Una piattaforma di punto di assistenza per il rilevamento simultaneo della PCR triplex di infezioni da chikungunya, dengue e virus Zika

Summary

Questo articolo raccomanda un sistema integrato completamente automatizzato che impiega la tripla tecnologia PCR per diagnosticare simultaneamente le coinfezioni di Chikungunya, Dengue e virus Zika utilizzando un singolo campione, ottimizzando così l'efficienza dei test nei laboratori clinici e di medicina primaria.

Abstract

La febbre chikungunya (CHIKF), una malattia virale acuta trasmessa dalle zanzare e scoperta per la prima volta in Tanzania nel 1952, ha mostrato una diffusione intermittente in Cina, con un aumento delle epidemie locali. A luglio 2025, la provincia del Guangdong, attualmente centro dell'epidemia, aveva segnalato 4.824 casi locali, inclusi quasi 3.000 nuovi contagi in una sola settimana. Questo rapido aumento crea un bisogno urgente di tecnologie diagnostiche avanzate. Tali strumenti sono fondamentali per supportare gli sforzi di contenimento in prima linea. Proponiamo una soluzione per la rilevazione simultanea e rapida delle infezioni da dengue (DENV), chikungunya (CHIKV) e virus Zika (ZIKV) per migliorare le capacità precoci di prevenzione e controllo delle epidemie. Questo approccio prevede lo sviluppo di protocolli di test personalizzati per i posti di blocco di frontiera e le strutture sanitarie primarie.

I metodi diagnostici tradizionali per CHIKV e DENV spesso mancano di sensibilità/specificità nei casi di coinfezione. Poiché CHIKV, DEV e ZIKV condividono schemi di trasmissione e sintomi simili, il monitoraggio simultaneo è fondamentale. Questo protocollo presenta un metodo triplex qPCR utilizzando sonde TaqMan per rilevare questi arbovirus in un singolo tubo entro 90 minuti. Rispetto alla coltura virale e ai test serologici, questo metodo migliora l'efficienza identificando infezioni attive e coinfette con alta specificità, semplificando il flusso di lavoro ed eliminando i requisiti di attrezzature specializzate.

La validazione con campioni clinici e di Valutazione Esterna della Qualità (EQA) ha confermato una concordanza del 100% con i saggi singleplex di standard d'oro. Questo metodo rappresenta uno strumento efficace per monitorare le malattie febbrili nelle regioni endemiche, in particolare in contesti a risorse limitate dove il rapido contenimento delle epidemie è fondamentale.

Introduction

La febbre chikungunya (CHIKF) è una malattia arbovirale sempre più diffusa, trasmessa principalmente dai vettori zanzare Aedes aegypti e Aedes albopictus. Caratterizzata da focolai ricorrenti nelle regioni tropicali, questa malattia si manifesta clinicamente come una febbre acuta, spesso accompagnata da forti dolori articolari e artrite^{persistente 1}. Al 26 luglio, il totale cumulativo dei casi di chikungunya confermati in laboratorio nella città di Foshan aveva raggiunto 4.824, con un notevole 87,2% di questi casi nel distretto di Shunde. Questa marcata concentrazione geografica impone un onere sostanziale alle infrastrutture sanitarie pubbliche regionali e comporta costi sanitari significativi, insieme a sfide macroeconomiche più^{ampie 2}.

Nel contesto della circolazione sempre più sovrapposta dei virus CHIKV, DEV e ZIKV, le attuali metodologie diagnostiche incontrano tre limitazioni principali. Innanzitutto, i sami sierologici non riescono a distinguere le infezioni acute a causa della prolungata persistenza degli anticorpi dopo la chiarezza^{virale 1}. In secondo luogo, le tecniche di coltura virale mostrano bassi tassi di sensibilità e richiedono diversi giorni, ostacolando così un processo decisionale clinico tempestivo. In terzo luogo, sebbene i test quantitativi PCR dimostrino un'elevata specificità (superiore al 95%), non possono rilevare le coinfezioni all'interno di una singola reazione, il che rappresenta un svantaggio significativo dato il tasso di co-infezione CHIKV-DENV segnalato del 12,8% in India³. Il monitoraggio filogenetico indica un cambiamento di paradigma. La linea ECSA, dominante durante l'epidemia indiana 2019-2022, ha acquisito mutazioni convergenti nelle proteine dell'involucro: E1-A226V (che aumenta l'infettività delle zanzare) ed E2-K252Q (associata all'evasione immunitaria). Queste mutazioni hanno portato a un genotipo con una virulenza documentata più elevata, come riportato da recenti studi di sorveglianza in Kerala e^{Maharashtra 3}. Contemporaneamente, la Cina affronta sfide derivanti dall'importazione del genotipo ECSA, come documentato nell'epidemia dello Yunnan, e da altri genotipi, con la trasmissione autoctone segnalata in più province, incluso lo^{Yunnan 4}.

Queste realtà creano esigenze urgenti e limitate di risorse per (i) diagnosi differenziale nonostante manifestazioni cliniche^{sovrapposte 5}, (ii) saggi diagnostici che eliminano la complessità degli strumenti tipicamente richiesti dalla PCR quantitativa in tempo reale convenzionale (qPCR⁾⁶, e (iii) validazione completa di nuove tecnologie di punto di cura, inclusi metodi basati su RT-LAMP^{e CRISPR 5}. Per affrontare queste sfide diagnostiche, proponiamo un rapido saggio triplice PCR che utilizza un sistema integrato completamente automatizzato, consentendo il rilevamento simultaneo di CHIKV, DEV e ZIKV in un'unica reazione. Abbiamo validato le prestazioni del nostro saggio triplex qPCR tramite confronto diretto con i saggi singleplex^{consolidati 5}, che hanno servito come standard di riferimento. Le sezioni seguenti dettagliano le procedure sia per il saggio triplex sia per quello di riferimento singleplex. L'analisi comparativa dei risultati di entrambi i metodi è presentata nella sezione Risultati Rappresentativi.

Protocol

Questo studio aderisce alle linee guida etiche stabilite dal Comitato Etico dell'Ospedale Popolare Provinciale del Guangdong, Southern Medical University, Guangzhou, Cina (n. approvazione: KY2025-510-01). Informazioni dettagliate riguardo ai materiali utilizzati in questa ricerca (reagenti, sostanze chimiche, attrezzature e software) si trovano nella Tabella dei Materiali.

1. Selezione dei partecipanti

1. Scegli partecipanti nella fascia d'età compresa tra 18 e 60 anni.
2. Scegliere i partecipanti che presentano una malattia febbrile acuta (T ascellare ≥ 38 °C) entro 12 giorni dall'insorgenza dei sintomi, più eruzione cutanea, artralgia o linfadenopatia cervicale, e recenti viaggi in aree endemiche di chikungunya; o individui asintomatici con una storia di viaggio identica.
3. Esclusione: uso di antimicrobici/antivirali entro 7 giorni o malattia febbrile attribuibile a HIV confermato o a una malignità.

2. Raccolta e lavorazione dei campioni

1. Controlla che la confezione esterna della scatola di campionamento non sia danneggiata e non sia scaduta, quindi rimuovi i materiali interni.
2. Posiziona il soggetto con il braccio teso. Identificare la vena cubitale mediana, applicare un laccio emostatico e disinfettare il sito della venpuntura con un tampone al 70% di alcol.
3. Raccogliere 1~3 mL di sangue dalla vena antecubitale del soggetto utilizzando un tubo di raccolta del sangue senza anticoagulanti.
4. Inverti delicatamente il tubo 5-8 volte e lascialo coagulare a temperatura ambiente per 30 minuti.
5. Centrifuga il campione di sangue a 4 °C, 1000 x g su una centrifuga, per 10 minuti. Il campione di siero ottenuto dopo la centrifugazione può essere testato immediatamente.
6. Con cura aliquota il siero soprandanante in tubi microcentrifughe sterili. Utilizzare immediatamente il siero per i test, oppure conservare le aliquote a -80 °C fino a ulteriori analisi degli acidi nucleici patogeni tramite qPCR.

3. Rilevamento automatico triplex qPCR di CHIKV, DAV e ZIKV

1. Preparazione di reagenti e tubi
   1. Recupera tutti i reagenti necessari dal deposito e scongelali a temperatura ambiente.
   2. Ispezionare visivamente ogni tubo di rilevamento TD sigillato per eventuali danni o guasti alla guarnizione. Scartare eventuali tubi compromessi.
   3. Vortice brevemente il buffer di estrazione degli acidi nucleici TD per 5 secondi per garantire l'omogeneità.
   4. Dispensare asepticamente 500 μL del tampone omogeneizzato in un tubo di estrazione TD (contenente sfere magnetiche liofilizzate viola).
   5. Vortice vigorosamente la miscela per 30 secondi finché tutti i componenti non sono completamente disciolti e le sfere sono completamente risospese.
   6. Trasferire l'intera soluzione ricostituita in un tubo di rilevamento TD pre-etichettato.
2. Caricamento del campione
   1. Pipetta 200 μL di siero limpido, non emolitico e non lipemico nel tubo preparato per la rilevazione TD.
   2. Sigilla bene il tubo e invertilo dieci volte per mescolare in modo omogeneo.
      NOTA: Durante l'inversione, lascia che lo strato di paraffina fluttui brevemente all'interno del tubo. Questa è una parte normale del processo.
3. Funzionamento degli strumenti e acquisizione dati
   1. Inserire i tubi di rilevamento sigillati negli slot designati dell'analizzatore .
   2. Sull'interfaccia touchscreen, inserisci le informazioni di identificazione del campione.
   3. PremiS Detectione tart per avviare il flusso di lavoro completamente automatizzato a tubo chiuso.
      NOTA: Il sistema eseguirà automaticamente la scansione dei codici a barre, l'estrazione degli acidi nucleici tramite cattura magnetica delle perle e l'amplificazione PCR a fluorescenza senza ulteriori interventi dell'utente. Il programma standard include una fase di denaturazione a 95 °C per 3 minuti, seguita da 40 cicli di amplificazione.
4. Interpretazione del risultato
   1. Al termine della prova, osservare i risultati di amplificazione per tutti e tre i bersagli (CHIKV, DENV, ZIKV) e il controllo interno sullo stesso schermo.
   2. Registra la lettura generata automaticamente, "Positivo", "Negativo" o "Invalido", per ciascun patogeno bersaglio nel rispettivo canale di fluorescenza.
      NOTA: Il software interno del sistema utilizza una soglia di ciclo (Ct) di 37,0 per l'interpretazione automatica. Non è richiesta alcuna analisi manuale dei dati.

4. Riferimento agli saghi Singleplex qPCR per il confronto dei metodi

1. Preparazione di reagenti di estrazione degli acidi nucleici
   1. Togli il piatto preconfezionato a 96 pozzi dal kit. Tocca delicatamente la piastra a 96 pozzi per far concentrare tutti reagenti e sfere magnetiche sul fondo della piastra a 96 pozzi. Rimuovere con attenzione la pellicola sigillante in alluminio, evitando vibrazioni della piastra a 96 pozzi per evitare che il liquido schizzi fuori.
   2. Nelle colonne 1 e 7 di una piastra a 96 pozzi, si aggiungono prima 20 μL di proteinasi K, seguiti da 200~300 μL del campione da estrarre.
   3. Estrazione automatica degli acidi nucleici (metodo a perla magnetica)
      1. Piastre preconfezionate da 96 pozzi (con campioni) sono posizionate nelle corrispondenti slot del sistema automatico di estrazione degli acidi nucleici.
      2. Il processo di estrazione degli acidi nucleici è il seguente: Adsorbire le sfere magnetiche legate agli acidi nucleici utilizzando una barra magnetica all'interno della camera di laboratorio. Trasferire il complesso di perne nel prossimo foro designato per il reagente. Attiva il dispositivo di mescolare per mescolare accuratamente il liquido con le sfere magnetiche attraverso una mescolare rapida e ripetuta. Consentire all'estrattore automatico di acidi nucleici di eseguire automaticamente i passaggi successivi: i) Lisi cellulare: 10 min a 25 °C. ii) Adsorbimento degli acidi nucleici: 15 min a 70 °C, con adsorbimento magnetico eseguito 3 volte. iii) Lavaggio: Mescolare per 2 minuti (ripetuto 3 volte), seguito da adsorbimento magnetico due volte (15 secondi ciascuno). iv) Eluzione: Eseguire due volte (5 min ciascuno), con adsorbimento magnetico eseguito 3 volte. Alla fine, ottengono acidi nucleici ad alta purezza.
   4. Per una rilevazione immediata, aspirare direttamente l'eluato contenente acido nucleico dalle colonne 6 e 12. Per una conservazione a lungo termine, trasferire i campioni rimanenti di acidi nucleici a -20°C.
2. Preparazione dei reagenti di amplificazione
   NOTA: Per una reazione PCR Singleplex, preparare tre tubi PCR separati utilizzando tre enzimi diversi e tre miscele di reazione corrispondenti. Completa la preparazione del reagente in tre fasi separate. Poiché i passaggi di preparazione sono simili, dimostreremo solo i passaggi di preparazione per il reagente di rilevamento CHIKV di seguito.
   1. Rimuovere dalla kit la soluzione di reazione di amplificazione degli acidi nucleici e la soluzione di reazione CHIKV (primer/sonde specifiche per CHIKV). Dopo lo scongelamento, posizionali in un ambiente a 22~25 °C, mescola accuratamente con una forte agitazione, poi esegui una breve centrifugazione (1000 x g, 15 s, 22~25 °C).
   2. Calcola il numero totale di reazioni come N + 2 (dove N = numero di campioni di prova, +2 = uno negativo e uno positivo controllo qualità). Prepara il Master Mix in un tubo microcentrifuga di dimensioni adeguate combinando i seguenti elementi per ogni reazione: Soluzione di Amplificazione di Nuclei Acidi da 17 μL (contenente tampone, dNTP, DNA polimerasi, enzima UDG), Soluzione di reazione CHIKV da 3 μL (contenente Primer, sonde per i geni bersaglio CHIKV e IC). Vortice il Master Mix con cura per garantire un mix completo. Centrifugare brevemente il tubo a 10.000 x g per 15 secondi a temperatura ambiente (22~25 °C) per raccogliere la soluzione sul fondo. Dispensare 20 μL del Master Mix in ogni tubo di reazione PCR.
   3. Aggiungere acidi nucleici e campioni di controllo qualità: nei tubi di reazione PCR preparati sopra (20 μL), aggiungere rispettivamente 5 μL di acido nucleico da campioni testati, controllo positivo e controllo negativo, ottenendo un volume finale di 25 μL per provetta; Blocca strettamente i tubi ed esegui la centrifugazione istantanea (1000 x g, 15 s, 22 ~25 °C) e poi inserisci i tubi nello strumento PCR.
3. Amplificazione PCR
   1. Impostare il programma di ciclismo come segue: Pre-denaturazione: 50 °C per 15 minuti, poi a 95 °C per 15 minuti (entrambi i passaggi insieme costituiscono un ciclo); i seguenti 2 passaggi per 40 cicli: denaturazione a 94 °C per 15 secondi e ricottura a 55 °C per 45 secondi.
   2. Impostare i parametri di rilevamento del segnale di fluorescenza come segue: marcatura fluorescente FAM dei geni CHIKV; Marcatura fluorescente VIC del gene IC utilizzata come controllo interno del kit. Raccogliere dati a 55 °C. Al termine della reazione, assicurarsi che i dati vengano salvati per analisi future.
   3. Analizza i dati utilizzando software specifico per qPCR
      1. Informazioni sul campione: Nel diagramma della disposizione delle piastre del pozzo del software, etichetta i tipi di campione (ad esempio, controllo positivo, controllo negativo, campione sconosciuto, gene di riferimento interno, ecc.) corrispondenti alle posizioni di carico del campione.
      2. Posizionamento dei tubi di reazione: Apri il coperchio del modulo riscaldante dello strumento, posiziona saldamente la piastra PCR sigillata/i tubi all'interno, assicurati che si adattino perfettamente al modulo di riscaldamento e chiudi bene il coperchio del modulo (per evitare irregolarità di temperatura)
      3. Avvio della reazione: Dopo aver confermato che le impostazioni del programma nel software siano corrette, clicca su Avvia Esecuzione e registra l'ID dell'esperimento per riferimento futuro.
      4. Fermare la corsa e rimuovere i tubi: una volta completato il programma, attendere che la temperatura del modulo di riscaldamento scenda sotto i 50 °C. Poi, apri il coperchio e rimuovi con cura la piastra o i tubi PCR. Procedere con l'analisi a valle o lo stoccaggio dei campioni secondo necessità.
      5. Analisi dei dati Prima di procedere con l'analisi, confermare che: i) Le curve di amplificazione per tutti i campioni e il controllo interno sono tipicamente a forma di S; ii) La soglia di fluorescenza è fissata all'interno della fase esponenziale, che produce valori di Ct ≤ 38 cicli (CV < 5%); iii) I risultati del controllo sono validi, indicando l'assenza di contaminazione. Se una condizione non è soddisfatta o se un campione mostra un'amplificazione anomala (ad esempio, una curva atipica o una Ct a intervallo critico), ricontrollare l'intero lotto o il campione specifico di conseguenza.
      6. Elaborare i dati grezzi con il software per determinare i valori di Ct, utilizzando la soglia auto-selezionata; un campione è considerato positivo se Ct < 38 e la sua curva di amplificazione presenta una forma sigmoide.

5. Biosicurezza e smaltimento dei rifiuti

1. Trasferire tutti i materiali in un contenitore designato e resistente alle perforazioni biologiche e decontaminare tramite autoclav prima dello smaltimento finale tramite il sistema istituzionale di rifiuti medici. Trasferire immediatamente questi materiali in un contenitore antiperdite e resistente alle perforazioni biologiche, etichettato come rifiuti ad alto rischio. Seguendo le linee guida istituzionali, decontaminare tutti i rifiuti contenenti prodotti amplificati tramite autoclaving (ad esempio, 121 °C per 30 minuti) per inattivare i patogeni e degradare gli acidi nucleici. Infine, smaltire i rifiuti sterilizzati tramite il sistema di gestione dei rifiuti medici designato.
   NOTA: Eseguire tutte le misure in conformità con le pratiche di Biosicurezza Livello 2 (BSL-2), utilizzando le attrezzature di protezione individuale appropriate per minimizzare i rischi di esposizione.

Results

Per convalidare la stabilità e l'accuratezza del sistema di rilevamento triplo PCR, abbiamo selezionato cinque campioni clinicamente rappresentativi dal nostro laboratorio interno e dieci campioni esterni EQA ciechi per la verifica. Questi cinque campioni clinici rappresentativi includono sia casi negativi che positivi (S1-S5), inclusi campioni positivi a CHIKV e DENV, selezionati per dimostrare l'applicabilità clinica del test e per supportare la validazione interna delle prestazioni del test (Tabella 1...

Discussion

CHIKV è un virus RNA a senso positivo, a singolo filamento, classificato nel genere alphavirus della famiglia^{Togaviridae 7}. L'accelerazione del riscaldamento globale, l'intensificazione del commercio internazionale e l'espansione delle reti turistiche hanno collettivamente aumentato il rischio di esposizione umana a minacce^{arbovirali 8}. Nell'ultimo decennio, la rapida evoluzione della diagnostica molecolare ha trasformato radicalmente il pa...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Estrattore automatico di acidi nucleici	DAAN	Smart 32	Per l'estrazione del DNA
BECKMAN X-12	BECKMAN	ALA04H01	For  centrifugazione siero/nbsp;
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Cabina di biosicurezza
E-centrifuga	WEALTEC		Centrifuga il liquido residuo dalla parete del tubo
Analizzatore PCR medico completamente automatico	Bioustar‌	UP0102	Amplificazione quantitativa per PCR fluorescente
Kit di rilevamento degli acidi nucleici per il virus chikungunya (metodo sonda PCR-fluorescente)	DAAN	20250804	Rilevamento di  Geni del virus chikungunya
Kit di rilevamento degli acidi nucleici per il virus della dengue (metodo sonda PCR-fluorescente)	DAAN	202504003	Rilevamento di  Geni del virus della dengue
Kit di rilevamento degli acidi nucleici per il virus della dengue, del virus Zika e del virus chikungunya (metodo della sonda PCR-fluorescente)	Bioustar‌	20250724	Rilevamento di  Virus della dengue, virus Zika e virus chikungunya geni
Kit di rilevamento degli acidi nucleici per il virus Zika (metodo della sonda PCR-fluorescente)	DAAN	202508041	Rilevamento del virus Zika   Geni
Kit di estrazione degli acidi nucleici	DAAN		Estrazione dell'acido nucleico
SLAN Sistema di analisi PCR medica completamente automatico	HONGSHI		Analisi dei Dati
SLAN-96S macchina PCR in tempo reale	HONGSHI	SLAN-96S	Amplificazione quantitativa per PCR fluorescente
Congelatori a bassissima temperatura (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 ° C per conservare reagenti
Vortex-5	Kylin-bell		Per il reagente di miscelazione