Effetti dei polisaccaridi di Cordyceps sulla Senescenza Renale indotta dalla D-Galactosio

Sommario

Un modello di senescenza è stato stabilito nei topi e nelle cellule HK-2 utilizzando il D-galattosio. Gli effetti dei polisaccaridi di Cordyceps (CCP) sull'invecchiamento renale sono stati valutati utilizzando western blotting e immunofluorescenza, con le modifiche mitocondriali valutate tramite la rilevazione di specie reattive di ossigeno e la colorazione con JC-1.

Abstract

La malattia renale cronica (CKD) rappresenta una significativa preoccupazione sanitaria globale. L'invecchiamento delle cellule epiteliali tubolari renali (RTEC) compromette la rigenerazione e la riparazione renale e promuove la progressione della CKD attraverso il rilascio del fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP). Cordyceps sinensis, i cui principali costituenti bioattivi includono Cordyceps polisaccaridi (CCP), è incorporato in molteplici preparazioni cliniche per la CKD e ha dimostrato benefici terapeutici. Per esaminare il ruolo della CCP nell'invecchiamento renale, è stato stabilito un modello di senescenza renale indotta da D-galattosio nei topi, con la CCP somministrata come intervento. Gli esiti del trattamento sono stati valutati utilizzando colorazioni correlate alla senescenza e valutazioni della funzione renale. Un modello di invecchiamento indotto dal D-galattoso nelle cellule HK-2 è stato ulteriormente stabilito per indagare i meccanismi cellulari sottostanti. La colorazione con JC-1 e la rilevazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono state utilizzate per valutare i cambiamenti mitocondriali dopo il trattamento CCP in condizioni senescenti. Immunofluorescenza, western blotting e PCR quantitativa (RT-PCR) sono stati eseguiti per valutare gli effetti della CCP sulla fosforilazione del MAPK, sulla traslocazione nucleare di NF-κB e sull'attivazione dell'inflammasoma NLRP3. I risultati mostrano che il CCP attenua la senescenza delle cellule tubulointerstiziali, la lesione renale e la fibrosi, migliorando al contempo la funzione mitocondriale sia nei modelli cellulari che animali di senescenza indotta dal D-galattosio. Questi effetti sono associati alla modulazione della via di segnalazione ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3.

Introduzione

La malattia renale cronica (CKD) è una delle malattie renali più comuni e colpisce una vasta popolazione a livello mondiale. La sua presenza è strettamente associata all'invecchiamento¹. I tubuli renali sono le principali unità funzionali del rene, e la senescenza cellulare all'interno delle cellule epiteliali tubolari renali (RTEC) è un contributo importante al declino funzionale^{renale 2}. L'esposizione a farmaci e altri fattori di stress possono indurre senescenza associata allo stress tubolare, portando a una perdita progressiva della funzione renale e alla progressione finale verso la malattia renale terminale (ESKD). Pertanto, mirare alla senescenza nelle RTEC può essere una strategia efficace per ritardare l'invecchiamento renale e prevenire o trattare la CKD.

L'infiammazione cronica è un segno distintivo dell'età^{di 3} anni e un importante fattore di molte malattie legate all'età. Le citochine pro-infiammatorie rilasciate dalle cellule senescenti sono collettivamente conosciute come fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP⁾⁴. Il SASP favorisce un'infiammazione sostenuta, induce la senescenza nelle cellule vicine e contribuisce al progressivo declino^{funzionale 5}. Il modello di senescenza indotta da D-galattosio (D-gal) è uno dei modelli sperimentali di invecchiamento più utilizzati. Studi precedenti hanno dimostrato che il trattamento con D-gal porta all'accumulo intracellulare di specie reattive dell'ossigeno (ROS), disfunzione mitocondriale, alterazione dell'omeostasi redox e induzione della senescenza cellulare^{correlata allo stress 6}. Rispetto ai modelli naturali di invecchiamento, che richiedono molto tempo e presentano un'elevata variabilità interindividuale, il modello indotto dal D-galattosio offre vantaggi tra cui semplicità, induzione rapida e relativamente bassa variabilità intra-gruppo. Questo modello è applicabile sia a studi in vivo che in vitro. Sebbene non ricapitoli completamente l'invecchiamento naturale lento e privo di patologie, è particolarmente adatto per modellare la senescenza renale, data l'elevata attività metabolica del rene e la sua suscettibilità allo stress ossidativo. Da una prospettiva meccanicistica, il D-galattosio favorisce la senescenza cellulare principalmente attraverso lo stress ossidativo, coerente con le indagini focalizzate sulla generazione di ROS e sulla disfunzione mitocondriale durante l'invecchiamento.

Cordyceps sinensis è un fungo medicinale tradizionale cinese ampiamente utilizzato nel trattamento delle malattie correlate ai^{reni 7}. Contiene molteplici componenti bioattivi, tra cui polisaccaridi, adenosina, amminoacidi, cordicepina ed ergosterolo. Gli estratti e le preparazioni fermentate di Cordyceps sinensis mostrano proprietà antinfiammatorie, antiossidanti e anti-età 8,9,10,11. Ad esempio, è stato dimostrato che i polisaccaridi di Cordyceps riducono l'infiltrazione infiammatoria in un modello murino per asma inibindo la via di segnalazione TGF-β1/^{Smad 12}. Inoltre, i polisaccaridi di Cordyceps possono sopprimere la fosforilazione delle vie MAPK e ridurre l'espressione di citochine infiammatorie come IL-6 e IL-1β nelle cellule RAW264.7¹³. Studi precedenti hanno dimostrato che Cordyceps polisaccaridi (CCP), il principale costituente bioattivo di Cordyceps sinensis, possono attenuare la senescenza nelle cellule epiteliali tubulari renali regolando l'autofagia e sopprimendo la produzione di SASP. Tuttavia, i meccanismi molecolari con cui il CCP contrasta i danni mediati dalla ROS rimangono incompletamente caratterizzati.

Il presente studio indaga gli effetti protettivi della CCP contro l'invecchiamento renale nei topi e ne esamina gli effetti su infiammazione, stress ossidativo e senescenza utilizzando un modello indotto da D-galattosio di invecchiamento delle cellule epiteliali tubolari renali. Esploriamo ulteriormente se il CCP moduli la produzione di ROS, la funzione mitocondriale e le vie di segnalazione a valle, inclusa la fosforilazione del MAPK, la traslocazione nucleare di NF-κB e l'attivazione dell'inflammasoma NLRP3. Insieme, questo lavoro mira a fornire evidenze sperimentali a sostegno dell'uso del CCP negli studi sulla senescenza renale e sulla lesione renale correlata all'età. Il flusso di lavoro sperimentale complessivo e il meccanismo proposto sono riassunti nella Figura 1.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte secondo le linee guida istituzionali e approvate dal Comitato Etico Animale dell'Università di Medicina Cinese di Nanchino (Approvazione Etica n. 202108A006). Tutti i rifiuti generati durante le procedure di coltura cellulare e colorazione venivano raccolti in contenitori sigillati e sacchetti per i rischi biologici e smaltiti da un servizio autorizzato di gestione dei rifiuti medici.

Modelli animali e interventi terapeutici

Per minimizzare la variazione interindividuale, 40 topi sono stati assegnati casualmente a cinque gruppi (n = 8 per gruppo) e sottoposti ai seguenti interventi: (1) Gruppo di controllo: somministrazione intragastrica di 0,2 mL di soluzione salina per topo; (2) Gruppo modello: Ricevette iniezioni sottocutanee giornaliere di D-galattosio (250 mg/kg), somministrate con 0,2 mL di una soluzione da 25 mg/mL per topo; (3) Gruppo CCP a basso dosaggio: Ricevuto iniezioni di D-galattosio combinate con somministrazione intragastrica di CCP a 50 mg/kg (0,2 mL di una soluzione da 5 mg/mL per topo); (4) Gruppo CCP ad alta dose: Ricevuto iniezioni di D-galattosio combinate con somministrazione intragastrica di CCP a 100 mg/kg (0,2 mL di una soluzione da 10 mg/mL per topo); (5) Gruppo vitamina E: Ricevuto iniezioni di D-galattosio combinate con somministrazione intragastrica di vitamina E a 100 mg/kg (0,2 mL di una soluzione da 10 mg/mL per topo). Dopo 8 settimane di trattamento, i topi sono stati soppressi e sono stati raccolti campioni di siero, urina e tessuto renale per analisi successive.

Analisi della funzione renale

La funzione renale è stata valutata utilizzando kit di test commerciali per misurare creatinina, acido urico e proteine urinarie secondo le istruzioni dei produttori. I valori di assorbanza sono stati misurati a 505 nm per la creatinina, 510 nm per l'acido urico e 585 nm per la proteina urinaria utilizzando un lettore multifunzione di microplacche.

Colorazione a sezioni di tessuto

I tessuti renali immersi in paraffina sono stati sezionati a uno spessore di 4 μm. Le sezioni sono state deparafinizzate, incubate con ematossilina per 5 minuti, risciacquate con acqua corrente, differenziate usando alcol acido all'1% per 5 secondi e poi risciacquate nuovamente. Dopo un lavaggio con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) di 1 minuto, le sezioni sono state controcolorate con eosina per 3 minuti, disidratate e montate. Per la colorazione tricroma di Masson, le sezioni sono state deparafinizzate e colorate con ematossilina come descritto sopra, seguite da Ponceau S per 5 minuti e blu anilina per 5 minuti. Le sezioni venivano poi disidratate e montate.

Saggio di viabilità cellulare

Le cellule HK-2 sono state seminate in piastre a 12 pozzi a 1 × 10⁵ cellule per pozzo. Dopo 24 ore di esposizione a D-galattosio e polisaccaridi di Cordyceps, è stata aggiunta una soluzione del 10% di CCK-8 a ciascun^{pozzo 14}. Dopo l'incubazione a 37 °C per 30 minuti, l'assorbanza è stata registrata a 450 nm utilizzando un lettore di microplacche. La documentazione di controllo qualità per i polisaccaridi di Cordyceps e l'autenticazione STR delle celle HK-2 sono fornite nel File Supplementare 1.

Trascrizione inversa reazione a catena quantitativa della polimerasi

Dopo 24 ore di coltura cellulare, il mezzo di coltura è stato rimosso e l'RNA totale è stato estratto utilizzando il reagente di estrazione. La concentrazione di RNA è stata determinata utilizzando uno spettrofotometro a microplacche, e l'integrità dell'RNA è stata verificata tramite elettroforesi su gel di agarosio al 2%. Il DNA genomico veniva rimosso e il cDNA veniva sintetizzato tramite trascrizione inversa. Le sequenze di primer sono elencate nella Tabella dei Materiali.

Misurazione dei livelli intracellulari di ROS

Le cellule HK-2 sono state seminate in piastre a 12 pozzi a 1 × 10⁵ cellule per pozzo. Al raggiungimento del 60-70% di confluenza, le cellule hanno subito un pretrattamento con D-galattosio per 12 ore. Dopo 24 ore di esposizione al farmaco, il substrato è stato scartato e le cellule sono state risciacquate una volta con PBS. La ROS intracellulare è stata rilevata per incubazione con una sonda fluorescente sensibile alla ROS a 37 °C per 20 minuti, e sono state catturate immagini di fluorescenza a lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 488/525^{nm 15}.

Tachia occidentale

Le proteine cellulari sono state lisate utilizzando il tampone RIPA e chiarite tramite centrifugazione a 13.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Le proteine sono state denaturate bollendo per 10 minuti e quantità uguali di proteine (20 μg per campione) sono state sottoposte a separazione elettroforetica e trasferite nelle membrane PVDF. Dopo un blocco per 1 ora, le membrane venivano incubate durante la notte con anticorpi primari. I successivi lavaggi PBST sono stati seguiti da incubazioni con anticorpi secondari coniugati con HRP, e la rilevazione è stata effettuata utilizzando un substrato a chemiluminescenza potenziata (ECL^{) 16}. I dettagli degli anticorpi e gli identificatori dei reagenti sono elencati nella Tabella dei Materiali.

Colorazione di senescenza SA-β-gal

Le celle HK-2 sono state placcate in piastre da 12 pozzi a una densità di 1 × 10⁵ celle per pozzo. Quando le cellule hanno raggiunto il 60-70% di confluenza, sono state pretrattate con D-galattosio per 12 ore. La colorazione con SA-β-gal è stata effettuata secondo il protocollo del produttore e le cellule colorate sono state osservate con un microscopio^{ottico 17}.

Misurazione del potenziale della membrana mitocondriale

Il potenziale della membrana mitocondriale è stato valutato utilizzando la sonda fluorescente JC-1 in conformità con le istruzioni del fornitore. I monomeri di JC-1 sono stati rilevati a lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 490/530 nm, mentre gli aggregati di JC-1 sono stati rilevati a 525/590 nm. Le immagini sono state acquisite osservando segnali di fluorescenza chiari rossi o verdi.

Analisi statistica

I dati venivano presentati come diagrammi a barre o puntini e analizzati utilizzando il software di riferimento. Le intensità delle bande western blot sono state quantificate utilizzando ImageJ. I dati sono stati analizzati tramite analisi della varianza (ANOVA) con test t successivi per confronti tra gruppi. La significatività statistica è stata definita come un valore P < 0,05. I simboli indicano confronti con il gruppo di controllo (*) o il gruppo D-gal (#) (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001).

Risultati

Il D-galattosio è stato utilizzato per stabilire un modello di senescenza nei topini, con la vitamina E che funge da controllo positivo anti-senescenza comunemente usato. I topi senescenti sono stati trattati con dosi diverse di Cordyceps polisaccaridi (CCP). I topi anziani hanno mostrato un significativo deficit renale, come dimostrato dall'aumento delle proteine urinarie, dell'acido urico sierico e dei livelli di creatinina (Figura 2B-D). ...

Discussione

Questo studio dimostra gli effetti protettivi dei polisaccaridi di Cordyceps sulle cellule epiteliali tubolari renali e fornisce prove che attenuano la senescenza infiammatoria nelle cellule HK-2 modulando la via di segnalazione ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3. Questi risultati chiariscono ulteriormente i potenziali meccanismi alla base degli effetti dei composti derivati da Cordyceps sinensis nel trattamento delle malattie renali acute e croniche e offrono...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Casepasi1/PAb del Coniglio Tagliato	WL03450	Wanlei, Shengyang, Cina
CCK-8 Kit	C0037	Biyotime, Shanghai, Cina
CCP	B21296	Yuanye Bio, Shengyang, Cina
Kit per il test della creatinina	C011-2-1	Jiancheng, Nanchino, Cina
D-gal	HY-N0210	MCE, USA
ERK Rabbit pAb	4695	CST, USA	AB_390779
gap Rabbit pAb	AC033	Abclonal, Wuhan, Cina
Kit di colorazione H & E	G1120	Solarbio, Pechino, Cina
JC-1 Kit	C2003S	Biyotime, Shanghai, Cina
Kit di macchiatura di Masson	G1340	Solarbio, Pechino, Cina
NLRP3 Rabbit pAb	WLH3383	Wanlei, Shengyang, Cina
P21 Rabbit pAb	64016s	CST, USA	AB_2892063
p38 PAb coniglio	9212	CST, USA	AB_330713
p50 Rabbit pAb	3035	CST, USA	AB_330564
p65 Rabbit pAb	8242	CST, USA	AB_10859369
p-ERK Rabbit pAb	4370	CST, USA	AB_2315112
Fosfo-SAPK/JNK mAnticorpo	4668	CST, USA	AB_823588
p-p38 Coniglio pAb	4511	CST, USA	AB_2139682
Kit per la vernice ROS	S0033S	Biyotime, Shanghai, Cina
Anticorpo SAPK/JNK	9256	CST, USA	AB_2250373
SA-β-gal Kit	C0602	Biyotime, Shanghai, Cina
Kit per il test dell'acido urico	C012-2-1	Jiancheng, Nanchino, Cina
Kit di rilevamento delle proteine urinarie	C035-2-1	Jiancheng, Nanchino, Cina
Vitamina E	S27812	Yuanye Bio, Shengyang, Cina
Primer per PCR
Nome genico	Primer in avanti	Primer inverso
Caspasi-1	5'-TACAGACAAGGGTGCTGAACAA-3'	5'-CGGAATAACGGAGTCAATCAAA-3'
GAPDH	5'-AGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTC-3'	5'-AAAGGTGGAGGAGTGTGTGTCG-3'
NLRP3	5'-GATCTTCGCTGCGATCAACAG-3'	5'-CGTGCATTATCTGAACCCCAC-3'