Articolo metodologico

Analisi dei traccianti isotopici stabili della vitamina A utilizzando LC-MS/MS

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DOI:

10.3791/69558

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30 dicembre 2025

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1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Newcastle University Centre for Cancer, 3Fera Science Ltd

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per quantificare simultaneamente sia i retinoidi marcati isotopicamente sia quelli nativi nel plasma umano, utilizzando LC-MS/MS, con limiti di rilevamento di 6 fmol in colonna. Il metodo incorpora una semplice procedura di estrazione del campione e un breve tempo di esecuzione analitico, consentendo un'elevata produttività dei campioni.

Abstract

Il metodo della diluizione isotopica del retinolo (RID) stima le riserve totali corporee (TBS) di vitamina A nell'uomo tramite diluizione stabile degli isotopi con il pool di vitamina A del corpo. Per questo, è fondamentale determinare in modo accurato ed efficiente il rapporto isotopico plasmatico tra retinolo marcato e non marcato tramite spettrometria di massa. Per evitare procedure di estrazione e/o purificazione estese e lunghe, come HPLC preparativa e derivatizzazione, si impiega LC-MS/MS per condurre analisi rapide, sensibili e simultanee di retinoidi marcati e non marcati. Il metodo utilizza due livelli di rilevamento: (i) una separazione iniziale massa/carica (m/z) degli ioni genitori (precursori), seguita da (ii) la rilevazione di ioni figli frammentati (prodotto). Questo comporta un'elevata sensibilità, con limiti di rilevamento del retinolo bassi fino a 6 fmol in colonna. Nonostante i vantaggi della spettrometria di massa tandem, è necessaria una separazione cromatografica liquida per separare il retinolo dagli esteri retinilici, poiché i gruppi funzionali terminali vengono persi durante l'ionizzazione, risultando in pattern di frammentazione genitori (m/z di 269) e figli di ioni simili. L'articolo descrive l'isolamento del retinolo endogeno e marcato (13C o 2H) dal plasma tramite estrazione con solvente, seguito dalla quantificazione tramite LC-MS/MS sotto ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI) in modalità ionica positiva.

Introduzione

La vitamina A è un nutriente liposolubile essenziale per la saluteumana 1. La carenza di vitamina A aumenta la suscettibilità a gravi morbilità infettive e mortalità e si stima che abbia una prevalenza globale del 29%, con livelli più elevati nell'Africa subsahariana (48%) e nel Sud Asia (44%)2. L'integrazione di vitamina A è una strategia efficace per ridurre la mortalità infantile eccessiva, in particolare in aree ad alto rischio come l'Africasubsahariana. Tuttavia, l'introduzione di integrazione semestrale di vitamina A insieme alla fortificazione su larga scala di vitamina A degli alimenti base e alla distribuzione di polveri di micronutrienti, spesso gestite da diversi enti pubblici e privati, ha il potenziale di esporre gli individui a un'assunzione eccessiva di vitaminaA 4,5,6,7,8,9,10 . Pertanto, i biomarcatori della vitamina A dovrebbero idealmente coprire l'intero spettro dello stato della vitamina A, dalla carenza alla tossicità. Il metodo di diluizione isotopica del retinolo (RID) è attualmente il metodo indiretto più accurato per valutare le immagazzini totali di vitamina A nell'uomo 11,12,13 ed è stato convalidato rispetto alle concentrazioni epatiche di vitamina A, considerate il miglior marcatore biochimico dello stato di vitamina A 14,15. Il metodo si basa sul principio che una dose orale di tracciante di vitamina A stabile marcata da isotopi si mescola con la vitamina A non etichettata (la traccia) in bacini corporei intercambiabili. La misurazione dell'attività specifica del retinolo plasmatico (cioè il rapporto tra tracciante di retinolo marcato e retinolo totale nel plasma (tracciatore/tracciato nel plasma)) in un momento specificato dopo la somministrazione consente di stimare lo stato della vitamina A utilizzando un'equazioneRID 11,12,13.

Per determinare concentrazioni accurate e precise sia di tracciante di retinolo che di tracee nel plasma, sono stati applicati vari metodi per quantificare la vitamina A stabile marcata con isotopi, tra cui cromatografia gassografica-spettrometria di massa (GC-MS), spettrometria a rapporto isotopico di massa (IRMS) e cromatografia liquida spettrometria tandem di massa (LC-MS/MS)16,17,18,19,20,21,22,23, 24, 25, 26. È importante sottolineare che LC-MS/MS combina alta sensibilità, specificità e semplicità operativa con la capacità di misurare direttamente sia il retinolo nativo che quello marcato in matrici complesse. Pertanto, per evitare una preparazione lunga del campione, come la cromatografia liquida ad alte prestazioni preparativa (HPLC) per IRMS o la derivatizzazione per GC-MS, l'analisi LC-MS/MS è una scelta ideale poiché questo metodo prevede una procedura di estrazione semplice, limiti di rilevamento molto bassi per isotopi stabili e tempi di esecuzionebrevi 7,18,19. Qui presentiamo un metodo LC-MS/MS aggiornato con tempi di esecuzione più brevi, flussi di lavoro semplici combinati con alta sensibilità e selettività, come metodo altamente adatto per l'analisi ad alto rendimento di campioni provenienti da studi di intervento umano su larga scala e osservazioni, dove è necessaria la determinazione delle riserve totali di vitamina A nel corpo.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal Research Ethics Board dell'Università delle Filippine, Manila (IRB ID: UPMREB 2016-282-01), dal Institutional Review Board della UC di Davis (IRB ID: 903681-2) ed è stato registrato presso ClinicalTrials.gov (ID: NCT03030339). Lo studio è stato approvato dal Comitato di Revisione Etica dei Servizi Sanitari del Ghana (GHS-ERC 012/07/20) e lo studio è stato registrato a https://clinicaltrials.gov come NCT04632771.

1. Preparazione di standard interni

  1. Soluzione standard interna standard: Preparare la soluzione interna a una concentrazione di 1 mg/mL di acetato di retinile in etanolo contenente 0,1% di idrossitoluene butilato (BHT; w/v). Dividere le soluzioni stock in aliquote e conservarle a -80 °C per un massimo di 3 mesi.
    NOTA: Per lo standard interno, è fattibile utilizzare acetato di retinile non marcato o acetato di retinile etichettato. Se viene utilizzato uno standard non etichettato di acetato di retinil, è fondamentale ottenere una risoluzione di base dei picchi di acetato di retinil e retinolo (vedi Figura 1).
  2. Soluzione di lavoro standard interna: Preparare una soluzione di lavoro standard interna diluendo lo standard standard di stocco (1 mg/mL) a 1 μg/mL. Prima diluire 60 μL dello standard stock con 300 μL di etanolo, seguita dalla diluizione di 60 μL di questa soluzione in 10.000 μL di etanolo. Per ogni campione vengono aggiunti 20 μL della soluzione standard interna di lavoro, contenente 20 ng di acetato-retinile.
    NOTA: Le soluzioni standard interne possono essere conservate a -20 °C per un massimo di 1 settimana.

2. Preparazione di standard di calibrazione

  1. Standard di calibrazione: Preparare le soluzioni standard di calibrazione a una concentrazione di 1 mg/mL di retinolo in etanolo contenente 0,1% BHT (p/v) sia per la traccia che per il tracciatore. Soluzioni di stocco in alluminio e conservare a -80 °C per un massimo di 3 mesi. Usa ogni aliquota solo una volta per evitare cicli di congelamento-disgelo.
  2. Soluzione di lavoro standard di calibrazione: Prelevare 100 μL della soluzione standard di calibrazione e diluire con 10.000 μL di etanolo in una fiaschetta volumetrica. Determinare la concentrazione della soluzione di calibrazione diluita a 325 nm in uno spettrofotometro utilizzando una cuvetta di quarzo (vedi Tabella 1 per i dettagli).
  3. Prendi un'aliquota dello standard di calibrazione diluito e regola la concentrazione a 8 μM per la traccia e a 2 μM per il tracciatore usando 50% etanolo e 50% acetonitrile/dH 2O (70:30 (v/v).
  4. Prepara standard di calibrazione duplicati a sette diverse concentrazioni utilizzando il 50% di etanolo e il 50% di acetonitrile/dH 2O (70:30 (v/v). Se vengono estratti 200 μL di plasma, gli standard di calibrazione a traccia dovrebbero variare da 6 μM a 0,03 μM, mentre gli standard di calibrazione dei tracer dovrebbero variare da 0,5 μM a 0,004 μM.
    NOTA: Per una quantificazione accurata, retinolo ed esteri retinilici marcati isotopicamente nel plasma vengono quantificati utilizzando curve di calibrazione duplicate a 7 punti27. Il punto più alto sulla curva di calibrazione (il doppio della concentrazione attesa più alta di traccia e tracciante nel plasma) considera il fattore di concentrazione dell'estratto ricostituito dal volume originale del plasma.

3. Estrazione dei retinoidi dal plasma

  1. Preleva campioni di plasma dal congelatore a -80 °C e scongela a temperatura ambiente (circa 30 minuti).
  2. Una volta scongelato, si vortice ogni campione e si fa girare per qualche secondo per assicurarsi che non rimanga plasma nel coperchio. Successivamente, mettere i campioni sul ghiaccio.
  3. Accendi una centrifuga refrigerata e lasciala raffreddare a 4 °C. Etichettare tubi di vetro da 15 mL con tappi a vite (ID soggetto e momento del tempo) e una pipetta di 200 μL di acqua deionizzata (dH2O) in ogni tubo campione.
  4. Dalla soluzione di lavoro standard interna, si pipettano 20 μL della miscela standard interna nel tubo di vetro.
  5. Utilizzando una pipetta, erogare 200 μL di plasma nel rispettivo tubo contenente lo standard interno edH 2O.
  6. Pipetta 400 μL di etanolo in ogni tubo campione e fai roteare il tubo per mescolare l'etanolo con il plasma. Non fare vortici per evitare che residui proteici si attacchino alla parete di vetro.
  7. Per la prima estrazione dell'esano, aggiungi 2 mL di esano a ogni tubo e fissa saldamente i coperchi.
  8. Metti i tubi in uno shaker orbitale e agita a 15.000 giri/min per 30 minuti. Trasferire i tubi in una centrifuga refrigerata e far girare a 1.800 x g per 10 minuti a 4 °C.
  9. Utilizzando pipette Pasteur di vetro, trasferisci il surnante in un set pulito di provette di vetro etichettate. Fai attenzione a non trasferire proteine, precipitati o acqua.
  10. Produrre una seconda estrazione di esano aggiungendo ulteriori 2 mL di esano al residuo residuo, chiudere saldamente i coperchi dei tubi e posizionare i tubi nello shaker orbitale e agitare a 15.000 giri/min per 15 minuti.
  11. Trasferire i tubi in una centrifuga refrigerata e far girare a 1.800 x g per 10 minuti a 4 °C. Utilizzando pipette Pasteur di vetro, trasferire il sovrantantante nella provetta di vetro contenente il sovrantantante della prima estrazione di esano (passo 3.9) per ogni campione, rispettivamente.
  12. Evaporare il solvente combinato di estrazione esano (primo e secondo soprandanante per ogni campione) sotto un flusso delicato di N2 in una cappa fumaria scurata per circa 30 minuti. Imposta il blocco riscaldante a 35 °C.
  13. Risospendere il residuo essiccato in 50 μL di etanolo, vortice brevemente e aggiungere 50 μL di fase mobile (70:30 acetonitrile/dH 2O (v/v)) e di nuovo vortice.
    NOTA: La risospensione del residuo essiccato dovrebbe essere eseguita utilizzando 100 μL di etanolo solo se l'obiettivo è quantificare gli esteri retinilici.
  14. Trasferisci in tubi microcentrifuga etichettati da 0,5 mL. Centrifuga a 16.900 x g per 5 minuti.
  15. Trasferire 80 μL del residuo ricostituito su fiale HPLC ambrate con inserti da 300 μL. Tappa immediatamente la fiala per evitare la perdita di solvente dovuta all'evaporazione.
  16. Trasferire le fiale di vetro in una criocassetta, etichettarle con il nome dello studio, la data di estrazione e gli ID del campione, e conservarle in un congelatore a -80 °C fino all'analisi.
    NOTA: L'analisi dei campioni conservati deve essere completata entro 3-5 giorni. Un volume plasmatico di 200 μL è normalmente sufficiente per rilevare il tracciante di vitamina A marcato fino a 90 giorni dopo la dose. Tuttavia, il volume del plasma può essere regolato a 400 μL se i rapporti plasma/acqua/etanolo sono mantenuti a 1:1:2 in volume.

4. Preparazione di campioni di controllo standard interni

  1. Preparare la soluzione di etanolo/fase mobile pipettando 120 μL di etanolo in un tubo microcentrifuga e aggiungendo 200 μL di acetonitrile/dH 2O (v/v) e vorticinge.
  2. In tre tubi separati da 0,6 mL, si pipettano 20 μL della soluzione di lavoro standard interna.
  3. Aggiungere 80 μL di etanolo/soluzione di fase mobile preparata e vortice. Trasferire i tre campioni di controllo standard interni su fiale HPLC ambra con inserti da 300 μL e chiudere immediatamente le fiale per evitare la perdita di solvente dovuta all'evaporazione.

5. Standard per case plasma

  1. Per preparare i campioni standard domestici, si ottiene un volume di plasma sufficiente da permettere l'analisi di almeno tre campioni per ogni prova analitica. Il volume totale di plasma richiesto è determinato dal numero di campioni da analizzare.
  2. Le aliquote contengono plasma standard in piccoli cryovial ai volumi necessari per ogni prova analitica e conservano a -80 °C.
    NOTA: È fondamentale che lo standard interno contenga il tracciatore di retinolo marcato con isotopi utilizzato nei campioni sconosciuti. Materiale sufficiente può essere ottenuto concentrando campioni di volontari in un'unica aliquota.
  3. Estrarre almeno tre campioni standard di plasma per ogni analisi al volume stesso dei campioni di plasma sconosciuti, come fatto nel passo 3.
  4. Posiziona gli standard della casa del plasma in tutto il rack dei campioni con almeno 10 campioni di plasma sconosciuti tra di essi. Utilizzare gli standard delle case plasma per calcolare le variazioni intra- e inter-giornate.

6. Campioni standard esterni

  1. Ottenere campioni certificati esterni standard e conservarli a -80 °C. Uno standard esterno certificato ampiamente utilizzato è il NIST Standard Reference Material SRM 968.
  2. Estrarre almeno quattro campioni standard esterni di plasma per analisi allo stesso volume di campioni di plasma sconosciuti utilizzando il passo 3. Utilizzare campioni standard esterni per verificare l'accuratezza dei risultati ottenuti.

7. Ottimizzazione manuale dei composti

  1. Assicurati che la sonda APCI Heat Nebulizer sia installata nell'alloggiamento della sorgente MS. Preparare la soluzione di infusione per ogni tracciante isotopico stabile a circa 1 μg/mL.
    NOTA: La soluzione dovrebbe essere simile alla fase mobile e contenere un po' di acido per la protonazione. Un buon solvente da usare sarebbe 1:1 acetonitrile/dH 2Ocon acido formico (v/v) allo 0,1%.
  2. Riempi una siringa Luer-lock Hamilton da 1 mL con la soluzione d'infusione, poi collega la siringa alla sorgente con il tubo PEEK tramite l'unione di messa a terra. Imposta la portata d'infusione a 10 μL/s.
  3. Seleziona Accordatura Manuale e assicurati che lo strumento sia in modalità Accordatura e Calibrazione. Avvia la pompa della siringa e seleziona Q1 Scan Type in modalità positiva.
  4. Imposta un intervallo di massa inferiore di 50 Da, e un intervallo superiore di circa 100 Da sopra la massa molecolare del composto bersaglio.
  5. Imposta i cicli a 500, velocità di scansione 200 Da/s. Clicca Start e osserva il segnale nella finestra degli spettri di massa.
  6. Aspetta che il segnale si stabilizzi, poi controlla che compaiano i picchi attesi m/z. Consideriamo i picchi [M+H]+ e [M+2H]2+ poiché la MS è in modalità positiva.
  7. L'altezza massima target dovrebbe essere intorno a 1e6. La corrente ionica totale (TIC) dovrebbe essere 1e7-1e9. Continua a infondere finché il segnale non è stabile, poi clicca su Stop. Dovrebbe esserci un picco distinto con alta intensità formato dal composto nella soluzione d'infusione. Viene visualizzata la corrente totale degli ioni (TIC), che mostra il segnale totale per tutti gli ioni messi insieme.
    NOTA: la massa attesa di 12C Retinolo è 269 Da, quindi un intervallo di 50-300 Da è appropriato per mostrare gli ioni [M+H]+ e [M+2H]2+ .

8. Scansione degli ioni prodotto (MS2) / controllo degli spettri CE

  1. Imposta la massa iniziale a una massa inferiore, ad esempio 50 Da, e la massa di Stop appena sopra la massa Q1 (ad esempio, 269,1 per il retinolo 12C). Imposta i cicli a 5 e cambia l'energia di collisione (CE) a 10. Controlla la massa Q1 come ione precursore. Se non compaiono frammenti più piccoli, aumentare CE a 20.
  2. Man mano che la CE aumenta, si formeranno più ioni prodotto. Continuare ad aumentare la CE finché lo ione precursore a destra dello spettro non è completamente sparito. Aumentare ulteriormente il CE per vedere una possibile frammentazione secondaria.

9. Scansione MRM

  1. Dalla scansione MS2, seleziona i tre ioni prodotto più abbondanti o più appropriati da portare avanti per ulteriori ottimizzazioni.
  2. Per ogni ione prodotto, inserisci la massa Q1 (precursore) e le masse Q3 (prodotto) trovate. Imposta il tempo di permanenza a 200 ms. Nomina ogni frammento di conseguenza (ad esempio, 12C_Frag_93).
  3. Seleziona l'energia di collisione e identifica il valore CE ottimale utilizzando la funzione rampa. Popola la colonna CE con il valore CE ottimizzato per ogni frammento.
  4. Ottimizzare il Potenziale di Declustering (DP) ottimizzato dopo aver ottimizzato la CE per minimizzare le interferenze isobariche. Ottimizzare il Potenziale di Uscita della Cella di Collisione (CXP) per una transizione alla volta.

10. Ottimizzazione sorgente/gas

  1. Questi parametri non possono essere ottimizzati automaticamente. Se devi migliorare l'intensità del segnale, esegui un processo di ottimizzazione manuale. Cambia un parametro alla volta e confronta se il segnale è aumentato, rimasto lo stesso o diminuito.

11. Condizioni della cromatografia liquida

  1. Per la cromatografia, utilizzare un gradiente di fase binario mobile dello 0,1% (v/v) di acido formico indH 2O (A) e 0,1% (v/v) di acido formico in acetonitrile (B).
  2. A seconda del sistema LC applicato, si utilizza una colonna ABZ PLUS da 100 mm x 2,1 mm (3 μm) dotata di una cartuccia C18 da 4 mm x 2 mm (per HPLC), oppure una Premier BEH Shield da 100 mm x 2,1 mm (1,7 μm) dotata di una colonna FIT RP18 (per cromatografia ad ultra-alta pressione (UPLC)) per l'analisi del retinolo. Mantenere le colonne a una temperatura rispettivamente di 40 °C o 50 °C.
  3. Iniettare 10 μL dell'estratto di plasma sulla colonna. Analiti eluti a una portata di 0,4 mL/min. Per i sistemi HPLC, il gradiente lineare è: 60% B a 95% B in 6,0 minuti; 100% B da 6,1 min a 13,0 min; 100% B al 60% B da 13,1 a 14,0 min; e 60% B da 14,0 a 17,0 min. Per i sistemi UPLC, il gradiente lineare dipende dalla domanda di ricerca. Se si determina solo il retinolo, il gradiente è: 40% B - 60% B in 1,0 min; 60% B a 95% B da 1,0 min a 6,0 min; 100% B da 6,5 minuti a 7,5 minuti; 100% B al 40% B da 7,5 a 7,6 minuti; e 40% di B da 7,6 a 8,5 min. Se l'obiettivo è anche analizzare i retinil-esteri insieme al retinolo, il gradiente lineare è: 60% B - 95% B in 3,0 minuti; 100% B da 3,5 minuti a 6,5 minuti; 100% B al 60% B da 6,5 a 7,0 min; e 60% di B da 7,0 a 8,5 minuti.

12. Condizioni MS/MS

  1. Eseguire analisi MS/MS sotto ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI) in modalità ionica positiva. L'APCI è scelto rispetto all'ionizzazione elettrospray perché fornisce un'intensità di segnale più alta, un intervallo lineare più ampio e un rumore di fondoinferiore 26.
  2. Per le rispettive transizioni di massa per [12C]retinolo, [13C10]retinolo e [2H6]retinolo e i rispettivi esteri/acetato con parametri selezionati di monitoraggio della reazione (SRM) per il API4000 e lo spettrometro di massa QTRAP 5500, controllare la Tabella 2, la Tabella 3 e la Figura 2.
    NOTA: Il monitoraggio selezionato degli ioni per retinolo, esteri retinilici e acetato di retinile ha riguardato lo stesso frammento di ione m/z 269 per la quantificazione APCI, poiché questo ione corrisponde alla perdita di acqua, acidi grassi o acidi acetici dalle molecole protone. Poiché il LC-MS/MS è in grado di separare i picchi del retinolo dai suoi esteri, una singola iniezione consente di determinare l'arricchimento isotopico sia nelle frazioni di retinolo che di quelle di retinil-esteri in un unico campione.

13. Quantificazione del retinolo

  1. Quantificare le concentrazioni di campioni di retinolo [12C], [2H6] e [13C10] di retinolo rispetto ai rispettivi standard di calibrazione.
  2. Determinare le perdite di estrazione utilizzando il recupero delle concentrazioni standard interne per ciascun campione rispetto ai campioni di controllo standard interno.
  3. Effettuare la conferma delle concentrazioni plasmatiche di retinolo utilizzando il materiale di riferimento standard del National Institute of Standards and Technology (NIST) (SRM) 968.

Risultati

Per illustrare l'efficacia del metodo analitico nell'analizzare il retinolo stabile marcato da isotopi in diversi sistemi cromatografici, presentiamo i risultati di due studi differenti.

Per l'utilizzo del API4000 con HPLC iniziale, sono stati analizzati campioni di plasma di 111 bambini filippini di età compresa tra 12 e 18 mesi, che hanno ricevuto una dose orale di 400 μg (1,17μmol) [13 C10] acetato di retinil al giorno 0, seguiti da una raccolta di 6 mL di sangue a 4 giorni dalla dose, 7,28. Le concentrazioni medie plasmatiche totali di retinolo erano 1,1 μmol/L, e la media [13C10] di retinolo era di 0,007 μmol/L. Poiché il livello di rumore di fondo nella transizione m/z 279-100 aveva un'altezza media massima di ~50 cps (Figura 1), il livello di rilevamento (LOD) e di quantificazione (LOQ) per [13C10] retinolo erano fissati a 150 cps e 500 cps, corrispondenti rispettivamente a 6 fmol e 19 fmol sulla colonna. Poiché si otteneva una buona risoluzione di base tra il retinolo [12C] e lo standard interno applicato di acetato-retinile, non era necessario utilizzare un acetato-retinilo stabile marcato con isotopi.

Una separazione cromaticografica più rapida può essere ottenuta utilizzando UPLC in combinazione con il QTRAP 5500, con tempi di esecuzione inferiori a 10 minuti. A seconda della domanda di ricerca, possono essere applicati due diversi metodi di separazione; (i) se l'obiettivo è determinare il retinolo marcato come nativo e quello con isotopi applicato con uno standard interno non marcato di acetato-retinile, i tempi di ritenzione tra retinolo (4,37 min) e retinil-acetato (5,33 min) garantiscono una buona separazione di base (Figura 3); (ii) se l'obiettivo è separare il retinolo marcato da quello nativo e quello isotopico insieme agli esteri retinilici nativi e marcati, una buona separazione può essere raggiunta in una corsa di 8,5 minuti (Figura 4). Tuttavia, a causa dei tempi di ritenzione stretti tra retinolo (2,10 min) e acetato di retinile (2,43 min), è consigliabile utilizzare acetato di retinile marcato isotopicamente ([2H4] acetato di retinile). In questo esempio, sono stati analizzati campioni di siero su 80 donne ghanesi in età riproduttiva che hanno ricevuto una dose equivalente di retinolo di 2 mg di [2H6] acetato, seguita da un prelievo di sangue a 21 giorni dalla dose. Le concentrazioni medie di retinolo totale in siero erano di 1,89 μmol/L, con retinolo medio [2H6] a 0,027 μmol/L e retinolo medio [13C10] a 0,025 μmol/L.

Il metodo presentato ha raggiunto un basso livello di rilevamento (LOD = 6 fmol; LOQ = 19 fmol sulla colonna), dimostrando alta sensibilità e specificità nel rilevare il retinolo stabile marcato con isotopi con una netta separazione di base tra retinolo nativo e standard interni. Inoltre, il metodo ha funzionato efficacemente sia con le configurazioni HPLC che UPLC, nonostante le differenze nei tempi di conservazione. L'uso di standard interni marcati isotopicamente ([2H4] acetato di retinile) ha garantito una quantificazione accurata in condizioni UPLC più rapide, se fosse necessario determinare gli esteri di retinil. La validazione rispetto agli standard di riferimento certificati dal NIST ha confermato accuratezza, mentre i coefficienti di variazione intra-giornati e inter-giornalieri (rispettivamente 2,3% e 4,4%) hanno dimostrato eccellente precisione e riproducibilità. L'analisi riuscita di campioni di plasma/siero provenienti da due popolazioni distinte (bambini filippini e donne ghanesi) con diversi protocolli di dosaggio mostra robustezza e utilità pratica in studi nutrizionali diversi.

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Figura 1: Cromatogramma LC-MS/MS usando lo spettrometro di massa API4000. Il cromatogramma del retinolo sirico è stato ottenuto 4 giorni dopo l'assunzione orale di 0,4 mg di [13C10] acetato di retinile. Il monitoraggio selezionato della reazione (SRM) di m/z 269-93 mostra la separazione del retinolo [12C] (RT = 5,06 min) e [12C] acetato di retinile (RT = 5,83 min) come standard interno (IS). Il segnale del retinolo [13C10] a m/z 279-100 supera adeguatamente sia il limite di rilevamento (LOD) sia il limite di quantificazione (LOQ). Condizioni cromatografiche: (A) gradiente di fase binario della fase mobile dello 0,1% (v/v) acido formico in dH2O e (B) 0,1% (v/v) acido formico in acetonitrile; portata di 0,4 mL/min con una pendenza lineare da: 60% B a 95% B in 6,0 min; 100% B da 6,1 min a 13,0 min; 100% B al 60% B da 13,1 a 14,0 min; e 60% B da 14,0 a 17,0 min; Colonna ABZ PLUS da 100 mm x 2,1 mm (3 μm), equipaggiata con una cartuccia C18 4 mm x 2 mm mantenuta a 40 °C. Clicca qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 2: Spettri di massa ionici prodotti APCI-MS/MS. Spettri di massa ionici APCI-MS/MS prodotti a flusso di (A) m/z 269 [12C] retinolo, (B) m/z 273 [2H4] retinolo, (C) m/z 275 [2H6] retinolo, e (D) m/z 279 [13C10] retinolo in modalità ionica positiva. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Cromatogramma LC-MS/MS usando lo spettrometro di massa QTRAP 5500. Cromatogramma LC-MS/MS di un tipico estratto da plasma standard campionato 21 giorni al giorno dopo l'assunzione orale di 1,0 mg di acetato di retinile [2H6] e a 90 giorni dopo l'assunzione orale di 1,0 mg di acetato di retinile. Il monitoraggio selezionato della reazione (SRM) di m/z 269→93 mostra il picco di retinolo [12C] (RT = 4,37 min) e l'acetato di retinile (RT = 5,33 min) come standard interno (IS); il retinolo [2H6] (RT = 4,36 min) a m/z 275→96; e il picco del retinolo [13C10] (RT = 4,38) a m/z 279→100. Condizioni cromatografiche: (A) gradiente di fase binario delle cellule mobili dello 0,1% (v/v) acido formico indH 2O e (B) 0,1% (v/v) acido formico in acetonitrile; portata di 0,4 ml/min con un gradiente lineare di: 40% B - 60% B in 1,0 min; 60% B a 95% B da 1,0 min a 6,0 min; 100% B da 6,5 minuti a 7,5 minuti; 100% B al 40% B da 7,5 a 7,6 minuti; e 40% B da 7,6 a 8,5 minuti; Colonna FIT AcquityTM Premier BEH RP18 VanGuard FIT 100 mm x 2,1 mm (1,1 mm), mantenuta a 50°C. Clicca qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 4: Cromatogramma LC-MS/MS di retinolo ed esteri retinilici utilizzando lo spettrometro di massa QTRAP 5500. Cromagramma LC-MS/MS di un estratto tipico da plasma standard campionato 6 ore dopo l'assunzione orale di 1,0 mg di acetato di retinile [2H6] e 90 giorni dopo l'assunzione orale di 1,0 mg di acetato di retinile. Il monitoraggio della reazione selezionata (SRM) di m/z 269→93 mostra il picco di [12C]retinolo (RT = 2,10 min); il [2H4]acetato di retinile a m/z 273→94 (RT = 2,43 min) come standard interno (IS); la separazione del retinolo [2H6]retinolo (RT = 2,09 min) e [2H6]palmato di retinile (RT = 5,11 min) raggiunge il picco a m/z 275→96; e il picco di [13C10]retinolo (RT = 2,10) a m/z 279→100. Condizioni cromatografiche: (A) gradiente di fase binario delle cellule mobili dello 0,1% (v/v) acido formico indH 2O e (B) 0,1% (v/v) acido formico in acetonitrile; portata di 0,4 ml/min con un gradiente lineare di: 60% B - 95% B in 3,0 min; 100% B da 3,5 minuti a 6,5 minuti; 100% B al 60% B da 6,5 a 7,0 min; e 60% B da 7,0 a 8,5 minuti; Colonna FIT AcquityTM Premier BEH RP18 VanGuard FIT 100 mm x 2,1 mm (1,1 mm), mantenuta a 50 °C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Parametri
Assorbimento molare (ɛ) del retinolo nell'etanolo:52.770 M-1 cm-1
Fattore di diluizione:100 (100μL di standard di calibrazione stock in 10 mL di etanolo)
Assorbenza media misurata:0.575
Calcolo
Concentrazione (mol) di [12C]retinolo nell'etanolo:Concentrazione (mol) = Assorbimento / ɛ x Lunghezza della cuvetta
= 0,575 / 52770 M-1 cm-1 x 1 cm = 1,09 x 10-5 M
Correzione per diluimento:1,09 x 10-5 M x 100 = 1,09 x 10-3 M o 1,09 mM

Tabella 1: Determinazione della concentrazione standard di calibrazione del retinolo.

AnalitaTransizioni MRM (m/z)Potenziale di declustering (V)Potenziale di ingresso (V)Energia di collisione (eV)Potenziale di uscita da collisione (V)
[12C]-retinolo/esteri269→935110276
[2H4]acetato di retinile273→945110276
[2H6] retinolo/esteri275→965110276
[13C10]-retinolo/esteri279→1004110276

Tabella 2: Parametri selezionati di monitoraggio della reazione (SRM). Parametri per [12C] retinolo, [13C10] retinolo e [2H6] retinolo e i rispettivi esteri utilizzando il API4000

AnalitaTransizioni MRM (m/z)Potenziale di declustering (V)Potenziale di ingresso (V)Energia di collisione (eV)Potenziale di uscita da collisione (V)
[12C]-retinolo/esteri269→939410338
[2H4]acetato di retinile273→9454102011
[2H6] retinolo/esteri275→966910253
[13C10]-retinolo/esteri279→10010210359

Tabella 3: Parametri selezionati di monitoraggio della reazione (SRM). Parametri per [12C] retinolo, [13C10] retinolo e [2H6] retinolo e i rispettivi esteri utilizzando il QTRAP 5500

Discussione

Il metodo LC-MS/MS presentato offre una sensibilità estremamente elevata, con limiti di rilevamento anche bassi fino a 6 fmol/L, permettendo così ai ricercatori di utilizzare solo 100-200 μL di plasma19. Questo metodo di SM tandem mirato è particolarmente efficace per confermare l'identità isotopologa dei retinoidi quando vengono utilizzati sia ioni quantificatori che di prodottoqualificatore 18. Tuttavia, poiché i retinoidi marcati con isotopi sono presenti a concentrazioni sostanzialmente inferiori rispetto ai retinoidi fisiologici non marcati, i campioni plasmamici contenenti retinolo marcato ed esteri retinilici possono richiedere un ulteriore passo di concentrazione. Questa necessità dipende da fattori come il tempismo del campione di sangue post-applicazione, la concentrazione di tracciatore orale e la sensibilità del sistema LC-MS/MS. Storicamente, dosi più elevate di applicazioni venivano utilizzate per superare la minore sensibilità degli spettrometri di massa precedenti, ma i recenti progressi hanno facilitato l'uso di dosi piùbasse 13. Negli esempi presentati, una dose orale più alta aumenta il livello di retinolo stabile marcato da isotopi anche in momenti successivi, cioè a 21 giorni rispetto a 4 giorni.

Poiché i gruppi funzionali terminali degli esteri retinilici si perdono durante l'ionizzazione, si osservano lo stesso genitore m/z di 269 e modelli simili di frammentazione degli ioni figli sia per il retinolo che per gli esteri retinilici. Pertanto, la separazione cromaticografica è cruciale per determinare le loro concentrazioniseparate 18. Inoltre, a causa dell'elevata abbondanza naturale degli isotopi stabili di 13C negli isotopologhi endogeni del retinolo, si raccomanda di incorporare più di tre atomi di 13C nel tracciante del retinolo per evitare la necessità di correggere per l'arricchimento naturale di base del retinolo a 13C nel plasmaumano 29.

I campioni di plasma richiedono un trattamento prima dell'analisi isotopica in due fasi. Innanzitutto, i campioni di plasma devono essere deproteinizzati, seguiti dall'estrazione di retinolo ed esteri retinilici utilizzando un solvente non polare, che crea un sistemabifasico 18,19,20. Sebbene si ottenga una netta separazione delle fasi utilizzando il protocollo sopra indicato, è fondamentale che l'interfase nel sistema bifasico non venga disturbata o raccolta, poiché ciò aumenterà il tempo di asciugatura e ridurrà la precisione dell'analisi. In alternativa, il nostro gruppo ha anche esplorato l'applicazione di una procedura di estrazione monofase per iretinoidi 20. Per questo, campioni di plasma da 200 μL vengono pipettati in un tubo microcentrifuga di plastica da 2 mL, e i retinoidi vengono estratti utilizzando una combinazione di etanolo e acetato di etile. L'applicazione di questo protocollo di estrazione consente l'analisi del retinolo e di retinoidi più polari, come gli isomeri dell'acido retinoico, con un recupero equivalente rispetto all'estrazione biphasica, ed è anche paragonabile al metodo di estrazione a un solo passaggio dell'acetonitrile di Kane eNapoli 30.

Dato che i retinoidi sono suscettibili all'ossidazione e all'isomerizzazione quando esposti alla luce UV e al calore, è fondamentale eseguire l'analisi il più rapidamente possibile e devono essere adottate precauzioni generali durante la raccolta, la manipolazione e la conservazione del plasma30. I metodi tradizionali per l'analisi dei retinoidi stabili marcati da isotopi impiegano isolamento e/o derivatizzazioni che richiedono molto tempo. L'analisi GC-MS richiede l'isolamento della frazione di retinolo dal siero umano tramite cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC), seguita dalla derivatizzazione delretinolo 22. Sebbene la derivatizzazione non sia necessaria per il GC-C-IRMS, è raccomandata la separazione preventiva del retinolo tramite due diversi passaggi di purificazione HPLC 17,25,31, e è inoltre richiesta la determinazione dell'arricchimento naturale basale del retinolo con 13C nel plasma umano nella popolazionecampionaria 17,32. Al contrario, il metodo LC-MS/MS presentato presenta diversi vantaggi. Evita procedure di estrazione e/o purificazione estese e lunghe e che richiedono tempo, permettendo un'analisi rapida, sensibile e simultanea degli esteri retinilici e del retinololibero 16,18,26,32. Inoltre, il metodo è efficace perché offre alta accuratezza con bassa variabilità ed è adattabile a diversi sistemi LC-MS/MS.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Ringraziamenti

Il supporto a questo lavoro è stato fornito dalla Bill & Melinda Gates Foundation (Numero di progetto: OPP1115464) e dall'Agenzia Internazionale per l'Energia Atomica (AIEA) a Vienna (Numero di progetto E4.30.30).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Solventi
Grado HPLC a etanolo assolutoFisher10428671
Grado HPLC per acetonitrileFisher10660131
Esano 95% N-Esano per HPLC Certificato HPLCFisherH/0406/17
Isopropanolo HPLC di gradoVWR20880.32
Isopropanolo HPLC di gradoVWR20880.32
Metanolo 99% 2,5 LThermo Scientific11367996
Standard/isotopi
All-trans-retinoloBioXtra95144
Acetato di retinileSigmaPHR1236
Isotopo stabile marcato con retinolo:ReseaChem/Buchem BV
Acetato di retinile marcato da isotopo stabile:ReseaChem/Buchem BVN/APer il metodo RID può essere utilizzata una gamma di isotopi stabili. Un elenco dei diversi isotopi commercialmente disponibili è riportato nella Tabella 1. 
Vitamina A e Vitamine A; (19,19,19,20,20,20-D6)
Vitamina A e Vitamine A; (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10)
Acetato di vitamina A (10,19,19,19-D4)
Acetato di vitamina A (19,19,19,20,20,20-D6)
Acetato di vitamina A (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10)
Equipaggiamento
Distributore regolabile di solventi da 5 mlSigma-AldrichZ627607-1EA
ABI 4000 LC-MS/MS.AB Sciex
Bilance analitiche  Fisher13592970
Pistoni capillari (punte per pipetta) CP100 10x96 TIPACKGilsonFD148314
Pistoni capillari CP250ST 6x96GilsonF148714
Armadio fumi
Microman E M100E Pipette (spostamento positivo)GilsonFD10004
Microman E M250E Pipette (spostamento positivo)GilsonFD10005
Pipetman P100, 10-100ul, espulsore metallicoGilsonF114057M
Pipetman P1000, 100-1000ul, espulsore metallicoGilsonF114059M
Pipetman P20, 2-20ul, espulsore metallicoGilsonF144056M
QTRAP 5500 LC-MS/MSAB Sciex
Centrifuga refrigerata 5810 REppendorf
Bagno d'acqua sonicanteVWRUSC100T
SpettrofotometroThermo Fisher ScientificA51119600C
Concentratore di campione Techne e blocco termico.VWR
Vibrax VXR Shaker BaseIKA0002819002
Miscelatore a vortice; MS3 base IKAFisherMPR-555-050L
Accessorio provetta VX2 - werke type VX2IKA0000568900
Consumabili
Tubi microcentrifughe da 1,5 mlFisherFB74323
100 mm x 2,1 mm (1,7 & mu; m) Colonna AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FITAcque186009498
100 mm x 2,1 mm (3 & micro; m) Colonna Supelcosil ABZ PLUSSupelco57917
Punte per pipette da 1000ulStarlabS1122-1830
Fiaschette volumetriche da 100mlFisher11323644Fiaschetta volumetrica certificata Pyrex Borosilicato di Classe A
Punte per pipette da 200ulStarlabS1120-8810
Cartuccia SecurityGuard C18 4 mm x 2 mmFenomenoAJ0-4286
Fiaschette volumetriche da 50 mlFisher11313644Fiaschetta volumetrica certificata Pyrex Borosilicato di Classe A
Fiale di vetro ambrato da 9mm con insertiFisher11583680
Coperchi a vite a filettatura per fiale da 9mmFisher13206419
Criocassetta di cartoneStarlabA9623-8181
Quarzo UV Hellma cuvetteSLSCEL1600
Gas azoto (massima purezza e privo di ossigeno)BOC
Pipetta PasteurFisher11546963
Tubi Pyrex Culture 100x16mmCorningCLS9944916
Tappi a vite PTFE liner 16mmCorningCLS999815
Tappi in PTFE da 2ml in vetro ambrato fialeFisher11573542
Tappo a vite fiala 9mm bianco silicone/PTFE rossoThermo 13206419

Riferimenti

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