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Articolo metodologico

Stabilimento di organoidi tumorali, fibroblasti associati al carcinoma e fibroblasti corrispondenti dallo stesso paziente con cancro esofageo

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DOI:

10.3791/69548

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3 aprile 2026

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1Department of Esophageal and Gastroenterological Surgery, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 2Department of Molecular Pathogenesis, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 3Department of Pathology and Oncology, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 4Faculty of Health Sciences, Graduate School of Medicine, Juntendo University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo per isolare simultaneamente organoidi tumorali, fibroblasti associati al carcinoma (CAF) e fibroblasti (CF) non associati al tumore provenienti dallo stesso paziente con carcinoma a cellule squamose esofagee (ESCC). L'impiego di questi materiali abbinati ai pazienti potrebbe evitare problemi legati alla variabilità tra pazienti e fornire una piattaforma sperimentale adeguata per la ricerca ESCC.

Abstract

Nel carcinoma a cellule squamose esofagee (ESCC), l'acquisizione della resistenza al trattamento e la recidiva tumorale rimangono sfide cliniche importanti. I fibroblasti associati al carcinoma (CAF), componenti chiave del microambiente tumorale, sono noti per influenzare la progressione dell'ESCC e la risposta terapeutica. Tuttavia, molti aspetti del ruolo dei CF nella malignità tumorale rimangono sconosciuti, presumibilmente a causa della variabilità tra pazienti nei pazienti ESCC. Si ritiene che varie linee cellulari ESCC umane disponibili per la ricerca imitino parzialmente la natura del carcinoma umano. Vengono inoltre propagati in vitro per anni e decenni in una piastra di Petri, portando all'adattamento alle condizioni della coltura. Inoltre, le linee cellulari ESCC umane presentano varie alterazioni genetiche ed epigenetiche distinte tra i pazienti originali, con conseguente variabilità tra i pazienti. Tuttavia, linee cellulari tumorali coltivate a lungo termine sono state impiegate nella maggior parte degli studi precedenti per sperimentare con CAF non allineati con i pazienti. La variabilità inter-paziente all'interno di ciascuna linea cellulare tumorale e tra cellule tumorali e CAF potrebbe quindi causare una riduzione della riproducibilità e affidabilità dei risultati. Per eliminare la variabilità inter-paziente, sono stati isolati tre tipi cellulari distinti dallo stesso paziente: organoidi tumorali e CAF da una regione ESCC chirurgicamente dissezionata, e fibroblasti (CF) corrispondenti da una regione non tumorale adiacente come controlli specifici per i CAF. Viene presentato un protocollo dettagliato che consente l'isolamento simultaneo di organoidi tumorali, CAF e CF. Gli organoidi tumorali sono cresciuti bene in condizioni tridimensionali. CAF e CF hanno colorato positivamente per la vimentina, uno dei marcatori fibroblastici, che supportano l'arricchimento di queste cellule nelle linee fibroblastiche. Il protocollo descritto ci consente di stabilire organoidi ESCC e fibroblasti compatibili con il paziente, fornendo una preziosa piattaforma sperimentale che esclude la variabilità inter-paziente nello studio delle interazioni tumore-stromi.

Introduzione

Il cancro esofageo è associato ad alti tassi di incidenza e mortalità in tuttoil mondo. È classificato in due principali sottotipi istologici: carcinoma esofageo a cellule squamose (ESCC) e adenocarcinoma esofageo (EAC)2. L'ESCC è più diffusa dell'EAC, con un'incidenza particolarmente più alta in Asia orientale eAfrica 3. Le strategie di trattamento per l'ESCC sono relativamente benconsolidate 4,5. Per lesioni in stadio iniziale confinate allo strato mucoso, la resezione endoscopica è indicata come opzione curativa e minimamente invasiva. Nei pazienti con malattia localmente avanzata ma resecabile, la combinazione di chemioradioterapia neoadiuvante seguita da esofagectomia ha dimostrato efficacia clinica. Per i casi non resecabili o metastatici, la chemioterapia sistemica rimane la base del trattamento. Tuttavia, la resistenza terapeutica e la recidiva della malattia continuano a rappresentare importanti sfide cliniche.

I tumori non sono costituiti solo da cellule tumorali, ma anche da un complesso microambiente tumorale che comprende vari tipi di cellule stromali. Tra questi, i fibroblasti associati al carcinoma (CAF), componenti cellulari principali del microambiente tumorale, si sono dimostrati di svolgere ruoli critici nella progressione tumorale e nella risposta terapeutica 6,7,8,9. Nell'ESCC, il coinvolgimento dei CAF nella malignità tumorale e nella resistenza al trattamento è stato inoltre sempre piùriportato 10,11,12. Tuttavia, i meccanismi molecolari precisi dei CAF alla base della malignità ESCC rimangono in gran parte poco chiari.

Nella maggior parte degli studi precedenti, gli effetti delle CAF sulle cellule tumorali sono stati valutati utilizzando varie linee cellulari ESCC propagate in piastre di Petri per molti anni, o addirittura decenni. Tali linee cellulari si adatterebbero alle condizioni della coltura e avrebbero poche somiglianze con i tumorioriginali 13. Inoltre, le linee cellulari ESCC derivano da pazienti diversi e presentano varie alterazioni genetiche ed epigenetiche, evidentemente distinte nelle rispettive cellule ESCC, fungendo da variabilità inter-pazienti. I risultati sperimentali di una linea cellulare tumorale possono spesso essere incoerenti con quelli di un'altra linea cellulare tumorale. Pertanto, esperimenti che impiegano diverse linee cellulari ESCC e i CAF non allineati con paziente possono risultare difficili nel gestire con precisione le interazioni di queste cellule in modo riproducibile e affidabile.

Per affrontare queste limitazioni, è stato sviluppato un protocollo per isolare simultaneamente organoidi tumorali compatibili con il paziente, CAF e fibroblasti (CF) non tumulti dallo stesso campione chirurgico ESCC. Gli organoidi derivati dal paziente generalmente riproducono caratteristiche architettoniche e fenotipiche chiave dei tumori primari, preservando al contempo l'eterogeneità molecolare. Gli organoidi consolidati formarono sferoidi in condizioni di coltura tridimensionale (3D) e mostrarono una capacità proliferativa stabile. Sia i CAF che i CF sono stati confermati arricchiti per popolazioni di cellule fibroblastiche positive a vimentina, un marcatore fibroblastico.

Questo protocollo fornisce passaggi dettagliati e riproducibili per l'elaborazione dei tessuti, la dissociazione enzimatmica, la semina degli organoidi, l'isolamento CAF/CF, il passaggio e la criopreservazione. Per aiutare i ricercatori a valutare l'applicabilità prima dell'implementazione, sono state incluse informazioni pratiche: gli organoidi si formano tipicamente entro 3–5 giorni, raggiungono la prontezza per il passaggio entro 7–10 giorni e possono essere estesi stabilmente per più di dieci passaggi. CAF e CF possono essere approvati per almeno otto generazioni. Organoidi e fibroblasti possono essere criopreservati in circa 20 giorni. I tassi di successo degli istituti raggiungono circa il 70% per gli organoidi e l'80% per i CAF e i CF. Inoltre, è incluso un saggio con mezzo condizionato validato che utilizza un mezzo condizionato CAF o CF, fornendo un approccio robusto per valutare gli effetti paracrini delle cellule stromali sul comportamento degli organoidi tumorali. Collettivamente, questa piattaforma organoide–stromale tumorale abbinata offre un modello sperimentalmente accessibile e biologicamente rilevante per indagare le interazioni tumore-stromale ESCC e supportare lo sviluppo di strategie terapeutiche di precisione.

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Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono tessuti umani devono essere eseguite con le appropriate approvazioni istituzionali di biosicurezza e in un armadietto certificato per la sicurezza biologica. Il paziente ha fornito un consenso informato scritto e il progetto è stato approvato dal Comitato Etico della Ricerca della Facoltà di Medicina dell'Università Juntendo. Una panoramica della procedura dai protocolli 2 al 6 è mostrata nella Figura 1. La composizione e le concentrazioni di ciascun componente nel mezzo organoide ESCC (Eso_v1) sono state determinate sulla base di Kijima et al.14 e altri studi 15,16,17 con solo modifiche minori. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Reagenti e preparazione dei tessuti

  1. Prepara reagenti e attrezzature.
    1. Sterilizza tutti gli strumenti, inclusi forbici, pinze e pipette, prima di iniziare la procedura.
    2. Prepara 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in un tubo da 15 mL.
    3. Prepara tubi a basso attacco da 15 mL e etichettali in base all'origine del campione (ad esempio, Tubo di Lavaggio Tumorale (A), Tubo di Digestione Tumorale (B), Tubo di Lavaggio Non Tumorale (C), Tubo Digestionale Non Tumorale (D)).
    4. Rivestire le pipette azionate aspirando e dispensando il siero bovino fetale (FBS) 2–3 volte per ridurre l'adesione cellulare durante la lavorazione.
      NOTA: Il rivestimento FBS impedisce ai frammenti di tessuto di aderire alle superfici di plastica durante la dissociazione meccanica.
  2. Prepara soluzioni enzimatiche
    1. Prepara la Soluzione Enzimatica I per la digestione tumorale mescolando 2,7 mL di Medium Eagle's Modified Dulbecco (DMEM) con FBS al 10% e 1x penicillina–streptomicina (PS) (d'ora in poi, DMEM/10% FBS), 0,3 mL di collagenasi da 10 mg/mL, 0,15 mL di dispase da 10000 PU/mL e 0,03 mL di 2,5 μg/mL di Amphotericina B. Riscaldare a 37 °C.
    2. Prepara la Soluzione Enzimatica II per la digestione non tumorale mescolando 2,7 mL di DMEM/10% FBS, 0,3 mL di 1 mg/mL di collagenasi e 0,03 mL di 2,5 μg/mL di Anfotericina B. Riscaldare a 37 °C.
      NOTA: Collagenasi e dispase facilitano la dissociazione del tessuto tumorale.
  3. Prepara il mezzo di coltura organoide
    1. Prepara un mezzo organoide ESCC (mezzo Eso_v1) contenente 60% di mezzo organoide basale, 40% di mezzo condizionatoL-WRN 18 (vedi passo 1.4), 50 ng/mL di EGF (fattore di crescita), 1 mM di N-acetil-L-cisteina (antiossidante), 5 mM di nicotinamide (vitamina idrosolubile), 500 nM A83-01 (inibitore TGF-βR (prevenendo la crescita di fibroblasti)), 1x B-27 (integratore senza siero), 1x N-2 (integratore senza siero) e 10 μM Y-27632 (inibitore ROCK).
    2. Bilanciare il mezzo a 37 °C prima dell'uso.
      NOTA: Il mezzo condizionato L-WRN (soprannatante dalle cellule L-WRN) fornisce segnali WNT, R-spondin e Noggin essenziali per l'iniziazione dell'organoide. Y27632 è contenuto nel mezzo per tutto il periodo culturale.
  4. Preparare un medio condizionato L-WRN
    1. Scongelare una fiala di cellule L-WRN e seminarle su una piastra da 100 mm con 10 mL di DMEM/10% FBS e coltura per 1–2 giorni.
    2. Sostituire il mezzo con 10 mL di DMEM/10% FBS contenenti G418 (500 μg/mL finali) e Igromicina B (500 μg/mL finali), e coltura fino a raggiungere l'80% di confluenza delle cellule.
    3. Far passare le cellule su due piastre da 100 mm con 10 mL di DMEM/10% FBS (con G418 e Igromicina B) e coltura finché le cellule non raggiungono la confluenza del 100%.
    4. Inserire le cellule su cinque piastre da 150 mm con 20 mL di DMEM/10% FBS (senza antibiotici) per piatto e coltura fino al 100% di confluenza.
    5. Aspirare e scartare il substrato da ogni piatto da 150 mm.
    6. Aggiungere 25 mL per piatto di mezzo di raccolta (mezzo basale organoide integrato con il 5% di FBS).
    7. Incubare per 24 ore.
    8. Raccogli il substrato da tutti e cinque i piatti (25 mL × 5 = 125 mL) in una bottiglia di vetro sterile.
    9. Ripeti i passaggi 1.4.6–1.4.8 per un totale di 8 collezioni (volume aggregato target: ~1.000 mL).
    10. Filtra sterilmente il CM accumulato usando un filtro a bottiglia.
    11. Aloquota 40 mL in 25 tubi sterili da 50 mL.
    12. Conservare le aliquote a −80 °C.
  5. Prepara il mezzo per colture di fibroblasti
    1. Prepara il fibroblasto medio-1.
    2. Bilanciare il mezzo a 37 °C prima dell'uso.
  6. Prepara piatti per la manipolazione dei fazzoletti
    1. Dispensare diverse gocce (da tre a cinque) di FBS con una punta P1000 su due piastre da 100 mm per creare un rivestimento (Dish T per il tessuto tumorale, Dish N per il tessuto non tumorale).
      NOTA: Il rivestimento FBS favorisce una tritazione meccanica più liscia e previene l'adesione di piccoli frammenti di tessuto alla superficie della piatta.
  7. Manipolazione dei tessuti e identificazione dei campioni
    1. Confermare che i campioni tumorali e non tumorali vengano trasportati sul ghiaccio.
    2. Metti i fazzoletti su un piatto da 60 mm contenente una piccola quantità di DMEM/10% FBS e conserva su ghiaccio fino all'uso. Iniziare la lavorazione entro 16 ore dalla resezione chirurgica per mantenere la vitalità.
    3. Identificare il tessuto tumorale per la sua consistenza compatta e la morfologia superficiale irregolare, che differisce da quella del tessuto non tumorale.

2. Elaborazione dei tessuti, lavaggio e digestione enzimatica

NOTA: Questo passaggio viene eseguito per digerire sezioni di tessuto tritato e non tumorale con diverse soluzioni enzimatiche.

  1. Taglia il tumore e i tessuti non tumorali
    1. Trasferire ogni campione di tessuto (circa 5 mm × 5 mm) sul rispettivo piatto rivestito di FBS (piatto T per il tessuto tumorale e piatto N per il tessuto non tumorale).
    2. Trita ogni tessuto in frammenti di ~0,5 mm usando un bisturi sterile.
      NOTA: Frammenti più piccoli aumentano l'accessibilità enzimatica e migliorano l'efficienza digestiva.
  2. Lava il fazzoletto tritato.
    1. Ricoprire una pipetta da 10 mL con FBS per prevenire l'aderenza dei tessuti.
    2. Aggiungi 5 mL di PBS su ogni piatto usando la pipetta rivestita con FBS e sospezioni delicatamente il tessuto tritato.
    3. Trasferire la sospensione al corrispondente tubo di lavaggio tumorale (Tubo A) o al tubo di lavaggio non tumorale (Tubo C).
    4. Ripeti i passaggi 2.2.2 e 2.2.3 (volume totale: 10 mL).
    5. Lascia riposare i tubetti per 2 minuti a temperatura ambiente; rimuovere il sovrantantante lasciando circa 0,5–1 mL di PBS e tessuto sul fondo.
    6. Aggiungi 10 mL di PBS fresco con una nuova pipetta; dopo aver rivestito la pipetta con FBS, pipetta la sospensione con forza evitando la formazione di bolle.
      NOTA: La pipetazione forzata aiuta nella dissociazione meccanica e nella rimozione di sangue e muco. Evitare le bolle previene la lisi cellulare indotta da taglio di taglio. Tutti i passaggi di lavaggio sono pensati per rimuovere i detriti.
    7. Lascia riposare i tubetti per 2 minuti a temperatura ambiente; rimuovere il sovrantantante lasciando circa 0,5–1 mL di PBS e tessuto sul fondo.
    8. Ripeti la procedura di lavaggio (passaggi 2.2.6 e 2.2.7) due volte per un totale di tre lavaggi.
  3. Trasferire i tessuti nei tubi digestivi.
    1. Aggiungi 10 mL di PBS fresco con una nuova pipetta; dopo aver ricoperto la pipetta con FBS, trasferire il tessuto tumorale nel Tubo di Digestione Tumorale (Tubo B) e il tessuto non tumorale nel Tubo di Digestione Non Tumorale (Tubo D).
    2. Lascia riposare i tubetti per 2 minuti a temperatura ambiente, rimuovi il surnatante lasciando circa 0,5 mL di PBS e tessuto sul fondo.
  4. Esegui una digestione enzimatica.
    1. Digestione del tessuto tumorale
      1. Aggiungi l'intero volume della Soluzione Enzimatica I (collagenasi + dispase) nel Tubo di Digestione Tumorale (Tubo B).
      2. Incubare a 37 °C per 2 ore con una rotazione delicata.
    2. Digestione del tessuto non tumorale
    3. Aggiungi l'intero volume della Soluzione Enzimatica II (solo collagenasi) nel Tubo Digestionale Non Tumorale (Tubo D).
      1. Incubare a 37 °C per 4 ore con rotazione delicata.
    4. Continuare al passo 3 (Elaborazione del campione tumorale) o al passo 6 (Alter Seed dei fibroblasti), a seconda dell'origine del campione.
      NOTA: I tipi di enzimi utilizzati per digerire i tessuti tumorali e non tumorali, così come i tempi di lavorazione, sono stati determinati sulla base di ottimizzazioni sperimentali precedenti. I tessuti tumorali spesso contengono una matrice extracellulare densa; La dispasi in combinazione con collagenasi aumenta la capacità digerente.

3. Elaborazione del campione di tumore per organoidi e isolamento CAF

NOTA: Questo passaggio viene eseguito per isolare le cellule tumorali epiteliali per la formazione organoide e i fibroblasti stromali (CAF) dagli stessi campioni tumorali digeriti.

  1. Filtrare e raccogliere cellule derivate dal tumore.
    1. Posizionare un colone a celle da 100 μm su un tubo conico da 50 mL.
    2. Pre-bagna il colino passando 3 mL di DMEM/10% FBS.
      NOTA: La pre-bagnatura riduce la perdita cellulare impedendo l'aderenza alle fibre della rete secca.
    3. Trasferire tutto il contenuto del Tubo di Digestione Tumorale (Tubo B) sul colino utilizzando una punta P1000 rivestita di FBS per rimuovere i frammenti di tessuto non digeriti.
    4. Aggiungi altri 6 mL di DMEM/10% FBS per risciacquare i grappoli residui attraverso il colino.
    5. Rimuovere il colone e riportare il filtrato al tubo B (può essere utilizzato anche un nuovo tubo da 15 mL a basso attacco).
  2. Lava e concentra il filtrato.
    1. Centrifuga il tubo a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
    2. Rimuovi il sovrandante usando una pipetta usa e getta.
    3. Aggiungi 10 mL di DMEM/10% FBS, mescola delicatamente per inversione e centrifuga di nuovo a 300 × g per 5 minuti.
    4. Aspira con cura il surnatante mantenendo il pellet.
    5. Riduci il volume residuo a 40 μL usando una pipetta P200.
  3. Alloca le cellule per organoidi e colture CAF.
    1. Allocare 30 μL per la semina organoide.
    2. Allocare 10 μL per la semina del CAF.
      NOTA: Questo rapporto fornisce empiricamente popolazioni epiteliali e fibroblastiche sufficienti per l'espansione parallela.

4. Semina organoide (coltura 3D)

NOTA: Questo passaggio viene eseguito per stabilire organoidi ESCC da una sospensione cellulare derivata dal tumore.

  1. Preparare le cupole della matrice a membrana del basale.
    1. Preriscaldare una piastra standard a 24 pozzi a 37 °C.
      NOTA: Il preriscaldamento della lastra accelera la solidificazione delle cupole della matrice di membrana basale.
    2. Mescolare 30 μL della sospensione derivata dal tumore con 90 μL di matrice basale di membrana gelida (rapporto 1:3).
    3. Applicare 30 μL per cupola su quattro pozzi.
    4. Lascia che le cupole si solidifichino per 15 minuti in un incubatore CO₂.
  2. Aggiungere un mezzo di coltura organoide
    1. Prepara un mezzo organoide con integratori premiscelati (FGF10, SB202190 e antibiotici, come 1× Amphotericina B e 100 μg/mL Primocina, se usati).
      NOTA: Beh 1: Eso_v1; Pozzo 2: Eso_v1 + 10 μM SB202190; Pozzo 3: Eso_v1 + 100 ng/mL FGF10; Pozzo 4: Eso_v1 + 10 μM SB202190 + 100 ng/mL FGF10 (concentrazioni finali).
    2. Aggiungi delicatamente 1 mL di substrato in ogni pozzo lungo la parete.
    3. Incubare in condizioni standard di coltura CO₂.
    4. Cambia il medium ogni 3–5 giorni.
      NOTA: Premiscelare gli integratori evita la necessità di pipetare piccoli volumi direttamente su fragili cupole della matrice di membrana basale. Gli antibiotici vengono somministrati solo nei primi 6 giorni dopo l'insediamento dell'organoide. Le condizioni di coltura (FGF10 +/-, SB202190 +/-) sono determinate in base al tasso di crescita e alla morfologia (preferibilmente sferica).
  3. Monitorare la formazione degli organoidi.
    1. Osserva le cupole quotidianamente usando un microscopio rovesciato.
      NOTA: Morfologia attesa: Giorno 3–5 → sferoidi visibili; Giorno 7–10 → sferoidi densi pronti per il passaggio di sferoidi.
    2. Far passare gli organoidi quando raggiungono una dimensione di circa 100–200 μm o mostrare un affollamento della cupola del 90% o più.

5. Testa di serie CAF

NOTA: Questo passaggio viene eseguito per stabilire i CAF da una sospensione cellulare derivata dal tumore.

  1. Semi i CAF su un vaso rivestito di collagene.
    1. Prepara una teglia da 60 mm rivestita di collagene contenente 1,5 mL di medium fibroblastico-1.
    2. Aggiungere 10 μL del filtrato tumorale destinato alla semina del CAF.
    3. Aggiungi antibiotici come 1× Anfotericina B e 100 μg/mL Primocina.
    4. Incubare in condizioni standard di coltura CO₂.
    5. Cambia il medium ogni 3–5 giorni.
      NOTA: Empiricamente, il mezzo fibroblastico-1 è spesso più adatto di altri mezzi per l'insediamento e la crescita iniziale di CAF e CF. Gli antibiotici vengono aggiunti solo nei primi 6 giorni.
  2. Monitorare la crescita della CAF
    1. Monitorare la comparsa della morfologia del fuso simile a fibroblasti a partire dai giorni 3 al 5 circa.
    2. Fibroblasti del passaggio con confluenza al 90%–100%.
      NOTA: Se si verifica contaminazione da cellule epiteliali, i fibroblasti possono essere isolati selettivamente regolando la durata della tripsinizzazione, poiché i fibroblasti si staccano più rapidamente delle cellule epiteliali durante il passaggio.

6. Classificazione CF

NOTA: Questo passaggio viene eseguito per ottenere le FQ compatibili con il paziente da tessuto adiacente non tumorale.

  1. Lava e prepara la digestione non tumorale.
    1. Centrifuga il tubo di digestione non tumorale (Tubo D) a 300 × g per 5 minuti.
    2. Rimuovi il sovrandante usando una pipetta usa e getta.
    3. Aggiungi 10 mL di DMEM/10% FBS, mescola delicatamente per inversione e centrifuga di nuovo a 300 × g per 5 minuti.
    4. Aspira con cura il surnatante, mantenendo il pellet.
    5. Ripeti ancora una volta i passaggi 6.1.3 e 6.1.4.
  2. Semina i CF su un piatto rivestito di collagene
    1. Trasferire l'intera sospensione su un piatto da 60 mm rivestito di collagene contenente 1,5 mL di medium fibroblastico-1.
    2. Aggiungi antibiotici come 1× Anfotericina B e 100 μg/mL Primocina.
    3. Incubare in condizioni standard di coltura CO₂.
    4. Cambia il medium ogni 3–5 giorni.
      NOTA: Gli antibiotici vengono somministrati solo nei primi 6 giorni.
  3. Monitorare la crescita della fibrosi cistica.
    1. Osservare la morfologia del fuso simile a un fibroblasto a partire dai 3 ai 5 giorni.
    2. Fibroblasti del passaggio con confluenza al 90%–100%.

7. Passaggio organoide e crioconservazione

  1. Passaggio organoide.
    NOTA: Lo scopo di questo passaggio è espandere gli organoidi una volta che raggiungono una densità appropriata.
    1. Aspira il vecchio mezzo e lava ogni pozzo con 1 mL di PBS.
    2. Aggiungi 0,5 mL di tripsina preriscaldata per organoide in ciascun pozzo.
    3. Pipetta vigorosamente con una punta P1000, usando il bordo della punta per interrompere la cupola della matrice di membrana del basamento.
      NOTA: Il taglio meccanico aiuta a degradare la densa matrice di membrana basale, migliorando l'accesso enzimatico.
    4. Incubare per 10–15 minuti in un incubatore CO₂ finché tutti i grumi di gel non si sciolgono. Dissociare gli organoidi in 20–50 gruppi cellulari.
      NOTA: Evitare la dissociazione completa a singola cellula, poiché riduce la vitalità.
    5. Raccogli la sospensione in un tubo da 15 mL a basso attacco.
    6. Risciacqua il pozzo quattro volte con 0,5 mL di DMEM/10% FBS e trasferisci tutti i risciacqui nello stesso tubo a basso attacco.
    7. Centrifuga il tubo a 300 × g per 5 minuti.
    8. Rimuovere il sovrantantante e risospendere il pellet con DMEM minimo/10% FBS; regolare il volume della sospensione a 80 μL.
    9. Mescolare 80 μL della sospensione organoide con 240 μL di matrice di membrana basale gelida (rapporto 1:3).
    10. Implatizzare la miscela su una piastra preriscaldata a 6 pozzi (37 °C), con 4–6 cupole per pozzo.
    11. Lascia solidificare le cupole per 15 minuti, poi aggiungi 3 mL di Eso_v1 substrato (la composizione ottimale nella coltura iniziale al passo 4.2) per pozzo.
    12. Cambia il medium ogni 3–5 giorni.
      NOTA: Gli organoidi vengono attraversati quando raggiungono un diametro di circa 100–200 μm o quando l'affollamento della cupola supera il 90%. Il conteggio delle cellule non viene eseguito. Per le sottocolture di routine, gli organoidi sono suddivisi in un rapporto di 1:4 a 1:10. Si prevede una rapida riformazione degli sferoidi entro 48–72 ore.
  2. Crioconservazione organoide
    1. Lava ogni pozzo con 3 mL di PBS.
    2. Aggiungi 1,5 mL di tripsina per organoide in ogni pozzo, pipetta energicamente e incuba per 10 minuti.
    3. Raccogli tutta la sospensione in un tubo da 15 mL a basso attacco e risciacqua il pozzo quattro volte.
    4. Centrifuga il tubo a 300 × g per 5 minuti e rimuovi il surnadante.
    5. Risospezione del pellet in 2 mL di 90% FBS/10% DMSO.
    6. Aliquota 0,5 mL in ciascun crioviale.
    7. Metti le fiale in un contenitore congelante e conserva a −80 °C durante la notte.
    8. Trasferire le fiale nell'azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
      NOTA: Gli organoidi vengono impopolati quando raggiungono un diametro di circa 100–200 μm o quando l'affollamento delle cuole supera il 90%.
  3. Recupero di organoidi congelati
    1. Scongelare rapidamente il cryovial in un bagno d'acqua a 37 °C.
    2. Trasferisci il contenuto in 5 mL di DMEM/10% FBS in un tubo da 15 mL.
    3. Centrifuga il tubo a 300 × g per 5 minuti.
    4. Rimuovere il sovrantantante e risospendere il pellet in 40–60 μL di DMEM/10% FBS.
    5. Mescola la sospensione con matrice di membrana basale ghiacciata in un rapporto 1:3.
    6. Implattare la miscela su una piastra preriscaldata a 6 pozzi (37 °C) come 4–6 cupole per pozzo.
    7. Lascia solidificare le cupole per 15 minuti, poi aggiungi 3 mL di Eso_v1 substrato (la composizione ottimale nella coltura iniziale al passo 4.2) per pozzo.

8. Passaggio dei fibroblasti e crioconservazione

  1. CAF e CF in passaggio
    NOTA: Lo scopo di questo passaggio è espandere i fibroblasti una volta raggiunta una densità adeguata.
    1. Lava il piatto con 2 mL di PBS.
    2. Aggiungi 0,4 mL di tripsina allo 0,25%.
    3. Incubare per 5 minuti in un incubatore a CO₂, monitorando il distacco al microscopio.
    4. Neutralizza la tripsina con DMEM/10% FBS e trasferisci l'intera sospensione cellulare su una piastra da 100 mm contenente 10 mL di mezzo.
      NOTA: I fibroblasti vengono espulsi quando raggiungono una confluenza del 90%–100%. Per le sottocolture di routine, sono suddivise in un rapporto di 1:3. Empiricamente, la proliferazione dei fibroblasti rallenta o cessa quando la densità cellulare è bassa.
  2. Crioconservazione dei fibroblasti
    1. Lava le cellule con 5 mL di PBS.
    2. Aggiungi 1 mL di tripsina allo 0,25%, poi incuba per 5 minuti in un incubatore CO₂.
    3. Neutralizza la tripsina con DMEM/10% FBS e trasferisci l'intera sospensione cellulare in un tubo da 15 mL.
    4. Centrifuga a 300 × g per 5 minuti.
    5. Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di 90% FBS/10% DMSO.
    6. Aliquota 0,5 mL in ciascun crioviale.
    7. Mettere le fiale in un contenitore congelante e conservarle a −80 °C durante la notte.
    8. Trasferire le fiale in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

9. Saggio medio condizionato

NOTA: Lo scopo di questo passaggio è valutare gli effetti paracrini dei fibroblasti sugli organoidi tumorali ESCC utilizzando il mezzo condizionato (MC). Questo saggio fornisce un modello di interazione stromale-tumore riproducibile quando la co-coltura diretta non è ancora ottimizzata.

  1. Preparazione di mezzo condizionato CAF/CF
    1. Coltivare lo stesso numero di CAF o CF in 3 mL di DMEM/10% FBS su parabole da 60 mm fino a raggiungere l'80%–90% di confluenza.
    2. Lava le cellule una volta con 2 mL di PBS.
    3. Aggiungi 3 mL di DMEM/2% FBS.
    4. Incubare per 48 ore in un incubatore CO₂.
    5. Raccogli il soprandanante in un tubo da 15 mL.
    6. Centrifugare a 2000 × g per 5 minuti per rimuovere i detriti cellulari.
    7. Raccogli 2,5 mL del sovrantantante in un nuovo tubo da 15 mL.
    8. Aliquota il mezzo condizionato in porzioni da 100–500 μL e conserva a -80 °C.
  2. Preparazione del mezzo organoide per il saggio
    1. Preparare il mezzo organoide ESCC come descritto nel passo 1.3.
    2. Mescola il mezzo organoide e il mezzo condizionato in un rapporto 1:1 (50% v/v).
  3. Coltura di organoidi tumorali utilizzando il mezzo per il test organoide.
    1. Dopo il passaggio organoide come descritto nel passo 7, si seminano gli organoidi in una singola cupola di matrice a membrana basale da 20 μL per pozzo su una piastra preriscaldata a 48 pozzi (37 °C).
    2. Dopo la solidificazione della cupola, aggiungere 0,3 mL di mezzo organoide per il saggio in ciascun pozzo.
    3. Sostituire il mezzo organoide ogni 3–7 giorni.
    4. Valuta la morfologia e la dimensione degli organoidi tumorali.
      NOTA: Tutti i materiali di origine umana sono trattati come potenzialmente infettivi. Sono sempre indossati dispositivi di protezione individuale appropriati, inclusi guanti, maschere e occhiali protettivi. Collagenasi, dispase e dimetilsolfosida (DMSO) possono causare irritazioni della pelle, degli occhi e delle vie respiratorie; di conseguenza, si evitano il contatto diretto e l'inalazione. Tutte le procedure enzimatiche che coinvolgono tessuti umani sono eseguite in conformità con le linee guida istituzionali sulla biosicurezza. I rifiuti liquidi contenenti tessuto umano vengono raccolti in contenitori sigillati per i rischi biologici e autoclavati prima dello smaltimento. I rifiuti chimici, inclusi DMSO e soluzioni enzimatiche, vengono smaltiti in conformità con le linee guida istituzionali sui rifiuti pericolosi. Tutti gli strumenti riutilizzabili vengono risciacquati con etanolo al 70% e autoclavati prima di essere riutilizzati.

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Risultati

Sono stati prelevati campioni di tessuto dalla regione tumorale e da una regione non tumorale adiacente situata a 3 cm dal tumore, espulsi chirurgicamente da un paziente con ESCC che non aveva ricevuto chemioterapia neoadiuvante. Gli organoidi tumorali e i CAF sono stati isolati dalla regione tumorale, mentre i CF sono stati isolati dalla regione non tumorale. I tessuti chirurgici venivano tritati in pezzi di circa 0,5 mm (Figura 2A), poi trattati enzimatica...

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Discussione

I rapporti precedenti hanno utilizzato organoidi oncologici e CAF abbinati ai pazienti per indagare il ruolo dei CAF nella proliferazione e resistenza ai farmaci nei tumori umani del colon, seno, pancreas e testa ecollo 20,21,22,23,24. Questi studi hanno dimostrato che i CAF influenzano la proliferazione e la resistenza ai far...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Premio Giovane Ricercatore dell'Università Juntendo (2024 e 2025) a P. Z. e da Sovvenzioni per la Ricerca Scientifica dal Ministero dell'Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia del Giappone (23K07362, 21K08693). Desideriamo ringraziare tutti i membri dei Dipartimenti di Patologia e Oncologia, e di Chirurgia Esofagea e Gastroenterologica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Antenne da 100 mmTPP93100
100x Penicillina-Streptomicina (PS)Nacalai26253-84
Tubo da 15 mlFastGeneFG2001
Placca di coltura cellulare a 24 pozziTPP92024
Piastra di coltura cellulare a 48 pozziTPP92448
Tubo da 50 mlFastGeneFG2004
Antena da 60 mmTPP93060
Placca di coltura cellulare a 6 pozziTPP92006
A83-01Cayman9001799
DMEM avanzato/F12 Gibco12634010Mezzo organoide basale = DMEM avanzato/F12 + GlutaMAX + 1x PS
Alexa488 anti-mouse IgGInvitrogenA11029
Anfotericina BThermoFisher15290018
Anticorpo anti-Vimentina (V9)Santa CruzSC-6260Diluizione 1/500 per l'uso
B-27ThermoFisher17504044
Filtro a tappo di bottigliaSartorius180F15
Filtro cellulare, 100 & micro; m poreBD Falcon352360
Collagenase, Tipo ISIGMAC0130
Dishe da 60 mm rivestita di collageneIWAKI4010-010
Dimetil Solfossido (DMSO)Wako043-07216
Dispasi IGODO SHUSEI386-02271
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Nacalai08459-64
ECLIPSE Ti2Nicon
Siero Fetale Bovino (FBS)SERANAS-FBS-CO-015
Mezzo di Crescita dei Fibroblasti 2PromoCellC-23020Mezzo fibroblastico-1 = Mezzo di crescita fibroblastico 2
G418InvivogenANT-GN-1
GlutaMAX Gibco35050061
HFDM-1KSK87-160Fibroblasti media-2 = HFDM-1 + 1% FBS + 1 x PS
Hoechst33342 Nacalai04929-82
IgromicinaInvivogenANT-HG-1
Sistema IncuCyteEssen BioScience
Celle L-WRNATCCCRL-3276
MatrigelCorning354234Matrice a membrana basale = Matrigel
N2ThermoFisher17502048
N-acetil-L-CisteïnaWako017-05131
NicotinamideTCIN0078
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Nacalai14249-24
PrimocinInvivogenANT-PM-05
EGF umano ricombinantePEPROTECHAF-100-15
FGF-10 umano ricombinantePEPROTECHPEP-100-26
SB202190SelleckS1077
Bisturi, n. 11Piuma8-3086-02
STEMFULLBachelite di sumitomoMS-90150Tubo a basso attacco da 15 mL = STEMFULL
TrypLE ExpressGibco12605028Tripsina per organoide = TrypLE Express
TripsinaNacalai35556-44
Y-27632SelleckS1049

Riferimenti

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