Articolo metodologico

Trapianto intramuscolare di cellule endocrine pancreatiche derivate da cellule staminali pluripotenti umane nei topi

DOI:

10.3791/69562

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10 aprile 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigaciones Biomédicas Sols-Morreale, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Universidad Autónoma de Madrid, 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas CIBERDEM, Instituto de Salud Carlos III

In questo articolo

Sommario

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Forniamo un protocollo minimamente invasivo per il trapianto intramuscolare di isolotti di cellule staminali pancreatiche derivate da cellule staminali umane in topi immunodeficienti per l'impianto in vivo e l'analisi a valle.

Abstract

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Le cellule endocrine del pancreas derivate dalle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) costituiscono una fonte promettente per la terapia delle cellule del diabete e la modellazione delle malattie. Sebbene siano stati stabiliti diversi protocolli di differenziazione, l'impianto in vivo è comunemente necessario per studiare la maturazione e la funzione in un contesto fisiologico. La maggior parte degli approcci di trapianto si basa su siti come la capsula renale o lo spazio sottocutaneo, che possono presentare limitazioni tecniche o fisiologiche. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per il trapianto intramuscolare di isolotti SC pancreatici derivati da hPSC in topi immunodeficienti. Questo sito consente un accesso chirurgico semplice, una riduzione dell'invasività e un prelievo affidabile di trapianti per analisi successive. La procedura consente l'impianto intramuscolare degli isolotti derivati da cellule staminali e ne supporta il recupero per la valutazione a valle della secrezione di insulina dopo una sfida orale del glucosio. Il protocollo include passaggi per la preparazione e compattazione del cluster, la chirurgia di trapianto, la secrezione di insulina stimolata dal glucosio in vivo (GSIS) e il prelievo di innesti per l'analisi istologica, fornendo un quadro riproducibile per il trapianto intramuscolare in modelli murini preclinici.

Introduzione

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Il diabete è un disturbo metabolico eterogeneo la cui prevalenza è raddoppiata negli ultimi trent'anni e si prevede colpirà 1,3 miliardi di persone entro il 2050. Sebbene fattori ambientali, come dieta e stile di vita, svolgano un ruolo significativo nell'insorgenza del diabete di tipo 2 (T2D), la predisposizione genetica contribuisce anche in modo sostanziale alla suapatogenesi 2. Le cellule β pancreatiche sono responsabili della sintesi e della secrezione di insulina e svolgono un ruolo centrale nella fisiopatologia deldiabete 3. Per comprendere come il rischio genetico contribuisca alla disfunzione delle cellule β, le cellule β derivate dalle cellule staminali umane organizzate come cluster endocrini tridimensionali (d'ora in poi denominati isolotti SC) forniscono un sistema modello altamente informativoe rilevante 4,5. I protocolli recenti guidano efficacemente la differenziazione delle cellule staminali umane in cellule β produttrici di insulina, ricapitolando le fasi chiave dello sviluppo pancreatico utilizzando inibitori e fattori di crescitaspecifici 6,7.

Questi sistemi replicano in modo affidabile le tappe dello sviluppo in modo scalabile e riproducibile, superando i limiti degli isolotti derivati dal donatore, che non supportano la modellizzazione dello sviluppo e sono soggetti a vincoli di approvvigionamento. I modelli murini hanno fornito preziose intuizioni sullo sviluppo pancreatico, ma spesso non riescono a riprodurre completamente le manifestazioni fenotipiche osservate nei pazientiumani 5. Di conseguenza, l'uso di un sistema basato su cellule staminali consente la caratterizzazione delle varianti genetiche coinvolte nello sviluppo pancreasico umano e nella disfunzione cellulareβ 8.

Nonostante questi progressi, gli isolotti SC generati in vitro rimangono trascrittomicamente e funzionalmente immaturi rispetto alle cellule β adulte native. Mostrano una secrezione di insulina stimolata dal glucosio subottimale e mancano l'espressione di marcatori β cellule mature come MAFA e G6PC2 9,10. Per colmare questo divario, spesso viene impiegata la maturazione in vivo tramite trapianto in topi immunodeficienti; Questo migliora tipicamente sia la dinamica della secrezione insulinica sia i profili di espressionegenica 6.

Il metabolismo del glucosio è strettamente regolato e richiede l'integrazione di segnali sistemici. Gli isolotti SC trapiantati sono in grado di integrare segnali provenienti da più organi, fornendo un ambiente fisiologicamente più rilevante, cruciale per valutare le conseguenze funzionali della variazione genetica nelle cellule βumane 11.

Il trapianto di isolotti SC su topi è stato eseguito in diversi siti anatomici. Il sito convenzionale è la capsula renale, efficace per promuovere la maturazione delle cellule β e invertire il diabete nei roditori trattati con streptozotocina(STZ) 12, ma comporta un intervento chirurgico invasivo complesso, che ne limita l'implementazione nei laboratori13. Inoltre, questo metodo non è adatto a contesti clinici per trattare pazienti con diabete di tipo 1 a causa delle limitazioni di dimensioni evascolarizzazione 14. Sono stati segnalati siti alternativi di trapianto, come intramuscolare, sottocutaneo e tessuto adiposo, che offrono vie meno invasive e più clinicamente applicabili. Sebbene il trapianto intramuscolare possa rappresentare difficoltà per raggiungere una maturazione ottimale delle cellule β e una secrezione di insulina rispetto alla capsularenale 12, può comunque garantire una secrezione efficace di insulina e il mantenimento dell'omeostasi del glucosio, offrendo al contempo un approccio chirurgico più semplice eaccessibile 15,16.

Pertanto, in questo protocollo, presentiamo un approccio di trapianto intramuscolare che affronta diverse limitazioni di altri protocolli di trapianto. Questo metodo è minimamente invasivo e fornisce una strategia affidabile in vivo per maturare gli isolotti SC e indagare varianti genetiche legate alla disfunzione delle cellule β.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti che coinvolgevano cellule staminali pluripotenti (hPSC) e animali da laboratorio erano stati approvati da comitati etici istituzionali, regionali e nazionali. Le linee hPSC utilizzate qui sono state originariamente derivate e distribuite in conformità con le appropriate approvazioni etiche e procedure di consenso informato presso le istituzioni di origine. La Figura 1 mostra il flusso di lavoro complessivo, dalla manutenzione degli hPSC fino alla differenziazione e maturazione della linea pancreatica diretta in isolotti SC adatti al trapianto.

1. Differenziazione degli hPSC in progenitori pancreati

NOTA: Questo protocollo si basa su due passaggi preparatorii essenziali: 1) il mantenimento e l'espansione degli hPSC, e 2) la loro differenziazione diretta verso la linea endocrina del pancreas. Entrambi i passaggi sono stati descritti indettaglio 7,17. Gli hPSC sono mantenuti in lastre rivestite con substrati B8 seguendo le raccomandazioni di Lyria-Leyte et al.17. Raccogliere gli hPSC per la differenziazione durante la crescita esponenziale prima che diventino confluenti. Alla densità di semina raccomandata, dovrebbero raggiungere il 90-100% di confluenza il giorno successivo, pronti a iniziare la differenziazione. La differenziazione verso la linea endocrina del pancreas viene effettuata secondo la procedura descritta da Barsby et al.7. I dettagli completi dei media si trovano nella Tabella 1.

  1. Ricoprire appena le placche di differenziazione con una matrice extracellulare derivata dalla membrana basale.
  2. Seme 0,16-0,19 milioni di cellule/cm2 al giorno 0 (1,7 milioni di celle in un pozzo da una piastra a 6 pozzi). Usa 1,5-2 volte il volume di B8 + CEPT per prevenire la deplezione dei nutrienti (3-4 mL per pozzo in una piastra a 6 pozzi).
    NOTA: Quando si passano hPSC o si esperimentano di differenziazione di semina, integriamo preferenzialmente i mezzi B8 con CEPT, un cocktail di chroman 1, emricasan, poliammine e trans-ISRIB, piuttosto che con l'inibitore ROCK convenzionale Y-27632, grazie alla sua comprovata capacità di aumentare la sopravvivenza dell'hPSC18. Tuttavia, Y27632 rimane un'alternativa valida per questo protocollo.
  3. Effettuare modifiche ai media utilizzando i media di differenziazione da S1 a S4 secondo il seguente calendario: S1 (giorni 1-4), S2 (giorni 4-7), S3 (giorni 7-9) e S4 (giorni 9-11).
    NOTA: Consulta la Tabella 1 per composizioni multimediali complete; ulteriori dettagli procedurali sono descritti da Barsby et al.7.

2. Generazione di cluster 3D e differenziazione verso cellule produttrici di insulina

NOTA: Al giorno 11, le cellule differenziate dovrebbero essersi sviluppate in progenitori pancreatici. Per promuovere ulteriormente la differenziazione endocrina in questa fase, le cellule passano dalla coltura planare alla coltura 3D.

  1. Aggiungere 0,5 mL di soluzione antiaderente al 5% (p/v) (vedi Tabella 1 per i dettagli) per coprire il fondo di una piastra di micropozzi a 24 pozzi contenenti micropozzi piramidali invertiti (diametro 400 μm). Centrifugare a 1.300 g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).
    NOTA: La soluzione antiaderente crea una superficie antiaderente che impedisce alle cellule di aderire alla plastica e favorisce un'aggregazione uniforme.
  2. Esaminare i micropozzi al microscopio per trovare bolle d'aria e ricentrifugare se necessario per rimuovere l'aria intrappolata (Figura 2A). Aspira la soluzione antiaderente e lava 2 volte con 0,5 mL di PBS per pozzo. Lascia i pozzi coperti di PBS fino a quando non sono pronti all'uso.
  3. Lavare le cellule con 1 mL di PBS-0,5 mM EDTA, aspirare il PBS-EDTA e coprire i pozzi con tripsina (1 mL per un pozzo di una piastra a 6 pozzi). Incubare a 37ºC per 8-12 minuti (finché il tapping non causa un distacco evidente).
  4. Non rimuovere la tripsina; invece, diluire con 2x volumi di DMEM-F12 o PBS, e risospendere delicatamente tramite pipetta. Metti la sospensione in un tubo conico e procedi immediatamente al passo successivo.
    NOTA: È meglio incubare più a lungo nella tripsina piuttosto che eseguire una dura triturazione meccanica.
  5. Centrifuga la sospensione a 200 g per 3 minuti a RT. Aspira con cura il sovrantantante e risospendi delicatamente il pellet in un mezzo S4 preriscaldato (1,25 mL per ogni pozzo di un micropozzo da 24 pozzi).
  6. Aspira il PBS dalle piattole micropozzi. Con delicatezza, aggiungi 1,25 mL delle celle sospese in ciascun pozzetto della piastra del micropozzo.
    NOTA: Ogni pozzo della piastra a 24 micropozzi contiene 1.200 micropozzi. La densità di semina richiesta per ottenere cluster di dimensioni appropriate è di 1.500 celle per micropozzo, corrispondente a 1,8 milioni di celle per pozzo. In alternativa, si possono utilizzare micropozzi a 6 pozzi, regolando volumi e numero di celle (circa 8,85 milioni di celle in 5 mL di mezzo di Stadio 4).
  7. Centrifuga la piastra a 100 g per 3 minuti a RT per distribuire le celle uniformemente nei micropozzi. Trasferisci con attenzione le piastre del micropozzo in un incubatore umidificato.
  8. Eseguire modifiche al supporto utilizzando i mezzi di differenziazione S5 (D14-D18), S6 (D18-D25) e S7 (D25-D46).
    NOTA: I dettagli completi della composizione sono forniti nella Tabella 1, con ulteriori dettagli procedurali descritti da Barsby et al.7.
    Il cocktail CEPT può essere utilizzato durante questa fase al posto dell'inibitore ROCK Y-27632, grazie alla sua comprovata capacità di aumentare la sopravvivenza cellulare durante la formazionedell'organoide 18. L'aggregazione riuscita è indicata dalla formazione di cluster compatti e sferici entro 24-48 ore (vedi Figura 2B).

3. Trapianto di isolotti SC nel muscolo teso di topi immunodeficienti

NOTA: Gli isolotti SC sono stati trapiantati in vari stadi di differenziazione (dalla fase 4 alla fase 7). Mentre il trapianto di isolotti SC differenziati S7 rappresenta la strategia ottimale per valutare la risposta alglucosio 6, il trapianto di progenitori in stadio precoce (S4-S5) o isolotti SC immaturi (S6) può aiutare a rivelare differenziazioni o differenziazioni di maturazione che vengono mascherate in vitro dall'uso di condizioni di coltura definite. Tuttavia, il trapianto di progenitori meno differenziati comporta un rischio aumentato di formazione di teratoma, principalmente a causa delle popolazioni cellulari residue indifferenziate.

  1. Compattazione degli ammassi
    1. Trasferire la quantità appropriata di grappoli su un tubo microcentrifuga da 1,5 mL (vedi nota).
      NOTA: La dose cellulare dipende dall'obiettivo sperimentale. Per l'istologia, 0,5-1 milione di cellule per topo sono sufficienti per un prelievo affidabile di innesti, mentre i saggi funzionali o la inversione del diabete nei topi trattati con STZ richiedono tipicamente dosi più elevate, fino a 2-5 milioni di cellule. Prima della compattazione, gli isolotti SC dovrebbero presentare una morfologia sferica uniforme con un diametro bersaglio di ~150-250 μm (intervallo accettabile: 100-300 μm). Questo intervallo corrisponde approssimativamente a ~10³-4 × 10³ cellule per cluster; si dovrebbero evitare aggregati sovradimensionati (>300-400 μm), poiché sono più suscettibili alla necrosi centrale. La dimensione e l'uniformità del cluster vengono verificate prima della compattazione tramite immagini a campo chiaro o stereomicroscopio di pozzi rappresentativi, seguite dalla misurazione del diametro tramite software standard di analisi delle immagini.
    2. Collega la siringa al gruppo ago-tubo e riempilo con un mezzo S7.
    3. Aspira i cluster direttamente nel tubo dalla microcentrifuga. Piega il tubo a metà e inserisci la sezione piegata in una punta di pipetta da 200 μL. Inserire l'assemblaggio punta-tubo e ago in un tubo conico da 15 mL e fissare le estremità al bordo del tubo usando del nastro adesivo.
    4. Centrifugare il tubo a 100 g per 2 minuti a 4 °C per compattare i grappoli. Metti subito il tubo sul ghiaccio.
  2. Trapianto di grappoli nei topi
    NOTA: Tutte le procedure chirurgiche devono essere eseguite utilizzando dispositivi di protezione individuale appropriati e in conformità con le normative istituzionali sulla biosicurezza e il benessere animale. Gli agenti anestetici e gli oggetti taglienti devono essere maneggiati e smaltiti secondo le procedure di sicurezza approvate.
    1. Indurre anestesia nei topi NOD-scid-gamma usando isoflurano al 3-5%.
    2. Rasi il lato posteriore della gamba destra sotto il ginocchio e disinfetta con etanolo al 70%.
    3. Stacca il tubo dalla punta della pipetta e collegalo alla siringa. Taglia il tubo vicino ai grappoli compattati e fissalo all'estremità smussata dell'ago. Spingi la soluzione salina finché il primo grappolo non raggiunge la punta dell'ago.
    4. Posiziona il topo a terra, inclinandosi verso destra, e estendi la gamba destra. Inserire l'ago a 4-5 mm di profondità nel compartimento mediale della coscia destra, nella regione tra i muscoli adduttore e gracile.
    5. Inietta i cluster mentre si ritrae l'ago di ~3 mm. Ruota la siringa e ritira l'ago.
    6. Monitora il topo finché non si riprese completamente dall'anestesia.
      NOTA: Per la caratterizzazione funzionale (cioè, GSIS in vivo , sezione 4), devono essere utilizzate isolotti SC di un singolo genotipo per topo; Un singolo trapianto è sufficiente. Tuttavia, per la caratterizzazione istologica o trastomica della maturazione post-impianto, si possono utilizzare entrambe le gambe (ad esempio, una zampa con cluster SC derivati da hPSC contenenti una variante genetica associata alla malattia, e l'altra gamba con la variante corretta). Una corretta consegna intramuscolare non può essere confermata direttamente in vivo immediatamente dopo l'iniezione. L'impianto riuscito viene invece verificato retrospettivamente dall'identificazione macroscopica dell'innesto al momento del prelievo (Figura 3) e dall'analisi istologica (Figura 4).

4. Secrezione di insulina in vivo stimolata dal glucosio (GSIS)

NOTA: GSIS in vivo, tramite sfida orale del glucosio, valuta la secrezione funzionale di insulina in risposta a uno stimolo fisiologico. Tutte le procedure devono seguire le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali. Le risposte funzionali delle cellule β trapiantate migliorano con la maturazione in vivo : il peptide C umano può essere rilevato già a 2 settimane dal trapianto, mentre una secrezione robusta e responsiva al glucosio si ottiene tipicamente entro 4 settimane. Questi tempi possono variare a seconda dello stadio di sviluppo degli isolotti SC al momento del trapianto

  1. Fai i topi veloci per 4-6 ore prima della somministrazione del glucosio, garantendo l'accesso all'acqua.
  2. Prepara una soluzione di D-(+)-glucosio al 20% (a pa/v) in acqua. Sterilizza passando attraverso un filtro da 0,22 μm e riscalda fino alla temperatura ambiente prima dell'uso.
  3. Pesa ogni topo e calcola la dose di glucosio richiesta a 3 g/kg di peso corporeo.
  4. Carica il volume appropriato di soluzione di glucosio in un ago curvo da 20 G attaccato a una siringa da 1 mL.
  5. Trattieni delicatamente il topo ed esegui il gavage orale, assicurando un inserimento fluido dell'ago per evitare l'aspirazione tracheale.
  6. Prelevare campioni di sangue tramite puntura submandibolare o vena caudal al punto di partenza (0 min) e 15 e 30 minuti dopo la gvaga, utilizzando tubi capillari e tubi microcentrifughe da 1,5 mL. Lascia coagulare il sangue a temperatura ambiente per circa 15 minuti, poi conserva i tubi sul ghiaccio.
  7. Centrifugare i campioni a 1.000 g per 15 minuti a 4 °C e trasferire il siero in nuovi tube. Conservare a −80 °C fino all'analisi da parte di ELISA.
    NOTA: I punti temporali possono essere regolati a seconda del modello sperimentale. È fondamentale utilizzare un saggio in grado di distinguere tra insulina umana e topo o peptide C per valutare la secrezione di insulina derivata da innesto nei modelli di xenotrapiante.

5. Recupero di grappoli innestati

  1. Eutanasia il topo seguendo le linee guida etiche istituzionali sugli animali.
  2. Per minimizzare la contaminazione tissutale con il pelo, spruzza etanolo al 70% (v/v) sul corpo.
  3. Rimuovere la pelle per esporre i muscoli degli arti inferiori e individuare i grappoli innestati usando una lente d'ingrandimento. Espelle tessuto contenente innesto usando forbici e pinzep.
  4. Risciacqua il tessuto una volta con PBS e trasferiscilo al 4% (p/v) di paraformaldeide (PFA) su ghiaccio. Fissare il tessuto al 4% di PFA a 4 °C per 4 ore con lievi scuotementi.
  5. Lava il campione in PBS per 1 ora con una lieve scuotita. Trasferire il tessuto al 30% (a settimana) di saccarosio con PBS e incubare durante la notte a 4 °C.
    NOTA: I tessuti biologici, i campioni di sangue e i rifiuti chimici (inclusi fissativi e residui anestetici) devono essere smaltiti seguendo le linee guida istituzionali sulla biosicurezza e sulla gestione dei rifiuti chimici.

6. Colorazione degli espiantili

  1. Incorporamento OCT
    1. Infondere il tessuto in uno stampo riempito con composto per la temperatura ottimale di taglio (OCT).
    2. Mettere lo stampo in un bagno di ghiaccio secco con isopropanolo per congelare rapidamente il campione. Conserva a -80 °C fino alla criosezionamento.
    3. Utilizzando un criostato, taglia sezioni da 5-7 μm e conserva le vetrine a -80 °C.
  2. Immunocolorazione
    1. Bilancia i vetri a RT per 15 minuti all'interno di un contenitore per evitare condensa.
    2. Risciacquo i vetri con PBS per 3 x 5 minuti.
    3. Incubare ogni sezione con 100 μL di soluzione bloccante/permeabilizzante per 30 minuti a RT (0,1% di tensioattivo non ionico in PBS, con il 5% di siero della specie in cui è stato sollevato l'anticorpo secondario).
    4. Incubare ogni sezione con 50 μL di anticorpi primari diluiti in soluzione bloccante/permeabilizzante durante la notte a 4 °C.
    5. Risciacquo i vetri con PBS per 3 x 5 minuti.
    6. Incubare ogni sezione con 50 μL di anticorpi secondari diluiti in soluzione di blocco/permeabilizzazione per 1 ora a RT.
    7. Risciacquo i vetri con PBS per 3 x 5 minuti.
    8. Montare le guide con 15 μL di soluzione di montaggio con DAPI e applicare un coverslip. Conserva a 4 °C al buio fino all'acquisizione di imaging.

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Risultati

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I risultati mostrati corrispondono al trapianto intramuscolare di isolotti SC di stadio 7 in topi immunodeficienti e all'analisi effettuata 6 settimane dopo il trapianto. Un numero limitato di animali con innesti rappresentativi è stato analizzato per illustrare la fattibilità della procedura. In questo studio, un esito positivo è definito come il prelievo macroscopico dell'innesto intramuscolare seguito dalla conferma istologica della sopravvivenza e del...

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Discussione

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In questo protocollo, descriviamo il trapianto intramuscolare di isolotti SC come un approccio diretto, riproducibile e minimamente invasivo per la maturazione in vivo , con potenziale di valutazione funzionale. Sebbene il trapianto sotto capsula renale sia ampiamente considerato il "standard d'oro" per l'intrazione di isolotti o isolotti SC nei roditori, richiede maggiore competenza tecnica e una procedura chirurgica più lunga. Al contrario, il sito intramuscolare offre semplic...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il Dr. Danwei Huangfu (Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, USA) per aver generosamente fornito le linee hPSC utilizzate in questo studio. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni PID2021-122284NA-I00 e CNS2023-145179 dal Ministero spagnolo della Scienza, dell'Innovazione e delle Università MICIU/AEI/10.13039/501100011033 e Next GenerationEU/PRTR (A.B.), e dal CIBER-Consortium for Biomedical Research in Network, CB07/08/0029 e PID2023-150719OB-I00 (M.V.), Instituto de Salud Carlos III (ISCIII). Il Centro per la Ricerca Biomedica sul Diabete e i Disturbi Metabolici Associati (CIBERDEM) è un'iniziativa di ISCIII e parzialmente sostenuto dal Fondo Europeo di Sviluppo Regionale (FEDER).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma Aldrich49752
Activin AQkineQk001
AggreWell 400 24-well (microwell plate)Stemcell34415
BetacellulinGenScriptZ03102
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Fatty Acid FreeGoldbioA-421
CHIR 99021LC labsC-6556 
Chroman-1Medchem ExpressHY-15392CEPT cocktail
CMRL-1066Pan BiotechP04-84600
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG7021
Dibenzazepine (DBZ)SyncomCustom productGamma-secretase inhibitor
Dulbecco's Modified Eagle Medium and Ham’s F12 media (DMEM/F12)Corning15383541
EGFQkineQk011
EmricasanMedchem ExpressHY-10396CEPT cocktail
EthanolamineSigma AldrichE9508
FGF2-G3GenScriptCustom product
FGF7GenScriptZ03047
HeparinSigma AldrichH3149
InsulinGibco30284510
L-Alanyl-L-GlutamineLinusX0551-100
L-Ascorbic AcidSanta Cruzsc-202686
LDN-193189 Sigma AldrichSML0559
Lipid ConcentrateGibco11548846
Matrigel (basement membrane-derived extracellular matrix)Falcon354230
MCDB 131Corning15-100-CV
N-acetylcysteineThermo Scientific10521221
NaHCO3Fisher Scientific10553325
NicotinamideSigma AldrichN0636
NRG-1QkineQk045
Pluronic F-127 (anti-adherence solution)Sigma Aldrich82184Used at 5% (w/v)
Polyamine Supplement (1000×)Sigma AldrichP8483CEPT cocktail
RepSoxMedChemExpressHY-13012Alk5 Inhibitor
Retinoic AcidSigma AldrichR2625
SANT-1SelleckchemS7092
Sobetirome (GC1)Sigma AldrichSML1900-5MGCell-permeable T3 analog
Sodium PyruvateCorning25-000-CI
Sodium SeleniteSigma AldrichS5261
T3 (3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)Sigma AldrichT6397
TGF-β1 QkineQk010
TPBTocris5343
Trace Elements ACorning15333641
Trace Elements BCorning15343641
Trans-ISRIBMedchem ExpressHY-12495CEPT cocktail
TransferrinInVitria777TRF029
Triton X-100 (nonionic surfactant)Thermo Scientific11488696
TrypLEGibco11538856
Y-27632LC LaboratoriesY-5301ROCK inhibitor
ZM-447439 MedChemExpressHY-10128
ZnSO4Sigma AldrichZ0251
Antibodies
Rat anti-Human C-peptide (insulin)DSHBGN-ID4-sUsed at 150 ng/mL
Mouse anti-glucagonProteintech67286-1-Ig1:2000
Rabbit anti-somatostatinMilliporeAB54941:500
Goat anti-rat AF488InvitrogenA-110061:500
Donkey anti-mouse AF488InvitrogenA-212021:500
Donkey anti-rabbit AF488InvitrogenA-212061:500

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Ismail, L., Materwala, H., Al Kaabi, J. Association of risk factors with type 2 diabetes: A systematic review. Comput Struct Biotechnol J. 19, 1759-1785 (2021).
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  6. Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nat Biotechnol. 40 (7), 1042-1055 (2022).
  7. Barsby, T., et al. Differentiating functional human islet-like aggregates from pluripotent stem cells. STAR Protoc. 3 (4), 101711(2022).
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