È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Imaging a due fotoni intravitali della morfologia degli assoni sensoriali del tatto nella pelle del topo

840 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/69589

⸱

30 dicembre 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio presenta un approccio di imaging a due fotoni in vivo per visualizzare le strutture dei terminali assonici dei meccanorecettori (LTMR) a bassa soglia nella pelle delle zampe anteriori dei topi. Utilizzando immagini ripetute ad alta risoluzione di singoli assoni, questo metodo offre una nuova piattaforma per studiare la struttura e la funzione del circuito sensoriale cutaneo durante lo sviluppo e negli adulti.

Abstract

I meccanorecettori a bassa soglia (LTMR) sono neuroni somatosensoriali che rilevano stimoli luminosi innocui come vibrazione, deviazione dei capelli e pressione. Formano terminali assonali specifici per sottotipo nella periferia e proiettano assoni centralmente verso il midollo spinale per trasmettere informazioni tattili. La comprensione attuale dello sviluppo e dell'organizzazione LTMR deriva da tessuti fissi che non possono rivelare i processi dinamici e temporali del cablaggio e rimodellamento assonali. Qui viene presentato un metodo di imaging a due fotoni per visualizzare la morfologia assonica LTMR nella zampa anteriore del topo durante lo sviluppo e negli adulti. La microscopia a due fotoni può ottenere immagini ad alta risoluzione all'interno della pelle intatta, permettendo di ripetere l'imaging degli stessi terminali assonici nei momenti postnatali. L'imaging a due fotoni può essere combinato con nuovi strumenti genetici del topo per rivelare lo sviluppo assonico con specificità per sottotipo. L'imaging cronico degli LTMR consente studi sull'assemblaggio e la riparazione dei circuiti dopo un infortunio. Questi approcci forniscono un sistema in vivo che fornirà nuove intuizioni sui meccanismi cellulari che regolano lo sviluppo e la rigenerazione degli assoni somatosensoriali.

Introduzione

Il tatto è il senso più antico che si sviluppa e gioca un ruolo centrale nel modo in cui gli organismi sperimentano e rispondono al mondo fisico. Il tatto è rilevato dai meccanorecettori a bassa soglia (LTMR), che sono sottotipi di neuroni ganglionali della radice dorsale (DRG) che rilevano stimoli meccanici innocui, tra cui incavazione, vibrazione e deviazione dei capelli 1,2. Gli LTMR sono pseudounipolari e estendono gli assoni periferici nei tessuti periferici per formare terminali specifici per sottotipo. I loro assoni centrali trasmettono informazioni tattili al sistema nervoso centrale formando connessioni sinaptiche con i neuroni del midollospinale 3. Tuttavia, il modo in cui i circuiti touch vengono stabiliti e mantenuti è poco compreso.

Studi fondamentali precedenti sui gatti negli anni '60 e '70 identificarono per primi questi meccanetori funzionalmente distinti e le loro proprietà di risposta nella pelle pelosa 4,5. I sottotipi LTMR sono classificati in base alla loro morfologia unica, velocità di conduzione e proprietàdi risposta 2. I principali sottotipi LTMR sono Aβ che si adattano rapidamente (RA) e si adattano lentamente (SA), Aδ-LTMR e C-LTMR 2,6,7. Gli Aβ RA-LTMR, Aδ-LTMR e C-LTMR formano complessi lanceolati longitudinali attorno ai follicolipiliferi 2. Gli Aδ-LTMR formano terminazioni lanceolate polarizzate attorno ai follicoli piliferi sul lato caudale, una caratteristica essenziale per le loro risposte selettive direzionali alla deviazionedei capelli 7. Le terminazioni assonali nei complessi lanceolati sono strettamente allineate con i fusti dei capelli e sono avvolte da processi simili a dita provenienti da cellule terminali di Schwann, che forniscono supporto trofico e influenzano la morfogenesiassonale 8,9,10. Nella pelle glabra, gli assoni Aβ RA-LTMR terminano nei corpuscoli di Meissner, che sono strutture a forma ovoidale situate all'interno delle papille dermiche e sintonizzate per il movimento sulla pelle 2,11.

L'organizzazione dei terminali assonali LTMR è regolata sia da programmi intrinseci sia da segnali cutanei durantelo sviluppo 12,13. Quando danneggiato, la disfunzione LTMR è associata a condizioni patologiche come l'allodiniameccanica 12,14. Tuttavia, i meccanismi per lo sviluppo e la manutenzione della LTMR nella pelle intatta restano poco chiari. Gran parte di ciò che si sa sul loro sviluppo deriva da tessuti fissi, che non possono catturare i processi dinamici che possono avvenire in vivo 6,15,16,17,18. Ad esempio, gli Aβ RA-LTMR e Aδ-LTMR mostrano innervazioni attive intorno ai follicoli piliferi e potatura assonale durante lo sviluppo postnataleprecoce 19. Come si ottenga l'innervazione e il mantenimento dei follicoli piliferi in vivo rimane sconosciuto.

La microscopia a scansione laser a due fotoni, una tecnica avanzata di imaging che consente la visualizzazione di strutture marcate fluorescenti all'interno dei tessuti viventi, ha permesso l'imaging ad alta risoluzione in vivo di processi fisiologicidinamici 20,21. Durante l'imaging a due fotoni, brevi impulsi di luce nel prossimo infrarosso eccitano i fluorofori solo nel piano focale, confinando così il segnale a un volume piccolo e minimizzando la fluorescenza fuorifuoco 21,22. Questo confinamento riduce significativamente la fototossicità e consente immagini tridimensionali e spazialmente risolte delle strutture 20,23,24. Inoltre, le lunghezze d'onda di eccitazione più lunghe utilizzate nella microscopia a due fotoni diffondono meno all'interno dei tessuti, permettendo una penetrazione più profonda e un rumore inferiore in ambienti complessi 20,25,26. Ad esempio, l'imaging a due fotoni ha rivelato plasticità sinaptica strutturale e attività neuronali nei neuroni del corno dorsale del midollospinale 27,28,29. Inoltre, l'imaging cronico in vivo a due fotoni dei follicoli piliferi ha rivelato intuizioni sulla loro omeostasi nella pelle dell'orecchiodel topo 23. Pertanto, la microscopia a due fotoni è particolarmente adatta per studiare le strutture LTMR nella pelle in vivo, specialmente quando è necessaria l'imaging ripetuto e a lungo termine per monitorare i cambiamenti dello sviluppo e cronici.

Quando abbinata a linee di topo geneticamente modificate che esprimono reporter fluorescenti, la microscopia a due fotoni può rivelare la morfologia neuronale nellapelle 3. Nel sistema somatosensoriale, la proteina fluorescente gialla (YFP), espressa sotto il controllo del promotore thy1 (Thy1-YFP)30, marchia selettivamente i complessi lanceolati Aβ-LTMR nella pelle pilosa e i corpuscoli di Meissner nella pelleglabra 30,31. Nei topi Thy1-YFP, gli assoni marcati sono positivi per proteine basiche mieliniche e neurofilamenti, che sono marcatori per gli assoni Aβmielinizzati 30,31. Inoltre, ilCreer TrkB CreER, in cui la Cre recombinasi indotta da tamoxifene (CreER) è guidata dall'espressione del gene TrkB (recettore della tropomiosina chinasi B), segna selettivamente gli Aδ-LTMR durante lo sviluppo7. Nella pelle, la microscopia a due fotoni è più efficace per l'imaging delle LTMR nei topi anestetizzati, poiché il movimento del topo influenzerebbe l'acquisizione ad alta risoluzione dell'immagini. Ci vuole tempo per visualizzare le proteine fluorescenti ai terminali assonali dopo l'espressione indotta da CreER, e il periodo minimo di attesa deve essere determinato per ciascuna linea transgenica. In generale, questa metodologia può essere applicata alla visualizzazione delle LTMR su topi di tutte le fasi dello sviluppo e negli adulti.

Questo protocollo spiega le procedure per l'uso della microscopia a due fotoni per indagare la morfologia degli assoni LTMR nella pelle pelosa e glabra di topi in via di sviluppo e adulti ad alta risoluzione. Il protocollo include diversi consigli per immagini ottimali ad alta risoluzione e croniche. Questo approccio integrativo consente di indagare i meccanismi cellulari che guidano l'assemblaggio e la plasticità degli assoni sensoriali del tatto in vivo.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con le normative istituzionali sulla cura degli animali e sono state approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali (IACUC) della Vanderbilt University. Per la sicurezza degli sperimentatori, tutte le procedure furono eseguite con camici da laboratorio, guanti sterili e maschere. Tutti gli strumenti sono stati sterilizzati accuratamente prima dell'uso e tutte le superfici sperimentali sono state pulite con etanolo al 70% prima e dopo ogni esperimento. I topi utilizzati in questo studio erano adolescenti e adulti di entrambi i sessi e derivavano da ceppi di Thy1-YFP, TrkBCreER e Ai140. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione degli strumenti

  1. Accendi il laser. Lascia abbastanza tempo al laser per riscaldarsi. In questo lavoro è stato utilizzato il laser Chameleon Discovery NX, che ha una durata di impulsi di 100 femtosecondi (fs) e una frequenza di ripetizione di 80 ± 0,5 megahertz (MHz).
  2. Accendi il microscopio a due fotoni e apri il software di controllo e acquisizione sul computer.
  3. Accendi la borsa termica e impostala a 37 °C per prevenire l'ipotermia durante l'anestesia.

2. Preparazione dell'anestesia e della zampa anteriore per l'imaging

  1. Per indurre l'anestesia, si colloca il topo nella camera di induzione e si imposta il sistema al 3,5% di isoflurano finché il topo non perde il riflesso di raddrizzarsi e mostra respirazioni regolari e regolari (seguendo i protocolli approvati dall'istituzione). L'aria ambiente viene usata come portatore e dovrebbe essere impostata a 1,0 litro al minuto (L/min).
  2. Metti il mouse sul cuscinetto riscaldante sulla piattaforma di imaging e riduci l'isoflurano all'1,5% e l'ossigeno a 0,5 L/min. L'isoflurano deve essere somministrato attraverso il cono nasale. Per i topi più giovani del giorno postnatale 20, l'isoflurano è impostato al 2-4% per mantenere l'anestesia. Monitorare la profondità anestetica ogni 10 minuti valutando la perdita dei riflessi pedali e palpebrali, la frequenza e la profondità respiratorie, e il tono muscolare complessivo.
  3. Per minimizzare gli artefatti di movimento durante l'immagini, incluso il movimento legato alla respirazione, il topo dovrebbe essere posizionato su un palco separato dalla zampa. Per questo protocollo, il corpo del topo si appoggia su una piattaforma direttamente adiacente, ma senza toccare, la piattaforma di imaging dove è montata la zampa.
  4. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'imaging.
  5. Applica delicatamente una crema depilatoria sulla zampa usando un cotton fioc per rimuovere i peli. Dopo averla lasciata agire sulla pelle per un minuto, togli la crema e poi pulisci la zampa del topo con etanolo al 70% e acqua.
  6. Allunga delicatamente la pelle per stabilizzare la superficie. Usando un ago sterile da 30 G e inchiostro nero, perfora delicatamente la pelle e il tatuaggio con due puntini adiacenti ai lati della regione dell'immagine desiderata. Assicurati che i punti siano distanziati di circa 2 millimetri (mm) l'uno dall'altro. Dopo aver completato il tatuaggio, getta correttamente l'ago in un contenitore per oggetti taglienti.
  7. Su un vetrino di vetro, posizionare quattro puntini di grasso a vuoto sugli angoli e posizionare un piccolo pezzo di argilla (ad esempio, argilla da modellazione per indurire all'aria DAS) di circa 1 mm di spessore al centro del vetrino. Posiziona il vetrino sotto la lente dell'obiettivo e centra la zampa del topo direttamente sul pezzo di argilla (Figura 1A,B). Fai rotolare delicatamente la zampa del topo sul slide per appiattirla e premetterala contro l'argilla. Posiziona con cura una copertura da 22 mm x 60 mm sopra la zampa per fissare il slide. Regolare l'angolo della pelle del topo esercitando una leggera pressione su ciascuno degli angoli della copertura finché la superficie della copertura e la pelle non sono parallele al piano di immagigine. L'uso di una forza delicata durante l'imaging aiuta a prevenire potenziali lesioni cutanee.
  8. Per immaginare la pelle glabra, posiziona il carrello sotto l'obiettivo e centra la zampa del topo sul carrello come descritto nel passo 2.7. Usa una pinzetta per ruotare la zampa in modo che la pelle glabra sia rivolta verso l'alto. Usa l'estremità piatta della pinzetta per premere delicatamente la zampa sull'argilla. Una volta che la zampa è piatta, posiziona il sottocoperto sopra e premi verso il basso come descritto nel passo 2.7.

3. Microscopio a due fotoni per la morfologia LTMR

NOTA: I seguenti parametri possono essere regolati in base all'esperimento specifico. Per questo esperimento è stato utilizzato un obiettivo a immersione in acqua da 20x con apertura numerica di 1 e distanza di lavoro di 2,00 mm. I passaggi 3.1-3.6 descrivono i parametri specifici utilizzati per la zampa anteriore destra del topo Thy1-YFP , che possono servire come guida di riferimento.

  1. Metti una goccia di acqua distillata sulla copertura, direttamente sopra la zampa del topo.
  2. Abbassare la lente obiettivo finché non si forma una colonna d'acqua.
  3. Una volta che la lente dell'obiettivo è centrata sopra la zampa del topo, chiudi la scatola del microscopio e usa lo schermo LED per mettere a fuoco il campione tramite i controller X, Y e Z. Lo schermo LED mostra un'immagine in tempo reale illuminata dal LED integrato nel microscopio.
    NOTA: La modalità LED viene utilizzata per confermare che l'obiettivo sia centrata sul campo di interesse prima di passare alla modalità a due fotoni. L'immagine LED mostra caratteristiche superficiali come vasi sanguigni e follicoli piliferi, fungendo da guida visiva per l'allineamento e il mirare. I tatuaggi sulla zampa del topo appaiono come macchie nere sullo schermo LED. Utilizzando questi punti di riferimento, individua e concentra l'area tra le macchie nere. Questo garantisce che la stessa area della zampa del topo venga riprodotta ripetutamente.
  4. Una volta trovato il campione, spegni lo schermo LED. Per effettuare l'imaging a due fotoni dal tessuto, si passa dal microscopio dall'impostazione specchio a quella dicroica ruotando una leva sul lato superiore destro del microscopio.
  5. Chiudi le tende oscuranti e accendi il rivelatore per visualizzare il YFP.
  6. Usando Prairie View, apri l'otturatore e passa il software in modalità imaging. Per l'imaging Thy1-YFP, accendi il laser sintonizzabile impostato a 960 nanometri (nm) con un guadagno di 700-800. Quando si effettua l'imaging della GFP, imposta il laser sintonizzabile a 920 nm.
    1. Per topi postnatali al giorno 10 o più giovani, imposta la potenza laser iniziale a 50, aumentando fino a raggiungere l'intensità del segnale desiderata. Questa potenza laser iniziale più bassa minimizza la penetrazione della luce e il rischio di danni da foto. Dopo che la lunghezza d'onda del laser, il guadagno e la potenza sono stati impostati, inizia la scansione.
      NOTA: Per catturare un'immagine ad alta risoluzione con campo visivo 1,00x o un'immagine di corpuscoli di Meissner con dita glabre, si raccomanda di utilizzare una dimensione immagine di 1024 x 1024 con un campo visivo di imaging di 601,9 μm x 601,9 μm e una dimensione dei pixel di 0,588 μm x 0,588 μm. Per l'imaging delle terminazioni lanceolate intorno ai follicoli piliferi, si raccomanda di avere una dimensione dell'immagine di 1024 x 1024 con uno zoom di 8,00x, un campo visivo di 75,2 μm x 75,2 μm e una dimensione dei pixel di 0,147 μm x 0,147 μm. È importante notare che il campo visivo dell'imaging e la dimensione dei pixel cambiano con l'impostazione dello zoom.
  7. Usa i controller X, Y e Z per trovare il campo di immagini, regola lo zoom secondo necessità e inizia l'acquisizione dell'immagine. Un'immagine ottimale viene tipicamente ottenuta in una posizione iniziale a circa 10-20 μm sotto la superficie cutanea.
    NOTA: Un'immagine ad alta risoluzione della pelle pelosa ha tipicamente una dimensione di 1 μm o 2 μm con circa 40-120 fette. Nel frattempo, un'immagine ad alta risoluzione della pelle glabra tipicamente ha una dimensione di passo da 2 μm a 4 μm con circa 80-100 fette. Questo si traduce in un tipico intervallo z di 100-250 μm, e la profondità massima complessiva di imaging è di circa 300 μm.
  8. La sessione di imaging sarà limitata a 25 minuti per minimizzare la durata dell'esposizione all'isoflurano e ridurre il rischio di effetti avversi legati all'anestesia sull'animale. L'isoflurano extra viene assorbito da un filtro di carbone anestetico, che può essere smaltito nella spazzatura normale.

4. Cure post-operatorie

  1. Togli la zampa del topo dal carrello di vetro e riporta il topo in una gabbia di recupero.
  2. Tieni la gabbia del topo calda su una borsa riscaldante finché il topo non si riprende completamente dall'anestesia.
  3. Rimetti il topo nella gabbia di casa, osservandolo per altri 30 minuti per assicurarsi che si integri con i compagni di gabbia.

5. Imaging cronico in vivo della morfologia LTMR

  1. Posiziona il mouse sotto il microscopio a due fotoni seguendo i passaggi 2.4-3.3.
  2. Utilizzando lo schermo LED, individua i punti d'inchiostro della sessione di imaging precedente. Orienta lo schermo tra i punti per assicurarti che l'area desiderata venga catturata. Durante la scansione al microscopio, controlla la presenza di punti di riferimento, come grandi nervi o modelli follicoli piliferi, per assicurarti di individuare la stessa area.
  3. Una volta trovata l'area di imaging, segui i passaggi 3.4-3.6 per continuare l'immagini.
  4. Controlla la qualità e l'intensità delle immagini, così come la morfologia degli assoni maggiori, ottenuta tramite eccitazione a due fotoni dell'area cutanea. Assicurati che i campi dell'immagine siano comparabili a quelli scattati durante la precedente sessione di imaging.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

In questo lavoro, la microscopia a due fotoni è stata utilizzata per visualizzare le strutture assonali Aβ RA-LTMR e Aδ-LTMR nella pelle durante lo sviluppo e negli adulti. Le terminazioni lanceolate mature, che si verificano nei topi intorno al giorno 20 e superiore al postnatale, sono completamentesviluppate 19,32. L'organizzazione complessiva dei terminali assonici nella pelle pelosa dei topi adulti è stata fotografata, come mostrato nella proiezione di massim...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Questo studio dimostra l'uso della microscopia a due fotoni per esaminare la morfologia LTMR nella pelle intatta di topi neonatali e adulti. Questo approccio di imaging longitudinale supera i limiti della fissazione dei tessuti e consente l'osservazione in tempo reale delle strutture assonali nei tessuti intatti. Le morfologie assonali Aβ RA-LTMR e Aδ-LTMR visualizzate tramite immagini a due fotoni sono coerenti con le osservazioni dei tessuti precedenti fissati conPFA<...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non riportano alcuna divulgazione rilevante.

Ringraziamenti

Desideriamo ringraziare la Dott.ssa Hannah Elam, la Dott.ssa Snighda Mukerjee, Rachelle Larivee e la Dottoressa Tegy J. Vadakkan per tutto il loro supporto e assistenza durante tutta questa ricerca. Ringraziamo Ryan Michael Nuera per l'aiuto nell'installazione del sistema isoflurano. Questo lavoro è sostenuto dalla borsa di studio Hanna Gray dell'Howard Hughes Medical Institute (Grant# GT17518).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Obiettivo 20x & ndash; Super NA 1.0Olympus1-U2B965Configurazione del microscopio a due fotoni
Copertura 22x60VWR16004-330Configurazione del microscopio a due fotoni
Argilla da modellare con indurimento all'ariaDASConfigurazione del microscopio a due fotoni
Pompa d'aria per anestesia (HF), 110VRWD Life Science Inc.R510-30Sistema isoflurano
Maschera Concentrica per AnestesiaRWD Life Science Inc.R510-MSistema isoflurano
Camera di induzione per anestesia – Topo e TopoRWD Life Science Inc.V105Sistema isoflurano
Bruker Ultima Investigator Plus Microscopio a Scansione LaserBruker Nano, Inc. Configurazione del microscopio a due fotoni
Aghi FarfallaFisher Scientific1484041Configurazione del microscopio a due fotoni
Chameleon Discovery NX con TPC: DualCoerente1385777Configurazione del microscopio a due fotoni
Maschera a cono con tubo per topi neonataliRWD Life Science Inc.68680Sistema isoflurano
Doppi filtri a emissione (et525/70m e et595/50m) e t565lpxr  Divisore di fascio dicroicoNikonINVP-01Configurazione del microscopio a due fotoni
Set di filtri a epifluorescenza ET-GFP ET470/40x e ET252/50m; Dicroico T495LPXR Nikon518065Configurazione del microscopio a due fotoni
EtanoloDecon Laboratories Inc.Configurazione del microscopio a due fotoni
Piscino riscaldante a infrarossi lontani con controller (alimentazione AC)Kent ScientificRT-0515Configurazione del microscopio a due fotoni
Rilevatori GaAsp (2) Hamamatsu Photonics HED-UP-2 Configurazione del microscopio a due fotoni
Contenitori del filtro a gasRWD Life Science Inc.R510-31-6Sistema isoflurano
Grasso ad alto vuotoSigma AldrichZ273554Sistema di imaging
Isoflurano, USP (250 mL)Piramal Critical Care6679-017-25Sistema isoflurano
Scatola per copertura laser & nbsp;Teco TechnologySistema di imaging
Topi: B6.129S6(Cg)-Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg/JJAX27214
Topoli: B6. Cg-Igs7tm140.1(tetO-EGFP, CAG-tTA2)Hze/JJAX30220
Topoli: B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/JFiume Charles3709
Crema Depilatoria NairAmazon28001Configurazione del microscopio a due fotoni
File di dati grezziZenodo10.5281/zenodo.17370834
Supporto rigido con grande portainserti rettangolareThorlabsMP15MConfigurazione del microscopio a due fotoni
Piattaforma Operativa per Anestesia per Piccoli AnimaliRWD Life Science Inc.R510-PGLSistema isoflurano
Unguento Lubrificante per gli OcchiBausch + LombConfigurazione del microscopio a due fotoni
Vetri Superfrost Plus per microscopioFisher Scientific12-550-15Configurazione del microscopio a due fotoni

Riferimenti

  1. Abraira, V. E., Ginty, D. D. The sensory neurons of touch. Neuron. 79 (4), 618-639 (2013).
  2. Handler, A., Ginty, D. D. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation. Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).
  3. Meltzer, S., Santiago, C., Sharma, N., Ginty, D. D. The cellular and molecular basis of somatosensory neuron development. Neuron. 109 (23), 3736-3757 (2021).
  4. Burgess, P. R., Petit, D., Warren, R. M. Receptor types in cat hairy skin supplied by myelinated fibers. J Neurophysiol. 31 (6), 833-848 (1968).
  5. Iggo, A., Muir, A. R. The structure and function of a slowly adapting touch corpuscle in hairy skin. J Physiol. 200 (3), 763-796 (1969).
  6. Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
  7. Rutlin, M., et al. The cellular and molecular basis of direction selectivity of Aδ-LTMRs. Cell. 159 (7), 1640-1651 (2014).
  8. Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346 (6212), 950-954 (2014).
  9. Handler, A., et al. Three-dimensional reconstructions of mechanosensory end organs suggest a unifying mechanism underlying dynamic, light touch. Neuron. 111 (20), 3211-3229 (2023).
  10. Yamamoto, T. The fine structure of the palisade-type sensory endings in relation to hair follicles. J Electron Microsc (Tokyo). 15 (3), 158-166 (1966).
  11. Cauna, N., Ross, L. L. The fine structure of Meissner's touch corpuscles of human fingers. J Biophys Biochem Cytol. 8 (2), 467-482 (1960).
  12. Olson, W., Dong, P., Fleming, M., Luo, W. The specification and wiring of mammalian cutaneous low-threshold mechanoreceptors. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (3), 389-404 (2016).
  13. Koutsioumpa, C., et al. Skin-type-dependent development of murine mechanosensory neurons. Dev Cell. 58 (20), 2032-2047 (2023).
  14. Duan, B., Cheng, L., Ma, Q. Spinal circuits transmitting mechanical pain and itch. Neurosci Bull. 34 (1), 186-193 (2018).
  15. Botchkarev, V. A., Eichmüller, S., Johansson, O., Paus, R. Hair cycle-dependent plasticity of skin and hair follicle innervation in normal murine skin. J Comp Neurol. 386 (3), 379-395 (1997).
  16. Peters, E. M. J., et al. Developmental timing of hair follicle and dorsal skin innervation in mice. J Comp Neurol. 448 (1), 28-52 (2002).
  17. Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3 (4), 389-395 (2003).
  18. Liu, Q., et al. Molecular genetic visualization of a rare subset of unmyelinated sensory neurons that may detect gentle touch. Nat Neurosci. 10 (8), 946-948 (2007).
  19. Meltzer, S., et al. A role for axon-glial interactions and Netrin-G1 signaling in the formation of low-threshold mechanoreceptor end organs. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (43), e2210421119(2022).
  20. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  21. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  22. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  23. Pineda, C. M., et al. Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse. Nat Protoc. 10 (7), 1116-1130 (2015).
  24. Kamei, R., Urata, S., Maruoka, H., Okabe, S. In vivo chronic two-photon imaging of microglia in the mouse hippocampus. J Vis Exp. (185), e64104(2022).
  25. Rompolas, P., Mesa, K. R., Greco, V. Spatial organization within a niche as a determinant of stem-cell fate. Nature. 502 (7472), 513-518 (2013).
  26. Theer, P., Denk, W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 23 (12), 3139-3149 (2006).
  27. Ahanonu, B., Crowther, A., Kania, A., Rosa-Casillas, M., Basbaum, A. I. Long-term optical imaging of the spinal cord in awake behaving mice. Nat Methods. 21 (12), 2363-2375 (2024).
  28. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), e2760(2012).
  29. Matsumura, S., Taniguchi, W., Nishida, K., Nakatsuka, T., Ito, S. In vivo two-photon imaging of structural dynamics in the spinal dorsal horn in an inflammatory pain model. Eur J Neurosci. 41 (7), 989-997 (2015).
  30. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  31. Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 88 (10), 582-595 (2012).
  32. Luo, W., Enomoto, H., Rice, F. L., Milbrandt, J., Ginty, D. D. Molecular identification of rapidly adapting mechanoreceptors and their developmental dependence on Ret signaling. Neuron. 64 (6), 841-856 (2009).
  33. Neubarth, N. L., et al. Meissner corpuscles and their spatially intermingled afferents underlie gentle touch perception. Science. 368 (6497), eabb2751(2020).
  34. Bai, L., et al. Genetic Identification of an Expansive Mechanoreceptor Sensitive to Skin Stroking. Cell. 163 (7), 1783-1795 (2015).
  35. Griffin, J. W., Thompson, W. J. Biology and pathology of nonmyelinating Schwann cells. Glia. 56 (14), 1518-1531 (2008).
  36. Tsai, P. F., Chou, F. P., Yu, T. S., Lee, H. J., Chiu, C. T. Depilatory creams increase the number of hair follicles, and dermal fibroblasts expressing interleukin-6, tumor necrosis factor-α, and tumor necrosis factor-β in mouse skin. Korean J Physiol Pharmacol. 25 (6), 497-506 (2021).
  37. Bourane, S., et al. Low-threshold mechanoreceptor subtypes selectively express MafA and are specified by Ret signaling. Neuron. 64 (6), 857-870 (2009).
  38. Jung, Y., Ng, J. H., Keating, C. P., Senthil-Kumar, P., Zhao, J. Comprehensive evaluation of peripheral nerve regeneration in the acute healing phase using tissue clearing and optical microscopy in a rodent model. PLoS One. 9 (4), e94054(2014).
  39. Gangadharan, V., et al. Neuropathic pain caused by miswiring and abnormal end organ targeting. Nature. 606 (7912), 137-145 (2022).
  40. Huang, S., Rompolas, P. Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice. Exp Dermatol. 26 (5), 379-383 (2017).
  41. Meleshina, A. V., et al. Multimodal label-free imaging of living dermal equivalents including dermal papilla cells. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 84(2018).
  42. Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Assoni somatosensorialiassoni LTMRimaging in vivoimaging cronicoinnervazione dei follicoli piliferisviluppo assonalecorpuscoli di Meissner
Imaging a due fotoni intravitali della morfologia degli assoni sensoriali del tatto nella pelle del topo
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.