Method Article

Isolamento e quantificazione degli mRNA assonali utilizzando inserti di membrana porosi e RTddPCR

DOI:

10.3791/69601

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February 6th, 2026

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1Department of Biological Sciences, Rutgers University- Newark, 2College of Arts & Sciences, Boston University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio presenta un metodo robusto per isolare gli mRNA assonali utilizzando inserti di membrana porosi, permettendo la separazione totale tra neuroni e neuriti e la purificazione dell'RNA. Combinato con RTddPCR, l'approccio consente la quantificazione assoluta di trascritti a bassa copia, facilitando studi sul trasporto e la traduzione locale dell'mRNA con alta sensibilità, riproducibilità e ampia applicabilità sperimentale.

Abstract

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La dinamica spaziale della localizzazione e della traduzione dell'mRNA all'interno dei neuroni è essenziale per vari meccanismi di funzione neuronale, tra cui la connettività neuronale, la plasticità sinaptica e la risposta alle lesioni. A causa dell'estrema polarità dei neuroni, molte di queste funzioni dipendono dalla capacità degli assoni di tradurre localmente specifici trascrivi. Tuttavia, quantificare queste popolazioni di RNA subcellulari rimane tecnicamente una sfida. Qui descriviamo un approccio riproducibile per ottenere compartimenti separati somatici e arricchiti assonale da neuroni di roditori coltivati e per quantificare l'espressione specifica di un compartimento per l'espressione di mRNA. I neuroni embrionali o adulti primari del roditore sono stati coltivati su inserti con membrana porosa di dimensione 1-3 μm. Queste membrane sono permissive solo agli assoni, permettendo la separazione fisica dei compartimenti somatico e assonale. L'RNA è stato poi isolato separatamente dall'intero neurone e dalle frazioni arricchite da assoni, che sono state ulteriormente utilizzate per la PCR digitale a gocce di trascrizione inversa (RTddPCR) con primer specifici per geni. Questo sistema offre un confronto assolutamente quantitativo tra compartimenti subcellulari, consentendo il rilevamento ad alta sensibilità di trascritti localizzati. Questo approccio misura l'abbondanza dell'RNA in stato stazionario e facilita l'esame dei cambiamenti dell'RNA assonale nel tempo in risposta a fattori neurotrofici, stress o modelli di lesione. La combinazione di compartimentalizzazione fisica e analisi RTddPCR riduce la contaminazione incrociata e fornisce numeri esatti di copie di trascritti rari, offrendo alta sensibilità, riproducibilità e rilevamento di mRNA a basso numero di copie che controllano la crescita e la rigenerazione degli assoni. Questo metodo funziona anche con test a valle, come la misurazione della sintesi proteica, lo studio della stabilità dell'RNA e la conduzione di esperimenti di perturbazione usando siRNA o farmaci che bloccano determinate proteine. È importante sottolineare che questa tecnica può essere adattata a diversi sottotipi neuronali, stadi di sviluppo o modelli di lesioni. In generale, questo approccio è un modo flessibile, sensibile e riproducibile per studiare la base molecolare della localizzazione dell'mRNA assonale e come essa influenzi la funzione neuronale e i meccanismi delle malattie.

Introduction

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I neuroni sono una delle cellule più strutturalmente complesse e polarizzate della biologia. Hanno processi lunghi che a volte possono raggiungere distanze superiori a un metro. Questa polarità complica la comunicazione cellulare e l'omeostasi proteica in modi distinti. Un approccio raffinato per rispondere a questi requisiti è trasportare mRNA verso compartimenti remoti come assoni e dendriti, facilitandone la traduzione in modo regolato in risposta a segnali localizzati 1,2,3. La traduzione locale consente agli assoni di sintetizzare proteine in modo spaziotemporale. Questo processo è cruciale per lo sviluppo assonale, la plasticità sinaptica, la rigenerazione dopo una lesione e le risposte agli stimoli dello sviluppo edextracellulari 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

La capacità di analizzare le funzioni degli mRNA localizzati negli assoni è cruciale per comprenderne il ruolo sia nella normale funzione neuronale sia nel contesto della fisiopatologia. La disregolazione della traduzione dell'mRNA assonale è stata collegata a varie malattieneurodegenerative16, come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA)17,18,19, l'atrofia muscolare spinale (SMA)20,21 e il morbo di Alzheimer (DA)22. La rigenerazione assonale dopo un danno dipende fortemente dalla rapida e precisa traduzione delle proteine del citoscheletro, delle molecole di segnalazione e dei recettori 3,23,24,25,26,27,28. Nonostante questi concetti innovativi, la disciplina continua ad affrontare sfide nel quantificare e catturare efficacemente le popolazioni di mRNA specifiche per assoni.

Una delle sfide della trasscrittomica assonale è far separare nettamente soma e assoni. Poiché la maggior parte degli mRNA è arricchita dal soma, anche piccole quantità di contaminazione dal corpo cellulare possono influenzare i risultati nella valutazione del contenuto assonale di un particolare mRNA. Le tecniche convenzionali, incluse le camere microfluidiche 29,30,31,32 o le camere Campenot 33, garantiscono una crescita assonale direzionale e una netta separazione tra i due compartimenti, ma la resa assonale può essere troppo bassa per studi biochimici come il sequenziamento di RNA in massa (RNA-seq), la co-immunoprecipitazione dell'RNA seguita dal sequenziamento dell'RNA o la reazione a catena quantitativa della polimerasi (qPCR). RNA-seq e qPCR in massa, sebbene benefiche, spesso mancano della sensibilità necessaria per identificare con precisione i trascrizioni a bassa copia negli assoni, causando una stima errata delle specie fisiologicamente significative.

Per affrontare queste sfide, noi e altri abbiamo utilizzato inserti a membrana permeabili per la separazione fisica degli assoni edella somata 34,35,36,37,38,39,40,41. Questi inserti permettono ai neuroni di svilupparsi su una superficie microporosa, e gli assoni possono estendersi nel compartimento inferiore attraverso di essi, ma non nel soma. Questa architettura di base ma efficace permette di coltivare un enorme numero di neuroni con una chiara separazione fisica tra soma e assoni. Il metodo a membrana è importante perché evita i problemi tecnici associati ai dispositivi microfluidici e fornisce grandi quantità di materiale assonale utilizzabile per studi molecolari e biochimici. Il sistema dell'inserto è anche facile da usare per cose come lesioni meccaniche, il che lo rende utile in molti contesti sperimentali legati alla riparazione neurale. Il metodo descritto qui ottimizza ulteriormente la resa e la purezza neuronale raffinando le condizioni di coltura, regolando le caratteristiche dei pori della membrana e incorporando la validazione basata sulla PCR digitale delle gocce trasscrittali inversa (RTddPCR) per campioni di RNA assonale a basso rendimento.

È anche importante assicurarsi che le frazioni assonali siano pure. Estraiamo gli assoni dalla camera inferiore solo dopo aver rimosso con cura qualsiasi materiale somatico residuo dalla superficie superiore. La validazione del primer mostra un forte arricchimento dei marcatori assonali e nessun o trascurabile marcatore somatico. La conferma molecolare rafforza questa distinzione: le frazioni assonali sono arricchite con mRNA assonali riconosciuti come Gap43, e un'espressione più bassa di Actγ42. Questo dimostra che il sistema dell'inserimento produce campioni assonali con contenuti trascurabili di soma, utili per ulteriori esame.

Dopo aver isolato le frazioni assonali arricchite, l'ostacolo successivo è misurare gli mRNA che esistono in numeri di copie estremamente bassi. Il poco materiale di partenza delle frazioni assonali e la presenza di mRNA a basso numero di copie negli assoni spingono i limiti di sensibilità della PCR quantitativa convenzionale della trascriscritta inversa PCR (RT-qPCR), che utilizza curve standard per la quantificazione. Inoltre, RT-qPCR non fornisce nemmeno i numeri assoluti di copie di un transcript specifico. RTddPCR, invece, separa i campioni di cDNA in migliaia di gocce, il che aiuta a ottenere un conteggio esatto dei trascrizioni utilizzando le statistiche di Poisson. Questo rende possibile trovare in modo affidabile i trascriverti anche se solo poche copie dei trascrivi potrebbero essere presenti in un singolo nanogrammo di RNAtotale 5,6,7,43.

In questo manoscritto, forniamo un approccio semplificato, che include metodi per coltivare diversi neuroni adulti o embrionali di roditori su inserti, isolamento di RNA da compartimenti arricchiti di neuroni interi rispetto a quelli arricchiti con sassoni, verifica della purezza assonale e quantificazione assoluta basata su RTddPCR di copie di mRNA. Questi metodi possono essere utilizzati per determinare i livelli di specifici mRNA, che si localizzano negli assoni in condizioni basali, e come cambiano durante l'assotomia o in risposta alla stimolazione dei fattori di crescita o a segnali neurotossici. Combinando questo metodo con le co-immunoprecipitazioni proteiche, si può anche valutare la dinamica dei complessi proteici ribonucleari (RNP) negli assoni. Ad esempio, abbiamo ampiamente utilizzato questo metodo per studiare gli mRNA, presenti nei granuli assonali della proteina attivante della proteina attivante Ras GTPasi 1 (G3BP1). G3BP1 è un componente centrale dei granuli distress 44, e i nostri studi precedenti hanno dimostrato che inibisce la sintesi delle proteine assonali e, a sua volta, blocca sia la rigenerazione assonica del SNP chequella del CNS 5. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per indagare il ruolo della disregolazione della traslazione assonale in varie condizioni fisiopatologiche, tra cui SLA, SMA e DA.

L'obiettivo di questo studio è creare e testare un metodo sensibile, riproducibile e scalabile per misurare gli mRNA assonali. Combinando colture compartimentate basate su inserti con la quantificazione basata su RTddPCR, forniamo al campo una soluzione ai problemi persistenti della trascrittomica assonale. Questa metodologia non solo consentirà scoperte essenziali riguardo alla traduzione locale, ma stabilirà anche una base per indagini traslazionali focalizzate su interventi terapeutici nella riparazione neurale e nella neurodegenerazione.

Protocol

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1. Preparazione degli inserti per la semina delle celle

  1. Posiziona gli inserti con la dimensione dei pori appropriata in una piastra a 6 pozzi.
    NOTA: Usa una dimensione dei pori di 1 μm per separare gli assoni dal soma e una dimensione di poro di 3 μm per separare tutte le neuriti (assoni e dendriti) dal soma.
  2. Aggiungi 100 μg/mL di poli-L-lisina (PLL) alla piastra a 6 pozzi in modo che tocchi il fondo degli inserti e la parte superiore degli inserti (2 mL/pozzo e 1 mL/inserto).
  3. Incubare durante la notte a 37 °C.
  4. Lava i pozzi (il fondo degli inserti) e la parte superiore degli inserti con acqua ultrapura sterile - 4 lavaggi × 5 minuti.
  5. Solo per i neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG), aggiungere 5 μg/mL di laminina (2 mL/pozzo e 1 mL/inserto) e incubare per almeno 1 ora a 37 °C. Assicurati che sia la parte superiore che inferiore dell'inserto siano rivestite in modo uniforme.
  6. Lavare con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) (pH 7,4) contenente 100 U/mL di Penicilina/Streptomicina - 2 lavaggi × 5 minuti.
  7. Proseguire con la dissezione e il seme intorno a 1 × 106 cellule/inserimento per i neuroni corticaliembrionali 5, ippocampali45 e neuroni colinergici basali del prosencefalo31,32. Per i DRG di ratti adulti, piastra 6-8 DRG/inserto 5,7 (Figura 1).

2. Raccolta di frazioni subcellulari neuronali da inserti a 6 pozzi

  1. Aliquota 250 μL di TRIzol ciascuno in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL per inserto e un pozzo/inserto di una piastra a 6 pozzi. Tienilo da parte.
  2. In un'altra piastra a 6 pozzi, aggiungi 2 mL/pozzetto di PBS sterile. Il numero di pozzi/piastre dovrebbe essere proporzionale al numero di inserti.
  3. Aspirare il materiale di coltura dalla parte superiore e inferiore dell'inserto e trasferire l'inserto su una piastra a 6 pozzi contenente PBS.
  4. Usando la pinza, posiziona delicatamente l'inserto e aggiungi 2 mL di PBS sopra l'inserto. Aspira i mezzi dalla parte superiore e inferiore dell'inserto e ripeti. In totale, lava due volte con PBS e lascia in PBS fresco (1 mL e 2 mL rispettivamente in parte superiore e inferiore dell'inserto).
  5. Isolamento dell'intera frazione neuronale
    1. Utilizzando un raschiatore cellulare sterile, raschiare tutta la frazione neuronale (la parte superiore dell'inserto). Applica la pressione giusta affinché le cellule inizino a staccarsi ma la membrana non si rompa (Figura 1).
    2. Raccogli l'intero neurone dall'inserto e trasferiscilo in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
    3. Centrifuga il tubo a 10.000-15.000 g per 2 minuti.
    4. Scartare il soprandanante e risospendere il lisato in 250 μL di TRIzol.
    5. Etichetta questo tubo come l'intera frazione del neurone.
    6. Continua con la raccolta della frazione di neurite.
  6. Isolamento della frazione di neurite
    1. Prendi un cotton fiagna sterile e, usando un'estremità, muovi lentamente in zig-zag dall'alto verso il basso su tutto il lato dei neuroni. Ruota l'inserto di 90 gradi e ripeti il processo con l'altra estremità del tampone (se usi un tampone a doppio lato, oppure usa un tampone nuovo per uno a un solo lato). Scartare questo tampone (Figura 1).
    2. Usa un nuovo tampone e muovi in cerchi concentrici, partendo dal centro dell'inserto e rientrando verso l'esterno. Assicurati di pulire anche i muri (circonferenza).
    3. Inverti l'inserto di membrana (lato neurite rivolto verso l'alto) e taglia la membrana usando una nuova lama sterile del bisturi tenendola con una pinza. Assicurati di lasciare ~2-3 mm nella periferia.
    4. Posizionare la membrana tagliata nella piastra a 6 pozzi contenente TRIzol con il lato neurite rivolto verso il basso. Assicurati che sia sommerso.
    5. Raccogli il TRIzol contenente il lisato di neurite dalla piastra a 6 pozzi e trasferiscilo in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
  7. Per entrambi i lisati interi e neuronali e neurite, procedere con l'isolamento dell'RNA oppure conservare i lisati a -80 °C per processarli successivamente.

3. Isolamento e quantificazione dell'RNA

  1. Isolamento dell'RNA
    NOTA: Per questa parte, lavora sempre in un ambiente senza RNase con plastica dedicata e sterili e guanti.
    1. Aggiungi 0,2 mL di cloroformio per 1 mL di TRIzol, agita energicamente per 15 secondi e incuba per 2-3 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C per separarsi in strati: organico, interfase e acquoso (contenente RNA).
    2. Trasferire la fase acquosa superiore in un nuovo tubo, evitando l'interfase. Per precipitare l'RNA, aggiungi 1 volume di isopropanolo e mescola delicatamente. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (o più a lungo a -20 °C per una resa maggiore) per precipitare l'RNA. Centrifugare a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C per mettere l'RNA in pellet.
    3. Scartare il surnadante e lavare il pellet con 1 mL di etanolo al 75%. Vortice e centrifuga brevemente a 7.500 × g per 5 minuti a 4 °C.
    4. Dissolvere l'RNA: Rimuovere con cura il lavaggio all'etanolo e asciugare il pellet all'aria per 5-10 minuti, evitando la completa secchezza. Risospendere il pellet in un piccolo volume di acqua priva di RNasi o in 1x tampone Tris-EDTA (TE), incubando a 55-60 °C per una dissoluzione completa. Conserva l'RNA purificato a -80 °C.
  2. Quantificazione dell'RNA utilizzando il saggio RiboGreen
    NOTA: Il saggio RiboGreen (qui sotto) utilizza un colorante fluorescente specifico per gli acidi nucleici, offrendo maggiore sensibilità, specificità e la capacità di rilevare RNA intatto rispetto ai metodi di assorbenza UV. Considera il trattamento con DNasi se la contaminazione da DNA è un problema.
    1. Prepara 1x TE buffer, diluisci il 20x TE buffer fornito 20 volte con acqua senza RNasi. Prepara le soluzioni di lavoro RiboGreen e proteggi il colorante fotosensibile con la carta stagnola. Diluire il colorante concentrato 1:200 in 1x TE per il saggio ad alta gamma (10 ng/mL-1 μg/mL), oppure 1:2000 in 1x TE per il saggio a basso intervallo (2,5 ng/mL-50 ng/mL). Preparare standard RNA tramite diluizione seriale dello standard RNA del kit in 1x TE per coprire l'intervallo atteso di campioni. Gestire gli standard in triplice.
    2. Preparare i campioni diluendo i campioni di RNA in 1x TE per adattarli alla gamma dinamica del saggio. Fai i campioni in triplice.
    3. Aggiungere volumi uguali di soluzione di lavoro RiboGreen e standard o campione RNA (ad esempio, 100 μL ciascuno). Incubare per 2-5 minuti a temperatura ambiente, protetto dalla luce. Misura la fluorescenza usando le impostazioni appropriate (eccitazione ~500 nm, emissione ~525 nm). Misura e sottrai una lettura di reagente in bianco (1x TE + colorante RiboGreen).
    4. Analizza e quantifica: traccia una curva standard usando i valori di fluorescenza degli standard rispetto alle loro concentrazioni. Utilizzare questa curva per determinare la concentrazione di RNA nei campioni (Figura 2).

4. Sintesi del cDNA

  1. Scongelare tutti i componenti sul ghiaccio. Mescola delicatamente ogni tubo con un colpo e gira brevemente verso il basso prima di usarlo. In un tubo PCR su ghiaccio, si combinano i seguenti componenti per ogni reazione:
    Master mix RT (5x): 4 μL
    Campione di RNA: variabile (fino a 1 μg di RNA totale)
    Acqua priva di nucleasi: fino a 20 μL di volume totale
    NOTA: Per un controllo senza modello (NTC), sostituire il campione di RNA con acqua priva di nucleasi.
  2. Mescola e gira delicatamente i tubi per raccogliere il contenuto sul fondo e avvia il programma termociclatrice.
    Ricottura del primer: 25 °C per 2 minuti
    Sintesi del cDNA: 55 °C per 10 min
    Inattivazione termica: 95 °C per 1 minuto

5. Progettazione e validazione dei primer

NOTA: La progettazione del primer RTddPCR segue generalmente gli stessi principi della qPCR quantitativa, ma richiede un'attenzione aggiuntiva per garantire una netta separazione tra gocce positive e negative. Utilizzare strumenti di progettazione di primer di NEB, IDT o ThermoFisher per facilitare questo processo. Un saggio RTddPCR di successo è definito da alta specificità e amplificazione robusta, che genera una netta separazione tra gocce amplificate (positive) e non amplificate (negative). I seguenti ID di accesso NCBI RefSeq sono stati utilizzati per progettare primer PCR:

Atto: NM_001127449.1
Attaccante 1: CAGTCTAACAGGGGGGGGGAAAG
Rovescio 1: CCAACTCAAGGCAAGTAACAAC
Durata dell'amplicon: 98
Avanti 2: GTAGTGATCTGTGCAGGGTATT
Rovescio 2: GACTTTCCCCCCCTGTTAGAC
Durata dell'amplicon: 118

Gap 43: NM_017195,3
Attaccante 1: GGAAATTCTTGCACTGTACCC
Rovescio 1: GACTCCTCAGAACGGAACAT
Lunghezza dell'amplicon: 122
Attaccante 2: CAGTCATCTTGGGAAATTCTTGC
Rovescio 2: CATTGCACACACACACTTGG
Durata dell'amplicon: 116

  1. Progetta un primer con la lunghezza consigliata di 18-30 basi e un contenuto di GC del 40-60%. Assicurati che la temperatura di fusione (Tm) sia tra 55 e 65 °C, e che gli inneschi avanti e indietro siano entro 2-5 °C l'uno dall'altro. Incorporare una pinza GC, una o due basi G o C nelle ultime cinque basi all'estremità a 3′, per migliorare la specificità del legame, ma evita lunghe corse di G o C.
  2. Validare la specificità degli innesco utilizzando strumenti di allineamento come il National Center for Biotechnology Information (NCBI) e il Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) per garantire che gli innesco si leghino solo alla sequenza target prevista. Il design amplifica tra 50 e 200 coppie di base, con ~100 coppie di basi come optimali, poiché i prodotti più corti si amplificano in modo più efficiente pur rimanendo distinguibili dai primer-dimeri.
    NOTA: In questo studio, i prodotti brevi per PCR sono tipicamente amplificati con maggiore efficienza rispetto a quelli più lunghi in RT-ddPCR.
  3. Minimizza i dimer di primer progettando primer con contenuto GC del 50-60%, evitando strutture secondarie e una complementarità di 3'. Durante la validazione del primer, si utilizza l'elettroforesi del gel di agarosio e si utilizza sempre un controllo senza modello per valutare i dimeri del primer.
  4. Evita di progettare primer in aree del modello con alta probabilità di formazione di strutture secondarie, poiché ciò può interferire con l'efficienza dell'amplificazione.

6. RTddPCR

NOTA: Utilizzare il sistema QX200 ddPCR (Bio-Rad) per eseguire la RTddPCR secondo le istruzioni del produttore e come descritto in precedenza da Das et al. (2022)43, con alcune piccole modifiche per migliorare la riproducibilità del saggio.

  1. Preparare le reazioni RTddPCR con ddPCR pronti all'uso universali e primer specifici per il bersaglio usando il cDNA appropriato.
  2. Genera le goccioline usando il generatore di gocce.
  3. Leggi la fluorescenza dell'endpoint con il lettore di gocce e analizza i dati con il software integrato.
  4. Impiegare le seguenti misure di controllo qualità per garantire una quantificazione precisa e la formazione riproducibile di gocceline:
    1. Fai funzionare set di primer in modo costante nella stessa riga o colonna per minimizzare gli effetti delle lastre.
    2. Prepara master mix per ridurre il pipetting di piccoli volumi.
    3. Pipetta a basso flusso per prevenire bolle e usa pipette multicanale per una distribuzione uniforme del campione.
    4. Maneggiare delicatamente le piastre dopo la formazione delle gocce e sigillare immediatamente per evitare l'evaporazione.
    5. Prepara tutte le reazioni sul ghiaccio ed evita cicli ripetuti di congelamento-disgelo per i reagenti.
    6. Includere controlli senza modello per ogni set di primer per monitorare la contaminazione.
    7. Escludere pozzi contenenti meno di 10.000 gocce accettate dall'analisi.
    8. Eseguire repliche tecniche per tutti i campioni per garantirne la riproducibilità.
  5. Ispezionare manualmente i grafici di ampiezza di fluorescenza delle gocce per verificare l'accuratezza della soglia automatica.

Results

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I neuroni corticali dei roditori embrionali primari, i neuroni ippocampali e i BFCN placcati su inserti da 1 μm rivestiti con PLL aderiscono in modo robusto e estendono le neuriti attraverso la membrana per 5-7 giorni in vitro (DIV). A 11 DIV, le colture mostrano reti dense. Per i DRG di ratto adulto, aggiungere uno strato di laminina a inserti da 3 μm rivestiti con PLL aiuta a ottenere un'estensione assonale comparabile di 5 DIV. Queste osservazioni confermano la capacità degli inserti di sostenere la crescita neuronale a lungo termine e di fornire materiale assonale sufficiente per l'estrazione dell'RNA a valle. In caso di necessità di scalare, combiniamo più inserti per avere materiale sufficiente.

L'estrazione da TRIzol da singoli inserti produce abbastanza RNA per la trascrizione inversa e la successiva ddPCR. La quantificazione RiboGreen conferma rese coerenti di RNA da frazioni intere di neuroni (212,85 ng/inserto) e rese inferiori da frazioni di neuriti (42,75 ng/inserto) (Figura 2). Generalmente otteniamo ~5-7 volte l'RNA dall'intera frazione neuronale rispetto a quella arricchita da neurite.

Tutti gli innesci vengono convalidati prima degli esperimenti RTddPCR. Per ogni trascrizione bersaglio, almeno due set di primer vengono ordinati e testati tramite PCR convenzionale su cDNA generato dagli stessi campioni neuronali. La coppia di primer che produce la banda più forte e specifica viene selezionata per RTddPCR (Figura 3A). Ad esempio, abbiamo scelto il set di primer 1 per Gap43. Nei casi di risultati ambigui, come quelli ottenuti per Actγ, eseguiamo una PCR a gradiente per ottimizzare le temperature di ricottura (Figura 3B). Questo garantisce che solo primer ben convalidati vengano utilizzati per la quantificazione assoluta, riducendo la probabilità di artefatti nella separazione delle gocce.

La procedura di raschiamento e tamponamento separa in modo affidabile i compartimenti somatici e neuritici. L'RNA isolato dall'intera frazione del neurone mostra arricchimento di trascrizioni, come Actγ 46,47,48,49 (Figura 4). Al contrario, le frazioni di assoni/neurite producono RNA totale nettamente inferiore, coerente con il loro volume limitato, ma mostrano un arricchimento di trascrizioni note per localizzarsi nei processi distali, come Gap43 (Figura 4). Un rilevamento incrociato minimo di trascritti soma-restricted indica un'elevata purezza compartimentale quando gli inserti vengono maneggiati con cura e placcati alla densità ottimale.

I risultati positivi sono caratterizzati da: (1) morfologia neuronale intatta con chiara estensione assonale, (2) separazione netta dei compartimenti senza rottura della membrana, (3) primer validati che producono una separazione netta tra gocce positive e negative, e (4) forti segnali RTddPCR per i trascrizioni assonali. Esperimenti subottimali portano a una bassa resa di RNA, contaminazione incrociata evidenziata dai marcatori soma nelle frazioni di neurite, o da artefatti RTddPCR come l'aumento della "pioggia" di gocce dovuta alla dimerizzazione del primer. Questi problemi sono più spesso legati a danni alla membrana dell'inserto, pressione di raschiamento eccessiva o un'ottimizzazione inadeguata della temperatura di ricottura dell'innesco.

Figura 1
Figura 1: Panoramica dell'isolamento dell'RNA specifico per compartimento utilizzando inserti a membrana. I neuroni dei roditori sono stati coltivati su inserti semipermeabili con una dimensione dei pori di 1-3 μm, che permettono l'estensione delle neuriti limitando il soma. Per la preparazione dell'intero neurone, le cellule del compartimento superiore venivano raschiate via utilizzando uno scraper cellulare sterile, pallinate e poi lisate in TRIzol per l'isolamento dell'RNA, la sintesi del cDNA e la RTddPCR. I residui cellulari venivano rimossi dalla membrana inserita con un cotton fioc sterile. Per la preparazione delle neuriti, la membrana inserita che ora conteneva solo neuriti è stata invertita e tagliata con una lama di bisturi, e immersa direttamente nel TRIzol, seguita da isolamento di RNA, sintesi di cDNA e RTddPCR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2: Curva standard di concentrazione di RNA utilizzando il saggio RiboGreen. (A) L'intensità di fluorescenza è stata misurata utilizzando il saggio di quantificazione dell'RNA RiboGreen su una serie di diluizione di standard di RNA. Un'analisi di regressione lineare ha rivelato una forte correlazione tra la concentrazione di RNA e il segnale di fluorescenza (R² = 0,9956). Il valore R² vicino a uno dimostra un'eccellente linearità e affidabilità del saggio RiboGreen per una quantificazione accurata dell'RNA. (B) Utilizzando l'equazione (y=19,738x + 14,905) per la pendenza ottenuta in A, è stato calcolato l'RNA totale per ogni frazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Validazione del primer tramite PCR ed elettroforesi del gel di agarosio. (A) I prodotti di amplificazione PCR utilizzando cDNA per Actγ e Gap43 sono stati risolti su un gel di agarosio al 2% per valutare la specificità del primer. Per ogni gene, sono stati testati due set di primer indipendenti (set 1 e set 2). I marcatori di dimensione del DNA (scale) sono mostrati nelle corsie adiacenti con i pesi molecolari indicati (10 kb, 0,5 kb, 0,1 kb). Bande singole distinte della dimensione attesa confermano un'amplificazione e specificità riuscita dei set di primer selezionati. (B) L'amplificazione per PCR è stata eseguita utilizzando il primer Actγ impostato 2 su un gradiente di temperatura (55-65 °C) per determinare la temperatura ottimale di ricottura. I prodotti amplificati sono stati risolti su un gel di agarosio al 2% accanto a una scala di DNA (corsia 2, dimensioni indicate). Bande singole costanti della dimensione attesa sono state osservate lungo tutto il range testato, con l'amplificazione più forte rilevata a 55 °C, suggerendo che sia la temperatura ottimale per questo set di innescenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Analisi RTddPCR di trascritti selezionati e quantificazione di copie di mRNA. (A,B) Grafici di ampiezza rappresentativo unidimensionale che mostrano la separazione delle gocce per (A) Actγ e (B) Gap43. Ogni punto rappresenta una singola goccia, con gocce blu che indicano amplificazione positiva e gocce grigie che indicano amplificazione negativa. L'asse Y rappresenta l'ampiezza, mentre l'asse X indica la posizione del pozzo nella piastra ddPCR. La netta separazione tra gocce positive (blu) e negative (grigie) conferma una rilevazione robusta dei trascrizioni target con i set di primer indicati. (C) Tabella che riassume il numero di copie/μL e copie per ogni ng di RNA totale per i trascrizioni Actγ e Gap43 nelle frazioni intere di neuroni e neuriti. Le stime del numero di copie sono state ottenute dalla quantificazione assoluta utilizzando i conteggi delle gocce ddPCR (mostrati nei pannelli A,B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

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Diversi passaggi sono fondamentali per la riproducibilità. Il rivestimento dell'inserto deve essere uniforme per favorire l'adesione neuronale; Un rivestimento incompleto porta a una scarsa crescita di neuriti/assoni. La densità di placcatura cellulare è altrettanto importante, poiché una densità eccessiva aumenta l'incrocio dendritico, mentre una placcatura scarsa produce RNA assonale insufficiente. La sequenza di raschiamento-tampone deve essere eseguita con precisione: una pressione troppo bassa lascia contaminazione somatica, mentre una pressione eccessiva rischia di danneggiare l'inserto.

La validazione del primer rappresenta un altro passo cruciale. L'esecuzione di due set di primer indipendenti per ciascun trascritto permette di selezionare la coppia più affidabile, mentre la PCR a gradiente può affinare ulteriormente le temperature di ricottura. Questa pratica riduce la formazione di primer e dimero, aumenta la chiarezza delle gocce e garantisce una quantificazione riproducibile tra repliche biologiche. Sebbene questo approccio raggiunga un'elevata purezza compartimentale, la contaminazione in tracce da materiale somatico non può essere completamente esclusa. Le rese di RNA assonale sono intrinsecamente basse, limitando l'ambito delle analisi che richiedono un alto input, come il sequenziamento completo del trascrittoma. Una limitazione critica di questo metodo è la sua incapacità di affrontare la localizzazione del trascrizione all'interno degli assoni distali rispetto a quelli prossimali. Sebbene estensioni gliali o endoteliali attraverso i pori della membrana siano state segnalate in alcune condizioni, il nostro sistema di coltura minimizza questa possibilità. Nelle colture DRG adulte, l'aggiunta di citosina β-D-arabinofuranoside (Ara-C)5,7 e l'uso di mezzi senza sieri per altre colture neuronali (corticali, ippocampali e BFCN)5,45 limitano efficacemente la proliferazione delle cellule gliali ed endoteliali. Inoltre, le membrane rigide di policarbonato o polietilene tereftalato (PC/PET) utilizzate qui sono non elastiche e non permissive alla migrazione cellulare attiva. Inoltre, utilizziamo inserti di poro di 3 μm per le colture DRG per consentire il passaggio di assoni di grande diametro. Al contrario, per le colture corticali o BFCN, utilizziamo inserti di poro da 1 μm, che limitano ulteriormente la migrazione della glia. Queste proprietà distinguono il nostro sistema dai microdispositivi basati su PDMS che supportano la migrazione endoteliale attraverso pori flessibili. In linea con i precedenti rapporti 34,35,36,40, la validazione molecolare in questo studio conferma un forte arricchimento dei trascrizioni assonali (ad esempio, Gap43) e una rilevazione trascurabile di marcatori somatici (ad esempio, Actγ), che supportano la specificità neuronale del materiale che attraversa la membrana. Poiché il vincolo fisico non elimina completamente la migrazione gliale, i ricercatori dovrebbero anche usare Gfap come indicatore negativo.

Rispetto ai dispositivi microfluidici, il sistema di inserto è più semplice, più scalabile e compatibile con i flussi di lavoro di coltura di routine. Evita apparecchiature specializzate, consentendo comunque la separazione assone-soma riproducibile. Accoppiando gli inserti con RTddPCR, questo metodo offre sia accessibilità che alta sensibilità, consentendo la quantificazione assoluta di trascrizioni spesso sotto le soglie di rilevamento della qPCR. Questo protocollo è particolarmente adatto per sondare i cambiamenti nella localizzazione dei trascriti assonali, valutare la traduzione locale in risposta a stimoli dello sviluppo, neurotossici o di lesioni, e anche per studiare difetti di trasporto dell'RNA implicati in malattie neurodegenerative o disturbi neurosviluppativi. Future miglioramenti potrebbero includere RTddPCR multiplexata per la quantificazione simultanea di più mRNA, o l'integrazione con approcci di sequenziamento RNA a basso input per ampliare la copertura trascrismica. Inoltre, adattare questo sistema per neuroni umani derivati da iPSC potrebbe estenderne le applicazioni alla modellazione delle malattie e agli studi rigenerativi.

Disclosures

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PKS detiene brevetti statunitensi sull'uso del peptide permeabile alle cellule G3BP1 per la rigenerazione assonica e la neurodegenerazione. Gli altri autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Merkin Peripheral Neuropathy and Nerve Regeneration Center (a P.K.S.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Inserti in coltura cellulare per piastra a 6 pozzi, 1.0  μ m Dimensione dei pori, sterileCorning353102Consumabili
Inserti in coltura cellulare per piastre a 6 pozzi, 3.0  μ m Dimensione dei pori, sterileCELLTREAT230603Consumabili
Sollevatore a celle con lama strettaVWR76036-006Consumabili
Piastre di coltura tissutale a 6 pozzi CELLSTARVWR82050-842Consumabili
ddPCR Placche a 96 Pozzi  Bio-rad12001925Consumabili
ddPCR Olio per Lettore di Gocce  Bio-rad1863004Reagenti
Cartucce DG8 per generatore di gocce QX200/QX100Bio-rad1864008Consumabili
LamininaGibco/Fisher Scientific23017-015Reagenti
LunaScript RT SuperMix KitNEBE3010LReagenti
Micropiastre per neri a base di fluorescenza, a 96 pozziThermo FisherM33089Consumabili
Sigillatura termica per piastra PCR, stagnola, perforabileBio-rad1814040Consumabili
Poli-lisinaSigmaP1274Reagenti
PTC Tempo 96 Thermal CyclerBio-rad12015382Equipaggiamento
Software QuantaSoftBio-RadSoftware per l'analisi dati PCR
Kit di test per il reagente Quant-it RiboGreen e RNAThermo FisherR11490Reagenti
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixBio-rad1864034Reagenti
Olio per la generazione di gocce QX200 per EvaGreenBio-rad1864005Reagenti
Generatore di Gocce QX200Bio-rad17005227Equipaggiamento
Lettore di gocce QX200Bio-rad17005228Equipaggiamento
Reagente TrizolInvitrogen15-596-026Reagenti

References

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