Standardizzazione del modello MCAO intraluminale Rat: un protocollo dettagliato con misure di controllo della qualità

Sommario

Questo protocollo dimostra una tecnica ottimizzata di 60 minuti per l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) nei ratti. Il protocollo viene convalidato utilizzando approcci multimodali, raggiungendo un tasso di successo dell'87,5% con mortalità minima e producendo esiti riproducibili per infarti e comportamenti per la ricerca sull'ictus.

Abstract

Il modello dell'occlusione dell'arteria cerebrale media del ratto (MCAO) rimane lo standard di riferimento per chiarire la fisiopatologia dell'ictus ischemico e per convalidare le terapie neuroprotettive. Deviazioni chirurgiche sottili, tuttavia, possono alterare profondamente il volume dell'infarto e gli esiti comportamentali. Utilizzando un framework "visualizza-then-sistematiza", abbiamo riesaminato ogni fase dell'istituzione e della validazione del modello. È stata effettuata una documentazione fotografica dettagliata dei principali punti di riferimento chirurgici e dei passaggi critici per standardizzare l'orientamento anatomico e la disposizione dei filamenti. La colorazione con cloruro di 2,3,5-Trifeniltetrazolio (TTC) è stata utilizzata per mappare con precisione il volume e la topologia degli infarti a 24 ore e 72 ore dopo la reperfusione. I deficit neurologici sono stati valutati con le scale di Zea-Longa, Bederson e Garcia modificate. Ventiquattro maschi di ratti Sprague-Dawley hanno subito 60 minuti di MCAO transitorio; Volume dell'infarto e punteggi neurologici sono stati valutati a 24 ore e 72 ore. Circa l'87,50% degli animali ha raggiunto con successo il blocco del flusso sanguigno cerebrale (Zea-Longa ≥ 1 e infarto definito inequivocabilmente TTC), con una mortalità complessiva del 12,50%, a testimonianza dell'elevata fedeltà del modello. Questo protocollo standardizzato fornisce una base tecnicamente raffinata e riproducibile per la ricerca preclinica sull'ictus, facilitando la coerenza interlaboratoriale negli studi che indagano la fisiopatologia dell'ictus e gli interventi terapeutici.

Introduzione

L'ictus è la seconda causa principale di morte e la terza causa di disabilità a livello^{mondiale 1,2}. L'ictus colpisce in modo sproporzionato i paesi a basso e medio reddito, dove si verifica, in media, 15 anni prima rispetto ai paesi ad alto^{reddito 1}. I due principali tipi sono ictus ischemico (85%) ed emorragia intracerebrale (15%⁾³. L'ictus ischemico, che rappresenta la stragrande maggioranza degli ictus, deriva da un blocco del flusso sanguigno cerebrale, che porta a morte cellulare e infarto^{cerebrale 4}. La cascata ischemica coinvolge molteplici eventi biochimici, inclusi processi proossidanti^{significativi 5,6}.

Nonostante gli ampi sforzi preclinici e clinici, solo poche terapie—in particolare la trombolisi endovenosa con attivatore tissutale plasminogeno e trombectomia meccanica—si sono dimostrate efficaci, e questi trattamenti sono limitati da ristrette finestre terapeutiche e criteri rigorosi di selezione del paziente. Di conseguenza, è urgente chiarire i meccanismi cellulari e molecolari alla base della lesione ischemica, della riparazione neurovascolare e del recupero post-ictus. Un modello animale riproducibile e clinicamente rilevante è indispensabile per raggiungere questo obiettivo.

Il modello dell'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) è ampiamente utilizzato per esplorare l'ictus ischemico^{nei roditori 7,8}. Il metodo di occlusione del filamento intraluminale è una delle tecniche MCAO più classiche e ampiamente^utilizzate. Questa tecnica può modellare sia occlusioni permanenti che transitorie senza richiedere craniectomia. Una tecnica transfemorale più recente che utilizza fili endovascolari ha mostrato potenzialità per l'indotta di MCAO transitorio nei ratti, offrendo risultati più^{coerenti 10}. Questo modello prevede l'occlusione dell'arteria cerebrale media, tipicamente utilizzando una tecnica del filamento^{intraluminale 11}. MCAO causa ipoperfusione cerebrale focale, portando a ischemia e lesioni da^{reperfusione 12}.

Sebbene l'MCAO sia preziosa per l'indagine sulla fisiopatologia dell'ictus e sui potenziali trattamenti, può produrre volumi di lesione^{variabili 7}. Pertanto, miglioramenti al modello MCAO — come il perfezionamento delle tecniche di reperfusione, l'istituzione di protocolli operativi standardizzati e lo sviluppo di criteri di valutazione unificati — possono ridurre la variabilità nella localizzazione e nel volume dell'infarto, aumentando così la sua utilità nella ricerca sull'ictus ischemico.

Questo protocollo richiede una curva di apprendimento di circa 10–15 interventi chirurgici per ottenere risultati^{coerenti 13}. I tassi di successo possono variare in base all'esperienza dell'operatore e alla ceppa^{del ratto 14}. Il modello è adatto allo studio dell'ictus ischemico acuto ma potrebbe non replicare completamente le comorbidità umane come ipertensione o^{diabete 15}. Di conseguenza, abbiamo cercato di ideare e validare rigorosamente un protocollo MCAO ottimizzato che miri a ridurre la variabilità sperimentale attraverso procedure standardizzate e rigorose misure di controllo della qualità. Quattro innovazioni complementari sono state integrate per ottenere un doppio guadagno in standardizzazione e affidabilità dei dati: (1) Valutazione longitudinale a doppio punto temporale—i punteggi neurologici delle scale Zea-Longa, Bederson e Garcia modificata sono stati ottenuti in parallelo con volumi di infarto derivati dal cloruro di 2,3,5-Trifeniltetrazolio (TTC) a 24 ore e 72 ore dopo la reperfusione, delineando la relazione temporale tra risoluzione dell'edema e recupero funzionale; (2) Validazione incrociata a tripla scala—punteggio in cieco con doppio investigatore e calibrazione integrata a tri-scale aumentava significativamente la sensibilità e la precisione della valutazione comportamentale; (3) Ipotermia a sezioni rapide su tutto il corso — è stata istituita una procedura operativa standard (SOP) di "estrazione da bagno di ghiaccio a 90 secondi seguita da taglio coronale a un solo passo di 2 mm in stampi pre-raffreddati" per minimizzare l'autolisi e l'errore umano, garantendo misurazioni volumetriche ad alta fedeltà; (4) Un quadro integrato di controllo qualità—un SOP completo che abbraccia digiuno preoperatorio, controllo della profondità anestesia, termoregolazione preoperatoria e prevenzione della contaminazione incrociata, è stato costruito per fornire una procedura operativa standard MCAO riproducibile e facilmente trasferibile, ponendo una solida base per la coerenza inter-laboratorio e la comparabilità tra gli studi incrociati.

Protocollo

L'esperimento è stato approvato e supervisionato dal Comitato per gli Esperimenti Istituzionali sugli Animali e il Benessere Sperimentale degli Animali della Capital Medical University. Tutti i protocolli conformi alla Guida NIH per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio (NIH Publ. 80-23, 1996 revisione), sono necessarie attrezzature sterili e tecniche asettiche.

1. Selezione degli animali

1. Utilizzare maschi di ratti Sprague-Dawley (di età compresa 6–8 settimane, con un peso di 240–270 g) ottenuti da un fornitore certificato di animali da laboratorio (Licenza n. SCXK (Pechino) 2021-0011) per stabilire un modello di MCAO.
2. Alloggiare gli animali convenzionalmente con cibo e acqua ad libitum; tutte le procedure seguivano il Codice Etico Internazionale.
3. Utilizzare i seguenti criteri basati sul peso corporeo animale per la selezione della dimensione del filamento, al fine di garantire un'occlusione coerente:
   - 220–250 g: diametro 0,33–0,35 mm
   - 250–280 g: diametro 0,35–0,38 mm
   - 280–310 g: diametro 0,38–0,40 mm
   NOTA: Queste specifiche tengono conto degli aumenti legati all'età del diametro del vaso e riducono l'incidenza di SAH o occlusione^{incompleta 13}.

2. Dimensione del campione

1. Calcola la dimensione del campione utilizzando un software di calcolo della dimensione del campione. Basandosi su dati preliminari che mostrano un volume di infarto atteso del 35% ± 10% (media ± SD) nel gruppo MCAO contro 0% ± 2% nel gruppo SHAM, stima una dimensione dell'effetto (d di Cohen). Per un test Mann-Whitney U a due code (alternativa non parametrica al test t), con α = 0,05 e potenza (1-β) = 0,80, calcolare una dimensione minima del campione.
   NOTA: La dimensione dell'effetto è stata stimata in 3,5 e la dimensione minima del campione era di 6 animali per gruppo.
2. Per tenere conto della mortalità prevista (12,5%) e del tasso di esclusione (5–10%), includete 24 ratti nel gruppo MCAO e 6 ratti nel gruppo SHAM, fornendo una potenza adeguata (>0,90) per il punto finale primario (volume dell'infarto a 24 ore).

3. Criteri di inclusione ed esclusione

1. Includere gli animali se soddisfacevano i seguenti criteri: (1) maschi di ratti Sprague-Dawley, 240–270 g, 6–8 settimane; (2) assenza di deficit neurologici preesistenti (punteggio neurologico preoperatorio = 0); (3) induzione riuscita dell'anestesia senza complicazioni.
2. Escludere gli animali dall'analisi se presentavano: (1) emorragia subaracnoidea (SAH) evidente alla necropsia; (2) morte prematura (<24 ore dopo la reperfusione) non correlata all'intervento sperimentale; (3) occlusione fallita (punteggio neurologico = 0 e assenza di infarcto definito per la TTC); (4) guasto chirurgico tecnico (ad esempio, rottura della CCA).
   NOTA: Questi criteri sono stati predefiniti prima dell'inizio dello studio per minimizzare il bias di selezione.
3. Politica di sostituzione animale: Sostituire solo gli animali esclusi a causa di un guasto chirurgico tecnico o della morte intraoperatoria per mantenere la potenza statistica. Non sostituire gli animali con modellazioni fallite (occlusione fallita), ma segnalarli come parte del calcolo del tasso di successo per evitare una riduzione artificiale della variabilità.

4. Preparazioni pre-chirurgiche

1. Prepara strumenti autoclavi, filamento sterile e un campo drappeggiato.
2. Non è richiesta una digiuna di routine; Quando necessario, limita la durata del digiuno a 2–4 ore. Indurre l'anestesia con isoflurano (3–4%) e mantenerla all'1,5–2% nel 30–40% di O₂ durante la procedura. Confermare la profondità dell'anestesia perdendo il riflesso di raddrizzamento e la pizzicatura del dito del piede.
3. Mantieni la temperatura corporea a 37 ± 0,5 °C utilizzando una borsa riscaldante controllata a feedback con monitoraggio della temperatura rettale.
4. Rasi il collo e il cuoio capelluto, poi pulisci l'area con povidone-iodio, seguito dal 70% di etanolo.
5. Somministrare buprenorfina (0,05 mg/kg, sottocutaneo) 30 minuti prima dell'intervento e ogni 12 ore postoperatorie per 48 ore, oppure melossicam (1 mg/kg, sottocutaneo) una volta al giorno per 3^{giorni e 16}. Valutare il dolore monitorando il comportamento di toelettatura, la postura e l'attività spontanea; Fornisci ulteriori analgesi se persistono i segni di disagio.

5. Occlusione dell'MCA

1. Posizionare il ratto in posizione dorsale giù con la testa delicatamente estesa per esporre il collo ventrale.
2. Fai un'incisione cervicale a metà linea (1,5–2,0 cm) usando forbici per l'iride.
3. Separare senza brivido i muscoli sternomastoideo e omohioideo usando una pinza curva per esporre la biforcazione dell'arteria carotide comune sinistra (CCA).
4. Legare l'arteria carotide esterna (ECA) distalmente con una sutura permanente di seta 4-0 e prossimalmente con una legatura temporanea. Crea una piccola incisione tra le due legature ECA usando delle microforbici.
5. Occluse temporaneamente la CCA e l'arteria carotide interna (ICA) utilizzando pinze microvascolari (pressione di 60 g).
6. Inserire un monofilamento rivestito di silicone 4-0 (diametro 0,35–0,40 mm) attraverso l'incisione ECA. Avanzala retrogradamente nel CCA, poi reindirizzala nell'ICA oltre la biforcazione del CCA.
   NOTA: Assicurarsi che il filamento entri nell'ICA verso la base cranica, non verso l'arteria pterigopalatina (PPA) che si dirama lateralmente. Se si riscontra resistenza a <10 mm, si ritrae il filamento, ruota la testa dell'animale di 30° verso il lato controlaterale e avanza di nuovo per reindirizzare oltre l'origine PPA.
7. Avanzare il filamento di 18–20 mm dalla biforcazione CCA finché una leggera resistenza indica un'occlusione dell'origine MCA. Verifica la profondità utilizzando la linea di riferimento pre-contrassegnata sul filamento (posizionata 2 mm prossimale al tappo in silicone), misurata con un calibro dal punto di inserimento del moncone ECA. Rilascia la morsa CCA una volta che il filamento è in posizione.

6. Reperfusion

1. Dopo 60 minuti di occlusione, riapri l'incisione e allenta la legatura temporanea dell'ECA.
2. Ritira delicatamente il filamento finché la punta non supera il moncone dell'ECA, ripristinando così il flusso sanguigno. Posiziona prontamente una legatura permanente prossimale al moncone per prevenire l'epistaggio di epistassi. Chiudi la ferita a strati.
3. Trasferire il ratto in una gabbia di recupero riscaldata per un monitoraggio continuo.

7. Chirurgia fittizia

1. Prepara l'animale seguendo la stessa procedura descritta sopra per MCAO (digiuno, anestesia, controllo della temperatura, drappeggiamento sterile).
2. Eseguire l'esposizione a incisione cervicale e biforcazione CCA come sopra.
3. Disseziona ed espone il recipiente. Non inserire il filamento.
4. Lasciamo che le arterie rimangano patenti; Non indurre ischemia cerebrale.
5. Chiudi l'incisione a strati dopo 10 minuti di esposizione. Trasferire l'animale in una gabbia riscaldata per il recupero per il monitoraggio.

8. Punteggi neurologici postoperatori

1. Valutare a 24 ore e 72 ore dopo la reperfusione, immediatamente prima del sacrificio per la misurazione del volume dell'infarcto.
2. Abitua l'animale in una stanza silenziosa, a 25 °C per 30 minuti.
3. Avere due investigatori indipendenti ciechi all'assegnazione dei gruppi. Far registrare i punteggi a ogni investigatore su fogli separati senza consultazione; Qualsiasi differenza tra valutatori ≥1 punto innesca una rivalutazione.
4. Scale (in ordine di somministrazione): eseguire punteggi^{Zea-Longa 17} (Tabella 1), Bederson¹⁸ (Tabella 2) e Garcia¹⁹ Modificato (Tabella 3), seguendo i protocolli più recenti pubblicati per criteri coerenti.
5. Usa la media dei due osservatori per l'analisi statistica. Escludi i dati di qualsiasi animale se i punteggi medi differiscono del >10% e sostituisci con un nuovo soggetto.

9. Misurazione del volume dell'infarto cerebrale

1. A 24 ore e 72 ore dopo la reperfusione, anestesiare profondamente i ratti con il 5% di isoflurano. Confermare l'anestesia profonda perdendo il riflesso di raddrizzarsi e la risposta al pizzicamento delle dita, insieme a una respirazione stabile, prima di procedere.
2. Rimuovere rapidamente il cervello entro 90 secondi dalla conferma dell'anestesia profonda, risciacquare con PBS ghiacciato e tagliare in fette coronali di 2 mm usando una matrice cerebrale di ratto raffreddata. Durante il taglio a fanno, rispetta le seguenti precauzioni
   1. Tieni l'intera procedura sul ghiaccio a 0–4 °C; Preleva il cervello entro 90 secondi e posizionalo piatto in una matrice pre-raffreddata.
   2. Usa una lama affilata per effettuare tagli singoli e puliti per sezioni coronali precise da 2 mm, raccogliendo ogni fetta in ordine rostro-caudale in PBS gelato.
   3. Pulire immediatamente la matrice e la lama con etanolo al 75% tra gli animali per evitare contaminazioni incrociate.
3. Dopo aver preriscaldato il 2% a 37 °C, immergi completamente le fette e incuba al buio per 20 minuti, facendo girare delicatamente ogni 5 minuti a 20 minuti.
4. Ferma subito la reazione risciacquando tre volte con PBS a 4 °C. Poi fissa il 4% di paraformaldeide a 4 °C durante la notte.
5. A 300 dpi, fotografa entrambi i lati di ogni fetta una volta.
   1. Usa un'illuminazione fissa su uno sfondo bianco per eliminare ombre e riflessi.
   2. Stendi le fette piatte senza sovrapposizione e include una barra di scala e un'etichetta ID in ogni fotogramma. Tieni la macchina fotografica perpendicolare alle sezioni e mantieni costanti la lunghezza focale e il bilanciamento del bianco per tutta la durata.
6. Quantifica il volume dell'infarto usando ImageJ.
   1. Importare l'immagine a 300 dpi (formato RGB) e convertirla in scala di grigi a 8 bit (Immagine > Tipo > 8 bit).
   2. Applica l'auto-thresholding di Otsu (Immagine > Regola > Soglia Automatica > seleziona Otsu) per separare l'infarto (bianco) dal tessuto vitale (rosso).
   3. Usa lo strumento di selezione a mano libera per delineare il confine dell'emisfero ipsilaterale.
   4. Misura l'area (Analizza > Misura) e registra il conteggio dei pixel.
   5. Calcola il volume dell'infarto: Σ (area dell'infarto × spessore della fetta [2 mm]) × (volume dell'emisfero controlaterale/volume dell'emisfero ipsilaterale), espressi come percentuale dell'emisfero controlaterale.

10. Analisi statistica

1. Presentare i dati come media ± deviazione standard (SD) o mediana [intervallo interquartile] a seconda di opportunità.
2. Effettuare confronti tra gruppi utilizzando il test Student's t non accoppiato o il test Mann-Whitney U per dati non distribuiti normalmente.
3. Stabilire la significanza statistica a P < 0,05. Esegui tutte le analisi utilizzando un software di analisi statistica appropriato.

Risultati

Gli animali sono stati assegnati casualmente a gruppi di sopravvivenza post-reperfusione di 24 ore (n = 10) o 72 ore (n = 10) per la colorazione terminale della TTC. Altri 4 ratti hanno subito MCAO ma sono deceduti prima del termine previsto (tasso di mortalità 12,5%). Il gruppo SHAM comprendeva n = 6. Quindi, il numero totale di animali utilizzati era di 30 (24 MCAO + 6 SHAM).

I ratti hanno subito una MCAO di 60 minuti per indurre ischemia cerebrale (Figura 1). La reperfusione è stata avviata rimuovendo il filamento intraluminale e rilasciando la legatura prossimale all'ECA. Tra i 24 ratti MCAO, 3 morirono entro 72 ore; uno mostrava un infarto esteso al tentativo di colorazione post-mortem entro 24 ore, mentre l'altro morì per cause indeterminate entro 72 ore. Due ratti aggiuntivi sono stati esclusi a causa di modellazione inefficace (i punteggi neurologici non soddisfacevano i criteri e la colorazione della TTC non ha rivelato infarto). Così, il tasso di mortalità a 72 ore era del 12,50%. Abbiamo definito l'istituzione con successo del modello come sopravvivenza per 24 ore più un punteggio di Longa di 1–3 e il tasso di modellazione di successo ha raggiunto l'87,50%.

La funzione neurologica è stata valutata a 24 ore e 72 ore dopo l'insorgenza dell'ictus (prima della misurazione del volume dell'infarcto). Tre scale più comunemente utilizzate in letteratura — Zea-Longa, Bederson e Garcia modificata — sono state impiegate per fornire una valutazione completa (Figura 2). A 24 ore, i ratti (n = 20) hanno ottenuto un punteggio di 2,02 ± 0,41 sulla scala Zea-Longa, 2,80 ± 0,41 sulla scala di Bederson e 8,15 ± 1,18 sulla scala Garcia modificata; questi deficit rimasero marcati a 72 ore (Zea-Longa: 1,65 ± 0,59; Bederson: 1,93 ± 0,38; Garcia modificato: 11.00 ± 1.34). Il volume dell'infarto, espresso in percentuale dell'emisfero controlaterale, era di 37,61 ± 2,81% a 24 ore dopo MCAO e diminuito a 28,32 ± 4,18% a 72 ore.

Figura 1: Diagramma schematico della fisiologia arterio-cerebrale sinistra e dell'embolia dell'arteria cerebrale media nel ratto. Diagramma schematico di (A) anatomia arterio-cervico-cerebrale, (B) pre-inserimento, (C) post-inserimento e (D) malposizionamento del filamento nell'arteria pterigopalatina. CCA: arteria carotide comune; ICA: arteria carotide interna; ECA: arteria carotide esterna; PPA: arteria pterigopalatina; MCA: arteria cerebrale media. "Triangolo nero": il sito dell'incisione; Linea blu: il filamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Misurazione del volume dell'infarto e valutazione neurologica comportamentale dopo l'occlusione dell'arteria cerebrale nei ratti. (A) Colorazione delle sezioni cerebrali TTC. (B) Il volume dell'infarto a 72 h è inferiore a quello a 24 h. (C,D) I punteggi Zea-Longa e Bederson a 72 h sono inferiori rispetto a quelli a 24 h. (E) I punteggi Garcia modificati a 72 h sono più alti di quelli a 24 h. ****P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Manifestazione	Punteggio / punti
Nessun deficit neurologico	0
Arto anteriore controlaterale fletto e addotto durante la sospensione della coda (lieve deficit neurologico)	1
Girare spontaneamente verso il lato controlaterale mentre striscio (deficit neurologico moderato)	2
Cadere sul lato controlaterale quando si sta in piedi o si cammina	3
(grave deficit neurologico)
Nessun movimento spontaneo accompagnato da una coscienza compromessa	4

Tabella 1: punteggio Zea-Longa^.

Manifestazione	Punteggio/punti
Afferra la coda dell'animale e sollevala in modo che il corpo sia sospeso a 10 cm sopra la panca. Nei ratti normali, entrambi gli arti anteriori rimangono estesi verso il pavimento. I ratti con deficit neurologici possono manifestare i seguenti comportamenti:
Nessun deficit neurologico	0
L'arto anteriore paretico è fletto e tenuto vicino all'addome, mentre l'arto non colpito si estende verso la panca	1
Oltre al comportamento descritto nel punto 1, la resistenza allo spinta laterale verso il lato paretico si riduce notevolmente quando l'animale viene posizionato a terra sulla panca	2
Oltre ai comportamenti descritti in 1 e 2, l'animale si sposta verso il lato paretico mentre cammina	3

Tabella 2: punteggio ^Bederson.

Voce	Manifestazione	Punteggio/punti
a) Movimento spontaneo	Attività normale	3
(Osserva l'attività del ratto nella sua gabbia per 5 minuti)	Leggermente compromesso	2
	Moderatamente compromettata	1
	Nessun movimento spontaneo	0
b) Movimento simmetrico degli arti	Postura simmetrica	3
	Postura asimmetrica	2
	Emisplegia	1
c) Allungamento dell'arto anteriore	Simmetrico	3
(Afferrare la coda e portare gli arti anteriori verso il bordo del tavolo; osservare l'estensione della zampa anteriore)	Leggermente asimmetrico	2
	Marcatamente asimmetrico	1
	Emisplegia	0
d) Presa e capacità di arrampicata	Sale forte con una presa salda	3
	Deficit unilaterale osservato	2
	Incapace di arrampicarsi o girare in cerchio	1
e) Riflesso tattile bilaterale sul corpo	Simmetrica su entrambi i lati	3
	Risposta lenta da un lato	2
	Nessuna risposta da una parte	1
f) Risposta tattile bilaterale delle vibrisse	Simmetrico	3
	Asimmetrico	2
	Nessuna risposta	1

Tabella 3: Punteggio Garcia modificato. Punteggio totale: 0–18 punti; Punteggi più alti indicano una migliore funzione neurologica.

Discussione

È importante chiarire che l'obiettivo principale di questo studio era la standardizzazione metodologica piuttosto che la scoperta biologica. Sviluppare un protocollo MCAO standardizzato è fondamentale per ridurre la variabilità inter-laboratorio e migliorare la riproducibilità nella ricerca sull'ictus ischemico. Questo protocollo migliora la trasparenza procedurale attraverso rigorose misure di controllo qualità e affronta le carenze tecniche comuni nella modellazione MCAO, inclusi l'inserimento standardizzato dei filamenti, la regolazione della temperatura e l'elaborazione istologica.

Sebbene la riduzione osservata del volume dell'infarto da 24 ore a 72 ore e il recupero neurologico parziale rappresentino fenomeni fisiopatologici attesi nel MCAO transitorio, il contributo di questo studio risiede nell'accertare l'affidabilità temporale di questi endpoint utilizzando una procedura rigorosamente standardizzata. Fornendo un quadro tecnico dettagliato e a tappe, questo protocollo garantisce che futuri studi meccanicistici—che indaghino cascate neuroinfiammatorie, vie apopttotiche o interventi terapeutici—siano basati su dati di base riproducibili e comparabili. Presentiamo esplicitamente questo lavoro come una risorsa tecnica coerente con l'ambito di JoVE, fornendo una base per la ricerca preclinica standardizzata sull'ictus piuttosto che per promuovere intuizioni meccanicistiche.

Diversi passaggi di questo protocollo sono particolarmente cruciali per garantire ischemia e reperfusione coerenti. Innanzitutto, avanzare con precisione la linea di occlusione fino a non avvertire una lieve resistenza è essenziale per ottenere un MCAO riproducibile, poiché una piccola deviazione nella profondità di inserimento può portare a un'occlusione incompleta o a un'emorragia subaracnoidea^20,21. In secondo luogo, mantenere una temperatura corporea normale intraoperatoria rigorosa (37 ± 0,5 °C) e una gestione della temperatura postoperatoria è fondamentale, poiché una temperatura corporea troppo bassa o troppo alta può alterare significativamente l'area dell'infarto e l'esito^{neurologico 12,22}. In terzo luogo, rimuovere rapidamente il cervello entro 90 secondi ed eseguire il raffreddamento con bagno di ghiaccio può minimizzare l'autolisi e mantenere l'integrità dei tessuti, garantendo così l'accuratezza della colorazione TTC e dell'analisi del^volume. Se questi passaggi potranno essere implementati in modo coerente, miglioreranno significativamente la fedeltà del modello e la comparabilità tra gli studi.

Abbiamo migliorato il metodo tradizionale MCAO per migliorarne la riproducibilità e la facilità d'uso. L'uso di stampi per fette cerebrali pre-raffreddate e protocolli standardizzati di slicing ha ridotto gli errori umani e gli artefatti di slice. Inoltre, l'adozione di una valutazione della funzione neurologica su tre scale (Zea-Longa, Bederson e Garcia modificato) da parte di due ricercatori ciechi ha aumentato la robustezza e la sensibilità della valutazione^funzionale 17,18,19. Attraverso procedure operative standard dettagliate che coprono ogni fase del programma, aiuta a identificare problemi comuni come la cattiva disposizione del filamento, la riperfusione precoce o l'ipotermia post-operatoria. Le linee guida per la risoluzione delle complicazioni comuni includono: (1) linea di occlusione spostata (ingresso PPA), riconosciuta per la mancanza di resistenza a 10–12 mm e miglioramento neurologico immediato—se riscontrate, ritrae immediatamente il filamento, ruota la testa dell'animale di 30° verso il lato controlaterale e riavanza con una leggera angulazione mediale verso la base cranica; (2) Riperfusione precoce, indicata da improvviso miglioramento neurologico durante l'occlusione—assicurarsi che il tappo in silicone sia ben fissato al moncone dell'ECA, verificare che il diametro del filamento corrisponda alla dimensione dell'arteria (0,35–0,40 mm per ratti da 240–270 g), e considerare l'uso di un filamento più lungo (aumentare il rivestimento in silicone di 0,5 mm) se persiste lo spostamento; e (3) ipotermia postoperatoria (temperatura rettale <36ºC)—aumentare la temperatura della borsa termica a 38 °C, posizionare una lampada termica 30 cm sopra l'animale e somministrare soluzione salina calda sterile (0,5 mL, intraperitoneale, 37ºC).

Nonostante questi progressi, questo protocollo presenta diverse limitazioni. Innanzitutto, la tecnica richiede una curva di apprendimento sostanziale (10–15 interventi chirurgici) per ottenere tassi di successo costanti, e variazioni individuali nell'anatomia vascolare del ratto possono influenzare il posizionamento dei^{filamenti 21,24}. In secondo luogo, l'attuale protocollo si basa su una verifica post-hoc (valutazione neurologica e colorazione TTC) piuttosto che sul monitoraggio intraoperatorio del flusso sanguigno cerebrale (LDF o LSCI), che limita il controllo di qualità durante l'intervento chirurgico e impedisce l'esclusione precoce di animali con occlusione^{incompleta 25}. In terzo luogo, la validazione è stata limitata ai maschi giovani di ratti Sprague-Dawley, limitando la generalizzazione a femmine, animali anziani e modelli^{comorbidi 26,27}. Gli studi futuri dovrebbero includere: (1) entrambi i sessi per affrontare il sesso come variabile biologica; (2) ratti anziani (12–18 mesi) con comorbidità vascolari; e (3) monitoraggio in tempo reale della CBF per aumentare la riproducibilità negli studi di intervento farmacologico.

Questo metodo è particolarmente prezioso nello screening preclinico dei farmaci, poiché la coerenza e la rilevanza traslazionale dei suoi risultati sono di importanza cruciale. Il protocollo standardizzato descritto in questo articolo offre grandi promesse per migliorare il rigore e la riproducibilità della ricerca sull'ictus ischemico. Le applicazioni future di questo protocollo includono: (1) screening preclinico degli agenti neuroprotettivi somministrati durante la finestra di reperfusione; (2) studi meccanicistici della lesione ischemia-reperfusione utilizzando i punti temporali di 24 e 72 ore; (3) indagine sulla neuroplasticità post-ictus e sul recupero funzionale; e (4) la validazione dei bersagli terapeutici in combinazione con interventi genetici o farmacologici. Fornendo SOP dettagliata e supportata da video, il nostro obiettivo è facilitare l'adozione diffusa di questo metodo in laboratori di vari livelli professionali, contribuendo infine a una ricerca preclinica sull'ictus più affidabile e clinicamente rilevante.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2% TTC staining solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T8170	25 g/bottle, ≥98 % purity
4% PFA	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	P1110	500 mL ready-to-use
Sutura assorbibile	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.	VCP345H	5-0 Vicryl
Forcipe Adson	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-11010	1×2 denti, 12 cm
Forcipe curvo Dumont	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-11052	11 cm lunghezza, punta fine 0,05 mm
Piani riscaldanti feedback	Shenzhen Reward Life Science & Technology Co., Ltd.	69001	37 ± 0,3 °C ciclo chiuso
ImageJ	National Institutes of Health	versione 1.53k
Forcipe per iride	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-14060	Punta curva, 10 cm
Clip per micro-vasi	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	JD-16010	Clip curvo 1,5 cm
Filo di seta non assorbibile	Shanghai Pudong Jin-Huan Medical Products Co., Ltd.	S-2304	Filo di seta nero 6-0
Software PASS	NCSS, LLC, Kaysville, UT, USA	versione 15.0	Software per il calcolo della dimensione del campione
Matrice cerebrale per ratti	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	68610	Slot coronali da 2 mm
Filamento di nylon rivestito in silicone	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	60-1250	OD 0,35 mm, punta in silicone da 30 mm, EO-sterile
Anestesia per piccoli animali	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	R500IE	Vaporizzatore di isoflurano, camera di induzione e maschera inclusi
SPSS	IBM Corp., Armonk, NY, USA	versione 26.0	Software per l'analisi statistica
Forcipe micro Vannas	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-14058	Punta curva, 8 cm