La profilazione RNA-seq dei linfonodi drenanti e metastatici nel cancro al seno HER2-positivo identifica il POSTN come marcatore prognostico

Sommario

Riveliamo un programma incentrato sulla matrice extracellulare e sulla PI3K-AKT alla base della diffusione dei linfonodi nel cancro al seno HER2-positivo e identifichiamo il POSTN come un marcatore di cattiva prognosi, supportando la stratificazione del rischio e strategie terapeutiche guidate dalle vie umane.

Abstract

Il cancro al seno HER2-positivo è clinicamente aggressivo e si diffonde frequentemente ai linfonodi, tuttavia i programmi trasscrittomici associati alla diffusione dei linfonodi rimangono incompleti. Qui, abbiamo profilato i linfonodi tumorali drenanti (TDLN) abbinati e i linfonodi tumorali metastatici (TMLN) di sei pazienti con cancro al seno HER2-positivo utilizzando sequenziamento a RNA (RNA-seq). L'analisi differenziale dell'espressione è stata effettuata con DESeq2, applicando la correzione di Benjamini-Hochberg (FDR < 0,05) e una soglia assoluta log2 di variazione di fold (|log2FC| ≥ 1). Abbiamo identificato 237 geni espressi differenzialmente (182 al rialzo e 55 al ribasso nel TMLN rispetto al TDLN). Le analisi di arricchimento funzionale hanno evidenziato l'interazione tra la matrice extracellulare (ECM) e il recettore, la segnalazione PI3K-AKT, l'adesione focale e il metabolismo del colesterolo come vie prominenti associate ai linfonodi metastatici, suggerendo un rimodellamento coordinato dell'ECM e l'attivazione della segnalazione durante la diffusione dei linfonodi. Tra i geni più alzati di regolazione, il POSTN è emerso come candidato chiave ed è stato ulteriormente collegato a caratteristiche clinicopatologiche avverse. In una coorte indipendente di validazione (n = 120), un'espressione più elevata di POSTN era associata a una sopravvivenza inferiore senza malattia. Collettivamente, questi risultati indicano POSTN come potenziale biomarcatore prognostico e supportano meccanismi centrati sull'ECM e correlati a PI3K-AKT come caratteristiche biologiche azionabili della metastasi linfonodare nel cancro al seno HER2-positivo.

Introduzione

Il cancro al seno (BC) è il cancro più frequentemente diagnosticato nelle donne e una delle principali cause di mortalità per cancro a livello mondiale, con un carico significativo e crescente in Cina^. Circa il 15%-20% dei BC sono HER2-positivi (HER2+), caratterizzati da amplificazione/sovraespressione di ERBB2 e un fenotipo aggressivo con maggiori rischi di recidiva e^{morte 2,3}. Sebbene la terapia sistemica anti-HER2 abbia notevolmente migliorato gli esiti, una parte considerevole dei pazienti continua a ricadere o sviluppare metastasi, sottolineando la necessità di una stratificazione del rischio biologicamente informata e di nuove opzioni^{terapeutiche 4}.

La metastasi linfonoda (LNM) è un fattore determinante fondamentale della stadiazione, della scelta del trattamento adiuvante e della prognosi nella BC; Il coinvolgimento ascellare preannuncia una sopravvivenza inferiore e facilita una diffusione ulteriore agli organi^{distanti 5,6}. Tuttavia, i biomarcatori robusti che catturano la biologia della diffusione nodale nella malattia HER2+ rimangono limitati, e i fattori clinicopatologici attuali spiegano solo parzialmente l'eterogeneità degli^{esiti 7}.

I progressi nell'RNA-seq consentono la profilazione ad alto intervallo di trascrisma e ad alto intervallo dinamico e sono ora ampiamente adottati nell'oncologia^{traslazionale 8}. Tuttavia, la maggior parte degli studi di espressione in HER2+ BC si concentra su tumori primari o coorti non accoppiate, mentre la profilazione comparativa tra linfonodi tumori drenanti (TDLN) e linfonodi tumorali metastatici (TMLN) è scarsa, limitando la comprensione dei programmi molecolari che stanno alla base della colonizzazione e progressione dei^{linfonodi 9}.

Basandoci sull'importanza clinica delle metastasi linfaticose e sulle evidenze precedenti che implicavano il rimodellamento della matrice extracellulare (ECM) e l'attivazione di PI3K-AKT nella semina^{metastatica 10}, abbiamo ipotizzato che, all'interno dello stesso paziente, i linfonodi tumorali-metastatici (TMLN) avrebbero mostrato un programma trascrittomico distinto rispetto ai linfonodi tumori drenanti (TDLN) abbinati, e che un sottoinsieme di geni associati all'ECM costantemente all'alzo sarebbe collegato a caratteristiche clinicopatologiche avverse e rischio di recidiva. Per testare questa ipotesi, abbiamo profilato TDLN e TMLN accoppiati da sei pazienti HER2 positivi per identificare geni differenzialmente espressi (DEG) e vie associate alla diffusione nodale. Abbiamo quindi dato priorità a POSTN e valutato la sua rilevanza prognostica in una coorte indipendente, collegando il rimodellamento ECM e la segnalazione PI3K-AKT a una stratificazione del rischio clinicamente utile nel cancro al seno HER2+. Dettagli della valutazione HER2 (secondo i criteri contemporanei ASCO-CAP), controllo qualità del sequenziamento, chiamata DEG con DESeq2 e controllo Benjamini-Hochberg FDR e procedure di validazione sono forniti^{qui 11,12}.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal comitato etico istituzionale e condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e le normative locali che regolano l'uso dei biocampioni umani. Questo studio è stato approvato dal comitato etico dell'Ospedale Boai di Zhongshan (KY-2020-012-124). Il consenso informato scritto di tutti i partecipanti è stato ottenuto prima di qualsiasi procedura specifica per lo studio.

Coorti di studio e campioni
La coorte di scoperta comprendeva tessuti accoppiati linfonodi tumoriosi drenanti (TDLN) e linfonodi metastatici (TMLN) raccolti intraoperatoriamente da 6 pazienti con cancro al seno HER2-positivo. Per ogni paziente, il TDLN abbinato è stato definito come un linfonodo drenante senza evidenza istologica di metastasi e ha servito come confrontatore di controllo interno al paziente, mentre il TMLN era tessuto metastatico confermato dalla patologia. I tessuti freschi venivano brevemente risciacquati in soluzione salina fredda tamponata con fosfato (PBS), asciugati con asciugatura, congelati rapidamente in azoto liquido entro 30 minuti dall'escissione e conservati a -80 °C fino all'estrazione. I criteri di inclusione erano carcinoma invasivo del seno patologicamente confermato, stato HER2-positivo per ASCO/CAP, disponibilità di linfonodi accoppiati e assenza di terapia neoadiuvante. I criteri di esclusione erano numero di integrità tessutale o RNA (RIN) inadeguato < 7,0. Un campione inizialmente selezionato ha fallito il controllo qualità a causa di RIN < 7,0 ed è stato escluso, quindi tutte le analisi di scoperta usano costantemente n = 6. La coorte indipendente di validazione comprendeva 120 campioni di linfonodi FFPE d'archivio con follow-up clinico ed è stata utilizzata per analisi qRT-PCR e di esiti. Per la modellizzazione prognostica, i pazienti sono stati confrontati per gruppi di espressione POSTN (Alto vs. Basso, con un punto di taglio determinato da X-tile), con il gruppo Basso che fungeva da comparatore di riferimento. I casi con follow-up mancante o covariate incomplete sono stati esclusi dalla modellizzazione prognostica.

Motivazione della dimensione del campione (Scoperta e validazione)
La fase di scoperta utilizzò un disegno accoppiato TDLN-TMLN per massimizzare il contrasto all'interno del paziente e ridurre la varianza interindividuale, controllando la molteplicità a FDR = 0,05. Per la coorte di validazione (n = 120), l'espressione POSTN è stata dicotomica al punto di taglio determinato da X-tile (Alto/Basso = 40/80). Date 48 eventi di sopravvivenza senza malattia (DFS) e α = 0,05, un'approssimazione di Schoenfeld indica ≥ 80% di potenza nel rilevare rapporti di rischio clinicamente rilevanti di circa HR ≥ 2,3 con una distribuzione uguale; questo è coerente con la dimensione dell'effetto osservata (HR = 2,31, IC 95% 1,41-3,77).

Definizione di positività di HER2
La positività HER2 ha seguito i criteri ASCO/ CAP^{contemporanei 13}: immunoistochimica (IHC) 3+ definita come colorazione uniforme intensa della membrana nel >10% delle cellule tumorali, o ibridazione in situ amplificata (ISH) definita come un rapporto HER2/CEP17 ≥2,0 con un numero medio di copie HER2 ≥4,0 segnali per cellula. I risultati dell'IHC 2+ sono stati sottoposti a riflesso ISH con riconteggio cieco di ≥20 cellule tumore invasive per confermare lo stato di amplificazione.

Elaborazione dei tessuti e isolamento dell'RNA
Tutte le procedure sono state eseguite sul ghiaccio salvo specifico, utilizzando consumabili senza RNasi. Per ogni campione con ≤ tessuto da 100 mg, è stata effettuata l'omogeneizzazione con 1 mL di reagente acido guanidinio-tiocianato-fenolo-cloroformio (AGPC), seguita dall'aggiunta di 200 μL di cloroformio con un collage vigoroso di 15 secondi e un'incubazione a temperatura ambiente di 2-3 minuti. La separazione di fase è stata ottenuta tramite centrifugazione a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Lo strato acquoso è stato quindi trasferito in un tubo fresco e l'RNA è stato precipitato con 500 μL di isopropanolo dopo un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente. La pelletatura è stata completata a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Il pellet è stato lavato con 1 mL di etanolo al 75% e centrifugato a 7.500 g per 5 minuti a 4 °C, asciugato all'aria per 5-10 minuti e sciolto in acqua priva di RNasi. Una digestione DNase I in colonna è stata utilizzata quando si sospettava un trasferimento genomico di DNa. I checkpoint visivi includevano una separazione di fase chiara dopo l'estrazione del cloroformio e un pellet traslucido intatto dopo la precipitazione di isopropanolo. La risoluzione dei problemi includeva la ripetizione del lavaggio all'etanolo per rapporti bassi A260/230 e l'estensione delle precipitazioni o l'assicurazione del raffreddamento durante la pelleting per ottenere basse rese.

Controllo qualità dell'RNA
La quantificazione utilizzava la spettrofotometria per monitorare A260/280 e A260/230 con bersagli intorno a 1,8-2,1, completati da misurazioni fluorometriche per maggiore precisione. L'integrità è stata valutata su un sistema di elettroforesi microfluidica e ha richiesto un RIN ≥ 7.0. Picchi distinti del rRNA 18S/28S e l'assenza di un test genomico di DNA sono stati utilizzati come criteri di accettazione; Le soglie di fallimento dei campioni sono state riestratte o escluse.

Preparazione della biblioteca
Sono state costruite librerie di mRNA con catene con selezione poli(A) per RNA intatto, mentre la deplezione dell'rRNA è stata permessa per input parzialmente degradati. L'input tipico era ≥ 1 μg di RNA totale per libreria. La frammentazione è stata eseguita vicino a 94 °C per 8 minuti; sintesi del cDNA a primo filamento a 50 °C per 50 minuti; sintesi del secondo filamento a 16 °C per 60 minuti; legazione dell'adattatore a 20 °C per 15 minuti; e l'amplificazione PCR utilizzava 10-12 cicli regolati per evitare un'amplificazione eccessiva. Le pulizie utilizzavano rapporti a perle intorno a 0,8x-1,0x, e la distribuzione prevista delle dimensioni della libreria era di 300 bp, inclusi gli adattatori. La qualità della libreria è stata verificata tramite elettroforesi microfluidica; La contaminazione da adattatore e dimero ha portato a una pulizia più rigorosa, e le distribuzioni eccessivamente ampie delle dimensioni sono state corrette accorciando modestamente la frammentazione.

Sequenziamento
Le librerie indicizzate erano sequenziate in modalità a estremità accoppiata a 150 bp (PE150), puntando a 30 milioni di coppie di lettura per libreria. La qualità a livello di run richiedeva Q30 ≥ 90% e densità di cluster stabili con un bias di corsia minimo. Le librerie sono state randomizzate tra le corsie per mitigare gli effetti del batch, ed eseguire registri, documentare le assegnazioni delle corsie e qualsiasi controllo sentinella utilizzato per monitorare la contaminazione incrociata.

Analisi computazionale ed espressione differenziale
Le analisi sono state condotte in R (v4.3.2) su Linux. La qualità della lettura grezze è stata valutata con FastQC (v0.11.9). Il taglio di adattatore e qualità veniva eseguito con fastp (v0.23.4) utilizzando il rilevamento automatico degli adattatori, rifinitura a finestra scorrevole (dimensione finestra 4 bp; media Phred Q ≥ 20), una lunghezza minima di lettura di 50 bp e ritaglio poli-G quando venivano rilevate le chimiche rilevanti. Le letture sono state allineate al genoma di riferimento GRCh37/hg19 utilizzando HISAT2 (v2.2.1) con parametri di strandness appropriati alla libreria e indici noti del sito splice. I conteggi a livello gene venivano generati con featureCounts (Subread v2.0.3) rispetto a GENCODE v19 utilizzando il conteggio a estremità abbinata, la gestione delle letture chimeriche, impostazioni multi-mapper e il corretto flag di strandness. I geni a basso numero sono stati filtrati richiedendo conteggi ≥ 10 in almeno tre campioni. L'analisi dell'espressione differenziale (DE) è stata effettuata utilizzando DESeq2 (v1.40.2) sotto un disegno accoppiato (progetto = ~ coppia + condizione) per confrontare TMLN con TDLN, con normalizzazione predefinita del fattore di dimensione e riduzione del fold log2 tramite apeglm. I potenziali valori eccezionali sono stati valutati utilizzando la distanza di Cook. La molteplicità a livello di trascrictoma fu controllata utilizzando il tasso di falsa scoperta di Benjamini-Hochberg (FDR). La significanza era definita come FDR < 0,05 e una soglia assoluta log2 di variazione fold (|log2FC|) ≥ 1. Il framework binomiale negativo di DESeq2 fornisce una modellizzazione media-varianza appropriata per i dati di conteggio e stabilisce le stime del fold-change in coorti piccole o moderate. Come analisi di sensibilità, abbiamo rieseguito test DE utilizzando edgeR e limma-voom con gli stessi criteri di filtraggio e soglie FDR, che hanno prodotto segnali concordanti di alto livello, supportando la robustezza delle principali scelte di analisi.

Arricchimento funzionale (GO e KEGG)
L'annotazione funzionale veniva eseguita in R utilizzando clusterProfiler (v4.8.3). I DEG a rialzo e a basso sono stati analizzati separatamente. Gli identificatori genici sono stati mappati agli ID genici Entrez (organismo: Homo sapiens) prima dell'arricchimento. L'arricchimento dell'Ontologia Genica (GO) è stato condotto utilizzando enrichGO (OrgDb: org. Hs.eg.db; ONT = BP/CC/MF; pAdAjustMethod = "BH"; pvalueCutoff = 0,05; qvalueCutoff = 0,05), e l'arricchimento delle vie KEGG è stato condotto utilizzando enrichKEGG (organismo = "has"; pAdajustMethod = "BH"; pvalueCutoff = 0,05; qvalueCutoff = 0,05). L'universo di fondo è stato definito come tutti i geni espressi mantenuti dopo il filtraggio a basso numero nell'analisi DE. I termini arricchiti sono stati inoltre filtrati per mantenere insiemi genici con 10-500 geni annotati (minGSSize = 10; maxGSSize = 500). Le visualizzazioni sono state generate utilizzando ggplot2 (v3.5.1) e ComplexHeatmap (v2.16.1), inclusi punti grafici del rapporto genico e valori -log10 (P aggiustati); il termine "vie di risposta immunitaria" si riferisce a moduli GO curati che coprono il processamento e la presentazione degli antigeni, la segnalazione dell'interferone e l'attivazione dei linfociti.

Interrogatorio esterno su database
I geni candidati sono stati esaminati in risorse esterne per fornire un contesto ortogonale. L'espressione tumorale versus mRNA normale è stata interrogata utilizzando GEPIA2 (v2.0) con campioni di carcinoma mammario invasivo TCGA (TCGA-BRCA) confrontati con tessuti mammari normali (normali GTEx/TCGA, se disponibili). I valori di espressione riportati da GEPIA2 (log2[TPM+1]) e il suo framework statistico predefinito per i confronti di gruppo sono stati utilizzati per generare boxplot e valori P per ciascun gene interrogato. La localizzazione a livello proteico è stata valutata utilizzando l'Human Protein Atlas (HPA) esaminando immagini immunoistochimiche e annotazioni dall'Tissue Atlas and Pathology Atlas per il tessuto mammario/cancro e registrando l'intensità di colorazione e il compartimento cellulare riportati (ad esempio, stromale vs epiteliale) quando disponibili.

Validazione qRT-PCR
I tessuti linfonodici indipendenti sono stati processati come sopra per estrarre l'RNA totale, e il cDNA è stato sintetizzato da 1 μg di RNA in reazioni di trascrizione inversa da 20 μL. La PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) veniva eseguita utilizzando chimica basata su SYBR, con ogni reazione contenente 1x master mix e 0,2-0,4 μM di ciascun primer. La specificità dell'innesco è stata confermata da profili a curva di fusione a singolo picco, e l'efficienza dell'amplificazione è stata valutata utilizzando curve standard a serie di diluizione, con efficienze accettabili definite come 90%-110%. Ogni campione è stato analizzato in triplicata tecnica; le repliche dovevano rispettare una SD di soglia di ciclo (Ct) ≤ 0,3. L'espressione genica è stata normalizzata in GAPDH (o un altro gene di riferimento validato, dove applicabile), e l'espressione relativa è stata calcolata utilizzando il metodo 2^-ΔΔCt. La normalità è stata valutata utilizzando i test di Shapiro-Wilk; i confronti tra gruppi utilizzavano test t bilaterali per dati approssimativamente normali o test Mann-Whitney U in altro modo.

Analisi prognostica nella coorte di validazione
La sopravvivenza senza malattia (DFS) era il primo punto di riferimento e veniva calcolata dalla data dell'intervento fino al primo evento di recidiva documentato o all'ultimo controllo (censurato). Per l'analisi primaria, l'espressione di POSTN è stata dicotomatizzata al punto di taglio determinato da X-tile (Alto vs Basso = 40/80); Le analisi di sensibilità utilizzavano punti di taglio alternativi come i tertili. Sono state utilizzate curve di Kaplan-Meier e test log-rank per confronti univariabili. I modelli multivariabili Cox a rischio proporzionale erano adatti a stimare i rapporti di rischio (HR) e gli intervalli di confidenza al 95%, aggiustando a priori per età, dimensione del tumore, stato linfonodale, grado istologico e stato del recettore. L'assunzione dei rischi proporzionali è stata valutata utilizzando i residui di Schoenfeld, la collinearità è stata esaminata utilizzando fattori di varianza-inflazione e le osservazioni influenti sono state valutate tramite dfbeta. Analisi complete dei casi sono state effettuate dopo aver escluso i casi con follow-up mancante o covariate incomplete, come descritto sopra.

Statistiche generali e reportage
Salvo diversa indicazione, i dati sono riassunti come media ± SD o mediana (IQR), si utilizzano test bilaterali e p < 0,05 è considerato statisticamente significativo. Per analisi a livello di trascrizione e arricchimento, la molteplicità è controllata con BH-FDR, e le dimensioni degli effetti sono accompagnate da intervalli di confidenza del 95% ogni volta che possibile.

Sicurezza e smaltimento dei rifiuti
I reagenti fenolo-guanidinio e i solventi organici venivano maneggiati in una cappa termica certificata con camice da laboratorio, guanti in nitrile e protezione dagli schizzi. I rifiuti organici e alogenati venivano segregati in contenitori etichettati e smaltiti secondo le politiche istituzionali. I rifiuti biologici venivano autoclavati o disinfettati chimicamente prima dello smaltimento, e superfici e strumenti venivano decontaminati con soluzioni inattivanti RNasi. I pericoli specifici dei reagenti, come corrosività e tossicità, sono stati documentati nelle procedure standard di laboratorio e osservati durante tutte le procedure.

Risultati

Coorti e caratteristiche clinicopatologiche
La coorte di scoperta era composta da 6 campioni accoppiati TDLN/TMLN, mentre la coorte di validazione comprendeva 120 campioni di linfonodi archivistici con follow-up longitudinale. Le caratteristiche clinicopatologiche di base per entrambe le coorti, inclusi età, dimensione del tumore, grado, stato del recettore e stato nodale, sono riassunte nella Tabella 1.

Qualità del sequenziamento e struttura dati g...

Discussione

Il cancro al seno HER2-positivo è caratterizzato da un'invasività aumentata, frequenti metastasi linfonodiche (LNM) e risultati inferiori nonostante la terapia sistemica moderna¹⁵. I fattori clinicopatologici convenzionali spiegano solo parzialmente la prognosi in questo sottotipo, lasciando una lacuna per marcatori biologicamente fondati che catturano il rischio di diffusione^{nodale 16}. Attraverso il profiling comparativo dei linfo...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bioanalizzatore	2100-BA	Agilent, USA	Apparecchiature per la valutazione dell'integrità e del controllo qualità dell'RNA.
DESeq2	N/A	R Bioconductor	Software di analisi di espressione differenziale per dati RNA-seq.
FastQC Software	N/A	Babraham Bioinformatica	Software di controllo qualità per i dati RNA-seq per valutare la qualità della sequenza.
Linea cellulare HEK293	ATCC-CRL-1573	ATCC, USA	Linea cellulare renale embrionale umana utilizzata per esperimenti di trasfezione.
Kit qRT-PCR	4385616	ThermoFisher, USA	Kit quantitativo PCR per la validazione dell'espressione genica.
Kit di estrazione RNA	74204	Qiagen, Germania	Kit di estrazione RNA utilizzato per isolare RNA di alta qualità da campioni di tessuto.
Kit di sequenziamento dell'RNA	RS-122-2001	Illumina, USA	Kit di preparazione della libreria RNA per il sequenziamento dei campioni di RNA.
Piattaforma di sequenziamento	NovaSeq 6000	Illumina, USA	Piattaforma di sequenziamento RNA ad alto rendimento per il sequenziamento delle librerie di RNA.
Apparecchiature per il congelamento dei tessuti	TFE-300	Thermo Fisher, USA	Attrezzatura per congelare campioni di tessuto in azoto liquido.
Termometro timpanico	55678-TT	ThermoScience, Giappone	Termometro preciso usato per la misurazione della temperatura corporea.