Articolo metodologico

Stabilimento di una trombosi del seno sagittale superiore indotta dal cloruro ferrico modificato

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DOI:

10.3791/69563

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30 dicembre 2025

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1Department of Neurology, Xuanwu Hospital Capital Medical University, 2Department of Neurosurgery, Xuanwu Hospital Capital Medical University

In questo articolo

Sommario

Questo studio presenta un protocollo per stabilire un modello ratto riproducibile e minimamente invasivo della trombosi del seno sagittale superiore indotta dal cloruro ferrico, utilizzando un metodo di sutura di seta in combinazione con immagini laser a contrasto di speckle e ultrasuoni ad alta risoluzione per la valutazione.

Abstract

La trombosi venosa cerebrale (CVT) è un disturbo neurologico raro ma potenzialmente letale. I modelli animali offrono piattaforme fondamentali per indagare la loro fisiopatologia e valutare potenziali terapie. In questo studio, presentiamo un modello modificato di trombosi del seno sagittale superiore (SSS) utilizzando una tecnica di sutura imbewita di FeCl₃. I maschi di ratti Sprague-Dawley (220-250 g) hanno subito un'incisione paramediana al cuoio capelluto e la creazione di una finestra ossea cranica di 1 cm sopra la SSS. Rispetto all'incisione tradizionale della linea mediana, questo approccio previene l'adesione tra la pelle incisa, la finestra ossea e la dura madre sottostante. Inoltre, evita le interferenze causate dai nodi di sutura posizionati sopra la SSS, migliorando così la qualità dell'imaging a ultrasuoni. Una sutura di seta 2-0 imbevuta nel 40% diFeCl 3 è stata applicata direttamente sul seno esposto per due intervalli consecutivi di 5 minuti. Rispetto al tradizionale metodo della cartafiltrante FeCl a 3, questa tecnica minimizza il danno chimico diretto alla corteccia parasagittale. L'imaging laser a contrasto speckle è stato utilizzato per valutare la perfusione venosa cerebrale prima e dopo l'applicazione di FeCl3 . Una significativa riduzione del flusso sanguigno ha confermato una trombosi riuscita e riuscita con successo. Sette giorni dopo l'intervento, la formazione del trombo e le variazioni emodinamiche sono state valutate tramite ecografia ad alta risoluzione e analizzate utilizzando il software Vevo LAB, che ha fornito dati volumetrici ed emodinamici del trombo. Questo modello modificato offre un approccio riproducibile, minimamente invasivo e compatibile con l'imaging per la ricerca preclinica sulla CVT.

Introduzione

La trombosi venosa cerebrale (CVT) è un tipo particolare di malattia cerebrovascolare, che rappresenta lo 0,5-3% di tutti gli ictus e rappresenta una causa importante di ictus nei giovaniadulti. Il cambiamento patologico centrale di questa malattia è la trombosi nei seni venosi durali e/o nelle vene cerebrali, che porta a un drenaggio venoso cerebrale compromesso, causando successivamente aumento della pressione intracranica, edema cerebrale, infarto venoso oemorragia 2. Per chiarire meglio i meccanismi sottostanti e valutare nuovi interventi terapeutici, modelli animali affidabili e riproducibili sono indispensabili. Dato che il seno sagittale superiore (SSS) è il sito più frequentemente colpito e la sua posizione superficiale facilita le procedureoperative 2,3, gli esperimenti attuali su animali utilizzano principalmente il modello della trombosi del seno sagittale superiore (SSST).

Tra i vari metodi di modellazione, il metodo di induzione con cloruro ferrico (FeCl3) è diventato una delle tecniche più utilizzate grazie alla sua semplicità operativa e alla sua costi-efficacia4. In questo modello, l'applicazione topica di una soluzione diFeCl 3 danneggia direttamente l'endotelio del seno venoso, esponendo la matrice subendoteliale grazie alle sue forti proprietà ossidative. Questa esposizione attiva l'aggregazione piastrinica e la cascata di coagulazione, inducendo infine la trombosi del senovenoso 5. Tuttavia, rispetto ad altri metodi, il tradizionale modello di cartafiltrante FeCl a 3 presenta anche diversi svantaggi. La questione più critica è che le proprietà paramagnetiche e l'elevata suscettibilità magnetica di FeCl3 generano artefatti significativi durante l'imaging a risonanza magnetica, compromettendo gravemente l'accuratezza della valutazione del trombo e dell'osservazione della ricanalizzazione del senovenoso 6. Inoltre, la forma della carta filtrante non si adatta bene all'SSS, rendendola soggetta a lesioni al parenchima cerebrale che circonda il seno. Pertanto, è difficile determinare se il danno parenchimante attorno alla SSS derivi dalla trombosi stessa o da una lesione chimica diretta causata da FeCl3.

L'obiettivo generale del presente lavoro è stabilire un modello di ratto SSST indotto da FeCl3 modificato che riduca il danno corticale diretto causato daFeCl 3 e consenta la valutazione del flusso sanguigno e della dimensione del trombo all'interno dell'SSS. Questo studio introduce un approccio paramediano combinato con una tecnica di sutura imbewita diFeCl 3, che minimizza il danno chimico corticale diretto causato dalFeCl 3 e consente un monitoraggio in tempo reale, non invasivo e quantitativo del flusso sanguigno del seno venoso e della formazione del trombo tramite ultrasuoni ad alta risoluzione.

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Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dal Comitato per gli Esperimenti Animali e il Benessere Sperimentale degli Animali della Capital Medical University con l'Approvazione n. AEEI-2025-138. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Stabilimento di un modello modificato di SSST per ratti indotti daFeCl 3

  1. Utilizzare maschi di ratti Sprague-Dawley (SD) di età compresa tra 6 e 7 settimane, che pesano tra 220 e 250 g, per l'esperimento. Prima delle procedure chirurgiche, acclimatare i ratti per 1 settimana e trattenere il cibo per 12 ore.
  2. Prepara i seguenti reagenti, strumenti e attrezzature: soluzione pentobarbital al 2%, soluzione 40% di FeCl3 , povidone-iodio al 5%, soluzione salina normale, unguento oftalmico, lamette usa e getta, bisturi, forbici chirurgiche, pinze, suture di seta 2-0 e 4-0, aghi da taglio inverso, portaaghi, siringhe da 1 mL e 5 mL, nastri medici, una piattaforma operativa per roditori, una borsa riscaldante con sonda termica rettale e un microtrapano cranico portatile.
  3. Dopo la pesata, anestetizzare il ratto con iniezione intraperitoneale di pentobarbital al 2% (50 mg/kg) (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati). Poi, pizzica la pelle dell'arto posteriore con una pinza per confermare l'assenza di ristoro e risposte al dolore.
  4. Applica unguenta oftalmica e radere i peli del cuoio capelluto del ratto con una lametta usa e getta.
  5. Fissa il ratto in posizione prona su una piattaforma operativa per roditori con dei nastro medici, mantieni la temperatura corporea a 37 ± 0,2 °C con una borsa riscaldante e monitora continuamente la temperatura del nucleo con una sonda rettale.
  6. Disinfetta il cuoio capelluto con povidone-iodio al 5%.
  7. Eseguire un'incisione paramediana di 15 mm sulla parte del cuoio capelluto, poi sezionare senza mezzi termini la fascia sottostante e il periosteo per esporre completamente il cranio.
  8. Assottigliare il cranio con un trapano cranico finché la SSS non è chiaramente esposta, partendo dalla lambda ed estendendosi di 10 mm anteriormente lungo la sutura sagittale. Impiegare una tecnica di perforazione intermittente per evitare di danneggiare la dura mater sottostante e l'SSS, e irrigare ripetutamente la punta con soluzione salina normale per prevenire danni termici alla corteccia.
  9. Applica un segmento da 10 mm di sutura di seta 2-0 imbevuto di soluzione al 40% di FeCl3 sulla superficie SSS esposta per 5 minuti, poi sostituisci la sutura con un segmento appena bagnato per un'altra applicazione di 5 minuti.
  10. Risciacquare il campo chirurgico con 0,5 mL di soluzione fisiologica normale tre volte per rimuovere il residuo diFeCl 3.
  11. Chiudi la pelle con punti interrotti usando sutura di seta 4-0, seguita da disinfezione povidone-iodio.
  12. Osserva il ratto finché non è completamente sveglio, poi riportalo nella gabbia.

2. Valutazione dell'istituzione di modelli di successo

NOTA: Durante la procedura chirurgica, la LSCI è stata utilizzata per misurare il flusso venoso nel SSS dopo aver creato la finestra cranica e prima dell'applicazione delFeCl 3 , e nuovamente dopo l'applicazione delFeCl 3 e il risciacquo del campo chirurgico, ma prima della chiusura della pelle. Il modello è considerato affermato con successo quando il flusso sanguigno venoso nella SSS mostra una diminuzione significativa.

  1. Attiva l'LSCI e il software corrispondente (RFLSI v5.0), poi premi il pulsante modalità online .
  2. Regolare l'altezza e la posizione dello strumento finché il laser indicatore non è centrato nel campo visivo.
  3. Posiziona il ratto su una piattaforma di schiuma e regola la posizione finché l'SSS non si allinea con il laser indicatore.
  4. Regola l'ingrandimento e la messa a fuoco finché l'immagine non si mostra chiara. Imposta i limiti inferiori e superiori della soglia di pseudocolore a 10 e 200 per ottimizzare l'aspetto visivo dell'immagine pseudocolore.
  5. Premi il pulsante Set ROI , seleziona lo strumento circolare e delimita la regione SSS.
  6. Premi il pulsante Registra per ottenere il flusso sanguigno venoso e catturare sia immagini originali che pseudocolori.

3. Valutazione dell'area/volume del trombo e delle variazioni emodinamiche

NOTA: Alcuni giorni o settimane dopo la procedura, utilizzare un'ecografia ad alta risoluzione per valutare i cambiamenti del trombo e la ricanalizzazione vascolare.

  1. Prepara i seguenti farmaci, strumenti e attrezzature: isoflurano, gel per ultrasuoni, lamette usa e getta, nastri medici, una macchina per anestesia per piccoli animali, un sistema di ecografia ad alta risoluzione per piccoli animali e imaging fotoacustico, un trasduttore ad array lineare UHF57x ultra-alta frequenza a 70 MHz e un motore di acquisizione 3D.
  2. Installa il motore di acquisizione 3D e il trasduttore UHF57x. Poi, inizializza il motore.
  3. Anestetizzare il ratto in una camera di induzione con isoflurano al 3% mescolato con 1 L/min di ossigeno.
  4. Posizionare il ratto in posizione prona sulla piastra termostatica a 37 °C, con testa e arti delicatamente fissati con nastri medici, e mantenere l'anestesia con isoflurano all'1,5%-2% attraverso un cono nasale.
  5. Rasi i peli del cuoio capelluto con una lametta usa e getta per esporre l'area di rilevamento, poi applica il gel per ultrasuoni.
  6. Regolare la posizione e l'orientamento del ratto rispetto al trasduttore finché il SSS e il trombo intraluminale non sono chiaramente visualizzati.
  7. Acquisire immagini tomografiche sequenziali dell'SSS sia nel piano sagittale che in quello coronale utilizzando immagini 3D in modalità B con una dimensione di passo di 0,04 mm.
  8. Usa la modalità Doppler a colori per osservare il flusso sanguigno nell'SSS, poi applica la modalità Doppler a Onda Pulsata (PW) per misurare la velocità del flusso sanguigno.
  9. Interrompi l'anestesia e riporta il ratto nella gabbia dopo che è completamente sveglio.
  10. Esporta le immagini e analizzale usando il software Vevo LAB. Registra le aree trasversali più massime sagittale e coronale, e il volume del trombo nel SSS, insieme alla massima velocità del flusso sanguigno del seno.

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Risultati

Il diagramma schematico del modello SSST modificato indotto daFeCl 3 è mostrato nella Figura 1. I risultati sperimentali hanno dimostrato che, dopo l'applicazione della sutura di seta satura diFeCl 3 al SSS, l'LSCI ha rilevato una significativa riduzione del flusso sanguigno locale, indicando un'occlusione riuscita del seno venoso e confermando la sensibilità dell'LSCI per rilevare cambiamenti dinamici di perfusione (

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Discussione

La CVT è un tipo specifico di malattia cerebrovascolare raro ma potenzialmenteletale. Per approfondire i suoi meccanismi patologici e sviluppare strategie di intervento efficaci, i ricercatori hanno stabilito vari modelli animali di SSST, tra cui principalmente la legatura o occlusione SSS 7,8,9, l'iniezione di sostanzeprotrombotiche 10, l'iniezion...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82401527).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa da 1 mLShenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd.21-3020
Suture di seta 2-0Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdA224
Motore ad acquisizione 3DFujifilm VisualSonicshttps://www.visualsonics.com/gallery/extended-3d-motor
Suture di seta 4-0Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdA222
5% povidone-iodioShandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.https://www.lircon.cn/products_details/100.html
Siringa da 5 mLShenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd.21-3023
Lametta usa e gettaDongyang Jinmin Trading Co., Ltd.ST300
FeCl3MacklinI811935
Cuscina riscaldanteShenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd.36-0001
IsofluranoScienze della Vita RWDR510-22-10
Sistema di imaging laser a speckleScienze della Vita RWDRFLSI III
Trasduttore a matrice lineareFujifilm VisualSonicsUHF57x
Nastro medicoSuzhou Konlida Medical Supplies Co., Ltd.B02
Micro trapano cranico portatileScienze della Vita RWD78001
PortaaghiScienze della Vita RWDF31025-13
Soluzione fisiologica normaleShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.ST341-500ml
Pomata oftalmicaShenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd.19-7223
Aghi a taglio inversoShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdTJ-3-514
Piattaforma operativa per roditoriShanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.30150
Lama del bisturiScienze della Vita RWDS31015-01
Manico a bisturiScienze della Vita RWDS32003-12
Macchina per anestesia per piccoli animaliScienze della Vita RWDR500
Sistema di ecografia e imaging fotoacustico per piccoli animaliFujifilm VisualSonicsVevo F2
Pinza lisciaScienze della Vita RWDF12013-10
Pentobarbital SodioSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.P3761
Forbici chirurgicheScienze della Vita RWDS14014-10
Pinza dentataScienze della Vita RWDF12011-13
Gel per ultrasuoniShandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.https://www.lircon.cn/products_details/230.html

Riferimenti

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