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Articolo metodologico

Patologia striatale indotta da lentivirali come modello preclinico delle atassie spinocerebelari poliglutamicraniche

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DOI:

10.3791/69550

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13 marzo 2026

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1ABC-RI, Algarve Biomedical Center Research Institute, 2Faculdade de Medicina e Ciências Biomédicas, Universidade do Algarve, 3ABC Collaborative Laboratory: Integrated Ageing and Rejuvenation Solutions (ABC CoLAB - Ageing Better)

In questo articolo

Sommario

Le ataxi spinocerebellari della poliglutamina sono causate dalle espansioni CAG che producono proteine inclini all'aggregazione. Questo protocollo descrive la produzione di vettori, la consegna stereotassica e l'analisi delle inclusioni e della perdita di marcatori neuronali, fornendo una piattaforma controllata per indagare i meccanismi e valutare terapie mirate per malattie neurodegenerative.

Abstract

Le ataxi spinocerebellari poliglutaminache sono un gruppo di sei malattie neurodegenerative causate da una mutazione nel tratto CAG trinucleotidico all'interno della regione codificante di ciascun gene causale. Questa mutazione porta a una dilatazione anormalmente espansa della poliglutamina nella proteina, rendendola soggetta all'aggregazione e portando alla formazione di inclusioni intraneuronali, che sono una caratteristica distintiva di queste malattie. I meccanismi molecolari alla base della patogenesi di queste malattie sono complessi e non completamente compresi. Finora, queste malattie restano incurabili. Comprendere i meccanismi molecolari nelle regioni cerebrali vulnerabili è essenziale per lo sviluppo terapeutico. Sono necessarie piattaforme sperimentali flessibili e specifiche per regione per testare rapidamente meccanismi e interventi senza il tempo e i costi di generare più linee transgeniche, anche senza affrontare la vulnerabilità selettiva. Negli ultimi anni, noi e altri abbiamo sviluppato diversi modelli basati su lentivirali per studiare l'impatto dell'espansione dell'espressione proteica in specifiche regioni del cervello. Questi modelli mostrano caratteristiche neuropatologiche e comportamentali che imitano alcune caratteristiche della malattia, evidenziandone l'importanza nella comprensione della patogenesi e nello sviluppo di nuove strategie terapeutiche. In questo articolo descriviamo lo sviluppo di un modello striatale usando SCA2 come esempio. Mettiamo in evidenza lo sviluppo e la produzione dei vettori lentivirali e l'iniezione stereotassica dei vettori che esprimono la forma espansa di atassina-2 (la proteina che causa la malattia). Infine, caratterizziamo due principali tratti neuropatologici: la formazione delle inclusioni e la perdita di marcatori neuronali. Fornendo una piattaforma controllata che riproduce queste caratteristiche patologiche chiave, questo modello rappresenta uno strumento prezioso per analizzare i meccanismi specifici della neurodegenerazione per regione e per valutare interventi terapeutici mirati.

Introduzione

Le ataxi spinocerebellari poliglutamiche (polyQ SCA) sono un gruppo di sei disturbi neurodegenerativi autosomici dominanti causati da espansioni ripetute dei trinucleotidi CAG in vari geni causali, che hanno portato a tratti tossici di poliglutamina (polyQ) all'interno delle proteinecodificate. Tra queste, le SCA polyQ più frequenti sono la malattia di Machado-Joseph e la malattia di Machado-Joseph e SCA22. Questi disturbi colpiscono principalmente le cellule neuronali in specifiche regioni cerebrali, inclusi il cervelletto e il tronco encefalico, così come lo striato e altre aree. Di conseguenza, causano una progressiva incoordinazione motoria, disturbi dell'andatura, gravi neurodegenerazioni e morteprematura 3.

Sono stati sviluppati molteplici modelli animali per studiare le polyQ SCA e per testare approcci terapeutici. Topi transgenici, linee knock-in e modelli murini a espressione condizionata sono stati utilizzati per chiarire la base molecolare della progressione della malattia e le vie cellulari coinvolte 4,5. Tuttavia, generare un nuovo modello animale per la malattia richiede tempo e costa, e spesso non è adatto per studiare il coinvolgimento regionale del cervello nella patogenesidella malattia 6.

I modelli murini basati su lentivirali (LV) offrono un'alternativa complementare ai modelli convenzionali, con costi ridotti e la possibilità di studiare specifiche regioni delcervello 7,8. I vettori lentivirus permettono la somministrazione di grandi transgeni (fino a 8 kb), portando a una rapida induzione della patologia in regioni cerebrali definite senza la necessità di modifiche della linea germinale, e possono essere utilizzati su animali di diverse età. L'iniezione diretta di vettori lentivirali nella regione cerebrale target può ottenere un'espressione specifica per regione di geni patogenici o terapeutici con immunogenicità ridotta rispetto ad altri vettorivirali 4. Inoltre, il parto postnatale evita la compensazione dello sviluppo per indagare i meccanismi della malattia in condizioni che assomigliano maggiormente all'insorgenzaumana 9. I livelli di espressione possono essere titolati aggiungendo la dose virale, generando fenotipi di gravità controllata e facilitando la modellizzazione della progressione graduale della malattia. Inoltre, questo metodo consente un'espressione specifica per tipo cellulare dipendente dal promotorescelto 4,7.

Diversi studi hanno dimostrato la praticità e l'utilità dei modelli murini basati sul LV per la modellazione delle polyQSCA 10,11,12,13. Noi e altri abbiamo sviluppato modelli basati su LV per SCA111, SCA212, SCA311,12 e SCA714, costituendo piattaforme per l'espressione rapida e specifica per regione o il silenziamento dei geni della malattia, riproducendo al contempo aspetti chiave della neuropatologia.

In sintesi, l'approccio lentivirale descritto qui fornisce uno strumento versatile ed efficiente per modellare la patogenesi delle polyQ SCA. Superando alcuni dei principali svantaggi dei modelli animali attuali, questo metodo accelera gli studi proof-of-concept e offre un maggiore controllo sull'insorgenza, la localizzazione e la gravità della malattia - caratteristiche che lo rendono altamente adatto allo screening terapeutico e allo studio dei meccanismi molecolari. Qui descriviamo un metodo riproducibile per generare e caratterizzare un modello lentivirale striatale dell'atassia spinocerebelare poliglutamina, consentendo un'analisi dettagliata degli eventi patogeni precoci e la valutazione di terapie candidate.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) e con la Guida dei National Institutes of Health per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio. Il presente studio è stato approvato dalla Direção-Geral da Alimentação e Veterinária (DGAV). In questo studio sono stati utilizzati topi C57BL/6J e ospitati in gabbie standard con un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di oscurità, con cibo e acqua forniti ad libitum.

NOTA: I materiali utilizzati in questo protocollo sono descritti ulteriormente nella Tabella dei Materiali.

1. Confezionamento dei vettori lentivirali

NOTA: Tutte le procedure che coinvolgono vettori lentivirali devono essere condotte in un laboratorio BSL-2 seguendo le linee guida di sicurezza dell'istituto. Abbiamo utilizzato il sistema di trasfezione a 4 plasmidi grazie alla sua maggiore biosicurezza rispetto ad altri sistemi produttori di lentivirali (vedi Figura 1 per i dettagli sul plasmide di trasferimento).

  1. Scongelare le cellule HEK 293T in un bagno d'acqua e seminarle in una fiaschetta T75 utilizzando il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con 2 mM di L-glutammina, 10% FBS e 1% Pen-Streptococco. Questo mezzo DMEM completo veniva utilizzato in tutte le fasi del protocollo. Usa le cellule al passaggio numero ≤10 per garantire alti titoli virali e risultati costanti.
    NOTA: Controlla sempre la presenza di contaminazione da micoplasmi prima di procedere.
  2. Quando le cellule raggiungono l'80%-90% di confluenza, espandele in 2 fiaschette T175 dividendo la coltura iniziale 1:2. Seminare 20 ciotole di coltura da 100 mm con 3,8 x 106 cellule per piatto (volume finale 10 mL) e incubarli per 24 ore a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂. Contare le cellule tramite esclusione di blu di tripano utilizzando un emocitometro di Neubauer.
    NOTA: Considera di escludere il Pen-Strep dal mezzo per ridurre lo stress cellulare e, di conseguenza, massimizzare la trasfezione cellulare.
  3. Il giorno successivo, prepara la miscela di trasfezione come descritto nella Tabella 1. Vortice e ruotano brevemente verso il basso per omogeneizzarsi. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 10–20 minuti per permettere la formazione di complessi di DNA: PEI.
  4. Dopo il DNA: i complessi PEI sono stati lasciati formarsi per 15 minuti a temperatura ambiente, regolando la miscela a 5 mL con DMEM completo.
    Rimuovi 5 mL di substrato da ogni ciotola di coltura (metà del volume totale) e sostituisci con i 5 mL di miscela per la trasfezione. Questo mantiene il volume finale di coltura a 10 mL durante la trasfezione.
  5. Trasfettare le cellule con i tre plasmidi di imballaggio e il plasmide di trasferimento come descritto nella Tabella 1.
    NOTA: Tutti i plasmidi utilizzati per la produzione lentivirale devono essere preparati utilizzando kit di purificazione privi di endotossine. Inoltre, l'integrità del plasmide dovrebbe essere verificata tramite analisi enzimatica di restrizione per confermare la correttezza delle regioni LTR e della cassetta transgene prima della trasfezione.
  6. Aggiungi 5 mL di miscela per la trasfezione a goccia su ogni piatto e incuba per 6 ore. Aspira tutto il mezzo e sostituiscilo con 10 mL di substrato fresco. Incubare per 48 ore.
    NOTA: Per aumentare il titolo virale, raccogli il mezzo a 48 ore, aggiungi 10 mL di mezzo fresco a ciascun piatto e raccogli di nuovo dopo 24 ore. Il substrato precedentemente raccolto può essere conservato a 4 °C per un massimo di 24 ore. Questo permetterà una concentrazione del doppio del volume e aumentare il titolo virale.
  7. Filtrare tutto il mezzo condizionato contenente vettori lentivirali utilizzando un'unità di filtro da 0,22 μm.

2. Purificazione e titolazione dei vettori lentivirali

  1. Trasferire il sovrantato filtrato in appositi tubi conici ultracentrifughe e centrifugare a 65.000 x g per 1 ora e 30 minuti a 4 °C, utilizzando, ad esempio, un rotore a secchio oscillante.
  2. Scartare con cura il sovrantantante e risospendere ogni pellet in 400 μL di BSA all'1% diluito in 1x PBS, evitando la formazione di bolle. Incubare sul ghiaccio per almeno 1 ora.
  3. Dopo 1 ora di incubazione, mescola delicatamente ogni tubo per assicurarti che i pellet siano completamente risospesi e omogenei, poi concentra tutti i pellet risospesi in un unico tubo.
  4. Riempi il tubo con BSA/PBS all'1% fino ad almeno due terzi per evitare il collasso durante la centrifugazione.
  5. Centrifugare di nuovo a 65.000 x g per 1 ora e 30 minuti a 4 °C per pelletare i vettori lentivirali. Scartare con cura il sovrantato e asciugare il bordo del tubo con carta sterile.
  6. Risospendere il pellet contenente i vettori lentivirali a 45 μL di BSA/PBS all'1%, evitando bolle. Sigilla il tubo con pellicola trasparente e incuba a 4 °C per 24 ore.
  7. Il giorno seguente, preparare aliquote da 10 μL dei vettori lentivirali. Tieni un'aliquota da 10 μL per la titolazione: 5 μL per il kit ELISA p24 e 2 μL per il kit qPCR. Titolare i vettori lentivirali usando ELISA e qPCR secondo le istruzioni del produttore.
    NOTA: La scelta del metodo di titolazione dipende dalle esigenze sperimentali, ad esempio una valutazione rapida o una quantificazione precisa delle unità infettive. ELISA basato su p24 quantifica la proteina capside e quindi misura le particelle fisiche totali; È rapido, meno costoso rispetto ad altri metodi e altamente riproducibile. Tuttavia, non distingue le particelle infettive da quelle non infettive, il che può portare a una sovrastima del titolo funzionale. La titolazione basata sulla qPCR misura il numero di genomi virali (vg) confezionati in particelle, fornendo una stima più accurata dei virioni contenenti genomi e permettendo il confronto diretto tra le preparazioni di vettori. Tuttavia, non può ancora valutare l'effettiva infettività delle particelle virali. Infine, i saggi basati sull'infettività, come la citometria a flusso per vettori fluorescenti o la formazione di colonie di resistenza agli antibiotici, misurano direttamente le unità di trasduzione funzionale (TU/ml) e sono le più rilevanti dal punto di vista biologico, sebbene siano più laboriose, dipendenti dal tipo cellulare, dispendiose in termini di tempo epiù costose 15,16.

3. Chirurgia stereotassica per la somministrazione bilaterale di lentivirali nello striato del topo

  1. Preparazione degli animali
    1. Pesa l'animale e calcola la dose anestesica richiesta. Somministrare l'anestesia intraperitoneale a una dose di 10 μL/g di peso corporeo utilizzando una soluzione pronta a miscelare. Questa soluzione viene preparata combinando 7,5 mL di NaCl allo 0,9%, 500 μL di medetomidina (1,0 mg/mL), 1,0 mL di midazolam (5,0 mg/mL) e 1,0 mL di fentanyl (0,05 mg/mL), per un volume finale di 10 mL. Prevedi circa 10 minuti per l'induzione completa dell'anestesia.
    2. Confermare la profondità dell'anestesia (ad esempio, riflesso di pizzicamento all'allucco). Applica unguenta oftalmica su entrambi gli occhi e radi il cuoio capelluto.
    3. Metti l'animale nella cornice stereotassica su una borsa riscaldante. Posiziona la testa usando le barre per le orecchie e la barra di morso.
      NOTA: Il numero di animali da iniettare e la tempistica dipendono dall'esperimento e dovrebbero essere determinati tramite analisi statistica a priori basata sulle ipotesi specifiche e sulle dimensioni degli effetti attese. Ad esempio, nel nostro precedente studio12, i cervelli iniettati sono stati analizzati a 4, 8 e 12 settimane dall'iniezione per valutare la progressione dei cambiamenti neuropatologici.
  2. Preparazione della siringa e caricamento virale
    1. Usa l'ago Hamilton standard per il carico e un ago da punta smussa da 26G per l'iniezione. Carica 2 μL di soluzione vettoriale lentivirale nella siringa. Assicurati che la dose virale per ogni sito di iniezione sia di 400 ng di antigene p24/mL, oppure 5 x 109 IU/mL 10,12,17.
    2. Montare la siringa nella pompa automatica di microiniezione (ad esempio, Stoelting). Prepara la siringa in modalità infusione finché una goccia di liquido non appare sulla punta dell'ago. Assicurati che la smussa sia rivolta in avanti.
    3. Imposta i parametri della pompa - velocità: 0,25 μL/min, volume per emisfero: 2 μL, tipo di siringa: adatto a ciò che viene utilizzato.
      NOTA: Il volume da iniettare dipende dalla specie di roditore e dall'area cerebrale bersaglio da trasdotto. Iniezioni di 1 μL portano a un'espressione focale, mentre volumi totali maggiori (fino a 10 μL) richiedono tassi di iniezione molto lenti e comportano un rischio maggiore di alterazione tissutale o reflusso.
  3. Targeting e iniezione striatale
    1. Disinfetta il cuoio capelluto con il 70% di etanolo. Eseguire un'incisione della linea mediana (~1–1,5 cm) utilizzando una lama sterile dal bisturi che va da tra le orecchie agli occhi.
    2. Espone e pulisci il cranio, rimuovendo il periosto con cotton swabs. Localizza Bregma e registra il punto zero stereotassico (manualmente o digitalmente).
    3. Determinare le coordinate di iniezione rispetto al Bregma (per un topo di 8-12 settimane di età con circa 18-20 g): Antero-posteriore (AP) +0,6 mm; Medio-laterale (ML) ±1,8 mm; Dorso-ventrale (DV): –3,3 mm.
    4. Esercita con attenzione sulle coordinate AP/ML segnate. Procedi lentamente per evitare di penetrare nel cervello. In alternativa, fermarsi una volta che l'osso è sufficientemente assottigliato - ciò è indicato dalla visualizzazione dei vasi sanguigni nella dura madre attraverso il cranio. Perfora con cura la dura mater con un piccolo ago.
    5. Controlla che il foro sia nella posizione giusta abbassando l'ago di iniezione. Testare l'ostruzione dell'ago iniettando una porzione della soluzione finché una goccia non è chiaramente visibile.
    6. Abbassa lentamente l'ago di iniezione fino alla coordinata DV. Iniettare 2 μL di soluzione virale per emisfero a 0,25 μL/min. Dopo l'iniezione, aspetta 5 minuti prima di ritirare lentamente l'ago per evitare il reflusso.
    7. Iniettare lentivirus codificando per la proteina selvatica (ATXN2WT o ATXN3WT) in un emisfero e lentivirus codificando per la proteina mutante/espansa (ATXN2MUT o ATXN3MUT) nel lato controlaterale (randomizzato o predefinito)12,13.
      NOTA: Utilizzando l'atlante cerebraledel topo 18, praticamente tutte le regioni cerebrali possono essere mirate stereotassicamente oltre lo striato, inclusi corteccia, ippocampo, substantia nigra e cervelletto. Poiché il cervelletto è il principale sito patologico nelle SCA, rappresenta un bersaglio particolarmente rilevante per la somministrazione dei vettori. Per lo sviluppo di questo modello murino SCA3 cerebello, abbiamo utilizzato coordinate 1,6 mm rostrale a lambda, 0 mm dalla linea mediana e 1 mm ventrale alla superficie del cranio, con la barra della bocca impostata a −3,3, garantendo un targeting preciso della cortecciacerebellare 12,15.
  4. Monitoraggio durante l'intervento chirurgico
    1. Monitora i movimenti dei baffi e i riflessi. Se si osserva movimento, somministrare una dose anestesica supplementare (un terzo del volume iniziale).
  5. Chiusura della ferita e guarigione
    1. Chiudi l'incisione con 3–5 punti di nylon 5-0 interrotti. Somministrare una miscela di farmaci antagonisti sottocutaneamente a una dose di 10 μL/g di peso corporeo per invertire gli effetti degli anestetici iniziali. Questa soluzione viene preparata combinando 1,5 mL di NaCl allo 0,9%, 500 μL di atipamezolo (5,0 mg/mL), 5,0 mL di flumazenil (0,1 mg/mL) e 3,0 mL di naloxone (0,4 mg/mL), per un volume finale di 10 mL.
    2. Metti l'animale in una gabbia di recupero pulita sopra una borsa riscaldante e monitoralo durante la notte.
      NOTA: La sala di iniezione dovrebbe idealmente essere dotata di un armadietto di sicurezza biologica per la gestione dei vettori. I ricercatori devono indossare l'attrezzatura di protezione individuale (DPI) adeguata, inclusi camice da laboratorio, guanti e protezione oculare. Tutti i rifiuti (ad esempio, aghi, siringhe e materiali contaminati) devono essere smaltiti in contenitori per rischi biologici secondo le normative istituzionali e nazionali.

4. Raccolta, preparazione e lavorazione dei tessuti

  1. Preparazione
    1. Preparare tutti gli strumenti di dissezione e le soluzioni necessarie per l'eutanasia del topo e la raccolta dei tessuti (ad esempio, anestesia, paraformaldeide al 4% [PFA] in PBS).
    2. Prepara il 4% di PFA in anticipo, conservalo congelato e scongela non più di 24 ore prima dell'uso. Assicurati che la soluzione sia ben raffreddata prima della perfusione.
      ATTENZIONE: PFA è tossica. Maneggiare solo all'interno di una cappa con l'equipaggiamento di protezione individuale (DPI) e l'addestramento appropriati.
    3. Somministrare una dose letale di pentobarbital (100–200 mg/kg, intraperitoneale) per anestetizzare l'animale. Confermare l'anestesia profonda in assenza del riflesso del pizzichio del dito del piede; Se il riflesso persiste, somministrare una dose aggiuntiva.
  2. Perfusione transcardica
    1. Posizionare e fissare l'animale nell'apparato di dissezione (dissection). Usando la pinza, sollevare la pelle addominale e fare un'incisione verticale ascendente con forbici (Figura 2A, freccia rosa).
    2. Sollevare la fascia superficiale e fare un'incisione superiore fino a quando il fegato non è visibile, evitando lesioni agli organi addominali.
    3. Taglia il diaframma orizzontalmente, poi estendi l'incisione verso l'ascella (Figura 2A, freccia bianca). Rifletti e fissa la parete toracica.
    4. Inserire un ago di perfusione nell'apice del ventricolo sinistro, assicurandosi che non perfori la parete ventricolare. Fai una piccola incisione nell'atrio destro con forbici fini (Figura 2B).
    5. Iniziare la perfusione transcardica utilizzando 50 mL di paraformaldeide (PFA) gelido al 4% a una portata di 1-2 mL/min.
      NOTA: Spesso, la soluzione fredda provoca arricciamento della coda e contrazioni muscolari, che sono un indicatore di buona perfusione.
  3. Dissezione cerebrale
    1. Prepara un tubo contenente abbastanza PFA 4% per immergere completamente il cervello. Decapita il topo con delle forbici grandi. Smaltire il corpo in una busta sigillata per i rischi biologici per l'incenerimento.
    2. Rifletti il cuoio capelluto per esporre il cranio. Identificare il forame magnum e iniziare a rimuovere il cranio tagliando lateralmente con forbici sottili, paralleli al cervello (Figura 2C).
    3. Ripeti sul lato controlaterale, poi taglia il cranio tra gli occhi sopra i bulbi olfattivi.
    4. Sollevare il cranio dal cervelletto verso i bulbi olfattivi per esporre il cervello. Utilizzando una spatola, rimuovere con cura il cervello da posteriore a anteriore e immergerlo nel PFA al 4% per non più di 24 ore a 4 °C.
    5. Sostituire la soluzione di incorporazione con il 20%-30% di saccarosio nel PBS e incubare a 4 °C fino al completamento dell'infiltrazione. Il cervello inizialmente galleggia e poi affonda una volta completamente infiltrato, tipicamente entro 24 ore. Se rimane a galla, estendi l'incubazione finché non si deposita sul fondo del tubo.
      NOTA: Questa fase di crioprotezione minimizza gli artefatti di congelamento riducendo il contenuto di acqua dei tessuti.
      Asciuga delicatamente il cervello e il tubo, poi conserva a -80 °C fino a un ulteriore utilizzo.
  4. Criosezionamento e raccolta libera di tessuti
    1. Prima di sezionare, imposta il criostato a -20 °C e lo spessore desiderato.
      NOTA: Per lo striato, le sezioni coronali con spessore di 20-25 μm offrono un compromesso ideale tra conservazione strutturale e penetrazione degli anticorpi, producendo sezioni sufficientemente robuste da maneggiare mantenendo un'alta qualità di colorazione e risoluzione spaziale. Le condizioni di criosezionamento dovrebbero essere specificate anche per altre regioni cerebrali, poiché lo spessore ottimale può variare con la citoarchitettura. Per il cervelletto, generalmente si raccomandano sezioni sagittali di 25–35 μm, poiché questo spessore preserva l'organizzazione stratificata della corteccia cerebellare.
    2. Trasporta il cervello su ghiaccio secco e lascialo in equilibrio all'interno del criostato per 5-10 minuti. Questo passaggio è importante per prevenire danni ai tessuti.
    3. Rimuovere i bulbi olfattivi con un bisturi; Dovrebbero essere morbidi e facili da tagliare. Applica una goccia di O.C.T. fresco grande quanto un pisello sul disco del campione e metti il cervelletto a contatto (Figura 1D). Posiziona il cervello per la sezione coronale. Una volta congelato, aggiungi ulteriori O.C.T. per incastrare l'intero cervello.
      NOTA: O.C.T. è trasparente a temperatura ambiente e diventa opaco bianco quando completamente congelato; Se rimane lucido, lascia più tempo di congelamento nel criostato.
    4. Montare il disco campione nel supporto e rifilare finché il striato (due cerchi bianchi in ciascun emisfero) non è visibile. Se gli emisferi hanno ricevuto trattamenti diversi, si trafigge un emisfero con un ago per mantenere l'orientamento. Annota questo per un'analisi successiva.
    5. Passa alla modalità sezionamento e raccogli sezioni fluttuanti su una piastra a 48 pozzi usando un pennello fine o una pipetta Pasteur in vetro lucidato al fuoco.
      NOTA: Il metodo free-floating migliora la penetrazione degli anticorpi, riduce il background, consente una conservazione a lungo termine e garantisce sezioni equidistanti per una copertura striatale completa.
    6. Riempire i pozzi con PBS contenente azido di sodio allo 0,05%.
      ATTENZIONE: L'azide di sodio è tossico - maneggiare con DPI e smaltire i rifiuti in modo appropriato.
    7. Posiziona la prima sezione nel pozzo A1, la seconda in A2, e continua in sequenza. Quando la piastra è piena, si continua con una nuova piastra oppure si torna al pozzo A1 e procedi fino a quando l'intero striato non è sezionato (~3 piastre complete da 48 pozzi). Sigilla le piastre con pellicola trasparente e conserva a 4 °C fino all'uso.
      NOTA: Per l'analisi dello striato intero, selezionare una colonna dalla lastra produce sezioni equidistanti rappresentative dell'intera regione.

5. Immunoistochimica con colorazione DAB

  1. Lava le sezioni 3 volte con PBS per rimuovere residui di azide di sodio. Incubare in soluzione di fenilidrazina (0,2 - 0,3 mg/mL in PBS) per 30 minuti a 37 °C.
    ATTENZIONE: La fenilidrazina è cancerogena - esegui questo passaggio in una cappa e smalti i rifiuti come pericolosi.
  2. Lava 3 volte in PBS per 5 minuti, 10 minuti, 10 minuti consecutivamente. Bloccare il tessuto per 1 ora in RT in PBS contenente il 10% di siero normale di capra (NGS) e 0,1% di Triton X-100.
  3. Incubare durante la notte a 4 °C con l'anticorpo primario nella diluizione raccomandata (ad esempio, anti-atasina-2 del topo, 1:1000 in soluzione bloccante) sotto agitazione delicata. Lava 3 volte in PBS per 5 minuti, 10 minuti, 10 minuti consecutivamente.
  4. Incubare con anticorpi secondari biotinilati (1:200 in soluzione bloccante) per 2 ore a RT sotto agitazione delicata. Lava 3 volte in PBS per 5 minuti, 10 minuti, 10 minuti consecutivamente.
  5. Incubare nel complesso ABC per 30–40 minuti a tempo di ritiro. Lavare 3 volte in PBS per 5 minuti, 10 minuti, 10 minuti in sequenza.
  6. Preparare la soluzione DAB fresca: per 2,5 mL di acqua ultrapura, aggiungere 1 goccia di tampone e vortice; aggiungere 2 drop di DAB e vortice; Aggiungi 1 drop H₂O₂ e torna a vortice.
    ATTENZIONE: il DAB è cancerogeno - maneggiare in una cappa e smaltire correttamente i rifiuti.
  7. Sviluppare singolarmente sezioni in soluzione DAB fino a raggiungere l'intensità di colorazione desiderata (tipicamente 1–10 minuti). Ferma immediatamente la reazione trasferendolo a PBS.
    NOTA: La reattività al DAB diminuisce nel tempo; Lavora in modo efficiente. Se nel pozzo ci sono più sezioni contemporaneamente, assicurati che non siano a contatto, poiché influenzeranno il processo di colorazione.
  8. Lava 3 volte in PBS per 5 minuti, 10 minuti, 10 minuti consecutivamente. Montare le sezioni su vetrine rivestite di gelatina e lasciarle asciugare completamente. Non etichettare i vetrini con una matita grafite, poiché potrebbe interferire con l'imaging.
  9. Disidratare, trasparire e copriscimento come segue: immergere in acqua distillata per 30 secondi, disidratare tramite serie etanolica: 75%, 96%, 100% (3 min ciascuno). Trasparenti in sostituto allo xilene per 5 minuti e asciugati all'aria. Applica il copertura usando un mezzo di montaggio a rapido indurimento e lascia che si indurisca all'interno della cappa per almeno 24 ore prima di effettuare l'imaging o la conservazione.

6. Quantificazione del volume esaurito da DARPP-32 nello striato del topo usando FIJI (ImageJ)

  1. Acquisizione dell'immagine
    1. Cattura immagini delle sezioni cerebrali coronali che coprono l'intero striato (approssimativamente Bregma +1,0 a –0,5 mm). Mantieni un'illuminazione, un ingrandimento (ad esempio, 10x) e una risoluzione costanti. Salva le immagini in formato TIFF con nomi file sequenziali (ad esempio, Striatum_Bregma_+0.5.tif).
  2. Preparazione dell'immagine nelle FIJI
    1. Apri ogni immagine in FIJI. Calibra la dimensione dei pixel: vai su Analizza > imposta scala. Usa una scala nota da un micrometro o dai metadati dell'immagine (ad esempio, 1 pixel = 1 μm).
    2. Converti immagini a 8 bit: Immagine > Tipo > 8 bit. Regola luminosità/contrasto se necessario per una visualizzazione ottimale dell'area esaurita (evita la soglia in questo passaggio).
  3. ROI selezione delle aree esaurite
    1. Usa lo strumento Polygon, Freehand o Pennello per delineare la regione impoverita di DARPP-32 (di solito più chiara o assente di colorazione nello striato). Vai su Analizza > Misura per registrare l'area in μm2.
    2. Salva il ROI andando su ROI Manager > aggiungi > altro > salva o usa la funzione Multi-misura per l'analisi batch.
    3. Ripeti per tutte le sezioni cerebrali rilevanti.
  4. Calcolo del volume esaurito
    1. Moltiplicare l'area esaurita in ogni sezione per la distanza tra le sezioni (tipicamente 120 – 240 μm, a seconda dello spessore e della distanza della sezione).
      Volume per sezione (mm3) = area esaurita (mm2) × intervallo di sezione (mm)
    2. Somma il volume su tutte le sezioni:
      Volume totale esaurito (mm3) = Σ (area × intervallo)
    3. Opzionale: sovrapposizione per visualizzazione. Usa l'Immagine > Overlay > From ROI per visualizzare le regioni esaurite tra le sezioni. Esporta un'immagine riassuntiva o un'animazione per le figure.
  5. Controlla sempre l'allineamento con l'atlante cerebrale del topo per una mappatura rostro-caudale accurata. Analizza ogni emisfero separatamente per distinguere gli effetti unilaterali (ad esempio, WT vs iniezione di mutanti).

7. Quantificazione degli aggregati proteici nello striato del topo

  1. Quantificazione manuale usando FIJI
    1. Carica e calibra l'immagine. Apri l'immagine in FIJI. Calibra la dimensione del pixel (salta questo passaggio se usi immagini con metadati).
    2. Vai su Analizza > imposta scala, inserisci la distanza conosciuta (ad esempio, 1 pixel = 0,5 μm). In FIJI, vai su Plugin > Analizza > contatore di celle > contatore di celle. Clicca su Inizializza, poi seleziona l'immagine.
    3. Scegli un tipo di marcatore (ad esempio, Tipo 1) per gli aggregati. Clicca manualmente su ogni aggregato visibile per etichettarlo. Dati di registrazione: FIJI mostrerà il conteggio nel pannello Cell Counter. Registrare i conteggi per ogni immagine/sezione. Esporta manualmente i conteggi o usa una macro per compilare i risultati.
  2. Quantificazione semi-automatizzata usando IHCAggreCount
    1. Carica e processa le immagini. Apri IHCAggreCount e clicca su Carica Immagine (Figura Supplementare 1).
      NOTA: L'applicazione IHCAggreCount è stata sviluppata dal nostro laboratorio come strumento scientifico autonomo progettato per semplificare e standardizzare la quantificazione degli aggregati cellulari da immagini microscopiche. Il software è stato realizzato interamente in Python utilizzando un'architettura modulare che separa la gestione delle immagini, l'elaborazione, le correzioni di selezione, il calcolo delle misure e altri ancora. IHCAggreCount è completamente compatibile con Windows 10 e Windows 11, così come con macOS 13 Ventura e macOS 14 Sonoma, ed è stato testato con successo su entrambe le piattaforme. Rispetto ai metodi manuali convenzionali di ispezione delle immagini, il software offre vantaggi analitici significativi: riduce la soggettività dell'utente, elimina i passaggi manuali ripetitivi, accelera l'elaborazione delle immagini, garantisce misurazioni riproducibili, consente un'estrazione coerente per regione di interesse e consente l'elaborazione batch di più ambienti. Nel complesso, l'applicazione offre un flusso di lavoro più rapido, oggettivo e robusto per il rilevamento e la quantificazione dei globuli rispetto all'approccio manuale tradizionale. La domanda è disponibile dagli autori su richiesta ragionevole.
    2. L'immagine apparirà nella visualizzazione originale dell'immagine. Naviga alla scheda Elaborazione. Applica HiLo per migliorare aggregati/contrasto di sfondo (vedi Figura Supplementare 2). Applicare una soglia di luminosità per filtrare gli aggregati dallo sfondo (Figura supplementare 3). Usa il filtro Dimensione Minima per rimuovere piccole particelle (rumore) (Figura Supplementare 4). Opzionalmente applicare la Soglia di Rotondità per escludere forme non aggregate (Figura Supplementare 5).
    3. Per il rilevamento degli aggregati IHC, vai alla scheda Generale e clicca su Calcola gli aggregati totali e Calcola l'area degli aggregati. Tutti gli aggregati rilevati sono evidenziati e elencati nella Matrix Table (ID, area, dimensione media; Figura supplementare 6).
  3. Correzioni manuali (opzionali)
    1. Vai alla scheda correzione, usa Smart Add per rilevare automaticamente aggregati in regioni selezionate (Figura Supplementare 8). Usa l'aggiunta manuale per etichettare manualmente gli aggregati. Usa Smart Delete per rimuovere le etichette indesiderate. (Gli aggregati evidenziati sono visualizzati per l'ispezione visiva; Figura supplementare 7).
  4. Risultati di esportazione
    1. Clicca su Esporta CSV per esportare i dati dell'immagine attuali. Clicca su Esporta Tutto per esportare dati in batch da più immagini analizzate. Analizza sempre le immagini con le stesse impostazioni di luminosità/contrasto e altri parametri (ad esempio, soglia) tra i gruppi sperimentali in IHCAggreCount.

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Risultati

Questo studio ha identificato con successo l'espressione di atassina-2 e DARPP-32 utilizzando il protocollo attuale. Dopo l'iniezione stereotassica di vettori lentivirali nello striato di topi C57BL/6J, è stata rilevata un'espressione robusta sia di atassina-2 di tipo selvatico che mutante dopo 12 settimane. Abbiamo già dimostratoa 12 che questi costrutti sono specifici dei neuroni, trasducendo di fatto una media di 20.000 neuroni per mm3. Nell...

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Discussione

Questo articolo descrive la generazione di un modello murino lentivirale striatali per una SCA polyQ. Descrive inoltre la produzione di vettori lentivirali ad alto titolo che codificano la forma selvatica ed espansa della proteina causale, e l'iniezione bilaterale delle LV nello striato del topo tramite chirurgia stereotassica. Inoltre, descrive la procedura di raccolta cerebrale, l'elaborazione istologica e la quantificazione basata su immagini dei segni distintivi della malatt...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

Il laboratorio di Clévio Nóbrega è finanziato dal progetto Cure CSB, dall'Associazione Viljem Julijan per i Bambini con Malattie Rare (Slovenia) e dall'Istituto di Ricerca del Centro Biomedico dell'Algarve (ABC-Ri). Alcuni degli autori di questo articolo hanno una borsa di dottorato finanziata dalla Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), con i seguenti riferimenti: Tiago Moreira-Gomes (2022.11008.BD), Inês T Afonso (2022.10161.BD) e Rafael G Costa (2022). 11973.BD).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0.9% NaClFornitore locale—Usato per la preparazione di miscele di anestesia e antagonisti
Piatti per coltura tissutale da 100 mmSPL Life Sciences11090
Kit ABC (Avidin-Biotin Complex)VECTASTAIN Elite
Atipamezolo (5,0 mg/mL)Fornitore locale—Antagonista della medetomidina
Centrifugatrice da banco--
Gabinetto di biosicurezza, Classe II (conforme BSL-2)--
Anticorpo secondario biotinilato--
Albumina sierica bovina (BSA)NZYTechMB47002
Sezioni cerebrali (ad esempio sezioni coronali da 30–40 µm) immunocolorate per DARPP-32--
Plugin Cell Counter (FIJI)Costruito / ImageJ—Strumento per il conteggio manuale degli aggregati
Incubatore CO2 (37 °C, 5% CO2, umidificato)--
Postazione di lavoroFornitore locale—Usato per l'elaborazione delle immagini e l'esecuzione del software
Tubi per ultracentrifugazione coniciBeckman Coulter358126
Tamponcini di cotoneFornitore locale—Usato per la rimozione del periostio
Criostato con supporto per dischi campione--
DAB (Diaminobenzidina)--
Lettore di coordinate stereotassiche digitaleStoelting/WPI51725Display digitale per la misurazione delle coordinate
DMEM (Medio di Eagle modificato di Dulbecco, glucosio alto)Gibco/Thermo Fisher11-965-092
Etanolo 70, 96 e 100%--
Etanolo, 70%Fornitore locale—Per la disinfezione del cuoio capelluto
Fentanil (0,05 mg/mL)Fornitore locale—Componente anestetico
Siero fetale bovino (FBS), inattivato termicamenteGibco/Thermo Fisher10500064
FIJI (distribuzione ImageJ)NIH / ImageJhttps://fiji.sc/Software open-source per la quantificazione manuale degli aggregati
Pinzette sottili (per pizzico del dito)Fornitore locale—Per il monitoraggio della profondità dell'anestesia
Flumazenil (0,1 mg/mL)Fornitore locale—Antagonista del midazolam
Pinzette e bisturiFornitore locale—Per la rimozione del periostio e l'esposizione del cranio
Seringhe microlitro/Gastight Hamilton 700/1700 SeriesHamilton / Fisher Sci.7653-01/10550203Per il caricamento della soluzione virale
Aghi rimovibili Hamilton con piccola imboccatura (26G)Hamilton / Fisher Sci.7804-03/ 10698205Per la somministrazione virale
Panno riscaldante (per roditori)Kent Scientific / SOMNIad esempio 04-777-177Per mantenere la temperatura corporea
Cellule HEK 293T (≤ passaggio 10, prive di micoplasmi)ATCC o equivalenteCRL-3216
Perossido di idrogeno--
Software IHCAggreCountFornito su richiestaN/ASoftware proprietario interno per il rilevamento e la quantificazione semi-automatizzati degli aggregati
Microscopio invertito (per confluenza cellulare)--
Miscelatore vortex da laboratorio--
Vettori lentivirali (WT e mutanti)Interno / Laboratorio centraleN/ASoluzione virale per iniezione
L-glutamina (200 mM)Gibco/Thermo Fisher25030081
Microscopio ottico con fotocamera (brightfield)--
Medetomidina (1,0 mg/mL)Fornitore locale—Componente anestetico
Microtrapano (compatibile con stereotassico)Stoelting / Fornitore locale—Per craniotomia
Pompa per microiniezione (ad esempio, Stoelting)Stoelting/WPI53210Pompa ad infusione automatizzata per iniezioni virali
Micropipetta (P1000, P200, P10) e punte--
Immagini al microscopio (sezioni IHC)Generate internamenteN/AImmagini di immunoistochimica da analizzare
Lamelle per microtomo (a basso profilo, monouso)--
Midazolam (5,0 mg/mL)Fornitore locale—Componente anestetico
Medium di montaggio--
Naloxone (0,4 mg/mL)Fornitore locale—Antagonista del fentanil
Porta-aghi e aghi per dissezione fine--
Siero di capra normale (NGS)--
Composto O.C.T.Tissue-Tek
Pomata oftalmica (Bepanthen Eye and Nose Ointment, 5% Dexpanthenol)Bayer11568-0053Previene l'essiccazione della cornea durante l'intervento
Miscelatore orbitale--
Kit ELISA p24ZeptoMetrix0801111
Parafilm--
Paraformaldeide (PFA)--
PBS--
PBS senza Ca2+/Mg2+, pH 7,0Gibco/Thermo Fisher10-010-031
pCMV-dR8.2AddgenePlasmid #12263
Penicillina-Streptomicina (100×)Gibco/Thermo Fisher15140122
Pentobarbital--
Fenilidrazina--
pMD2.G

Riferimenti

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