Generazione e caratterizzazione mediata da CRISPR/Cas9 di un ceppo Ent2*/CyO di Drosophila melanogaster

Sommario

Il trasportatore di nucleosidi equilibrati 2 (ENT2) è una proteina transmembrana conservata coinvolta nel trasporto dei nucleosidi e nel metabolismo cellulare. In questo studio, è stato istituito un flusso di lavoro di editing genomica basato su CRISPR/Cas9 per generare un allele mirato a Ent2 in Drosophila melanogaster. Una linea eterozigote stabile Ent2*/CyO è stata costruita e mantenuta utilizzando una strategia di cromosomi bilanciatori. Questo lavoro descrive la progettazione, la generazione e la validazione molecolare della linea mutante, nonché la sua caratterizzazione fenotipica in diverse condizioni di temperatura. Il flusso di lavoro consolidato e il ceppo mutante forniscono un quadro pratico per studiare geni con fenotipi letali omozigoti e per indagare la variazione fenotipica associata alla temperatura in Drosophila.

Abstract

In questo studio, è stato utilizzato un approccio di editing genomico basato su CRISPR/Cas9 per introdurre mutazioni nel gene equilibrativo del trasportatore nucleosidico 2 (Ent2) in Drosophila melanogaster. Gli RNA guida che mirano alla regione codificante di Ent2 sono stati progettati e co-iniettati con l'mRNA di Cas9 in embrioni w¹¹¹⁸. Gli alleli mutanti sono stati identificati tramite sequenziamento Sanger e mantenuti come linea eterozigote stabile Ent2*/CyO utilizzando un cromosoma bilanciatore. Successivamente, abbiamo valutato il peso corporeo, la capacità di arrampicata, il tasso di sopravvivenza e le attività della superossido dismutasi (SOD) e della catalasi (CAT) nelle moscerini della frutta rispettivamente a 22 °C e 25 °C. I risultati indicano che sia a 22 °C che a 25 °C, la lunghezza corporea e il peso delle moscerini della frutta Ent2*/CyO sono stati significativamente ridotti rispetto al w¹¹¹⁸, e il loro sviluppo è stato ritardato. A 22 °C, la durata complessiva delle mosche Ent2*/CyO era leggermente più lunga rispetto a quella del W¹¹¹⁸, mentre a 25 °C non si osservavano differenze significative. Per quanto riguarda la capacità locomotoria, le prestazioni di arrampicata delle mosche eterozigoti erano significativamente inferiori a quelle del w¹¹¹⁸ a entrambe le temperature, con i maschi più gravemente colpiti. Inoltre, le attività enzimatiche antiossidanti di CAT e SOD nelle moscerini della frutta Ent2*/CyO sono state significativamente ridotte, indicando un chiaro compromissione della capacità antiossidante. Questi risultati descrivono il profilo fenotipico di una linea mutante Ent2 generata da CRISPR e dimostrano la fattibilità di combinare l'editing genomico con strategie di cromosomi bilanciatori in Drosophila. Questo studio fornisce un quadro metodologico e una risorsa genetica per future indagini sui geni associati al metabolismo e alle risposte ambientali.

Introduzione

Drosophila melanogaster rimane uno degli organismi modello più utilizzati per la genetica e la biologia dello^{sviluppo 1}. È caratterizzato da un ciclo vitale breve, riproduzione rapida, strumenti di manipolazione genetica consolidati e un genoma completamente^{annotato 2,3}. Questa specie è ampiamente applicata in studi sulla funzione genica, la regolazione metabolica e l'adattabilità^{ambientale 4,5}. I nucleosidi e i loro derivati come l'ATP sono centrali per la generazione di energia cellulare, la sintesi degli acidi nucleici e la trasduzione del segnale in Drosophila, riflettendo una regolazione metabolica conservata tra i^{metazoi 6}. Le vie di segnalazione purinergica in Drosophila, che dipendono dai meccanismi extracellulari di trasporto di adenosina e nucleosidi, evidenziano il ruolo funzionale del movimento dei nucleosidi attraverso le membrane nel coordinare le risposte di energia e trasduzione^{del segnale 7}. Tra questi processi, il trasporto dei nucleosidi attraverso la membrana citoplasmatica è mediato principalmente dalla famiglia dei trasportatori di nucleosidi equilibrati (ENT), con DmENT2 che mostra attività di trasporto funzionale in Drosophila⁸.

La famiglia ENT comprende più sottotipi, tra cui ENT2 è un trasportatore nucleosidico^{transmembrana 9} ampiamente studiato. Facilita il trasporto transmembrana indipendente dall'energia di vari nucleosidi purina e^{pirimidinica 10,11}. Nei mammiferi, ENT2 è un trasportatore bidirezionale espresso ubiquitarmente che facilita l'assorbimento cellulare di nucleosidi e nucleobasi di purina e pirimidina. Questa attività di trasporto contribuisce al recupero dei nucleotidi e aiuta a mantenere l'omeostasi metabolica^{cellulare 12}. ENT2 media anche il trasporto di una varietà di farmaci derivati dai nucleosidi, estendendo la sua rilevanza funzionale oltre il movimento endogeno dei nucleosidi, evidenziandone la più ampia importanza fisiologica^{e clinica 13}. Inoltre, ENT2 è stata implicata in disturbi^{neurologici 14}, metabolismo^{tumorale 15}, disfunzione^{vascolare 16} e metabolismo energetico cellulare negli^{esseri umani 17}. Tuttavia, gli studi che affrontano i ruoli a livello di organismo di Ent2 in Drosophila restano limitati.

I ruoli di ENT2 nella crescita e sviluppo, nel metabolismo energetico, nelle prestazioni locomotorie e nella capacità antiossidante in condizioni di temperatura variabile non sono stati ancora pienamente^{esplorati 18}. La temperatura influisce fortemente sul tasso metabolico basale e sulla durata della vita in Drosophila, con temperature di allevamento più elevate che generalmente aumentano l'attività metabolica e riducono la^{longevità 19}. Questi cambiamenti dipendenti dalla temperatura nell'espressione genica possono influenzare le vie fisiologiche e quindi modificare gli effetti fenotipici di specifiche mutazioni^{geniche 20}.

La proteina 9 (CRISPR/Cas9) a ripetizioni palindromiche corte e interspaziate regolarmente interspaziate e clusterizzate brevi (CRISPR/Cas9) è stata ampiamente applicata in Drosophila per varie operazioni di modifica genomica come knockout specifico del sito, la delezione, la sostituzione e l'introduzione del tag, dimostrandone efficienza e^{affidabilità 21,22,23}. Gli ultimi progressi indicano che gli editor di base derivati da CRISPR possono essere utilizzati anche per modifiche di base site-specific più fine in Drosophila, fornendo un nuovo strumento per mutazioni puntiformi e un controllo fenotipico^{preciso 24}. I metodi tradizionali di mutagenesi, inclusi la mutagenesi chimica e da radiazioni così come gli screening mediati dai trasposoni, possono generare mutazioni^{genetiche 25}. Questi approcci sono spesso limitati dalla bassa efficienza e dall'alta casualità negli eventi di mutazione. Di conseguenza, i ricercatori devono selezionare un gran numero di individui per isolare alleli specifici di^{interesse 26}. CRISPR/Cas9 consente la scissione programmata diretta tramite RNA guida (gRNA) in sequenze di DNA specificate. Le rotture a doppio filamento risultanti vengono riparate tramite un'unzione non omologa delle estremità o riparazione diretta dall'omologia, generando mutazioni ereditarie definite e riducendo significativamente le mutazioni di fondo che potrebbero confondere l'analisi^{fenotipica 27,28}. Gli alleli mutanti generati tramite CRISPR/Cas9 possono essere mantenuti in uno stato eterozigote tramite collegamento con cromosomi bilanciatori, come Curly O (CyO)²⁹. Questa strategia ha dimostrato di prevenire efficacemente la perdita degli alleli letali in forma omozigote nella genetica di Drosophila. Di conseguenza, supporta una valutazione fenotipica sistematica e a lungo termine, inclusi studi funzionali sotto temperature o condizioni ambientali^{variabili 29,30}. Il design semplice e l'elevata efficienza di CRISPR/Cas9 hanno significativamente accorciato il ciclo di costruzione dello strain e aumentato la stabilità del background genetico. Questo è particolarmente importante per studiare fattori ambientali a lungo termine come la risposta alla temperatura e l'omeostasi dello sviluppo.

Sulla base di queste fondamenta, il gene Ent2 in Drosophila melanogaster è stato eliminato utilizzando il sistema CRISPR/Cas9, e è stato stabilito un ceppo mutante eterozigote Ent2*/CyO ereditato in modo stabile. Il ciclo di sviluppo, il peso corporeo, la capacità locomotoria e le attività degli enzimi antiossidanti SOD e CAT sono stati valutati sistematicamente. Confrontando i fenotipi multidimensionali di ^w1118 e mosche mutanti in condizioni di temperatura variabili, questo studio mira a presentare una strategia riproducibile per generare e mantenere linee mutanti derivate da CRISPR e fornisce una caratterizzazione descrittiva dei fenotipi risultanti. Questo lavoro offre un quadro metodologico e una risorsa genetica utile per studi futuri che indagano i geni coinvolti nel metabolismo e nelle risposte ambientali.

Protocollo

1. Progettazione di bersagli CRISPR/Cas9 per il gene Ent2

1. Seleziona i siti CRISPR candidati negli esoni 2 e 5 di Ent2 (ID FlyBase: FBgn0263916) usando CHOPCHOP (v3)³¹ e il CCTop (v1.0)³².
2. Il genoma di riferimento è stato definito come Drosophila melanogaster Release 6 (dm6) (Accession assemblaggio RefSeq: GCF_000001215.4). Successivamente, sono stati identificati i siti gRNA candidati. Infine, i siti identificati sono stati filtrati per ottenere i gRNA ottimali.
3. Filtrare gli obiettivi per punteggio di specificità MIT ≥ 80 (CHOPCHOP), punteggio CFD ≤ 0,1 (CCTop), contenuto GC 40%–60% e distanza minima PAM.
4. Classifica gli obiettivi con un punteggio ponderato (efficienza 50%, specificità 30%, ottimizzazione GC 20%) e scegli due gRNA.
5. Aggiungere un "G" all'estremità 5′ di ogni gRNA per soddisfare il requisito del promotore T7. Utilizzare i seguenti oligonucleotidi anteriori specifici per gRNA per generare il modello di trascrizione sgRNA a lunghezza completa tramite PCR:
   Ent2-sg1-F: TAATACGACTCACTAT
   AGGTGACGTTAAATCCATCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
   Ent2-sg2-F: TAATACGACTCAC
   TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
6. La sequenza residua dell'impalcatura sgRNA è fornita dall'oligonucleotide inverso universale durante la PCR.

2. Preparazione di modelli di trascrizione sgRNA

1. Preparazione di modelli di trascrizione degli sgRNA
   1. Assemblare una miscela di reazione PCR da 60 μL utilizzando il metodo di annealing–PCR a doppio oligonucleotide³³ secondo le istruzioni del produttore. Combinare l'oligonucleotide anteriore specifico per gRNA (Ent2-sg1-F o Ent2-sg2-F) con un oligonucleotide inverso universale che codifica per l'impalcatura dello sgRNA per ottenere il modello dsDNA a lunghezza intera per la trascrizione in vitro.
   2. Programma il termociclatore: 95 °C 3 min; 35 cicli di 95 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 20 s; poi 72 °C per 10 minuti; mantieni a 12 °C.
2. Purifica il modello di trascrizione
   1. Aggiungere 100 μL di acetato di ammonio (vedi Tabella dei materiali) al prodotto PCR da 60 μL; Mescola. Aggiungi 400 μL di etanolo anidro; Inverti per mescolare e incuba a -20 °C per 20 minuti.
   2. Centrifugare a 4 °C, 20.000 x g per 15 minuti; Scarta il soprantantante.
   3. Asciuga il pellet all'aria con il tubo aperto per 10 minuti. Risospendere il pellet in 10 μL di ddH₂O privo di nucleasi.
3. Trascrizione in vitro del gRNA
   1. Impostare una reazione di trascrizione in vitro di T7 a 10 μL seguendo le istruzioni del kit (vedi Tabella dei Materiali).
   2. Incubare a 37 °C per 35 minuti. Aggiungere 0,5 μL di DNasi I (fornito nel kit di trascrizione) e incubare a 37 °C per 15 minuti.
4. Purificare il gRNA
   1. Diluire la miscela di trascrizione a 60 μL con ddH₂O senza nucleasi. Aggiungere 60 μL di fenolo/cloroformio saturo d'acqua (vedi Tabella dei materiali); Vortice brevemente e centrifuga a 4 °C, 16.000 x g per 5 minuti.
   2. Trasferire 45 μL della fase acquosa in un nuovo tubo privo di RNasi da 1,5 mL. Aggiungere 5 μL di acetato di sodio; Mescola.
   3. Aggiungere 125 μL di etanolo anidro pre-raffreddato; Mescola e incuba a -20 °C per 20–30 minuti. Centrifugare a 4 °C, 20.000 x g per 15 minuti; Scarta il soprantantante.
   4. Lavare il pellet con 200 μL di etanolo al 70% (senza RNasi); centrifuga a 4 °C, 20.000 x g per 5 minuti; Rimuove il soprantantante.
   5. Asciugare il pellet a 37 °C finché l'etanolo non evapora completamente. Risospendere a 20 μL ddH₂O; aliquota e conserva a -80 °C.
   6. Misura la concentrazione di gRNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop e regola la concentrazione a 250 ng/μL per l'iniezione. Assicurarsi la purezza del gRNA con un rapporto A260/A280 di circa 2,0.
      NOTA: Sottolineiamo che i guanti devono essere indossati per tutto il processo per la protezione RNase. Tutti i consumabili, inclusi i tubi centrifughe e le punte delle pipette senza RNase pre-raffreddati, devono essere utilizzati costantemente durante la procedura. I rifiuti di reagenti organici generati durante l'operazione devono essere raccolti separatamente in contenitori designati per i rifiuti in base al tipo e regolarmente trasportati in un centro certificato di smaltimento di rifiuti pericolosi per una corretta manipolazione.

3. Preparazione dell'mRNA Cas9

1. Preparazione del Modello di Trascrizione
   NOTA: Usa punte e tubi senza RNasi durante le fasi relative all'RNA.
   1. Scongelare il plasmide di espressione Cas9 MLM3613 (vedi Tabella dei Materiali) su ghiaccio. In un tubo privo di RNasi, si combinano 20 μg di DNA plasmidico, 7,5 μL 10x di buffer di restrizione, 1 μL di PmeI (10.000 U/mL) e ddH₂O senza nucleasi a 75 μL.
   2. Incubare a 37 °C per 30 minuti. Verifica la linearizzazione completa caricando 5 μL su un gel di agarosio all'1% a 120 V per 30 minuti.
2. Purificazione dei modelli di trascrizione
   1. Aggiungere 23 μL di solfato dodecile di sodio al 2% (SDS, vedi Tabella dei materiali per dettagli) e 0,5 μL di proteinasi K (vedi Tabella dei materiali per i dettagli) a 70 μL della digestione; Incubare a 50 °C per 30 minuti.
   2. Aggiungere 45 μL di cloroformio e 45 μL di fenolo trisaturato; vortice per un breve periodo; centrifuga 13.800 x g, 5 min.
   3. Trasferire la fase acquosa da 90 μL in un nuovo tubo. Aggiungere 10 μL di acetato di sodio (fornito dal kit) e 200 μL etanolo anidro preraffreddato; mix; incubare −20 °C, 30 minuti.
   4. Centrifuga 20.000 x g, 4 °C, 15 min; Scarta il soprantantante. Lavare il pellet due volte con 100 μL di etanolo al 70%; centrifuga 20.000 x g, 2 min ciascuna; Asciuga all'aria.
   5. Dissolvere DNA in 20 μL ddH₂O privo di nucleasi; confermare >500 ng/μL.
3. Trascrizione in vitro con co-capping
   1. Impostare la reazione utilizzando un kit di trascrizione in vitro T7 con tappa (vedi Tabella dei Materiali) secondo le istruzioni del produttore.
   2. Incubare a 37 °C per 2 ore per generare un mRNA Cas9 limitato.
   3. Dopo che la reazione di trascrizione è completata, aggiungere 1 μL di DNasi (fornito nel kit, concentrazione 2 U/μL), mescolare accuratamente e incubare a 37°C per 15 minuti per degradare il modello di DNA.
4. Aggiungi una coda in poli(A)
   1. Porta l'RNA a 14 μL ddH₂O.
   2. Aggiungere 2 μL di 10x E. coli polimerasi buffer, 2 μL di ATP (10 mM), 1 μL inibitore della RNasi e 1 μL di poli(A) polimerasi.
   3. Incubare a 37 °C per 45 minuti.
5. Purifica l'mRNA
   1. Applicare la reazione a un kit di RNA totale a colonna di spin (vedi Tabella dei Materiali). Carica il campione su una colonna di spin a membrana silicea da 2 mL; centrifuga 8.000 x g, 15 s; Scartare il flusso attraverso la testa.
   2. Aggiungere 500 μL di tampone RPE alla colonna RNeasy, centrifugare a 8000 x g per 15 secondi e scartare il liquido residuo. Ripeti questo passaggio una volta, poi centrifuga per 2 minuti e elimina il liquido residuo.
   3. Posiziona la colonna RNeasy in un nuovo tubo centrifuga da 1,5 mL. Aggiungi 30 μL di ddH₂O senza RNasi, centrifuga a 8000 x g per 1 minuto per eluire l'RNA. Regolare la concentrazione di mRNA a 500 ng/μL per l'iniezione. Conservare l'RNA eluzionato a -80 °C.

4. Microiniezione di embrioni di Drosophila

1. Preparazione dei campioni di iniezione
   1. Mescolare 15 μg di mRNA Cas9 con gRNA a doppio filamento di 7,5 μg a un rapporto di volume di 2:1.
   2. Regolare a 30 μL con acqua priva di RNase trattata con DEPC; Tieni il ghiaccio.
2. Crescita di Drosophila
   1. Trasferire il ceppo iniettato di Drosophila w¹¹¹⁸ su grandi tubi alimentari per l'amplificazione. W¹¹¹⁸ mosche sono state utilizzate come controllo di riferimento per rappresentare lo stato fisiologico di base senza effetti associati al bilanciatore.
   2. Mantenere le mosche in una camera climatica artificiale impostata a 25 °C con un'umidità del 60%–70% e un ciclo chiaro-buio di 12:12 per 14 giorni.
   3. Alle 17:00 del giorno successivo al periodo di allevamento di 14 giorni (Giorno 15), raccogliere le mosche adulte per sincronizzare la deposizione temporizzata degli embrioni. Questo tempo specifico di raccolta garantisce che gli embrioni utilizzati per l'iniezione siano in una fase di sviluppo costante. Controllare l'orario della giornata è importante per minimizzare gli effetti del ritmo circadiano sullo sviluppo embrionale e sul comportamento riproduttivo, garantendo così la riproducibilità sperimentale e riducendo la variabilità fisiologica tra i lotti.
3. Microiniezione di Drosophila
   1. Raccogliere mosche adulte per l'iniezione nelle gabbie per mosche, con circa 400 adulti per gabbia. Raccogliere embrioni su piastre agar rivestite di lievito; Raccogli gli embrioni entro 60 minuti dalla deposizione delle uova e sciacquali sulle coperture. Non è stata eseguita alcuna decorionazione prima dell'iniezione.
   2. Allineare gli embrioni su copertine con i poli posteriori rivolti verso l'esterno, disposti ordinatamente dall'alto verso il basso. Assicurarsi che l'ago di iniezione penetri il polo posteriore fino a una profondità appropriata (circa un quinto della lunghezza dell'embrione) per una consegna citoplasmatica costante. In questo studio sono stati utilizzati in totale 300 embrioni.
   3. Sotto uno stereomicroscopio, focalizzare la punta dell'ago e l'embrione nello stesso piano.
   4. Utilizzando lo strumento di iniezione, perforare il polo posteriore e iniettare 0,001 μL della miscela in ogni embrione.
   5. Trasferire gli embrioni iniettati in fiale alimentari; incubano a 25 °C, ~70% di umidità relativa (RH) per ottenere generazione P₀ (gli adulti iniettati che sopravvivono per produrre progenie).

5. Costruzione di ceppi stabili di espressione in Drosophila

1. Incrocio P₀ eclosed con mosche Bc/CyO .
   1. Microinietta una miscela di gRNA che prende di mira il gene di interesse e la proteina Cas9 in 300 embrioni del ceppo w1118 Drosophila . Dopo l'iniezione, si ottengono un totale di 30 adulti P0 vitali e fertili. Incrocia ogni adulto P0 (mosaico) individualmente con mosche del ceppo w1118 , ottenendo 16 incroci a coppia singola (8 fiale con maschi P0 incrociati con femmine vergini e 8 fiale con femmine P0 incrociate con maschi). Mantenere tutti gli incroci a 25 °C in condizioni di coltura costante.
   2. Dopo la comparsa delle larve F1, rimuovere le mosche parentali P0. Estrarre il DNA genomico dalla progenie F1 e sottoporlo ad analisi PCR per determinare i genotipi adulti F1 (Ent2/+).
   3. Genera progenie F2 tramite incroci singoli tra mosche Bc/CyO . Seleziona individui adulti F2 e genotipali per identificare le mosche con il genotipo Ent2/CyO .
   4. Intercross F3 vola (Ent2/CyO) per valutare la presenza di mutanti omozigoti. Se non vengono recuperate mosche omozigote, incrociare mosche Ent2/CyO per un'ulteriore generazione per determinare ulteriormente se il genotipo omozigote sia letale.
2. Estrazione del DNA genomico di Drosophila
   1. Raccogli una o due mosche adulte in un tubo EP da 1,5 mL e aggiungi 110 μL di PA per l'estrazione del DNA vegetale.
   2. Omogeneizzare accuratamente i campioni usando un tritatessuti per almeno 3 minuti.
   3. Incubare gli omogeneati in un bagno metallico a 65 °C per non meno di 30 minuti.
   4. Aggiungi 100 μL di cloroformio, inverti delicatamente la miscela per mescolare e vortice per 10 secondi. Centrifuga i campioni a 14.000 giri/min per 10 minuti a temperatura ambiente.
   5. Trasferire con attenzione circa 65 μL (o più) del surnatante in un nuovo tubetto, aggiungere due volumi di etanolo assoluto pre-raffreddato (pre-incubato a 4 °C per almeno 10 minuti), invertire delicatamente per mescolare e incubare a -20 °C per almeno 15 minuti.
   6. Centrifugare campiona a 14.000 giri/min per 10 minuti a 4 °C e scartare con cura il surnadante.
   7. Asciugare la pellet di DNA all'aria a temperatura ambiente o in un incubatore fino a essere completamente asciutta, quindi risospendere in un volume appropriato di buffer PB. Per i campioni femmina (f), aggiungere 50 μL di buffer PB, mentre per i campioni maschi (m) aggiungere 15 μL.
3. Amplificazione PCR e sequenziamento Sanger
   1. Eseguire amplificazione PCR utilizzando primer specifici progettati per aggirare le regioni a monte e a valle del sito target del gRNA.
   2. Purificare i prodotti PCR e sottoporli al sequenziamento Sanger. Analizza i cromatogrammi di sequenziamento utilizzando il software^{SnapGene 34} e allineala alla sequenza di riferimento wild-type per un'analisi comparativa.
   3. Esaminare i grafici dei picchi vicino al sito target del gRNA per i picchi sovrapposti indicanti mutazioni dell'indel. Eseguire la divisione dei picchi per risolvere segnali contrastanti e confermare il tipo di mutazione, inclusi inserimenti o delezioni nel sito target.
   4. Backcross con maschi Bc/CyO per 4 generazioni per stabilire Ent2/CyO.
      Nota: È stato osservato che Ent2*/Ent2* e CyO/CyO sono letali nelle prime fasi dello sviluppo; pertanto, gli eterozigoti Ent2*/CyO sono mantenuti.
4. Dopo aver stabilito gli eterozigoti Ent2*/CyO , raccogliere campioni dallo stesso lotto di eterozigoti Ent2*/CyO sotto stereomicroscopio.
5. Seleziona casualmente 20 mosche adulte e pesale usando un bilanciere di precisione con risoluzione di 0,001 g. Fotografa i campioni per documentare le caratteristiche fenotipiche.

6. Caratterizzazione fenotipica descrittiva

1. I 120 uomini e 120 femmine (testati tre fiale per ogni gruppo, con ogni fiala contenente 20 mosche) ciascuno di Ent2*/CyO e w¹¹¹⁸ a 22 °C e 25 °C.
2. Annota il numero di morti settimanalmente e traccia le curve di sopravvivenza.
3. Impostare 30 coppie di accoppiamento casuali per gruppo; consentire un accoppiamento di 24 ore;
4. Trasferire gli adulti su tubi nuovi; Figli posteriori.
5. A 7 giorni dall'eclosione, si valuta il successo dell'arrampicata (≥8 cm entro 30 s) con sei repliche per gruppo.
6. Tutte le osservazioni sono state registrate come caratteristiche descrittive della linea mutante e non sono state utilizzate per dedurre la funzione genica.

7. Misurare le attività degli enzimi antiossidanti

1. Raccogliere 300 maschi e 300 femmine adulte (testate tre fiale per ogni gruppo, con ogni fiala contenente 100 mosche), Ent2*/CyO e w¹¹¹⁸ mosche di controllo a 5 giorni dall'echiusura per garantire maturità fisiologica e un'età comparabile.
2. Trasferire le mosche in tubi vuoti senza cibo e morire di fame per 2 ore per standardizzare lo stato metabolico prima dei test biochimici.
3. Aggiungi una sfera/tubo d'acciaio; omogeneizzare a 60 Hz, 2 min.
4. Centrifuga 4 °C, 161 x g, 10 min; Raccogli il soprantantante.
5. Misurare la dismutasi totale di superossido (SOD, vedi Tabella dei Materiali per i dettagli) e catalasi (CAT, vedi Tabella dei Materiali per i dettagli) secondo le istruzioni del kit.

8. Statistiche e analisi dei dati

1. Esprimi tutti i dati come media ± errore standard della media (± SEM).
2. Utilizzare ANOVA unidirezionale per confrontare i dati sull'attività enzimatica; Applica ANOVA a tre vie (fattori: genotipo, temperatura, sesso) per il peso corporeo, la capacità di arrampicata e la lunghezza del corpo. Esegui il test HSD di Tukey post hoc quando^{opportuno 35}.
3. Definisci la significanza come P < 0,05 per tutti i test statistici.
4. Analizzare i dati sulla durata della vita utilizzando curve di sopravvivenza ed eseguire il test log-rank (Mantel-Cox), che valuta se esistano differenze significative nelle traiettorie di sopravvivenza tra le coorti^{sperimentali 36}.
5. Esegui tutte le analisi e i grafici nel software GraphPad Prism 9.5.0 seguendo le linee guida^{software 37}.
6. Tutte le analisi statistiche sono state effettuate solo per confronto descrittivo e non per stabilire relazioni causali.

Risultati

Analisi di progettazione e verifica dell'efficacia dei siti di targeting genico Ent2
I siti target candidati per il gene Ent2 sono stati progettati utilizzando le piattaforme CHOPCHOP e CCTop (Figura 1). Due gRNA che mirano alle regioni dell'esone 2 e dell'esone 5 sono stati selezionati in base a criteri di specificità ed efficienza. Per verificare il successo dell'editing genomico, il DNA genomico di individui selezionati casualmente della linea Ent2*/CyO consolidata è stato amplificato e sottoposto al sequenziamento Sanger. I cromatogrammi di sequenziamento hanno mostrato picchi sovrapposti a partire dal sito bersaglio, coerenti con mutazioni di inserimento/delezione (indel). Ulteriori analisi di sequenza hanno rivelato mutazioni di spostamento del sistema di riferimento che portano a codoni di stop prematuri (Figura 2). Questi risultati confermano che il sistema CRISPR/Cas9 ha introdotto con successo mutazioni nel locus Ent2 bersaglio e dimostrano la fattibilità del flusso di lavoro di editing genomico.

Figura 1. Diagramma schematico del sito di eliminazione del gene Ent2 e della posizione del primer di rilevamento nel genoma. Questo schema illustra la struttura genomica del locus Ent2, evidenziando i codoni CDS (verde), start e stop (rosso), il motivo PAM del gRNA (grigio), la sequenza target del gRNA (blu) e la sequenza del primer di amplificazione del gRNA (giallo). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Il grafico massimo dei risultati di sequenziamento della progenie di Drosophila di Ent2*/CyO autoconsanguinea di linea stabile. Cromatografia sequenziante che conferma il genotipo della progenie ottenuta dall'auto-incrocio della linea eterozigote stabile Ent2*/CyO. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Osservazioni morfologiche descrittive della linea Ent2/CyO
Abbiamo osservato differenze nella forma corporea tra i due genotipi di moscerini della frutta tra i sessi in condizioni di 22 °C e 25 °C utilizzando uno stereomicroscopio (Figura 3). In entrambe le condizioni di temperatura, sia i maschi che le femmine di moscerina della frutta avevano una tipica forma corporea a "fuso lungo". Gli addomi femminili erano larghi e a forma di fuso, con le punte alari che si estendevano leggermente oltre quella addominale. La giunzione torace–addome nei maschi era chiaramente definita, e la pigmentazione scurita all'estremità dell'addome—una caratteristica distintiva dei maschi—era visibile. Le ali delle mosche w¹¹¹⁸ di entrambi i sessi erano trasparenti con vene chiaramente definite, e non si osservava curvatura dei bordi alari né rottura delle vene. Al contrario, gli eterozigoti Ent2*/CyO hanno mostrato una flessione della base dell'ala e una curvatura dei bordi dell'ala. A 22 °C, indipendentemente dal genere, la lunghezza corporea delle moscerini della frutta era significativamente maggiore rispetto a quella dello stesso genotipo a 25 °C. Inoltre, la lunghezza del corpo femminile era significativamente maggiore rispetto a quella dei maschi alla stessa temperatura. Inoltre, sia a 22 °C che a 25 °C, la dimensione corporea degli eterozigoti Ent2*/CyO era inferiore a quella delle corrispondenti ^w1118 mosche. Per indagare la base morfologica, abbiamo misurato contemporaneamente la lunghezza del corpo delle mosche (Figura 3E, Tabella 1). Un'ANOVA a tre vie ha rivelato effetti principali significativi del genotipo (F(1,16)=230,1, P<0,0001), della temperatura (F(1,16)=19,50, P=0,0004) e del sesso (F(1,16)=166,9, P<0,0001). Sono state inoltre osservate interazioni genotipo x sesso significative (F(1,16)=14,96, P=0,0014) e un'interazione a tre vie genotipo x temperatura x sesso significativa (F(1,16)=6,231, P=0,0239).

Figura 3. La morfologia di controllo degli adulti w¹¹¹⁸ ed Ent2*/CyO . Immagini rappresentative che mostrano caratteristiche posturali di Drosophila femminile (A, C) e maschio (B, D) a 22 °C e 25 °C, insieme a confronti quantitativi della lunghezza del corpo (E). ** P < 0,01. Barra in scala: 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi della sopravvivenza in diverse condizioni di temperatura
Abbiamo analizzato statisticamente le curve di sopravvivenza degli eterozigoti Ent2*/CyO e di^{W 1118} mosche a 22 °C e 25 °C (Figura 4). I risultati hanno mostrato che la curva di sopravvivenza delle femmine eterozigoti Ent2*/CyO era la più alta, con due individui ancora vivi alla 14ª settimana. Tutte ^{le 1118} donne sono morte entro la quattordicesima settimana. Tutti i maschi eterozigoti Ent2*/CyO sono morti entro la dodicesima settimana, mentre tutti i¹¹¹⁸ maschi sono morti entro l'undicesima settimana. Questi risultati indicano che a 22 °C, la durata complessiva di vita delle femmine è più lunga rispetto a quella dei maschi e, all'interno dello stesso sesso, la capacità di sopravvivenza degli eterozigoti Ent2*/CyO è leggermente più forte rispetto a quella del tipo ^{w 1118}.

In condizioni di 25 °C, il periodo complessivo di sopravvivenza fu significativamente ridotto. Le curve di sopravvivenza di ^{w 1118} femmine e maschi eterozigoti Ent2*/CyO sono scese a zero entro la decima settimana. Le curve di sopravvivenza delle femmine eterozigoti Ent2*/CyO e dei^{maschi W 1118} sono diminuite a 1–2 individui entro l'ottava settimana e hanno raggiunto lo zero alla nona settimana. La differenza tra il mutante e W¹¹¹⁸ non era statisticamente significativa (P > 0,05). Queste osservazioni descrivono le caratteristiche di sopravvivenza della linea mutante in diverse condizioni ambientali.

Figura 4. Curve di sopravvivenza di Drosophila in diverse condizioni di temperatura. Analisi di sopravvivenza confrontando la durata di vita delle mosche Ent2*/CyO e w¹¹¹⁸ a 22 °C e 25 °C. n=3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Valutazione dell'attività locomotoria
Le capacità di arrampicata delle mosche della frutta w¹¹¹⁸ ed Ent2*/CyO sono state confrontate in due condizioni di temperatura: 22 °C e 25 °C (Figura 5, Tabella 2). I risultati mostrano che a 22 °C (Figura 5A), il 98,15% delle ¹¹¹⁸ femmine ha scalato con successo più di 8 cm entro 30 s, mentre questa proporzione è scesa all'89,74% nelle femmine eterozigoti Ent2*/CyO (P < 0,05). Tutti ^{i 1118} maschi sono riusciti a scalare più di 8 cm, mentre il tasso di successo nell'arrampicata nei maschi eterozigoti Ent2*/CyO è stato del 98,14% (P < 0,05). A 25 °C (Figura 5B), tutte ^{le 1118} femmine (100%) sono salite di oltre 8 cm entro 30 s, ma questa percentuale è diminuita al 91,31% nelle femmine eterozigoti Ent2*/CyO (P < 0,05). Tra ^{i 1118} maschi, il 77,28% è riuscito a scalare con successo più di 8 cm (P < 0,01), mentre solo il 63,57% dei maschi eterozigoti Ent2*/CyO ha raggiunto questo obiettivo (P < 0,01). Per valutare ulteriormente le prestazioni locomotorie, è stata analizzata la proporzione di mosche che si arrampicano oltre i 15 cm (Figura 5C). Un'ANOVA a tre vie ha rivelato effetti principali altamente significativi del sesso (F(1,16) = 201,7, P < 0,0001) e della temperatura di allevamento (F(1,16) = 72,60, P < 0,0001) sulle prestazioni di arrampicata. Tuttavia, l'effetto principale del genotipo non è stato significativo (F(1,16) = 0,59, P = 0,4545). Questi risultati indicano che le prestazioni locomotorie variano a seconda delle condizioni sperimentali e possono differire tra i gruppi in modo dipendente dal contesto.

Figura 5. Confronto della capacità di arrampicarsi di Drosophila a diverse temperature. Quantificazione delle prestazioni di arrampicata a 22 °C (A) e 25 °C (B) e statistiche per individui con distanza di arrampicata > 15 cm (C). ** P < 0,01. n=3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Misurazione del peso corporeo
Il peso corporeo è stato misurato in ^w1118 ed Ent2*/CyO eterozigoti di mosche della frutta a 22 °C e 25 °C (Figura 6). I nostri risultati mostrano che, rispetto a ^{W 1118} mosche, il peso degli eterozigoti Ent2*/CyO è stato significativamente ridotto sia a 22 °C che a 25 °C (P < 0,05 o P < 0,01). Abbiamo osservato che il peso dei maschi w¹¹¹⁸ mosche era significativamente inferiore a quello delle femmine w¹¹¹⁸ mosche (P < 0,01). Analogamente, il peso degli eterozigoti maschi Ent2*/CyO era significativamente inferiore rispetto a quello delle femmine eterozigoti Ent2*/CyO (P < 0,01). Abbiamo eseguito un'ANOVA a tre vie per valutare gli effetti indipendenti e interattivi del genotipo, della temperatura di allevamento e del sesso sul peso corporeo in Drosophila. L'analisi ha mostrato effetti principali significativi del genotipo (F(1,16) = 32,38, P < 0,0001), della temperatura (F(1,16) = 23,31, P = 0,0002) e del sesso (F(1,16) = 25,52, P = 0,0001) (Figura 6; Tabella 3). Inoltre, vi è stata un'interazione bidirezionale significativa tra temperatura e sesso (F(1,16) = 24,76, P = 0,0001), indicando che l'effetto della temperatura sul peso corporeo variava a seconda del sesso. Tuttavia, non sono state trovate interazioni significative tra genotipo e temperatura (F(1,16) = 0,40, P = 0,538), genotipo e sesso (F(1,16) = 1,31, P = 0,269), o l'interazione a tre vie (genotipo x temperatura x sesso: F(1,16) = 0,48, P = 0,497), suggerendo che la risposta dei mutanti Ent2*/CyO a temperatura e sesso fosse simile a quella del tipo selvatico.

Data la significativa temperatura × interazione sessuale, abbiamo eseguito un'analisi degli effetti semplice per chiarirne il modello specifico. I risultati mostrarono che, nelle femmine di mosca, gli individui allevati a 22 °C avevano un peso corporeo significativamente superiore rispetto a quelli allevati a 25 °C (P = 0,0012); tuttavia, nei maschi non vi era una differenza significativa di peso corporeo tra le due temperature (P > 0,9999). Ciò indica che abbassare la temperatura da 25–22 °C ha specificamente aumentato il peso corporeo delle femmine, senza però avere un effetto significativo sui maschi.

Sebbene non vi siano state interazioni significative tra genotipo e altri fattori, il forte effetto principale del genotipo ha indicato che i mutanti Ent2*/CyO avevano generalmente un peso corporeo inferiore in tutte le condizioni rispetto al tipo selvatico. Confronti post-hoc hanno inoltre rivelato che a 22 °C, le femmine di tipo selvatico (w¹¹¹⁸:22 °C femmine) avevano un peso corporeo significativamente superiore a tutti i gruppi mutanti (P < 0,0001) e, all'interno della stessa temperatura, entrambi i genotipi hanno mostrato un significativo dimorfismo sessuale (femmine > maschi, P < 0,01). A 25 °C, la differenza di peso corporeo tra tipi selvatici e mutanti mostrava una tendenza simile ma non raggiunse la significanza statistica. Questi risultati descrivono le caratteristiche del peso corporeo della linea mutante in diverse condizioni ambientali e biologiche.

Figura 6. Il confronto del peso corporeo in Drosophila a diverse temperature. Misurazioni del peso corporeo a 22 °C e 25 °C. ^ns P > 0,05, * P < 0,05, ** P < 0,01. n=3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Attività enzimatica antiossidante
Le attività enzimatiche antiossidanti di W¹¹¹⁸ ed Ent2*/CyO eterozigote Drosophila sono state confrontate a 25 °C (Figura 7). I nostri risultati hanno mostrato che, rispetto a ^{w mosche 1118}, sia maschi che femmine eterozigoti Ent2*/CyO hanno mostrato attività significativamente ridotte di catalasi (CAT) e dismutasi superossida (SOD) (P < 0,01). Abbiamo inoltre riscontrato che le attività di CAT e SOD nel W¹¹¹⁸ maschi erano significativamente più elevate rispetto a quelle nel W¹¹¹⁸ femmine (P < 0,05 o P < 0,01). Analogamente, le attività enzimatiche antiossidanti nei maschi eterozigoti Ent2*/CyO erano significativamente più elevate rispetto a quelle nelle femmine eterozigoti Ent2*/CyO (P < 0,01).

Figura 7. Il confronto della capacità antiossidante di Drosophila alla temperatura ottimale di alimentazione. Saggi di attività enzimatica che mostrano l'attività CAT (A) e SOD (B) nelle mosche Ent2/CyO rispetto a W¹¹¹⁸ mosche. * P < 0,05, ** P < 0,01. n=3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

	SS	DF	MS	F (DFn, DFd)	Valore P
Genotipo	0.8026	1	0.8026	F (1, 16) = 230,1	P<0.0001
Temperatura	0.06803	1	0.06803	F (1, 16) = 19,50	P=0,0004
Genere	0.5822	1	0.5822	F (1, 16) = 166,9	P<0.0001
Genotipo x Temperatura	0.005798	1	0.005798	F (1, 16) = 1,662	P=0,2156
Genotipo x Genere	0.05218	1	0.05218	F (1, 16) = 14,96	P=0,0014
Temperatura x Genere	0.01323	1	0.01323	F (1, 16) = 3,793	P=0,0692
Genotipo x Temperatura x Genere	0.02173	1	0.02173	F (1, 16) = 6,231	P=0,0239
Residuo	0.05581	16	0.003488

Tabella 1: Analisi della varianza delle misurazioni della lunghezza corporea in Drosophila.

Tabella ANOVA	SS	DF	MS	F (DFn, DFd)	Valore P
Genere	0.1483	1	0.1483	F (1, 16) = 201,7	P<0.0001
Genotipo	0.0004319	1	0.0004319	F (1, 16) = 0,5877	P=0,4545
Temperatura	0.05336	1	0.05336	F (1, 16) = 72,60	P<0.0001
Genere x Genotipo	0.01418	1	0.01418	F (1, 16) = 19,30	P=0,0005
Genere x Temperatura	0.007134	1	0.007134	F (1, 16) = 9,708	P=0.0067
Genotipo x Temperatura	0.0135	1	0.0135	F (1, 16) = 18,37	P=0,0006
Genere x Genotipo x Temperatura	0.005903	1	0.005903	F (1, 16) = 8.032	P=0,0120
Residuo	0.01176	16	0.0007349

Tabella 2: Analisi della varianza della capacità di arrampicata (> 15 cm) in Drosophila.

	SS	DF	MS	F (DFn, DFd)	Valore P
Genotipo	4.363E-07	1	4.363E-07	F (1, 16) = 32,38	P<0.0001
Temperatura	3.141E-07	1	3.141E-07	F (1, 16) = 23,31	P=0,0002
Genere	3.439E-07	1	3.439E-07	F (1, 16) = 25,52	P=0,0001
Genotipo x Temperatura	5.333E-09	1	5.333E-09	F (1, 16) = 0,3958	P=0,5381
Genotipo x Genere	1.765E-08	1	1.765E-08	F (1, 16) = 1,310	P=0,2692
Temperatura x Genere	3.336E-07	1	3.336E-07	F (1, 16) = 24,76	P=0,0001
Genotipo x Temperatura x Genere	6.513E-09	1	6.513E-09	F (1, 16) = 0,4834	P=0,4968
Residuo	2.156E-07	16	1.347E-08

Tabella 3: Analisi della varianza delle misurazioni del peso corporeo in Drosophila.

Discussione

L'ENT è una proteina evolutivamente conservata che influenza molteplici processi^{biologici 38}. Quando espressa negli ovociti di Xenopus laevis, Ent2 mostra attività di trasporto^{nucleosidico 8}. Gli studi hanno dimostrato che il mutante omozigote di Ent2 è letale durante la fase larvale tarda o la^{fase pupale iniziale 10}. Nel presente studio, è stato istituito un flusso di lavoro di editing genomico basato su CRISPR/Cas9 per generare alleli mirati a Ent2 in Drosophila melanogaster. La letalità osservata dei mutanti omozigoti durante l'istituzione del ceppo è coerente con questi precedenti rapporti, a sostegno della validità della strategia di editing genomico. All'interno di questo contesto, la linea eterozigote Ent2*/CyO generata in questo studio fornisce un modello per documentare le caratteristiche fenotipiche associate alla perdita parziale di Ent2. Nelle condizioni sperimentali testate, sono state osservate differenze nella dimensione corporea, nel peso corporeo, nell'attività locomotoria e nei livelli di enzimi antiossidanti tra mosche Ent2*/CyO e w¹¹¹⁸ . Queste osservazioni descrivono il profilo fenotipico della linea mutante già stabilita.

In termini di sviluppo e dimensione corporea, gli individui eterozigoti Ent2*/CyO erano significativamente più piccoli rispetto alle ^{mosche W 1118}, sia a 22 °C che a 25 °C. Questa differenza può essere attribuita alla riduzione dell'efficienza del trasporto dei nucleosidi dovuta all'assenza del gene Ent2, che a sua volta influisce sulla stabilità del metabolismo energetico e sulla regolazione dell'ecdisone. Inoltre, gli effetti negativi divennero più evidenti a 25 °C. Le ricerche hanno indicato che la durata della vita animale è influenzata dal tasso metabolico, un concetto noto come teoria del tasso^{metabolico 19}. I risultati di questo studio suggeriscono che il tasso metabolico elevato delle mosche della frutta a temperature più elevate potrebbe essere strettamente associato alle carenze nutrizionali e ai ritardi nello sviluppo derivanti da un metabolismo dei nucleosidi compromesso. Tuttavia, dato l'uso di un singolo allele derivato da CRISPR, questi risultati dovrebbero essere interpretati come osservazioni descrittive piuttosto che come prove dirette della funzione genica.

La variazione dipendente dalla temperatura era evidente anche in più letture fenotipiche. Il mutante mostra una modesta estensione della durata della vita a 22 °C, in particolare nelle femmine, un risultato coerente con studi^{precedenti 39,40}. Al contrario, a 25 °C, la differenza di durata di vita diminuisce o addirittura scompare. In quanto organismi poikilotermici, le moscerini della frutta mostrano un tasso metabolico più elevato e di conseguenza una durata di vita più breve a temperature^{elevate 41,42}, il che è in linea con i risultati di questo studio. In questo contesto, i modelli osservati possono riflettere risposte fisiologiche generali alla temperatura.

Le prestazioni locomotorie e le attività degli enzimi antiossidanti variavano anche tra genotipi, sessi e condizioni di temperatura. Sono state osservate prestazioni di arrampicata ridotte e attività SOD e CAT più basse nelle mosche Ent2/CyO in determinate condizioni. Studi precedenti hanno collegato i trasportatori nucleosidici al metabolismo del NAD⁺, alla funzione mitocondriale e alla regolazione dello stress^ossidativo 17,43,44,45,46,47. Sebbene questi rapporti forniscano un possibile contesto biologico, i dati attuali sono limitati alla caratterizzazione fenotipica e non stabiliscono legami meccanicistici tra Ent2 e queste vie.

I nostri risultati mostrano anche che, nelle stesse condizioni, i maschi di mosca della frutta di solito mostrano un'attività enzimatica antiossidante più elevata rispetto alle femmine^39,48. Ciò significa che fattori legati al genere possono regolare la risposta antiossidante attraverso diversi percorsi di segnalazione. I fattori di trascrizione correlati alle risposte antiossidanti, come Nrf2/CncC e i loro geni target a valle, mostrano differenze di espressione tra i diversi generi, influenzando così la capacità antiossidante^{complessiva 49}. Questa osservazione è coerente con i rapporti di differenze di sesso nella resistenza allo stress ossidativo e nelle difese antiossidanti in Drosophila, dove le femmine mantengono tipicamente livelli più bassi di ROS e attività enzimatiche antiossidanti di base più elevate rispetto ai maschi, il che può contribuire a differenze nella resistenza allo stress e nella longevità tra i^{sessi 50}. Queste osservazioni sottolineano ulteriormente l'importanza di considerare variabili biologiche come il sesso nella caratterizzazione dei fenotipi mutanti.

Da un punto di vista metodologico, questo studio delinea un flusso di lavoro riproducibile per generare e validare mutazioni mediate da CRISPR/Cas9 in Drosophila. Una progettazione precisa e la selezione del gRNA sono essenziali, poiché gRNA efficaci determinano l'efficienza della scissione mirata da Cas9 e minimizzano le modifiche^{indesiderate 21,51}. La microiniezione ad alta precisione di componenti Cas9 e gRNA negli embrioni è anch'essa cruciale, poiché iniezioni inefficienti possono portare a bassi tassi di editing o^{mosaicismo 52}. Una conferma accurata del genotipo tramite sequenziamento garantisce che le modifiche previste siano presenti ed esclude modifiche fuori target o incomplete, rafforzando così l'integrità del modello⁵³. In particolare, l'uso del cromosoma bilanciatore CyO era essenziale per mantenere l'allele mutante Ent2 a causa della letalità dei mutanti omozigoti. Questo approccio è ampiamente utilizzato nella genetica di Drosophila per preservare mutazioni deleterie e consentire analisi a valle. Il presente studio dimostra l'applicazione pratica di questa strategia all'interno di un framework di editing CRISPR/Cas9.

Devono essere riconosciute diverse limitazioni. Per prima cosa, sono state condotte analisi fenotipiche utilizzando una singola linea mutante derivata da CRISPR. È ben riconosciuto che il montaggio CRISPR/Cas9 può generare alleli eterogenei, e generalmente si raccomanda l'analisi di più linee indipendenti per rafforzare le conclusioni genetiche. Pertanto, i risultati qui riportati dovrebbero essere interpretati come caratterizzazione preliminare di un allele mutante. Saranno necessari studi futuri che incorporino ulteriori alleli Ent2 generati indipendentemente per migliorare la robustezza delle conclusioni. In secondo luogo, la linea mutante è stata mantenuta utilizzando il cromosoma bilanciatore CyO, mentre il gruppo di controllo (w¹¹¹⁸) non porta un cromosoma bilanciatore. Poiché i cromosomi bilanciatori stessi possono influenzare le caratteristiche dello sviluppo e fisiologiche, la mancanza di un controllo bilanciatore abbinato rappresenta una potenziale fonte di confusione. Questa limitazione dovrebbe essere presa in considerazione nell'interpretazione delle differenze fenotipiche tra i genotipi. In terzo luogo, condizioni ambientali come umidità, ciclo luminoso e dieta venivano mantenute in ambienti standard di laboratorio, ma non erano sistematicamente variate. Poiché questi fattori possono influenzare il metabolismo e le risposte allo stress, studi futuri che incorporino gradienti ambientali controllati fornirebbero una valutazione più completa delle interazioni fenotipo-ambiente.

In sintesi, questo studio stabilisce un flusso di lavoro basato su CRISPR/Cas9 per generare e mantenere alleli mutanti Ent2 in Drosophila melanogaster e fornisce una caratterizzazione descrittiva della linea eterozigote risultante in diverse condizioni ambientali. I risultati evidenziano l'applicabilità di questo approccio allo studio di geni con fenotipi letali e sottolineano l'importanza delle considerazioni del disegno sperimentale, inclusi il background genetico, i cromosomi bilanciatori e le variabili ambientali.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ammonium acetate	Sigma	A1542
Catalase (CAT) Assay Kit (Visible Light Method) (Ammonium Molybdate Method)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1
Dodecyl sulfate	Sigma	L3771
Injection device	Eppendorf FemtoJet	4i
Linearized plasmid: MLM3613	Addgene	42251
Microscope	OLYMPUS	CKX3-SLP
mMESSAGE mMACHINE T7 kit	Thermo Fisher	AM1344
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit	Thermo Fisher	AM1344
PmeI restriction enzyme	NEB	R0560S
Poly(A) polymerase	NEB	M0276S
Protease K	Thermo Fisher	EO0491
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320
T7 RiboMAX Kit	Promega	P1320
Total Superoxide Dismutase (T-SOD) assay kit (Hydroxylamine method)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A001-1
w1118 Drosophila	Fangjing Biology
Water-saturated phenol/chloroform	Sigma	P2069