gRNA per soddisfare il requisito del promotore T7. Utilizzare i seguenti oligonucleotidi anteriori specifici per gRNA per generare il modello di trascrizione sgRNA a lunghezza completa tramite PCR:
    Ent2-sg1-F: TAATACGACTCACTAT
    AGGTGACGTTAAATCCATCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
    Ent2-sg2-F: TAATACGACTCAC
    TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
  6. La sequenza residua dell'impalcatura sgRNA è fornita dall'oligonucleotide inverso universale durante la PCR.

2. Preparazione di modelli di trascrizione sgRNA

  1. Preparazione di modelli di trascrizione degli sgRNA
    1. Assemblare una miscela di reazione PCR da 60 μL utilizzando il metodo di annealing–PCR a doppio oligonucleotide33 secondo le istruzioni del produttore. Combinare l'oligonucleotide anteriore specifico per gRNA (Ent2-sg1-F o Ent2-sg2-F) con un oligonucleotide inverso universale che codifica per l'impalcatura dello sgRNA per ottenere il modello dsDNA a lunghezza intera per la trascrizione in vitro.
    2. Programma il termociclatore: 95 °C 3 min; 35 cicli di 95 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 20 s; poi 72 °C per 10 minuti; mantieni a 12 °C.
  2. Purifica il modello di trascrizione
    1. Aggiungere 100 μL di acetato di ammonio (vedi Tabella dei materiali) al prodotto PCR da 60 μL; Mescola. Aggiungi 400 μL di etanolo anidro; Inverti per mescolare e incuba a -20 °C per 20 minuti.
    2. Centrifugare a 4 °C, 20.000 x g per 15 minuti; Scarta il soprantantante.
    3. Asciuga il pellet all'aria con il tubo aperto per 10 minuti. Risospendere il pellet in 10 μL di ddH₂O privo di nucleasi.
  3. Trascrizione in vitro del gRNA
    1. Impostare una reazione di trascrizione in vitro di T7 a 10 μL seguendo le istruzioni del kit (vedi Tabella dei Materiali).
    2. Incubare a 37 °C per 35 minuti. Aggiungere 0,5 μL di DNasi I (fornito nel kit di trascrizione) e incubare a 37 °C per 15 minuti.
  4. Purificare il gRNA
    1. Diluire la miscela di trascrizione a 60 μL con ddH₂O senza nucleasi. Aggiungere 60 μL di fenolo/cloroformio saturo d'acqua (vedi Tabella dei materiali); Vortice brevemente e centrifuga a 4 °C, 16.000 x g per 5 minuti.
    2. Trasferire 45 μL della fase acquosa in un nuovo tubo privo di RNasi da 1,5 mL. Aggiungere 5 μL di acetato di sodio; Mescola.
    3. Aggiungere 125 μL di etanolo anidro pre-raffreddato; Mescola e incuba a -20 °C per 20–30 minuti. Centrifugare a 4 °C, 20.000 x g per 15 minuti; Scarta il soprantantante.
    4. Lavare il pellet con 200 μL di etanolo al 70% (senza RNasi); centrifuga a 4 °C, 20.000 x g per 5 minuti; Rimuove il soprantantante.
    5. Asciugare il pellet a 37 °C finché l'etanolo non evapora completamente. Risospendere a 20 μL ddH₂O; aliquota e conserva a -80 °C.
    6. Misura la concentrazione di gRNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop e regola la concentrazione a 250 ng/μL per l'iniezione. Assicurarsi la purezza del gRNA con un rapporto A260/A280 di circa 2,0.
      NOTA: Sottolineiamo che i guanti devono essere indossati per tutto il processo per la protezione RNase. Tutti i consumabili, inclusi i tubi centrifughe e le punte delle pipette senza RNase pre-raffreddati, devono essere utilizzati costantemente durante la procedura. I rifiuti di reagenti organici generati durante l'operazione devono essere raccolti separatamente in contenitori designati per i rifiuti in base al tipo e regolarmente trasportati in un centro certificato di smaltimento di rifiuti pericolosi per una corretta manipolazione.

3. Preparazione dell'mRNA Cas9

  1. Preparazione del Modello di Trascrizione
    NOTA: Usa punte e tubi senza RNasi durante le fasi relative all'RNA.
    1. Scongelare il plasmide di espressione Cas9 MLM3613 (vedi Tabella dei Materiali) su ghiaccio. In un tubo privo di RNasi, si combinano 20 μg di DNA plasmidico, 7,5 μL 10x di buffer di restrizione, 1 μL di PmeI (10.000 U/mL) e ddH₂O senza nucleasi a 75 μL.
    2. Incubare a 37 °C per 30 minuti. Verifica la linearizzazione completa caricando 5 μL su un gel di agarosio all'1% a 120 V per 30 minuti.
  2. Purificazione dei modelli di trascrizione
    1. Aggiungere 23 μL di solfato dodecile di sodio al 2% (SDS, vedi Tabella dei materiali per dettagli) e 0,5 μL di proteinasi K (vedi Tabella dei materiali per i dettagli) a 70 μL della digestione; Incubare a 50 °C per 30 minuti.
    2. Aggiungere 45 μL di cloroformio e 45 μL di fenolo trisaturato; vortice per un breve periodo; centrifuga 13.800 x g, 5 min.
    3. Trasferire la fase acquosa da 90 μL in un nuovo tubo. Aggiungere 10 μL di acetato di sodio (fornito dal kit) e 200 μL etanolo anidro preraffreddato; mix; incubare −20 °C, 30 minuti.
    4. Centrifuga 20.000 x g, 4 °C, 15 min; Scarta il soprantantante. Lavare il pellet due volte con 100 μL di etanolo al 70%; centrifuga 20.000 x g, 2 min ciascuna; Asciuga all'aria.
    5. Dissolvere DNA in 20 μL ddH₂O privo di nucleasi; confermare >500 ng/μL.
  3. Trascrizione in vitro con co-capping
    1. Impostare la reazione utilizzando un kit di trascrizione in vitro T7 con tappa (vedi Tabella dei Materiali) secondo le istruzioni del produttore.
    2. Incubare a 37 °C per 2 ore per generare un mRNA Cas9 limitato.
    3. Dopo che la reazione di trascrizione è completata, aggiungere 1 μL di DNasi (fornito nel kit, concentrazione 2 U/μL), mescolare accuratamente e incubare a 37°C per 15 minuti per degradare il modello di DNA.
  4. Aggiungi una coda in poli(A)
    1. Porta l'RNA a 14 μL ddH₂O.
    2. Aggiungere 2 μL di 10x E. coli polimerasi buffer, 2 μL di ATP (10 mM), 1 μL inibitore della RNasi e 1 μL di poli(A) polimerasi.
    3. Incubare a 37 °C per 45 minuti.
  5. Purifica l'mRNA
    1. Applicare la reazione a un kit di RNA totale a colonna di spin (vedi Tabella dei Materiali). Carica il campione su una colonna di spin a membrana silicea da 2 mL; centrifuga 8.000 x g, 15 s; Scartare il flusso attraverso la testa.
    2. Aggiungere 500 μL di tampone RPE alla colonna RNeasy, centrifugare a 8000 x g per 15 secondi e scartare il liquido residuo. Ripeti questo passaggio una volta, poi centrifuga per 2 minuti e elimina il liquido residuo.
    3. Posiziona la colonna RNeasy in un nuovo tubo centrifuga da 1,5 mL. Aggiungi 30 μL di ddH₂O senza RNasi, centrifuga a 8000 x g per 1 minuto per eluire l'RNA. Regolare la concentrazione di mRNA a 500 ng/μL per l'iniezione. Conservare l'RNA eluzionato a -80 °C.

4. Microiniezione di embrioni di Drosophila

  1. Preparazione dei campioni di iniezione
    1. Mescolare 15 μg di mRNA Cas9 con gRNA a doppio filamento di 7,5 μg a un rapporto di volume di 2:1.
    2. Regolare a 30 μL con acqua priva di RNase trattata con DEPC; Tieni il ghiaccio.
  2. Crescita di Drosophila
    1. Trasferire il ceppo iniettato di Drosophila w1118 su grandi tubi alimentari per l'amplificazione. W1118 mosche sono state utilizzate come controllo di riferimento per rappresentare lo stato fisiologico di base senza effetti associati al bilanciatore.
    2. Mantenere le mosche in una camera climatica artificiale impostata a 25 °C con un'umidità del 60%–70% e un ciclo chiaro-buio di 12:12 per 14 giorni.
    3. Alle 17:00 del giorno successivo al periodo di allevamento di 14 giorni (Giorno 15), raccogliere le mosche adulte per sincronizzare la deposizione temporizzata degli embrioni. Questo tempo specifico di raccolta garantisce che gli embrioni utilizzati per l'iniezione siano in una fase di sviluppo costante. Controllare l'orario della giornata è importante per minimizzare gli effetti del ritmo circadiano sullo sviluppo embrionale e sul comportamento riproduttivo, garantendo così la riproducibilità sperimentale e riducendo la variabilità fisiologica tra i lotti.
  3. Microiniezione di Drosophila
    1. Raccogliere mosche adulte per l'iniezione nelle gabbie per mosche, con circa 400 adulti per gabbia. Raccogliere embrioni su piastre agar rivestite di lievito; Raccogli gli embrioni entro 60 minuti dalla deposizione delle uova e sciacquali sulle coperture. Non è stata eseguita alcuna decorionazione prima dell'iniezione.
    2. Allineare gli embrioni su copertine con i poli posteriori rivolti verso l'esterno, disposti ordinatamente dall'alto verso il basso. Assicurarsi che l'ago di iniezione penetri il polo posteriore fino a una profondità appropriata (circa un quinto della lunghezza dell'embrione) per una consegna citoplasmatica costante. In questo studio sono stati utilizzati in totale 300 embrioni.
    3. Sotto uno stereomicroscopio, focalizzare la punta dell'ago e l'embrione nello stesso piano.
    4. Utilizzando lo strumento di iniezione, perforare il polo posteriore e iniettare 0,001 μL della miscela in ogni embrione.
    5. Trasferire gli embrioni iniettati in fiale alimentari; incubano a 25 °C, ~70% di umidità relativa (RH) per ottenere generazione P₀ (gli adulti iniettati che sopravvivono per produrre progenie).

5. Costruzione di ceppi stabili di espressione in Drosophila

  1. Incrocio P₀ eclosed con mosche Bc/CyO .
    1. Microinietta una miscela di gRNA che prende di mira il gene di interesse e la proteina Cas9 in 300 embrioni del ceppo w1118 Drosophila . Dopo l'iniezione, si ottengono un totale di 30 adulti P0 vitali e fertili. Incrocia ogni adulto P0 (mosaico) individualmente con mosche del ceppo w1118 , ottenendo 16 incroci a coppia singola (8 fiale con maschi P0 incrociati con femmine vergini e 8 fiale con femmine P0 incrociate con maschi). Mantenere tutti gli incroci a 25 °C in condizioni di coltura costante.
    2. Dopo la comparsa delle larve F1, rimuovere le mosche parentali P0. Estrarre il DNA genomico dalla progenie F1 e sottoporlo ad analisi PCR per determinare i genotipi adulti F1 (Ent2/+).
    3. Genera progenie F2 tramite incroci singoli tra mosche Bc/CyO . Seleziona individui adulti F2 e genotipali per identificare le mosche con il genotipo Ent2/CyO .
    4. Intercross F3 vola (Ent2/CyO) per valutare la presenza di mutanti omozigoti. Se non vengono recuperate mosche omozigote, incrociare mosche Ent2/CyO per un'ulteriore generazione per determinare ulteriormente se il genotipo omozigote sia letale.
  2. Estrazione del DNA genomico di Drosophila
    1. Raccogli una o due mosche adulte in un tubo EP da 1,5 mL e aggiungi 110 μL di PA per l'estrazione del DNA vegetale.
    2. Omogeneizzare accuratamente i campioni usando un tritatessuti per almeno 3 minuti.
    3. Incubare gli omogeneati in un bagno metallico a 65 °C per non meno di 30 minuti.
    4. Aggiungi 100 μL di cloroformio, inverti delicatamente la miscela per mescolare e vortice per 10 secondi. Centrifuga i campioni a 14.000 giri/min per 10 minuti a temperatura ambiente.
    5. Trasferire con attenzione circa 65 μL (o più) del surnatante in un nuovo tubetto, aggiungere due volumi di etanolo assoluto pre-raffreddato (pre-incubato a 4 °C per almeno 10 minuti), invertire delicatamente per mescolare e incubare a -20 °C per almeno 15 minuti.
    6. Centrifugare campiona a 14.000 giri/min per 10 minuti a 4 °C e scartare con cura il surnadante.
    7. Asciugare la pellet di DNA all'aria a temperatura ambiente o in un incubatore fino a essere completamente asciutta, quindi risospendere in un volume appropriato di buffer PB. Per i campioni femmina (f), aggiungere 50 μL di buffer PB, mentre per i campioni maschi (m) aggiungere 15 μL.
  3. Amplificazione PCR e sequenziamento Sanger
    1. Eseguire amplificazione PCR utilizzando primer specifici progettati per aggirare le regioni a monte e a valle del sito target del gRNA.
    2. Purificare i prodotti PCR e sottoporli al sequenziamento Sanger. Analizza i cromatogrammi di sequenziamento utilizzando il softwareSnapGene 34 e allineala alla sequenza di riferimento wild-type per un'analisi comparativa.
    3. Esaminare i grafici dei picchi vicino al sito target del gRNA per i picchi sovrapposti indicanti mutazioni dell'indel. Eseguire la divisione dei picchi per risolvere segnali contrastanti e confermare il tipo di mutazione, inclusi inserimenti o delezioni nel sito target.
    4. Backcross con maschi Bc/CyO per 4 generazioni per stabilire Ent2/CyO.
      Nota: È stato osservato che Ent2*/Ent2* e CyO/CyO sono letali nelle prime fasi dello sviluppo; pertanto, gli eterozigoti Ent2*/CyO sono mantenuti.
  4. Dopo aver stabilito gli eterozigoti Ent2*/CyO , raccogliere campioni dallo stesso lotto di eterozigoti Ent2*/CyO sotto stereomicroscopio.
  5. Seleziona casualmente 20 mosche adulte e pesale usando un bilanciere di precisione con risoluzione di 0,001 g. Fotografa i campioni per documentare le caratteristiche fenotipiche.

6. Caratterizzazione fenotipica descrittiva

  1. I 120 uomini e 120 femmine (testati tre fiale per ogni gruppo, con ogni fiala contenente 20 mosche) ciascuno di Ent2*/CyO e w1118 a 22 °C e 25 °C.
  2. Annota il numero di morti settimanalmente e traccia le curve di sopravvivenza.
  3. Impostare 30 coppie di accoppiamento casuali per gruppo; consentire un accoppiamento di 24 ore;
  4. Trasferire gli adulti su tubi nuovi; Figli posteriori.
  5. A 7 giorni dall'eclosione, si valuta il successo dell'arrampicata (≥8 cm entro 30 s) con sei repliche per gruppo.
  6. Tutte le osservazioni sono state registrate come caratteristiche descrittive della linea mutante e non sono state utilizzate per dedurre la funzione genica.

7. Misurare le attività degli enzimi antiossidanti

  1. Raccogliere 300 maschi e 300 femmine adulte (testate tre fiale per ogni gruppo, con ogni fiala contenente 100 mosche), Ent2*/CyO e w1118 mosche di controllo a 5 giorni dall'echiusura per garantire maturità fisiologica e un'età comparabile.
  2. Trasferire le mosche in tubi vuoti senza cibo e morire di fame per 2 ore per standardizzare lo stato metabolico prima dei test biochimici.
  3. Aggiungi una sfera/tubo d'acciaio; omogeneizzare a 60 Hz, 2 min.
  4. Centrifuga 4 °C, 161 x g, 10 min; Raccogli il soprantantante.
  5. Misurare la dismutasi totale di superossido (SOD, vedi Tabella dei Materiali per i dettagli) e catalasi (CAT, vedi Tabella dei Materiali per i dettagli) secondo le istruzioni del kit.

8. Statistiche e analisi dei dati

  1. Esprimi tutti i dati come media ± errore standard della media (figure-protocol-1± SEM).
  2. Utilizzare ANOVA unidirezionale per confrontare i dati sull'attività enzimatica; Applica ANOVA a tre vie (fattori: genotipo, temperatura, sesso) per il peso corporeo, la capacità di arrampicata e la lunghezza del corpo. Esegui il test HSD di Tukey post hoc quandoopportuno 35.
  3. Definisci la significanza come P < 0,05 per tutti i test statistici.
  4. Analizzare i dati sulla durata della vita utilizzando curve di sopravvivenza ed eseguire il test log-rank (Mantel-Cox), che valuta se esistano differenze significative nelle traiettorie di sopravvivenza tra le coortisperimentali 36.
  5. Esegui tutte le analisi e i grafici nel software GraphPad Prism 9.5.0 seguendo le linee guidasoftware 37.
  6. Tutte le analisi statistiche sono state effettuate solo per confronto descrittivo e non per stabilire relazioni causali.

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Risultati

Analisi di progettazione e verifica dell'efficacia dei siti di targeting genico Ent2
I siti target candidati per il gene Ent2 sono stati progettati utilizzando le piattaforme CHOPCHOP e CCTop (Figura 1). Due gRNA che mirano alle regioni dell'esone 2 e dell'esone 5 sono stati selezionati in base a criteri di specificità ed efficienza. Per verificare il successo dell'editing genomico, il DNA genomico di individui selezionati casualmente della linea Ent2*

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Discussione

L'ENT è una proteina evolutivamente conservata che influenza molteplici processibiologici 38. Quando espressa negli ovociti di Xenopus laevis, Ent2 mostra attività di trasportonucleosidico 8. Gli studi hanno dimostrato che il mutante omozigote di Ent2 è letale durante la fase larvale tarda o lafase pupale iniziale 10. Nel presente studio, è stato istituito un flusso di lavoro di editing gen...

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Dichiarazioni

Tutti gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Sostenere questa ricerca tramite il Programma di Sviluppo della Scienza e della Tecnologia della provincia di Jilin (Progetto n. 20230505044ZP).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ammonium acetateSigma A1542
Catalase (CAT) Assay Kit (Visible Light Method) (Ammonium Molybdate Method)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA007-1-1
Dodecyl sulfateSigmaL3771
Injection deviceEppendorf FemtoJet 4i
Linearized plasmid: MLM3613Addgene42251
MicroscopeOLYMPUS CKX3-SLP
mMESSAGE mMACHINE T7 kitThermo FisherAM1344
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription KitThermo FisherAM1344
PmeI restriction enzymeNEB R0560S
Poly(A) polymeraseNEBM0276S
Protease KThermo FisherEO0491
RNeasy Mini KitQIAGEN74104
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production SystemPromega P1320
T7 RiboMAX KitPromega P1320
Total Superoxide Dismutase (T-SOD) assay kit (Hydroxylamine method)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-1
w1118 Drosophila Fangjing Biology
Water-saturated phenol/chloroformSigmaP2069

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