Articolo metodologico

Isolamento delle cellule epiteliali alveolari di tipo II da polmoni murini neonatali, giovani e adulti adattabili a contesti sperimentali infettivi

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DOI:

10.3791/69581

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19 dicembre 2025

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1Infection Immunology Research Group, Institute of Medical Microbiology and Hospital Hygiene, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 2Immune Regulation Research Group, Helmholtz Centre for Infection Research, 3Flow Cytometry and Cell Sorting Platform, Helmholtz Centre for Infection Research, 4Experimental Immunology Department, Helmholtz Centre for Infection Research

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo presenta un metodo basato su citometria a flusso per isolare cellule epiteliali alveolari di tipo II (AECII) vitali da polmoni murini neonatali, giovani o adulti (infetti o non infetti). Questo approccio consente a seguito studi molecolari e/o funzionali dell'AECII di identificarne il ruolo durante l'infiammazione e l'infezione polmonare.

Abstract

Le cellule epiteliali alveolari di tipo II (AECII) contribuiscono in modo critico alla regolazione immunitaria nei polmoni e sono quindi elementi chiave nell'organizzazione dell'omeostasi polmonare. Queste funzioni rendono l'AECII particolarmente rilevante nel contesto dell'infezione da virus respiratori, che colpiscono l'epitelio inferiore delle vie aeree e compromettono l'integrità alveolare. I modelli murini preclinici sono strumenti fondamentali per chiarire i ruoli dell'AECII nel contesto dell'infiammazione e/o infezione polmonare. Questo protocollo presenta una pipeline dettagliata e riproducibile per isolare AECII vitali e altamente purificati dai polmoni murini nelle fasi neonatale, giovanile e adulta. La metodologia combina dissociazione meccanica, digestione enzimatica e il successivo ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) per ottenere popolazioni AECII altamente arricchite, dimostrate adatte ad analisi molecolari e funzionali a valle. Per applicazioni che coinvolgono virus patogeni, il protocollo include una fase opzionale di fissazione del paraformaldeide (PFA), che consente una gestione sicura in condizioni di biosicurezza inferiori senza compromettere l'integrità dell'RNA. Con un recupero cellulare ottimizzato attraverso le fasi di sviluppo, che può produrre fino a 1,0 × 106 cellule AECII per polmone adulto, questo protocollo supporta studi preclinici, ad esempio, sulla patogenesi virale, la funzione epiteliale e la capacità rigenerativa.

Introduzione

Grazie ai loro ruoli sfaccettati nello sviluppo polmonare, nella fisiologia, nell'immunità e nei processi di riparazione, le cellule epiteliali alveolari di tipo II (AECII) contribuiscono in modo vitale al mantenimento e al ripristino dell'omeostasi dopo una lesione polmonare. Poiché gli AECII sono bersagli cellulari primari di virus pandemici come il virus dell'influenza A (IAV) o il SARS-CoV-2, il loro destino e le loro funzioni sono stati al centro della ricerca sulla biologia delle infezioni. In questo contesto, studi precedenti hanno riportato che i segnali intrinseci (ad esempio, statogenetico 1,età 2,3) così come quelli estrinseci (ad esempio, stimolimicrobici 4) hanno un impatto significativo sui fenotipi AECII e sulla loro reattività a fattori scatenanti ambientali come i patogeni trasportati dall'aria. In particolare, è stato dimostrato che l'infiammazione polmonare lascia cambiamenti sostenuti nello stato trascricromico, proteomo ed epigenetico diAECII 5,6. Le complesse interazioni cellulari dell'AECII all'interno del polmone, così come il contributo di vari fattori biotici e abiotici alla biologia dell'AECII, evidenziano l'importanza di modelli in vivo adatti che permettano di esaminare queste cellule in modo più dettagliato.

FACS rappresenta l'attuale tecnica di riferimento per l'arricchimento e la purificazione delle cellule primarie da tessuti umani e animali, poiché consente l'implementazione simultanea della selezione (o esclusione) multiparametrica e rappresenta l'unico metodo in cui proprietà intrinseche cellulari come dimensione, granularità o autofluorescenza possono essere integrate in modo affidabile nel flusso di lavoro di selezione/esclusione. Ad oggi, alcuni protocolli pubblicati forniscono metodologie per l'isolamento basato su FACS degli AECII murini primari. Sinha e Lowell hanno riportato un metodo per l'isolamento di AECII da topi adulti che presenta un flusso di lavoro simile per l'elaborazione dei tessuti e la citometria a flusso e includeva l'arricchimento di AECII prima della FACS tramite esaurimento magnetico basato su perle su cellule nonbersaglio 7. Un altro protocollo descrive l'uso dell'isolamento a perla magnetica delle cellule polmonari EpCAM positive o l'uso di topi transgenici che hanno permesso l'isolamento basato su FACS di AECII basato sull'identificazione di cellule SPC-positive (GFP+) utilizzando un modello di topo segnalatorecondizionale 8. Sebbene l'espressione della SPC identifichi in modo affidabile AECII nei polmoni murini, questa metodologia è applicabile solo in combinazione con un ceppo dedicato di segnalatori di topo e quindi esclude l'isolamento AECII, ad esempio, da topi di tipo selvatico. È importante sottolineare che, sebbene siano stati riportati rese e purezza simili di AECII, nessuno di questi protocolli ha fornito adattamenti per l'isolamento di AECII da ospiti neonatali, giovanili o infetti.

A tal fine, il presente protocollo include un insieme di flussi di lavoro adattati per l'isolamento di AECII altamente puri e vitali dai topi utilizzando la digestione enzimatica in combinazione con FACS. Questa metodologia all'avanguardia si basa su un protocollo di isolamentoAECII 9 basato su FACS precedentemente sviluppato e contiene importanti miglioramenti che migliorano la purezza dell'AECII attraverso l'aggiunta di ulteriori marcatori di identificazione e esclusione. È importante sottolineare che questo protocollo aggiornato prevede il recupero AECII tramite strategie di ordinamento "toccate" e "non toccate". Inoltre, poiché lo sviluppo polmonare postnatale è associato a cambiamenti significativi nella composizione cellulare e nella riorganizzazione strutturale, questo protocollo include adattamenti per ottimizzare il prelievo AECII dai polmoni neonatali, giovanili e adulti. Questo permette di esaminare la biologia AECII durante l'ontogenesi, ad esempio nel contesto della maturazione polmonare o degli studi sulla biologia delle infezioni. Questo approccio può essere utilizzato per ottenere AECII vitali per la successiva coltivazione ex vivo e l'infezione da IAV. Inoltre, questo protocollo include una procedura di fissazione utilizzando il fissatore chimico paraformaldeide (PFA). Questo passaggio richiede l'inattivazione di vari patogeni respiratori (ad esempio, SARS-CoV-2, IAV) nelle sospensioni di cellule polmonari, il che a sua volta consente una successiva gestione dei campioni (inclusa l'isolamento AECII basato su FACS) in strutture con minori precauzioni di biocontenimento. Sebbene la fissazione basata sul PFA escluda la successiva coltivazione ex vivo di AECII per studi funzionali, consente il prelievo di quantità significative di RNA intatto per la profilazione trascrivomica di AECII, al fine di chiarire i loro ruoli biologici nel contesto delle infezioni respiratorie.

Protocollo

Tutti gli animali sono stati allevati e ospitati nella struttura per animali del Helmholtz Centre for Infection Research in condizioni specifiche prive di patogeni (SPF) e in conformità con le linee guida nazionali e istituzionali. L'eutanasia di topi ingenui per il successivo isolamento AECII è stata effettuata secondo le linee guida nazionali della Society of Laboratory Animal Science (GV-SOLAS, Gesellschaft für Versuchstierkunde). Sono stati utilizzati maschi con un background genetico C57BL/6 all'età di 2 giorni (neonatale), 3 settimane (giovanile) o 8-12 settimane (adulti). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione del polmone del topo

  1. Sacrifica il topo (seguendo protocolli approvati dall'istituzione):
    1. Per topi adulti e giovani : somministrare un overdose anestesiale (ad esempio, ketamina/xilazina) tramite iniezione intraperitoneale.
    2. Per i topi neonati : decapitare.
      NOTA: Evitare la lussazione cervicale nei topi adulti e giovanili poiché questa procedura può danneggiare la trachea.
  2. Sterilizza il pelo del topo con etanolo al 70% (v/v).
    ATTENZIONE: Liquido infiammabile. Irritante per gli occhi. Stai lontano dal caldo. Tieni il contenitore ben chiuso e fai un'incisione ventrale nella linea mediana per esporre gli organi interni.
  3. Rimuovere con attenzione la pelle e il peritoneo.
  4. Essanguinare il topo tagliando entrambe le vene giugulari e la vena cava, permettendo al sangue di defluire dal corpo.
  5. Rimuovere con attenzione il diaframma per esporre cuore e polmoni.
    NOTA: Fai attenzione a non danneggiare i polmoni. La perforazione del tessuto polmonare ostacolerebbe significativamente l'efficacia della successiva digestione mediata dagli enzimi del tessuto polmonare.
  6. Apri la gabbia toracica usando delle forbici.
  7. Inserire una cannula nel ventricolo destro del cuore e perfondere con soluzione salina fredda tamponata con fosfato (PBS) finché il sangue residuo non viene eliminato dal polmone e il tessuto polmonare diventa pallido:
    1. Per i topi adulti : usa una cannula da 26 g e perfondi il polmone con 10 mL di PBS.
    2. Per i topi neonatali : usa una cannula da 30 g e perfondi il polmone con 1 mL di PBS.
      NOTA: Non perfondere i polmoni dei topi giovani per evitare la rottura della struttura alveolare da pressione eccessiva nei vasi sanguigni polmonari. La perfusione potrebbe essere meno efficace nei polmoni infiammati e il cambiamento di colore nel tessuto polmonare potrebbe essere meno evidente. Se necessario, può essere eseguito un lavaggio broncoalveolare prima della fase successiva su topi adulti e giovani.

2. Digestione enzimatica del tessuto polmonare

  1. Topi adulti e giovanili:
    1. Esponi la trachea rimuovendo le ghiandole salivari e il muscolo circostante.
    2. Inserire una cannula a permanenza da 22 G nella trachea, rimuovere l'ago e spostare il catetere di plastica verso i polmoni.
    3. Lega saldamente un pezzo di filato attorno sia alla trachea che al catetere per tenerlo fermo.
    4. Prepara il tessuto polmonare instaurando la dispa.
      ATTENZIONE: Può causare allergie o sintomi di asma o difficoltà respiratorie se inalata. Evita di respirare polvere. Indossa protezione respiratoria. Smaltire i contenuti/contenitori in un impianto di smaltimento dei rifiuti approvato.) attraverso il catetere inserito nella trachea:
      1. Per topi adulti : inserire 2 mL di dispasi.
      2. Per i topi giovani : inserire 500 μL di dispase.
        NOTA: Utilizzare una siringa con connessione a slittamento luer per facilitare lo scambio di siringhe tra i passaggi 2.1.4 e 2.1.5. Per garantire una digestione enzimatica efficiente del tessuto polmonare, è fondamentale garantire il completo riempimento enzimatico degli spazi broncoalveolari.
    5. Sostituire la siringa e ripetere con agarosio a bassa fusione (1% (p/v), 45 °C) per mantenere la struttura durante la lavorazione.
      1. Per topi adulti : usa 500 μL di agarosio a bassa fusione.
      2. Per i topi giovani : usa 200 μL di agarosio a bassa fusione.
        NOTA: Per evitare il riflusso dei liquidi, lasciare la siringa attaccata.
        NOTA: Prima dell'uso: sciogliere l'agarosio a bassa fusione usando calore (95 °C), lasciare raffreddare la soluzione di agarosio a 45 °C, ad esempio in un termoblocco.
    6. Copri il polmone con carta velina da laboratorio e aggiungi ghiaccio per far solidificare l'agarosio per 2 minuti.
    7. Rimuovi ghiaccio, carta velina, siringa e catetere.
    8. Lega il filato per chiudere la trachea e mantenere l'enzima nelle vie aeree inferiori.
    9. Rimuovi cuore e timo.
    10. Taglia la trachea sopra il filato e rimuovi il polmone intatto dal torace.
    11. Trasferire il polmone in un tubo da 15 mL contenente dispasi preriscaldata (37 °C) e incubare il tessuto polmonare in dispasi per 45 minuti a temperatura ambiente (20-25 °C).
      1. Per i topi adulti : incubare il polmone in dispasi di 2 mL.
      2. Per i topi giovani : incubare il polmone in dispasi di 1,5 mL.
  2. Topolini neonatali
    1. Raccogli e trita i lobi polmonari singoli usando forbici fini nel coperchio di un tubo da 2 mL.
    2. Aggiungi 500 μL di dispase, chiudi il coperchio e inverti il tubo per assicurarti che tutto il tessuto sia coperto dalla dispase.
    3. Incubare il tessuto polmonare in disdissezione a temperatura ambiente per 45 minuti.

3. Preparazione del tessuto polmonare

  1. Per topi adulti e giovani:
    1. Rimuovere il polmone dalla disdisparte e sezionare i lobi polmonari dal fusto bronchiale.
    2. Inserire i lobi polmonari in una piastra di Petri (diametro: 8,5 cm) contenente 7 mL di DMEM + HEPES, 1 μg/mL (concentrazione finale) anticorpo anti-CD16/32 e 100 μL di DNAsi (concentrazione finale ~600 unità di Kunitz).
      ATTENZIONE: Può causare allergie o sintomi di asma o difficoltà respiratorie se inalata. Evita di respirare polvere. Indossa protezione respiratoria. Smaltire il contenuto/il contenitore in un impianto di smaltimento dei rifiuti approvato.
    3. Disintegra il tessuto polmonare usando una pinza.
      NOTA: Per garantire una digestione enzimatica efficiente del tessuto polmonare, è fondamentale garantire una completa disintegrazione meccanica del tessuto.
    4. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente dondolando delicatamente a 200 giri/min.
      NOTA: La sospensione delle celle può essere conservata a 4 °C fino al passaggio successivo, se necessario.
  2. Per i topi neonatali:
    1. Trasferire la dispase, compreso il tessuto digerito, in una piastra di Petri (diametro: 5,4 cm) contenente 3 mL di DMEM + HEPES, 1 μg/mL (concentrazione finale) anticorpo anti-CD16/32 e 100 μL di DNAsi (concentrazione finale ~ 600 unità di Kunitz).
    2. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente dondolando delicatamente a 200 giri/min.
      NOTA: La sospensione delle celle può essere conservata a 4 °C fino al passaggio successivo, se necessario.
  3. Continua per tutte le fasce d'età:
    1. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una serie di filtri di nylon con pori in diminuzione (100 μm - 70 μm - 40 μm) per rimuovere detriti e aggregati di grandi dimensioni.
    2. Risciacqua con cura filtri e tubi cellulari per minimizzare la perdita di cellule. Nel caso in cui i campioni vengano aggregati, le sospensioni cellulari dei topi dello stesso gruppo possono essere passate attraverso gli stessi filtri cellulari.
      NOTA: In caso di ostruzione, cambia i filtri cellulari.
    3. A seconda del volume, trasferire la sospensione a celle filtrate su uno o più tubi da 15 mL e centrifugare la sospensione per 12 minuti a 140 x g a 4 °C.
    4. Scartare il sovrandanante e risospendere il pellet cellulare nel buffer di lisi degli eritrociti (ACK buffer).
      1. Per topi adulti e giovani : utilizzare 2 mL di tampone per la lisi degli eritrociti e incubare per 2 minuti.
      2. Per i topi neonatali : usa 3 mL di tampone per la lisi degli eritrociti e incuba per 3 minuti.
    5. Fermare la lisi degli eritrociti riempiendo il tubo da 15 mL con DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS e centrifugare di nuovo per 12 minuti a 140 x g a 4 °C.

4. Colorazione degli anticorpi per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza

  1. Risospendere le cellule in una soluzione di colorazione per anticorpi contenenti anticorpi anti-F4/80, anti-CD93, anti-CD11c, anti-CD19, anti-CD31, anti-CD11b, anti-CD16/32, anti-CD45, anti-CD24 e anti-CD326 preparati in DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS.
    NOTA: Per ottenere risultati ottimali di colorazione, usa solo anticorpi pre-titolati. Se gli AECII devono rimanere intatti per la selezione cellulare, non includere anti-CD326 nella soluzione di colorazione degli anticorpi.
    1. Per topi adulti : utilizzare una soluzione di anticorpi da 600 μL per polmone.
    2. Per i topi giovani : usa una soluzione di anticorpi da 400 μL per polmone.
    3. Per i topi neonatali : utilizzare una soluzione di anticorpi da 200 μL per polmone.
  2. Incubare la sospensione cellulare con gli anticorpi per 10 minuti a 4 °C al buio.
  3. Dopo l'incubazione, lavare le cellule riempiendo il tubo con DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS.
  4. Centrifugare per 12 minuti a 140 x g a 4 °C.
  5. Risospendere le cellule DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS:
    1. Per topi adulti : risospendere 300 μL per polmone.
    2. Per i topi giovani : risospendere 200 μL per polmone.
    3. Per i topi neonatali : risospendere 100 μL per polmone.

5. Smistamento dell'AECII

NOTA: Preparazione dello strumento: installare un ugello da 100 μm per l'ordinamento dell'AECII utilizzando un dispositivo FACS.

  1. Immediatamente prima della separazione, filtrare le celle attraverso un filtro da 50 μm. Risciacqua il colino cellulare con DMEM integrato con HEPES e FBS al 10% (v/v) per prevenire una perdita cellulare eccessiva:
    1. Topi adulti : Risciacquare il filtro cellulare con 300 μL per polmone.
    2. Topolini giovanili : Risciacquare il filtro cellulare con 200 μL per polmone.
    3. Topi neonatali : Risciacquare il filtro cellulare con 100 μL per polmone.
  2. Sospensi le celle vorticando direttamente prima di ordinarle.
  3. Porta per AECII identificando eventi in cui I) hanno un alto side scatter (SSC alto), II) sono negativi per i fluorocromi di linea e III) sono positivi per il fluorocromo CD326 accoppiato all'anticorpo anti-CD326.
    NOTA: Utilizzare fluorocromi con indici di luminosità da alti a molto elevati (come APC, PE e BV785) per facilitare la discriminazione tra non AECII e AECII. Per un approccio di ordinamento non modificato (esclusione di anti-CD326 nella soluzione di colorazione), gli AECII sono identificati come cellule lineage-negative,SSC alto eautofluorescenza positive/alta . L'autofluorescenza AECII può essere identificata nei rilevatori di luce verde, ad esempio FITC o GFP.
  4. Escludere doppietti o aggregati usando l'altezza di scatter diretta vs. area (FSC-H vs. FSC-A) e altezza di scattering laterale vs. area (SSC-H vs. SSC-A).
  5. Raccogliere le cellule selezionate in un tubo contenente DMEM integrato con HEPES e FBS al 10% (v/v) e centrifugare per ulteriori analisi o coltura.

6. Isolamento RNA da AECII fissato con PFA (Opzionale)

NOTA: Nel caso in cui AECII debba essere isolato da topi che sono stati infettati, ad esempio, da patogeni virali respiratori, l'isolamento di AECII deve essere effettuato in condizioni BSL2 o BSL3, a seconda del patogeno. Se l'espertore non ha accesso alla selezione cellulare nelle condizioni di sicurezza appropriate, AECII isolato utilizzando il protocollo sopra descritto può essere fissato con PFA dopo la colorazione degli anticorpi. Questa fase inattiva i patogeni10,11 e quindi può avvenire un successivo ordinamento citometrico di flusso AECII in condizioni BSL1. Sebbene le cellule non possano più essere impiegate per saghi funzionali a causa del processo di fissazione, sono adatte per analisi molecolari.

  1. Per l'inattivazione dei virus, fissare sospensioni monocellulari marcate da anticorpi in 500 μL di PFA al 4% (w/v).
    ATTENZIONE: Solido infiammabile. Dannoso se ingerito o inalato. Provoca irritazione della pelle, gravi danni agli occhi. Può causare una reazione allergica cutanea, irritazione respiratoria e cancro. Sospettata di causare difetti genetici. Stai lontano dal caldo. SE VIENE INGHIOTTITO: Chiama un CENTRO ANTIVELENI o un medico se non ti senti bene. SE INSPIRATO: Porta la persona all'aria fresca e mantenela comoda per respirare. Chiama un CENTRO ANTIVELENI o un medico se non ti senti bene. SE DENTRO GLI OCCHI: SCIACQUARE CON CAUTELA CON ACQUA PER DIVERSI MINUTI. Rimuovi le lenti a contatto, se presenti e facili da fare. Continua a risciacquare. SE ESPOSTO O PREOCCUPATO: Cerca consigli o assistenza medica.
    NOTA: In conformità con le linee guida 3R, in questo studio sono stati utilizzati AECII da topi non infetti. Gli AECII sono stati fissi per 10 minuti a temperatura ambiente. La durata della fissazione deve essere testata individualmente per ogni patogeno che rappresenta un potenziale rischio per l'uomo e l'ambiente. La successiva selezione in condizioni S1 richiede una verifica preventiva in un laboratorio BSL2 o BSL3 che non sia presente alcun virus replicabile dopo la fissazione del PFA.
  2. Dopo la fissazione, lava le celle con DMEM e centrifuga per 15 minuti a 140 x g.
  3. Risospendere le celle in 300 μL DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS e far passare la sospensione delle celle attraverso un filtro cellulare da 100 μm.
  4. Risciacquare il filtro cellulare con un ulteriore mezzo DMEM + HEPES + 10% (v/v) di FBS per prevenire una perdita eccessiva di cellule.
  5. Ordina le celle come descritto nel passo 5. "Smistamento dell'AECII".
    NOTA: Dopo la verifica sperimentale obbligatoria che qualsiasi virus sia stato inattivato con un PFA al 4% (a/v), l'AECII può essere classificato secondo le condizioni BSL1.
  6. Per l'isolamento dell'RNA da cellule fissate con PFA, si utilizza il kit FFPE RNeasy.
    ATTENZIONE: Questo kit contiene sostanze chimiche pericolose. Segui le istruzioni del produttore. Presta attenzione alla scheda dati di sicurezza inclusa, con le seguenti modifiche:
    1. Dopo la smistamento, centrifugare le celle per 15 minuti a 140 x g a 4 °C.
    2. Risospendere le celle in PKD a buffer da 150 μL e trasferirle in un tubo da 1,5 mL.
    3. Aggiungere 10 μL di proteinasi K e incubare a 56 °C per 15 minuti, seguita da incubazione a 80 °C per un massimo di 15 minuti, a seconda del conteggio cellulare (vedi Tabella 1).
  7. Continuare con il processo di isolamento dell'RNA secondo il protocollo, includendo il trattamento con DNasi, i passaggi di lavaggio e l'eluzione finale in acqua priva di RNasi a 30 μL.

Risultati

Il protocollo qui descritto rappresenta un metodo ottimizzato e dettagliato per isolare e analizzare AECII da tessuto polmonare di topo in varie fasi dello sviluppo, che vanno dal neonato al giovanile e adulto. La metodologia prevede la dissociazione polmonare meccanica ed enzimatica, combinata con un flusso di lavoro ottimizzato per la selezione citometrica delle cellule a flusso, utilizzando protocolli personalizzati adatti per la lavorazione dei campioni di animali infetti per il successivo Smistamento a Flusso in condizioni BSL1.

I dati sperimentali hanno rivelato un'elevata efficacia di questa procedura di isolamento (riassunta nella Figura 1) nella produzione di popolazioni AECII vitali e altamente pure (>95%). L'ordinamento del flusso ha generato popolazioni AECII pure, con l'analisi post-ordinamento che ha validato quasi il 100% di specificità per i marcatori cellulari consolidati (Figura 2). La quantificazione dei campioni cellulari post-sort ha indicato elevate rese tra 0,15 × 106 AECII vitali dai polmoni neonatali e 1,0 × 106 cellule da campioni adulti per preparazione per polmone intero (Figura 3A). Gli AECII isolati hanno mantenuto la morfologia tipica (Figura 3B) e l'integrità cellulare durante tutto il processo di isolamento (Figura 3C). Inoltre, l'applicabilità del protocollo agli studi funzionali è stata confermata tramite un'infezione ex vivo di successo utilizzando un IAV adattato al topo (H1N1, ceppo A/Porto Rico/8/34) che esprime la proteina reporter mCherry (IAV-mCherry12), con una dimostrazione della capacità delle cellule di supportare la replicazione virale (Figura 4).

Per supportare flussi di lavoro sperimentali che richiedono la fissazione del campione, il protocollo include un approccio specializzato di estrazione dell'RNA che utilizza la fissazione PFA. Un esame approfondito della qualità dell'RNA da AECII fissati con PFA in diversi momenti di elaborazione ha indicato che RNA di alta qualità adatto ad analisi molecolari a valle può essere estratto in modo affidabile da campioni fissi (Tabella 1). La qualità dell'RNA estratto ha mostrato una relazione diretta con la durata del trattamento termico a 80 °C durante la procedura di estrazione, offrendo linee guida chiare di ottimizzazione basate su particolari esigenze sperimentali (Tabella 1, Figura 5). La validazione tramite analisi PCR di trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR) ha mostrato un'amplificazione efficace sia dei geni di mantenimento (proteina ribosomica S9, Rps9) sia dei marcatori specifici AECII (proteina tensioativa C, Sftpc) con campioni fissati in PFA e nuove preparazioni di controllo (Figura 6).

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Figura 1: Flusso di lavoro schematico per l'isolamento AECII da polmoni neonatali, giovani e adulti di topo utilizzando la digestione enzimatica dei tessuti e la selezione cellulare citometrica a flusso. Il diagramma illustra l'elaborazione sistematica dei polmoni di topo provenienti da diverse fasce d'età. L'eutanasia dei topi e l'estrazione polmonare sono seguite da una digestione enzimatica a più fasi con dispasi per la disintegrazione dei tessuti. Dopo una rottura meccanica, le cellule vengono purificate attraverso una serie di fasi di filtrazione con pori in diminuzione. Successivamente, gli eritrociti vengono lisati. L'arricchimento specifico dell'AECII si ottiene tramite selezione negativa tramite marcatura anticorpale contro marcatori ematopoietici (CD45, CD11b, CD11c, F4/80, CD19, CD16/32), marcatore endoteliale CD31, marcatore piastrinico CD93 e marcatore delle cellule epiteliali bronchiali CD24, selezione positiva delle cellule epiteliali tramite marcatura di anticorpi contro CD326 e successiva selezione citometrica a flusso basata sull'alto caratteristico SSC profilo di AECII granulare. Questo protocollo consente l'isolamento di AECII primari altamente puri (≥ 95%), validi per analisi funzionali e molecolari a valle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Strategia rappresentativa di gating utilizzata per l'isolamento di AECII da topi adulti. (A) Le sospensioni polmonari monocellulari sono state colorate con anticorpi contro i seguenti antigeni: F4/80, CD93, CD11c (accoppiato all'APC), e CD19, CD31, CD11b, CD16/32, CD45, CD24 (accoppiato a PE) e CD326 (accoppiato a BV785). (B) Rianalisi (A) per l'analisi della purezza. Gli AECII ordinati sono stati rianalizzati per confermare la purezza del 97,2% di AECII. (C) Immagini rappresentative di microscopia a fluorescenza dell'AECII dopo la smistamento. I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). La colorazione intracellulare è stata eseguita utilizzando un anticorpo anti-SPC primario (specie: coniglio), mentre la colorazione secondaria è stata eseguita usando IgG anti-coniglio di capra accoppiato ad Alexa 594 (rosso). AECII colorato solo con DAPI e anticorpi secondari, e splenociti colorati con anticorpi primari e secondari hanno servito come controlli rilevanti, indicando il legame specifico sia di anti-SPC che di anti-coniglioAlexa 594. Barre di scala: 20 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Resa, morfologia e vitalità dell'AECII dopo la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. (A) Numero totale di AECII vitali per polmone ottenuto da topi neonatali, giovani e adulti. (B) Immagine microscopica della post-ordinamento dell'AECII ordinato. Barra di scala: 75 μm. (C) Viabilità AECII osservata tramite colorazione blu di tripano dopo la smistamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Infezione ex vivo di AECII ordinato con IAV-mCherry. Le cellule AECII isolate da topi adulti sono state coltivate ex vivo durante la notte in piastre di coltura tissutale rivestite con Matrigel per consentire l'adesione. Successivamente, le cellule sono state infettate con IAV-mCherry (molteplicità di infezione 2) per 8 ore. È stato osservato un aumento dipendente dal tempo dell'intensità del segnale mCherry. Barra della scala: 200 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: integrità dell'RNA dal 4% di PFA ha fissato AECII. Profili rappresentativi di RNA di PFA fissati e classificati AECII dopo isolamento RNA utilizzando il kit Qiagen FFPE RNeasy con modifiche. I picchi specifici per 18S e 28S rRNA, insieme al numero di qualità dell'RNA (RQN), rappresentano l'integrità e la qualità dell'RNA intatto e isolato proveniente da AECII fissati con PFA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Curve di amplificazione del gene di mantenimento Rps9 e del gene specifico AECII Sftpc da controllo (non trattato) e PFA al 4% fissato AECII. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

EsempioTempo di incubazione a 80 °C28S/18SRQNRNA conc. [ng/μ]
Control 0,5x106-2105.8
Control 1x106-1.91012.3
PFA fisso 0,5x106526.45.5
PFA fisso 0,5x106101.98.13.7
PFA fisso 0,5x106151.88.22.76
PFA fisso 1 x106528.26.26
PFA fisso 1 x106101.18.45.12
PFA fisso 1 x106150.98.55

Tabella 1: Qualità dell'RNA isolato dal 4% di PFA fisso AECII - impatto di diversi tempi di fissazione. L'RNA di AECII è stato isolato secondo il protocollo del produttore (FFPE RNeasy Kit) con modifiche descritte nel passaggio 6. Le cellule fissate sono state incubate a 80 °C per 5 minuti, 10 minuti o 15 minuti per eluire l'RNA dal campione. L'integrità dell'RNA è stata determinata utilizzando il Fragment Analyzer di Agilent

Discussione

Il protocollo ottimizzato qui descritto fornisce un approccio affidabile e riproducibile per l'isolamento e l'analisi di AECII dal tessuto polmonare del topo in età neonatale, giovanile e adulta. Inoltre, prevede un passaggio opzionale di fissazione del PFA prima dello smistamento, che permette di selezionare AECII da topi in condizioni BSL1, anche se sono stati precedentemente infettati da patogeni respiratori. Attraverso la combinazione di esposizione polmonare accuratamente eseguita e perfusione, seguita da un'instillazione intratracheale di enzimi e da agarosio a basso scioglimento nel polmone, la struttura tissutale viene mantenuta, permettendo il recupero di sospensioni monocellulari di alta qualità per l'analisi a valle. L'aggiunta di ordinamento citometrico a flusso sulle proprietà di dispersione laterale, la gating lineage-negative e la selezione positiva per cellule CD326-positive ha portato a popolazioni straordinariamente pure di AECII. Questa purezza è di particolare importanza per garantire che i saggi molecolari e funzionali a valle rappresentino la biologia intrinseca AECII e non siano confusi da tipi cellulari contaminanti, migliorando l'interpretabilità degli studi sull'espressione genica e sull'interazione virus-ospite.

Il protocollo sopra menzionato prevede l'esclusione di non AECII utilizzando un'ampia gamma di anticorpi marcati con fluorescenze diretti contro antigeni leucocitici e non leucocitici e la successiva selezione positiva di AECII tramite proprietà di diffusione laterale ed espressione della molecola specifica per cellule epiteliali CD326. Sebbene sia stato dimostrato che questa metodologia ha prodotto popolazioni AECII altamente pure (utilizzando SPC, un marcatore AECII distintivo), la purezza delle popolazioni ottenute è stata confermata finora solo tramite colorazione intracellulare post-smistamento. Questo protocollo può essere applicato per isolare AECII dai polmoni infettati da SARS-CoV-2 e virus influenzale, in cui gli AECII sono principalmente bersagliati dal virus e mostrano adattamenti cellularidistinti 1. Tuttavia, questo metodo potrebbe non essere appropriato per isolare AECII murini nel contesto degli studi biologici del cancro ai polmoni, poiché EpCAM (CD326) è espresso anche dalle cellule del cancro polmonare nei topi e negli esseriumani 13. Per questi studi, l'uso di ceppi di topo transgenici che esprimono proteine fluorescenti sotto il controllo trascrizionale del promotore Spc potrebbe fornire un approccio più adatto per l'isolamento affidabile degli AECII primari.

Un rendimento di 0,15 × 106 AECII vitali per polmone neonatale e fino a 1,0 × 106 cellule per polmone adulto illustra l'efficienza e la scalabilità del protocollo. Un ostacolo importante all'isolamento efficace di grandi quantità di AECII è la digestione enzimatica inefficiente e la disintegrazione meccanica del tessuto polmonare. Pertanto, è fondamentale garantire il completo riempimento degli spazi broncoalveolari con l'enzima nel passo 2.1.4 e eseguire con attenzione la disintegrazione meccanica del tessuto nel passo 3.1.3. Una digestione enzimatica efficace produce una sospensione a cellule torbide con un contributo minimo di aggregati visibili che di solito possono essere disintegrati usando uno sturalavandini nei passaggi seguenti del filtro. Gli aggregati più grandi che non possono essere fatti passare attraverso il filtro cellulare di solito si manifestano a causa di una digestione enzimatica insufficiente. Si noti che non è consigliato prolungare i tempi di digestione enzimatica, poiché ciò potrebbe influire negativamente sulla successivaimmunocolorazione 14 e quindi sull'accuratezza dell'isolamento AECII basato su FACS.

Oltre all'efficienza della disintegrazione enzimatica e meccanica dei tessuti, il background genetico può influenzare la resa dell'AECII. Per questo protocollo sono stati utilizzati topi su uno sfondo C57BL/6. In linea con differenze specifiche specifiche dello sviluppo15,immunologiche 16 efisiologiche 17,18,19 specifiche per ceppo, è concepibile che l'uso di altri ceppi di topo di laboratorio (ad esempio, BALB/c, DBA) possa portare a diverse rese AECII. Inoltre, la resa di AECII da polmoni infiammati (infettivi o non contagiosi) può essere significativamente ridotta. Ciò può essere il risultato di morte cellulare indiretta (infiammatoria) o diretta (mediata dal patogeno) degli AECII, che rappresentano bersagli principali, ad esempio perIAV 20,21 e SARS-CoV-2 22,23,24.

La preservazione dell'integrità cellulare durante la dissociazione meccanica, la digestione enzimatica e l'ordinamento dei flussi è ulteriormente fondamentale per le analisi molecolari e/o funzionali a valle. Pertanto, la vitalità e la funzione cellulare dell'AECII sono state valutate dopo lo smistamento. AECII erano in grado di aderire a Matrigel e mantenere una morfologia corporea lamelare ricca di corpo per almeno 24 ore, il che indica competenza funzionale dopo isolamento e idoneità alla coltura ex vivo (inclusi modelli di infezione).

L'infezione efficiente di AECII selezionati con IAV-mCherry reportervirus 12 e l'osservazione di una forte replicazione virale confermano questo sistema come una piattaforma robusta per chiarire risposte antivirali epiteliali-intrinseche. Poiché AECII regola i processi chiave coinvolti nella biosintesi dei tensioattivi, nella rigenerazione alveolare e nell'immunitàinnata 25,26, la capacità di esaminare la cinetica di replicazione IAV e le risposte trascrizionali dell'ospite nelle popolazioni AECII purificate fornirà informazioni non ottenibili nelle preparazioni a cellule miste.

Una delle principali innovazioni di questo protocollo è l'inclusione di una procedura di fissazione, che consente l'analisi affiancata di campioni freschi e inattivati. La fissazione del PFA e i processi di estrazione dell'RNA FFPE adattati mantengono l'integrità dell'RNA in una misura compatibile con le analisi trascricomiche a valle, come dimostrato dal successo della PCR quantitativa di trascrizione inversa (qPCR).

I tempi di fissazione del PFA possono influenzare la qualità della colorazione e quindi il recupero di AECII tramite FACS. Inoltre, la resa e la qualità dell'RNA sono generalmente influenzate dai processi di fissazione. A seconda del modello di infezione in vivo utilizzato, questi aspetti devono essere considerati per la progettazione sperimentale. Si raccomanda di evitare tempi di fissazione estesi e invece di ottimizzare la durata del trattamento con PFA in modo da utilizzare il tempo minimo necessario, che è stato sperimentalmente dimostrato come garanzia di completa inattivazione del rispettivo virus.

La valutazione dell'abbondanza di RNA ribosomico (rRNA) tramite uno strumento microfluidico funge da surrogato per stimare la qualità dell'mRNA nei campioni biologici. Il protocollo di fissazione/isolamento dell'RNA descritto dall'AECII consente l'isolamento di RNA intatto con qualità sufficiente per analisi trascricomiche a valle, come dimostrato dai rapporti rRNA 28S/18S >1 e dai valori del numero di qualità dell'RNA (RQN) >8. È importante notare che la fase di incubazione a 80 °C riduce criticamente la resa e la qualità dell'RNA. L'adattamento dei tempi di trattamento termico può essere opzionalmente applicato per aumentare la resa e la qualità dell'RNA per applicazioni a valle.

Collettivamente, questi miglioramenti metodologici forniscono un ampio arsenale di strumenti per lo studio della biologia AECII nel contesto della salute, delle malattie infettive e dello sviluppo (dal neonato all'adulto). L'elevata resa e purezza degli AECII isolati da questo approccio permettono profilazioni multi-omiche, comprendendo saggi trascrittomici, proteomici e di accessibilità alla cromatina, oltre a saggi funzionali (ad esempio, infezione ex vivo ) per analizzare ulteriormente i meccanismi rilevanti di AECII in vivo.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non esserci conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare Tatjana Hirsch e Friederike Kruse per il loro esperto supporto tecnico, Lisa Hönicke e Justine Smout per le loro discussioni utili, e Yoshihiro Kawaoka per aver fornito il virus IAV-mCherry reporter. Questo studio è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione Tedesca per la Ricerca) - TRR 359 - Progetto numero 491676693 (a D.B. e J.H.), dall'iniziativa COVIPA (KA1-Co-02, Associazione Helmholtz; a D.B.) e da una sovvenzione dalla Fondazione Tedesca per la Ricerca (BO 7036/1-1; a J.D.B.). Riconosciamo il sostegno del Fondo per la Pubblicazione ad Accesso Aperto della Facoltà di Medicina dell'Università Otto-von-Guericke di Magdeburgo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Buffer ACK--8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO3, 200 g e micro; L di 0. 5 M EDTA, aggiungi 1000 mL di Milli-Q, regola il pH da 7,2 a 7,4
anti-mouse CD11beBioscienza12-0112-83clone M1/70; PE accoppiato
anti-mouse CD11cBiolegend117310clone N418; APC accoppiato
anti-mouse CD16/32BD in Biologia553141clone 93; purificato
anti-mouse CD16/32BD in Biologia561727clone 2.4G2; PE accoppiato
anti-mouse CD19Biolegend115508clone 6D5; PE accoppiato
anti-mouse CD24Biolegend101808clone M1/69; PE accoppiato
anti-mouse CD31Biolegend102408clone 390; PE accoppiato
anti-mouse CD326Biolegend118245clone G8.8; BV785 accoppiata
anti-mouse CD45BD in Biologia553081clone 30-F11; PE accoppiato
anti-mouse CD93eBioscienza17-5892-82clone AA4-1; APC accoppiato
anti-mouse F4/80Biolegend123116clone BM8; APC accoppiato
anti-mouse SPC abcamab211326Specie ospite: coniglio; Clone: EPR19839; purificato
Aria-FusionBD in BiologiaSmistatore di celle
Aria-II SORPBD in BiologiaSmistatore di celle
Placca Biozym AgarosioBiozym8401011% (c/v) in H2O
Filtro cellulare (100 & micro; M, 70 & Micro; M, 40 & Micro; m)BD Falcon352360, 352350, 352340
CellTrics (50 & micro; m)Sysmex04-004-2327
Desossiribonucleasi I dal pancreas bovino, 2000 unità di Kunitz/fialaSigma-AldrichD4263Contenuto di 1 fiala appena sciolta in 330 & micro; L DMEM
Dispase, 100 mL (5000 unità caseinolitiche)Corning354235eseguire la filtrazione sterile (dimensione dei pori 0,22 & micro; m), preparare 4 mL aliquote in tubi da 15 mL, conservare a -20 ° C
DMEMGibco31885-049Glucosio basso, con piruvato, aggiungere HEPES (concentrazione finale di 25 mM)
FACS DivaBD in BiologiaSoftware di ordinamento
FlowJoSoftware di valutazione per i dati FACS
Capra Anti-ConiglioAlexa 594 accoppiata
Cannula Interna Introcan 22GBraun4252098B
RNeasy FFPE KitQiagen73504
Symphony S6 SEBD in BiologiaSmistatore di celle

Riferimenti

  1. Stegemann-Koniszewski, S., et al. Alveolar type II epithelial cells contribute to the anti-influenza A virus response in the lung by integrating pathogen- and microenvironment-derived signals. mBio. 7 (3), (2016).
  2. Kumova, O. K., et al. Severity of neonatal influenza infection is driven by type I interferon and oxidative stress. Mucosal Immunol. 15 (6), 1309-1320 (2022).
  3. Angelidis, I., et al. An atlas of the aging lung mapped by single-cell transcriptomics and deep tissue proteomics. Nat Commun. 10 (1), 963(2019).
  4. Cleaver, J. O., et al. Lung epithelial cells are essential effectors of inducible resistance to pneumonia. Mucosal Immunol. 7 (1), 78-88 (2014).
  5. Boehme, J. D., et al. Epigenetic changes and serotype-specific responses of alveolar type II epithelial cells to Streptococcus pneumoniae in resolving influenza A virus infection. Cell Commun Signal. 23 (1), 278(2025).
  6. Worrell, J. C., et al. Lung structural cells are altered by influenza virus leading to rapid immune protection following re-challenge. Nat Commun. 16 (1), 7061(2025).
  7. Sinha, M., Lowell, C. A. Isolation of highly pure primary mouse alveolar epithelial type II cells by flow cytometric cell sorting. Bio Protoc. 6 (22), (2016).
  8. Chen, Q., Liu, Y. Isolation and culture of mouse alveolar type II cells to study type II to type I cell differentiation. STAR Protoc. 2 (1), 100241(2021).
  9. Gereke, M., et al. Flow cytometric isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells for functional and molecular studies. J Vis Exp. (70), e4322(2012).
  10. Avelin, V., Sissonen, S., Julkunen, I., Österlund, P. Inactivation efficacy of H5N1 avian influenza virus by commonly used sample preparation reagents for safe laboratory practices. J Virol Methods. 304, 114527(2022).
  11. Jureka, A. S., Silvas, J. A., Basler, C. F. Propagation, inactivation, and safety testing of SARS-CoV-2. Viruses. 12 (6), (2020).
  12. Fukuyama, S., et al. Multi-spectral fluorescent reporter influenza viruses (Color-flu) as powerful tools for in vivo studies. Nat Commun. 6, 6600(2015).
  13. Hanssen, A., Loges, S., Pantel, K., Wikman, H. Detection of circulating tumor cells in non-small cell lung cancer. Front Oncol. 5, 207(2015).
  14. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
  15. Soutiere, S. E., Mitzner, W. Comparison of postnatal lung growth and development between C3H/HeJ and C57BL/6J mice. J Appl Physiol. 100 (5), 1577-1583 (2006).
  16. Alberts, R., et al. Gene expression changes in the host response between resistant and susceptible inbred mouse strains after influenza A infection. Microbes Infect. 12 (4), 309-318 (2010).
  17. Kida, K., Fujino, Y., Thurlbeck, W. M. A comparison of lung structure in male DBA and C57 black mice and their F1 offspring. Am Rev Respir Dis. 139 (5), 1238-1243 (1989).
  18. Reinhard, C., et al. Inbred strain variation in lung function. Mamm Genome. 13 (8), 429-437 (2002).
  19. Soutiere, S. E., Tankersley, C. G., Mitzner, W. Differences in alveolar size in inbred mouse strains. Respir Physiol Neurobiol. 140 (3), 283-291 (2004).
  20. Koerner, I., Matrosovich, M. N., Haller, O., Staeheli, P., Kochs, G. Altered receptor specificity and fusion activity of the haemagglutinin contribute to high virulence of a mouse-adapted influenza A virus. J Gen Virol. 93 (Pt 5), 970-979 (2012).
  21. Weinheimer, V. K., et al. Influenza A viruses target type II pneumocytes in the human lung. J Infect Dis. 206 (11), 1685-1694 (2012).
  22. Youk, J., et al. Three-dimensional human alveolar stem cell culture models reveal infection response to SARS-CoV-2. Cell Stem Cell. 27 (6), 905-919.e10 (2020).
  23. Ziegler, C. G. K., et al. SARS-CoV-2 receptor ACE2 is an interferon-stimulated gene in human airway epithelial cells and is detected in specific cell subsets across tissues. Cell. 181 (5), 1016-1035.e19 (2020).
  24. Katsura, H., et al. Human lung stem cell-based alveolospheres provide insights into SARS-CoV-2-mediated interferon responses and pneumocyte dysfunction. Cell Stem Cell. 27 (6), 890-904.e8 (2020).
  25. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: Defender of the alveolus revisited. Respiratory Res. 2 (1), 33(2001).
  26. Mason, R. J. Biology of alveolar type II cells. Respirology. 11 (Suppl), S12-S15 (2006).

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