Saggio di profilazione trombonica: una piattaforma basata sulla microfluidica per caratterizzare in modo completo la trombogenesi biomeccanica

Summary

Questo lavoro descrive un saggio microfluidico che utilizza lo stress di taglio per innescare la formazione di trombo nel sangue e caratterizza il trombo tramite molteplici dimensioni di lettura. Il test può misurare la tendenza protrombotica dei campioni di sangue ed è quindi utile nella diagnosi di malattie, nella scoperta di farmaci e in studi meccanicistici di base relativi alla trombosi.

Abstract

La trombosi è una condizione patologica che descrive l'accumulo anomalo di piastrine e fattori di coagulazione in un vaso sanguigno. Sebbene molti studi si siano concentrati sull'attivazione piastrinica da parte degli agonisti solubili come meccanismo sottostante della trombosi, spesso è stato trascurato che il flusso sanguigno faciliti anche la formazione di trombosi. In particolare, nelle arterie, la trombosi è generalmente associata alla stenosi arteriosa, che aumenta lo stress di taglio nel flusso sanguigno e facilita il processo di trombogenesi, un fenomeno chiamato trombogenesi biomeccanica. Per molto tempo, non è stato disponibile alcun biosaggio per fornire approfondimenti dettagliati e completi sul processo di trombogenesi biomeccanica. Per affrontare questo problema, è stato sviluppato un saggio di profilazione del trombo combinando microfluidica con imaging a fluorescenza multicolore, che consente una caratterizzazione completa della trombogenesi biomeccanica con sette letture che coprono la dimensione e la composizione del trombo e il livello di attivazione piastrinica. Questo saggio di profilazione del trombo può essere utilizzato per valutare la tendenza protrombotica negli esseri umani e l'efficacia degli agenti antitrombotici, ed è anche utile per comprendere meglio i meccanismi alla base della trombosi arteriosa.

Introduction

La trombosi è una delle principali cause di malattie cardiovascolari, responsabile di milioni di decessi in tutto il mondo ogni^anno. Attualmente, non è disponibile alcun biosaggio in contesti clinici standard per valutare i rischi di trombosi. Tra i saggi ematologici commercializzati di laboratorio e al punto di cura, i saghi convenzionali di coagulazione e l'aggregometria si sono dimostrati inaffidabili nel prevedere la trombosi o eventi cardiovascolari avversi^{maggiori 2,3,4}. Il test globale di^{trombosi 5}, PFA-100/200⁶ e i saghi globali di^{coagulazione 7, 8, 9, 10, 11} hanno anch'essi dati limitati a supporto delle loro prestazioni.

Sulla base della comprensione attuale, il processo di trombogenesi è principalmente contribuito da tre meccanismi. Oltre ai due meccanismi convenzionalmente riconosciuti, ovvero l'aggregazione e coagulazione biochimica delle piastrine, un terzo meccanismo poco studiato e spesso sottostimato è l'aggregazione piastrinica guidata da taglio (shear-driven shear), definita anche "aggregazione piastrinica biomeccanica^"12,13. Nell'aggregazione piastrinica biomeccanica, l'elevato stress di taglio e il gradiente di taglio servono come principale motore per il reticolamento piastrino tramite fattore GPIbα-von Willebrand (VWF), integrina α_IIbβ 3-VWF e integrina α_IIbβ interazioni_{3-fibrinogene}. Nella trombosi arteriosa, l'aggregazione piastrinica biomeccanica probabilmente rappresenta il meccanismo più essenziale, considerando che è fortemente rafforzata dall'elevato flusso di taglio causato dalla stenosi arteriosa. Pertanto, la trombogenesi guidata dall'aggregazione biomeccanica delle piastrine fu definita 'trombogenesi ^{biomeccanica'12,14}.

In lavori precedenti, un metodo comune per osservare sperimentalmente l'aggregazione biomeccanica delle piastrine è il saggio di stenosi microfluidica, in cui un sito di stenosi grave viene inserito in un canale rettilineo. Quando il sangue viene perfuso sopra il canale sotto una tensione fisiologica di taglio della parete, si genera una tensione di taglio patologicamente elevata attorno al sito stenotico, che favorisce l'accumulo di piastrine per formare un trombo. Tuttavia, i lavori precedenti utilizzavano solo una singola lettura (per le piastrine, che riflette la dimensione del trombo) 15,16,17,18,19 o al massimo due (una per le piastrine e una per un altro biomarcatore) ^13,20, che quindi non sono in grado di ottenere una caratterizzazione completa del trombo.

Recentemente è stato sviluppato un saggio di profilazione a trombo, che incorpora immagini a fluorescenza multicolore nell'analisi di stenosi microfluidica, ottenendo un tracciamento in tempo reale di 7 biomarcatori (piastrine, livello di fibrinogeno, livello fattore von Willebrand, livello di espressione P-selectina, livello di esposizione alla fosfatidilserina, integrina estesa α_IIbβ_{livello 3} , integrina completamente attiva α_IIbβ₃ livello di espressione) in un trombo, che pone le basi per caratterizzare in modo completo la trombogenesi^{biomeccanica 21}. In questo lavoro sono forniti protocolli dettagliati sulla preparazione e l'esecuzione del test di profilazione del trombo, nonché sull'analisi dei dati correlata. L'hardware richiesto per il saggio include un microscopio a fluorescenza multicolore invertito e un sistema microfluidico. Il saggio utilizza una quantità relativamente piccola di sangue umano intero (meno di 2 mL), ha un'elevata costo-efficacia (~12 dollari per campione) e ottiene i risultati entro 30 minuti. Il test può rilevare con precisione le anomalie protrombotiche multidimensionali degli individui e valutare gli effetti degli agenti antitrombotici nel modificare dimensioni, composizione e stato di attivazione piastrinica del trombo, confermandone l'ampia applicazione sia per scopi di ricerca che clinici in^{futuro 21}. È importante notare che il test deve utilizzare sangue eparinizzato appena raccolto. Conservare il sangue a 4 °C o per oltre 6 ore, o usare anticoagulanti diversi dall'eparina, previene la formazione di trombo o produce risultati imprecisi.

Protocol

Questo protocollo segue le linee guida ed è stato approvato dal Comitato Etico della Ricerca Umana della University of Texas Medical Branch. L'impianto hardware sperimentale consiste in un dispositivo microfluidico, componenti per perfusione (connettori, tubo, siringa e pompa per siringa) e un microscopio rovesciato con componenti ottiche che permettono immagini a campo chiaro e a fluorescenza multicolore. Un faro multi-LED e un cubo filtro multi-passaggio sono utilizzati nel microscopio per suddividere 4 canali fluorescenti con un flusso reciproco minimo: eccitazione: 391/32, 479/33, 554/24, 638/31 ed emissione: 435/30, 519/25, 594/32, 695/58. Indossare dispositivi di protezione individuale, inclusi guanti, protezione per gli occhi e una giacca da laboratorio, per tutte le procedure sperimentali. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione dei dispositivi microfluidici

1. Progetta uno stampo master che contenga canali rettangolari (larghi 200 μm × alti 50 μm) che incorporino un sito con restringimento luminale dell'80%. Ogni canale ha prese e uscite dedicate per le connessioni dei tubi (Figura 1; vedi File Supplementare 1 per il file di progetto originale).
2. In base al design, si utilizza un wafer di silicio per fabbricare uno stampo master a fotoresist SU-8 tramite fotolitografia standard. Fissa lo stampo sul fondo di una piastra di Petri da 15 cm (Figura 2A).
3. Prepara la miscela PDMS mescolando la base prepolimerica e l'agente polimerico nel kit di elastomero in silicone con un rapporto di peso 10:1. Versa la miscela sullo stampo maestro (Figura 2B).
4. Posizionare la piastra contenente la miscela PDMS in un essiccatore a vuoto per degas ed eliminare le bolle d'aria intrappolate.
   NOTA: Mantenere la piastra sotto vuoto per almeno 2 ore finché le bolle non saranno completamente rimosse.
5. Polimerizzare termicamente la miscela PDMS incubandola a 75 °C per 2 ore.
6. Ritaglia con cura il PDMS polimerizzato dallo stampo master (Figura 2C,D) e suddividilo in singole unità di chip.
7. Crea l'ingresso e l'uscita perforando i fori nei punti designati usando un ago a sonda (Figura 2E).
   NOTA: Usa un spray ad aria compressa per rimuovere eventuali residui dai fori perforati. Per minimizzare la contaminazione superficiale, pulire i dispositivi PDMS usando nastro adesivo prima dell'adesione.
8. In una cappa chimica, spruzza etanolo al 75% su una salvietta per la lava e usa la salvietta bagnata per pulire e pulire i vetri. Lascia asciugare le vetrine del vetro.
9. In una cappa chimica, si trattano i vetrini di vetro e i chip PDMS con un generatore ad alta frequenza per 30 secondi e 20 secondi rispettivamente, poi allineano ciascun chip con un vetrino di vetro. Premi delicatamente la scheggia sulla superficie di vetro per poterla fissare.
   NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito in una cappa chimica perché il generatore ad alta frequenza produce ozono durante l'uso, dannoso per la salute.
10. Lega termicamente i dispositivi incubandoli a 150 °C per 15 minuti. Dopo il raffreddamento, i dispositivi saranno pronti all'uso (Figura 2F).
11. Conserva i dispositivi a temperatura ambiente in condizioni prive di polvere.
12. Usa una chela per rimuovere la parte di plastica degli aghi della sonda e piega i tubi metallici a 90°. Questi tubi piegati saranno utilizzati come connettori per i dispositivi microfluidici.

2. Preparazione dei sensori fluorescenti

NOTA: L'esperimento utilizza un totale di 7 sensori fluorescenti: SZ22-FITC, fibrinogeno-Alexa Fluor 405, 2.2.9-Alexa Fluor 555, AK4-Alexa Fluor 647, Annexin V-Pacific Blue, MBC 370.2-Alexa Fluor 555, PAC-1-Alexa Fluor 647. Tra questi, fibrinogeno, 2.2.9 e MBC 370.2 sono disponibili commercialmente solo in forma non coniugata e devono essere coniugati con fluorescenza in laboratorio.

1. Per coniugare fibrinogeno con Alexa Fluor 405:
   1. Prepara un tampone fresco di bicarbonato di sodio 0,1 M, pH 8,5.
   2. Diluire il fibrinogeno a 1 mg/mL in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM_{Na 2}HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4).
   3. Aggiungi 1/10 di volume di tampone di bicarbonato di sodio alla soluzione di fibrinogeno.
   4. Mescola 1 mL di fibrinogeno con 1 mg di Alexa Fluor 405 NHS-ester e incuba per 1 ora a temperatura ambiente su un rotatore. Proteggi dalla luce.
   5. Rimuovere il buffer di stoccaggio da una colonna di purificazione centrifugando la colonna a 1.100 × g per 2 minuti e scartare il flusso diretto. Carica la soluzione di reazione sulla colonna, monta la colonna su una fiala di raccolta compatibile e centrifuga a 1.100 × g per 5 minuti per raccogliere il fibrinogeno-Alexa Fluor 405.
   6. Usa uno spettrofotometro per misurare l'assorbanza a 280 nm (A₂₈₀; segnale proteico) e 405 nm (A₄₀₅; segnale di colorante). Calcola la concentrazione proteica e il rapporto F/P (fluorescenza: rapporto molare proteico).
      NOTA: Il rapporto F/P dovrebbe essere nell'intervallo 8-10.
   7. Conserva fibrinogeno-Alexa Fluor 405 a 4 °C al buio.
2. Per coniugare gli anticorpi 2.2.9 e MBC 370.2 con Alexa Fluor 555:
   1. Prepara un tampone fresco di bicarbonato di sodio 0,1 M, pH 8,5.
   2. Diluire il stock di anticorpi a 1 mg/mL in un tampone senza amimine.
   3. Aggiungi 1/10 di volume di bicarbonato di sodio alla soluzione di anticorpi.
   4. Mescolare 100 μL di anticorpo con 1 fiala (100 μg) di Alexa Fluor 555 NHS-ester e incubare per 1 ora a temperatura ambiente su un rotatore. Proteggi dalla luce.
   5. Rimuovere il buffer di stoccaggio da una colonna di purificazione centrifugando la colonna a 1.100 × g per 2 minuti e eliminare il flow-through. Carica la soluzione di reazione sulla colonna, monta la colonna su una fiala di raccolta compatibile e centrifuga a 1.100 × g per 5 minuti per raccogliere il 2.2.9- o MBC 370.2-Alexa Fluor 555.
   6. Usa uno spettrofotometro per misurare l'assorbanza a 280 nm (A₂₈₀; segnale proteico) e 555 nm (A₅₅₅; segnale di colorante). Calcola la concentrazione di anticorpi e il rapporto F/P (fluorescenza: rapporto molare degli anticorpi).
      NOTA: Il rapporto F/P dovrebbe essere nell'intervallo 1-1,5.
   7. Conserva 2.2.9- e MBC 370.2-Alexa Fluor 555 a 4 °C al buio.
      NOTA: Evitare l'eccessiva etichettatura - un alto rapporto F/P può compromettere la funzione biologica.

3. Raccolta di sangue da soggetti umani

NOTA: Questa procedura deve essere eseguita da personale medico qualificato (ad esempio, infermieri autorizzati, flebotomisti certificati). Inoltre, ottieni il consenso informato scritto dalle persone che partecipano allo studio.

1. Preparare la siringa aspirando 500 μL di buffer tirodico (12 mM_{NaHCO 3}, 10 mM Hepes, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 5,5 mM D-Glucosio, 0,5% albumina bovina bovina, pH 7,4) contenente 0,32 U/mL di eparina per 10 mL di sangue da prelevare.
2. Raccogli sangue tramite venpuntura. Usa una siringa vuota per raccogliere i primi 2 mL di sangue da scartare. Poi, si passa alla siringa contenente eparina per prelevare il campione di sangue. Tira lentamente la siringa per minimizzare l'attivazione delle piastrine.
3. Trasferire il sangue raccolto in un tubo centrifugo da 15 mL e mantenerlo sotto i 37 °C.
   NOTA: I campioni di sangue devono essere utilizzati per gli esperimenti entro 6 ore dalla prelieva.

4. Saggio di profilazione a trombo

NOTA: Si raccomanda di eseguire tutte le procedure che coinvolgono la gestione del sangue in un armadietto di biosicurezza ogni volta che è possibile per evitare fuoriuscite di sangue sull'sperimentatore. Se non è possibile, allora usa uno scudo antischizzo da banco.

1. Diluire il monomero VWF a 2 μg/mL nel PBS. Pre-rivestire i dispositivi microfluidici con monomero VWF e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
2. Incubare il campione di sangue con sensore fluorescente imposta 1 o 2 per 10 minuti a temperatura ambiente:
   1. Set 1: SZ22-FITC (0,5 μg/mL), fibrinogeno-Alexa Fluor 405 (60 μg/mL), 2,2,9-Alexa Fluor 555 (1 μg/mL), AK4-Alexa Fluor 647 (1 μg/mL).
   2. Set 2: SZ22-FITC (0,5 μg/mL), Annexin V-Pacific Blue (1 μg/mL), MBC 370.2-Alexa Fluor 555 (1 μg/mL), PAC-1-Alexa Fluor 647 (1 μg/mL).
      NOTA: Poiché due set di sensori devono essere utilizzati separatamente, ogni campione di sangue deve essere testato almeno due volte (una con il Set 1 e una con il Set 2) per ottenere un set completo di dati.
3. Collega un dispositivo microfluidico con connettori di presa e uscita e tubi. Collega l'altra estremità del connettore di ingresso con un tubo contenente PBS, e l'altra estremità del connettore di uscita con una siringa. Monta la siringa su una pompa per siringa. Montare il dispositivo microfluidico su un microscopio rovesciato e manovrare manualmente lo stadio per trovare il sito della stenosi sotto il microscopio (Figura 3A).
4. Riempi il canale microfluidico e il tubo con PBS usando la pompa della siringa a una portata di 0,5 mL/min. Assicurati che non ci siano bolle d'aria intorno al sito della stenosi.
5. Collega il tubo di ingresso al campione di sangue e perfondi il campione attraverso il canale microfluidico usando la pompa della siringa a una portata di 0,018 mL/min (Figura 3A).
6. Imposta il tempo di esposizione e il guadagno di ogni canale di fluorescenza. Esegui immagini a fluorescenza multicolore in tempo reale alternando tra i 4 canali, eccitando un tipo di fluoroforio alla volta. Nel frattempo, individuare il piano di messa a fuoco del trombo e registrare i segnali nel sito della stenosi, tipicamente per 15-30 minuti (Figura 4).
   NOTA: Il tempo di esposizione di ciascun canale deve essere regolato in modo che il segnale fluorescente sia facilmente distinguibile evitando la saturazione (Figura 4). Nel sistema attuale, i campioni di sangue dei soggetti sani tipicamente evidenziano il seguente intervallo di intensità del segnale all'interno del trombo formato: SZ22-FITC, 70-110; fibrinogeno-Alexa Fluor 405, 60-100; 2.2.9-Alexa Fluor 555, 70-110; AK4-Alexa Fluor 647, 45-75; Annexin V-Pacific Blue, 35-65; MBC 370.2-Alexa Fluor 555, 45-85; PAC-1-Alexa Fluor 647, 10-30. È in particolare, tuttavia, che una piccola percentuale di soggetti sani fornirebbe un risultato non tipico. Pertanto, si raccomanda di analizzare almeno 5 campioni di sangue di soggetti sani per assicurarsi che il tempo di esposizione per ciascun canale sia selezionato correttamente.

5. Analisi dei dati

1. Apri il file dati usando ImageJ 1.53 (Fiji, National Institutes of Health).
   NOTA: Ogni file dovrebbe contenere un totale di 4 video provenienti da 4 canali diversi. La procedura seguente è generalmente applicabile a qualsiasi momento in cui l'utente sia interessato ad analizzare.
2. Utilizzare il canale SZ22-FITC per identificare il contorno del trombo e usare le 'selezioni poligonali' per selezionare approssimativamente l'area del trombo (Figura 5A,B).
3. Per ogni canale, usa Immagine -> Regola -> Soglia per eliminare lo sfondo (Figura 5C), poi usa Analizza -> Misura per misurare l'area e l'intensità media del segnale all'interno del trombo.
   NOTA: SZ22-FITC colora le piastrine e quindi riflette la dimensione del trombo. Nel Set 1, il fibrinogeno-Alexa Fluor 405 riflette il livello di arricchimento del fibrinogeno, 2.2.9-Alexa Fluor 555 riflette il livello di arricchimento del fattore von Willebrand (VWF) e AK4-Alexa Fluor 647 riflette l'espressione della selezione P. Nel Set 2, Annexin V-Pacific Blue riflette l'esposizione alla fosfatidilserina (PS), MBC 370.2-Alexa Fluor 555 riflette l'attivazione dell'integrina α_IIbβ₃ nella conformazione estesa (E⁺ α_IIbβ₃), e PAC-1-Alexa Fluor 647 riflette l'attivazione completa dell'integrina_{α IIbβ 3} (Act. α_IIbβ₃)²¹.

Results

Il test di profilazione del trombo perfusa il sangue attraverso un canale stenotico per permettere la formazione di trombosi guidati da taglio e esegue immagini di fluorescenza multicolore in tempo reale per raccogliere informazioni multidimensionali sul trombo formato. Completando esperimenti utilizzando sia i sensori Set 1 che Set 2, si dovrebbe essere in grado di caratterizzare il trombo in aspetti quali dimensioni, arricchimento delle proteine reticolanti (fattore di von Willebrand, ...

Discussion

Combinando il saggio di stenosi microfluidica con l'imaging a fluorescenza multicolore, il saggio di profilazione del trombo offre un approccio comodo e potente per studiare la trombogenesi biomeccanica e la meccanobiologia piastrinica. Nel frattempo, il saggio è utile in una vasta gamma di applicazioni. Ad esempio, può essere utilizzato per selezionare agenti antitrombotici che inibissero specificamente l'aggregazione biomeccanica delle piastrine, dove il bersaglio molecolare e il mecca...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Siringhe da 10 mL	Henke Sass Lupo	5100-X00V0	Raccolta di campioni di sangue
Tubi falcon da 15 mL	Genesee Scientific	28-101	Conservazione dei campioni di sangue
Siringa di vetro ermetica da 1 mL	Hamilton	81331	Assemblaggio hardware
2.2.9	MERU VasImmune		Colorazione a trombo
Aghi sonda 20 X1/2	McMaster-Carr	M919	Creazione di dispositivi PDMS
Siringhe da 20 mL	Henke Sass Lupo	5200-X00V0	Raccolta di campioni di sangue
70% etanolo	Sigma-Aldrich	EX0281-1	Disinfezione delle siringhe ermeche e pulizia delle vetrine in vetro
AK4-Alexa Fluor 647	BioLegend	304918	Colorazione a trombo
Alexa Fluor 405 NHS Ester	Invitrogen	A30000	Marcatura dei fibrinogeni
Kit di marcatura degli anticorpi Alexa fluor 555	Invitrogen	A88065	Etichettatura MBC 370.2 e 2.2.9
Annexin V-Pacific Blue	Invitrogen	501121505	Colorazione a trombo
Detergente	Deposito Uffici	911245	Creazione di dispositivi PDMS
Set di coltelli da hobby artigianali con scatola di legno	Lamelle Excel	44282	Creazione di dispositivi PDMS
Acqua deionizzata	ThermoFisher Scientific	751-628	Lavaggio delle siringhe gasserette
Essiccatore	Bel Art	F420270000	Degasaggio PDMS
Spatula di laboratorio monouso polifunzionale	LevGo	17211	Miscelazione della base elastomerica in silicone e dell'agente di polimerizzazione
Colonna di filatura per la rimozione di coloranti e biotina	Zeba	A44296S	Marcatura dei fibrinogeni
Fibrinogeno	Ricerca innovativa	IHUFBG25MG	Colorazione a trombo
Pompa a siringhe Fusion 200-X	Chemyx Inc.	0720X	Assemblaggio hardware
Eparina	Sigma-Aldrich	H3149	Anticoagulazione del campione di sangue
Generatore ad alta frequenza	Electro-technic product Inc.	BD-20	Creazione di dispositivi PDMS
Monomero VWF umano	Sino Biological Inc.	10973-H08C	Rivestimento microfuidico per dispositivi
Software Image J v1.53	Fiji, Istituto Nazionale di Salute		Analisi dei dati
Microscopio rovesciato	Leica	IL HA GUIDATO IL DM; cubo filtro: Leica DFT51010; Faro: LED5	Assemblaggio hardware
Kimwipes	Kimberly-Clark Professionista	34120	Pulizia delle vetrine di vetro
Cappucci Luer lock	International Medical Industries, Inc.	57100B	Raccolta di campioni di sangue
MBC 370.2	Kerafast	EBW104	Colorazione a trombo
Vetrali per copertura microscopica	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	ES0107222	Creazione di dispositivi PDMS
Raschietto a mini-lametta	Stanley	28-100	Creazione di dispositivi PDMS
NanoDrop 2000 Spettrofotometro UV-Vis	Thermo Scientific	ND-2000	Concentrazione proteica e misurazione del rapporto F/P
Forno	Strumenti di laboratorio	3512	Creazione di dispositivi PDMS
PAC-1-Alexa Fluor 647	BioLegend	362806	Colorazione a trombo
Bicchiere di plastica	ThermoFisher Scientific	S04589	Miscelazione della base elastomerica in silicone e dell'agente di polimerizzazione
SU-8 fotoresist master  Muffa	Struttura Cleanroom Nano3 Nano3 della UC San Diego		Creazione di dispositivi PDMS
Kit Elastomero in Silicone Sylgard 184	Krayden Dow	DC4019862	PDMS
SZ22-FITC	Beckman Coulter	IM 1756U	Colorazione a trombo
Tubi	Cole - Palmer Instrument Co.	06422-01	Assemblaggio hardware