Questo metodo delinea lo sviluppo di un sistema di alimentazione del sangue con zecche in vitro che incorpora una camera stampata in 3D e una membrana in silicone fabbricata in laboratorio. Il sistema consente l'alimentazione artificiale delle zecche, consentendo un facile campionamento in varie fasi di alimentazione e utilizzando bassi volumi di sangue, fornendo uno strumento prezioso per studiare le zecche ixodidi.
Articolo metodologico
Sangue di zecca che si alimenta attraverso una membrana artificiale su una camera stampata in 3D nella ricerca sulle zecche Ixodid
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo lavoro presenta un protocollo dettagliato per un sistema di alimentazione delle zecche tramite una membrana artificiale in silicone che utilizza una camera stampata in 3D realizzata con resina fotopolimerica ad alta risoluzione. Il metodo include la progettazione della camera di alimentazione, la preparazione della membrana in silicone, l'assemblaggio del sistema e condizioni ottimizzate per l'alimentazione delle zecche. Le zecche sono uno dei principali vettori di malattie negli Stati Uniti e nel mondo. La ricerca sulle zecche è essenziale per sviluppare strategie efficaci per prevenire e ridurre l'incidenza delle malattie trasmesse da zecche. In quanto ectoparassiti ematofagi obbligati, le zecche devono nutrirsi di sangue per sopravvivere e quindi trasmettere malattie, rendendo l'alimentazione del sangue un processo fondamentale nell'indagine delle interazioni vettore-ospite, della trasmissione patogeno e della biologia, fisiologia e morfologia anatomica delle zecche. I sistemi di alimentazione delle zecche con membrana in silicone sono stati ampiamente utilizzati e perfezionati negli ultimi decenni. Tuttavia, molti sistemi esistenti sono adattati a una singola specie di zecca, a uno stadio di vita o a un insieme specifico di condizioni. Il sistema di alimentazione delle zecche descritto in questo protocollo è stato utilizzato con successo per ottenere sia esemplari parzialmente nutriti che completamente gonfiati da alcune delle specie vettoriali di zecche più importanti degli Stati Uniti, tra cui Amblyomma americanum, A. maculatum, Ixodes scapularis e Rhipicephalus sanguineus adulti. Il sistema ha dimostrato successo nell'avviare l'alimentazione di adulti di Dermacentor variabilis e di ninfa A. americanum, con i tassi di alimentazione più alti (>85%) osservati negli adulti di A. americanum. Di conseguenza, la camera di alimentazione sviluppata in questo studio è adattabile all'uso con un basso volume di sangue diverso, fino a 100 μL, fondamentale nella trasmissione dei patogeni e negli studi tossicologici. Il coperchio trasparente con altezza minima della camera facilitava l'osservazione delle zecche durante la durata dell'alimentazione delle zecche.
Introduzione
Le zecche sono ectoparassiti obbligati che si nutrono del sangue e possono trasportare e trasmettere una vasta gamma di patogeni, inclusi batteri, virus e parassiti che causano malattie ad animali e umani in tuttoil mondo 1,2,3,4. Essendo il vettore di malattie numero uno negli Stati Uniti, secondo solo alle zanzare nel resto del mondo 2,3,5, diverse specie di zecche possono trasmettere malattie associate a patogeni, mentre altre specie sono note per indurre malattie non trasmissibili come la sindrome alfa-gal (AGS, nota anche come allergia alla carne rossa), che negli ultimi anni è stata sempre più segnalatain tutto il mondo 6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. La ricerca volta a comprendere la biologia, la fisiologia, la genetica e la competenza dei vettori è essenziale per sviluppare strategie volte a ridurre il carico economico e sanitario pubblico sia delle malattie trasmesse da zecche trasmissibili che non trasmissibili. Lo studio delle interazioni zecche-ospite spesso richiede zecche parzialmente nutrite o completamente gonfie per rispondere a domande di ricerca specifiche. Questo può essere ottenuto tramite l'alimentazione di animali vivi, permettendo alle zecche di completare il loro ciclovitale completo 17. Sebbene l'uso di animali vivi per l'alimentazione delle zecche sia altamente efficace per sviluppare e mantenere colonie di zecche18,19, può essere difficile da implementare e potrebbe non essere applicabile a tutte le ipotesi di ricerca a causa delle limitazioni sulla disponibilità degli ospiti e delle normative sulle strutture. Soprattutto, l'implementazione efficace di sistemi di alimentazione in vitro per zecche aiuta a ridurre l'uso di animali vivi, un obiettivo significativo nella ricerca nell'ambito del quadro "Animal Use Alternative (3Rs)" (sostituire, ridurre, perfezionare)20.
Ci sono numerosi vantaggi nell'utilizzare sistemi di alimentazione delle zecche a membrana artificiale nella ricerca, offrendo ampie opportunità per affrontare una vasta gamma di questioni scientifiche. Questi possono essere riassunti in tre gruppi; (1) valutazione dell'effetto sulla variazione del sangue ospite e sulle interazioni vettore-ospite, utilizzando diverse fonti di sangue, come la produzione di alfa-gal della zecca durante l'alimentazione21, (2) valutazione della tossicità da acaricida tramite la somministrazione di composti con il sangue22 e il recupero dei composti secreti dalla zecca durante l'alimentazioneematica 23, (3) valutazione della competenza del vettore, attraverso la somministrazione di patogeni per acquisizione naturale durante l'alimentazionedel sangue 24, 25, 26, 27, tra gli altri. Inoltre, la natura del sistema di alimentazione a membrana artificiale consente test su larga scala di vari trattamenti e concentrazioni senza introdurre variazioni legate all'ospite, su piccola scala e volume, riducendo la necessità di animali vivi.
I sistemi di alimentazione delle zecche tramite membrane artificiali sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca e per supportare l'allevamento delle zecche 19,28,29, in alcuni casi consentendo il completamento del lungo ciclo di vita della zecca 30,31. Sono stati riportati molti protocolli sull'ottimizzazione dei sistemi di alimentazione delle zecche e dei loro materiali per diverse speciedi zecche 32,33,34. Tuttavia, è ben noto che l'alimentazione in vitro delle zecche può essere molto variabile a seconda delle condizioni del sistema, dei materiali utilizzati e, soprattutto, delle speciee stadi 34 delle zecche. Inoltre, molti sistemi si affidano a grandi volumi di sangue, come i sistemi a flussocontinuo 27, che sono altamente efficaci ma possono essere costosi a causa dei volumi sanguigni significativi richiesti. Questo protocollo descrive un sistema di alimentazione artificiale per zecche a membrana che si è dimostrato efficace negli stadi adulti di cinque diverse specie di vettori di malattia da zecche negli Stati Uniti. Questo include Amblyomma americanum, A. maculatum, Ixodes scapularis, Rhipicephalus sanguineus e Dermacentor variabilis.
Protocollo
Sono stati condotti esperimenti di alimentazione con zecche utilizzando sangue bovino defibrinato disponibile in commercio (Hemostat Laboratories, CA, USA) e sangue umano defibrinato (Bioivt, CA, USA), che raccoglie e processa il sangue in conformità con i protocolli e le linee guida approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e dall'Institutional Review Board (IRB). In questo studio non sono stati utilizzati animali vertebrati vivi per l'alimentazione delle zecche. Tutte le zecche utilizzate in questo protocollo sono state acquistate presso la struttura di allevamento delle zecche dell'Oklahoma State University. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Camere di alimentazione delle zecche
- Progettare le camere utilizzando un software gratuito per il design 3D da adattare a una piastra di Petri da 35 mm x 10 mm. Le dimensioni dei pezzi stampati (Figura 1A) sono le seguenti: corpo della camera (parte i) 25 mm (diametro interno) x 20 mm (alto), con spessore di parete di 3 mm alla base e 6 mm di spessore alla parte superiore del coperchio ( parte ii), spessore di parete di 30 mm (diametro interno) x 5 mm (alto) e 3,5 mm (anello esterno (parte iii), 31 mm (diametro interno) x 5 mm (alto) e spessore pariete di 3 mm.
NOTA: L'anello del coperchio include quattro aperture circolari di 3 mm (diametro) x 2 mm (altezza) in alto per posizionare i magneti. La parte superiore della camera ha anche aperture della stessa dimensione per fissare i magneti (Figura 1B). Il design del modello 3D dovrebbe essere salvato come file .stl , il formato di file di stampa 3D più comune. I file contenenti il design 3D utilizzato in questo protocollo saranno forniti su richiesta. - Camere di stampa utilizzando una stampante 3D LCD 10" 14K con resine fotopolimeriche grigie o bianche (Figura 1A) o un'altra stampante/servizi 3D ad alta risoluzione che stampa modelli 3D da file .stl.
NOTA: Questo protocollo utilizzava i servizi di stampa e le resine dell'Università dell'Arizona. L'uso di resine ad alta risoluzione garantisce la creazione di camere dettagliate e durevoli. - Usando i guanti, assicurati che non ci siano residui di resina sui pezzi prima dell'assemblaggio, lavando e, se necessario, carteggiando delicatamente con carta vetrata fine (grana 180-200). Assicurati che il fondo piatto della parte i (Figura 1A) sia liscio. Questo garantisce una corretta adesione della membrana in silicone, riducendo il rischio di perdite.
- Esponi tutti i pezzi secchi alla luce UV per 10 minuti per garantire una polimerizzazione completa della resina.
NOTA: La maggior parte dei servizi di stampa 3D che utilizzano resine tossiche per la stampa impiega luce UV per polimerizzare la resina (indurendo i modelli e rimuovendo la tossicità della resina); tuttavia, a volte rimane "non completamente guarito". Un modello non completamente polimerizzato rimarrà leggermente appiccicoso al tatto e potrebbe contenere resina non polarizzata, che può essere tossica o causare irritazione durante la maneggiazione. Un'esposizione extra alla luce UV garantirà un completo indurimento della resina. - Incolla i magneti rotondi da 3 mm x 2 mm alle fessure sulla parte superiore delle camere e agli anelli del coperchio usando colla epossidica trasparente. Lascia asciugare tutta la notte a temperatura ambiente (20–25 °C/minimo di 16 ore). Assicurati che i poli dei magneti siano orientati verso una direzione per corrispondere all'attrazione dei poli sui magneti nella parte superiore dell'anello del coperchio (Figura 1A, parte ii).
- Assemblare tutti i pezzi del modello per garantire la corretta composizione di tutti i componenti, come mostrato nella Figura 1A–C.
2. Preparazione della membrana
- Posiziona un film trasparente lungo 30 cm x 30 cm su una superficie pulita e assicurati che non abbia pieghe, tendendolo su una superficie piana e fissando i bordi con del nastro adesivo (Figura 2Ai).
- Posizionare 4–5 fogli singoli di carta per la pulizia delle lenti su un pezzo esteso di plastica/pellicola trasversale distanziati 5 cm (Figura 2Aii).
- Prepara la membrana in silicone utilizzando i componenti e le quantità fornite di seguito.
NOTA: Le quantità sono sufficienti per preparare 4–5 membrane (7 cm × 12 cm), ciascuna ospite fino a 5–6 camere di alimentazione, per un totale di 20–30 camere. - Prepara la miscela di silicone combinando 15 g di silicone con silicone trasparente (durezza 20–25 Shore A) e aggiungendo 4,5 g di olio di silicone (30% del silicone totale) e 2,9 g di esano (19,3% del silicone totale). Metti gli ingredienti in una barca di plastica per pesare e mescola delicatamente con una spatola (Figura 2Aiii).
NOTA: Assicurati di minimizzare la formazione di bolle mescolando delicatamente gli ingredienti. - Posiziona 2–3 g di miscela di silicone lungo il bordo più piccolo della carta per la lente per fissarla alla pellicola trasparente. Lascia 5–10 secondi affinché il silicone penetri attraverso la carta dell'obiettivo (Figura 2Aiv).
- Distribuisci uniformemente la miscela di silicone lungo il foglio di carta dell'obiettivo usando uno strumento a bordo dritto, come un coperchio, un righello o una spatola. Assicurati che l'oggetto utilizzato copra l'intera area della carta dell'obiettivo (Figura 2Av). Questo garantisce una copertura in silicone in un solo colpo, prevenendo le ondulazioni e le ondulazioni della membrana sul bordo dell'oggetto.
- Assicurati che tutta la miscela di silicone venga utilizzata nella membrana riportando lo strumento di espansione nella posizione iniziale per la diffusione. Poiché un po' di miscela di silicone rimarrà trattenuta sullo strumento di espansione, riportarlo per raccoglierla garantirà che tutto il silicone venga utilizzato per evitare spazi (Figura 2Avi).
NOTA: La membrana dovrebbe apparire uniformemente traslucida senza increspature (Figura 2B). - Prepara inizialmente membrane di spessore diverso aggiungendo più o meno miscela di silicone, poiché lo spessore non può essere misurato finché le membrane non sono asciutte.
- Lasciare asciugare le membrane all'aria durante la notte a temperatura ambiente (20–25 °C/minimo di 16 ore).
- Misura lo spessore della membrana utilizzando uno strumento digitale di misurazione micrometrico esterno. Diversi spessori di membrana sono utilizzati per specie adulte di zecche, che vanno da parti boccali corte (spessore membrana di 70 μm) a parti boccali più lunghe (spessore di membrana di 200 μm).
- Rimuovi tutte le parti dalle camere già assemblate e applica colla al silicone sul bordo inferiore delle camere. Per una colla precisa, usa una siringa da 1 ml e riempila con colla al silicone (Figura 2Ci).
- Posizionare una punta di pipetta da 200 μL sulla punta della siringa (invece dell'ago) per l'applicazione della colla (Figura 2Cii) e avvitarla all'estremità della siringa, come con una punta a ago (Figura 2Ciii). Questo permetterà l'applicazione di una colla fine sul bordo inferiore di ogni camera (Figura 2Civ).
- Posizionare la camera sopra la membrana (Figura 1, parte i) con un oggetto ponderato per garantire la sedimentazione. Lascia riposare tutta la notte a temperatura ambiente (20–25 °C/minimo di 16 h) (Figura 2D, E).
NOTA: Usa qualsiasi oggetto con peso piatto. Questo protocollo utilizzava un pezzo di acrilico da 2,5 kg (Figura 2E). - Taglia l'eccesso di membrana dalle camere usando forbici curve (Figura 3A).
- Prima di utilizzare la camera per l'alimentazione delle zecche, rimuovere eventuali pellicole trasparenti residue (dove la membrana è preparata (passo 2.1) (Figura 3B).
- Riassemblare le parti della camera, includere una piastra di Petri da 35 mm x 10 mm sul fondo e usare i coperchi delle piastre come coperchi delle camere invertendoli e posizionandoli tra i magneti (Figura 3C,D).
NOTA: Usa i coperchi invertiti, poiché l'anello del portacoperchio si adatta esattamente al coperchio se rovesciato (vedi descrizioni dei pezzi nella Figura 3C,D). - Immergi la membrana della camera in acqua distillata utilizzando la parte inferiore di piastre di Petri da 35 mm x 10 mm. Lasciare la membrana in acqua tutta la notte a temperatura ambiente (20–25 °C/minimo di 16 ore). Poiché la membrana è inizialmente idrofobica, immergerla in acqua prima di aggiungere sangue aiuterà a ridurre la formazione di bolle intrappolate.
NOTA: L'assenza di bolle conferma che l'idrofobia è stata rimossa.
3. Alimentazione delle zecche e preparazione del sangue
- Realizzare 2–3 piccoli fori respiratori nei coperchi di ogni camera (dalle piastre di Petri da 35 mm x 10 mm) (parte IV nella Figura 1A) menzionate nel passo 2.16 (Figura 3E). Usa un bisturi di metallo riscaldato o una sottile spatola di metallo per forare i fori per respirare il coperchio.
NOTA: I fori di respirazione permettono all'umidità di essere internalizzata all'interno della camera di alloggiamento. - Integrare il sangue con solfato di gentamicina a una concentrazione finale di 50 μg/mL. Aggiungi antibiotici solo al sangue destinato all'uso entro una settimana e conserva a 4 °C. Conserva il sangue bovino (o qualsiasi altro sangue animale) a 4 °C prima e dopo l'aggiunta degli antibiotici.
- Metti 2–3 mL di sangue in una piastra di Petri pulita da 35 mm x 10 mm, poi posiziona la camera sopra. Regolare l'altezza della camera per aumentare o ridurre la quantità di sangue utilizzata per camera ruotando l'anello di regolazione (parte iii dalla Figura 1A). Regola l'altezza della camera, lasciando uno spazio di 1–2 mm dal fondo della piastra di Petri alla membrana. Vedi le frecce magenta nella Figura 4A per riferimento.
NOTA: Il design dell'anello di regolazione delle camere consente il controllo del volume di sangue utilizzato. cioè, uno spazio più ampio tra il fondo della piastra di Petri e la membrana richiederà un volume maggiore per riempire lo spazio. - Posiziona zecche non nutrite all'interno delle camere in uguale numero di maschi e femmine. Assicurati che entrambi i sessi siano sempre inclusi nella camera, poiché ciò può influenzare i tassi di alimentazione (la Figura 4B mostra 4 maschi e 4 femmine di A. americanum adulto all'interno della camera). Un massimo di 10–15 tick per camera (per la fase adulta) viene utilizzato per facilitare la manovrabilitate.
NOTA: Quando si lavora con stadi immaturi, il numero di zecche è maggiore (20–50 ninfe per camera, non presentato in questo protocollo). - Posizionare le camere in bagni asciutti coperti a 37 °C ± 1 °C con una fonte di umidità (cioè bicchieri d'acqua) che mantenga un'umidità relativa del 63% ± del 2% (Figura 4C) in un fotoperiodo chiaro-oscuro di 12:12 ore.
NOTA: Questi requisiti possono variare a seconda della specie di zecca e delle condizioni di laboratorio; Prova altre impostazioni di umidità se necessario e valuta la migliore configurazione per il laboratorio.
4. Sostituzione di sangue e camere
- Prepara due flaconi per spruzzare con le soluzioni da usare per risciacquare la membrana tra un cambio di sangue e l'altro. In una bottiglia, aggiungere una soluzione allo 0,005% di nistatina in acqua distillata; Nella seconda bottiglia, aggiungi acqua distillata.
- Dopo 12–16 ore, prepara nuove piastre di Petri con sangue fresco e mettile nel bagno a secco a 37 °C prima di posizionare la camera.
- Mentre il sangue fresco si riscalda, rimuovere la camera dal sangue usato e risciacquare la parte inferiore della membrana con acqua distillata per 3–5 secondi, poi con soluzione di nistatina allo 0,005% per 3–5 secondi per prevenire la contaminazione fungina. Risciacqua nuovamente la membrana con acqua distillata per rimuovere eventuali residui residui di nistatina.
NOTA: Questo processo dura meno di 5 minuti e non influisce sull'alimentazione delle zecche attaccate alla membrana sulla superficie superiore. - Getta tutto il sangue usato e sciacquando l'acqua in un contenitore contenente soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,5% (10% di candeggina). I rifiuti di sangue vengono scartati in conformità con il protocollo di sicurezza istituzionale.
- Dopo il risciacquo, posiziona la camera nella nuova piastra di Petri con il sangue.
NOTA: Utilizzare le camere per un massimo di 2–3 mesi prima del lavaggio, a patto che non ci siano contaminazioni e perdite. Le camere e le membrane si sporcano e sono a rischio di contaminazione oltre i 3 mesi di utilizzo senza lavaggio. Questo comporta una riduzione dei tassi di alimentazione delle zecche. Riutilizzare le camere per un massimo di 1,5 anni (~10 cicli di lavaggio). - Riutilizza le camere mettendoli in una soluzione di ipoclorito di sodio allo 0,5% (candeggina al 10%) per un massimo di 30 minuti, poi lavandoli con detersivo per piatti. Non esporre le camere alla candeggina per periodi prolungati (>30 minuti), poiché l'odore riduce i tassi di attacco e può indebolire l'integrità della resina nel tempo.
NOTA: L'esposizione prolungata alla candeggina rende la camera flessibile quando bagnata e fragile quando si asciuga, causando la rottura. Questo fa sì che la camera non duri più di 4–5 cicli di lavaggio basandosi su osservazioni ripetute. L'uso continuo della stessa camera senza lavaggio (fino a 3 mesi) comporta un attacco della zecca più veloce (1–3 giorni dopo la posa nella camera) rispetto a una camera appena lavata (spesso >7 giorni per l'attacco). Ciò è probabilmente dovuto all'odore di frass e ad altri feromoni aggregati provenienti dalle zecche che si nutrono nella camera, che possono stimolare l'alimentazione dellezecche 35,36.
Risultati
Spessore della membrana per ogni specie di zecca.
I tassi di alimentazione più elevati delle zecche sono stati osservati con le seguenti specifiche di spessore di membrana per ogni specie adulta: Amblyomma americanum 100–200 μm; A. maculatum 100–250 μm; Rhipicephalus sanguineus 70–100 μm; Ixodes scapularis <150 μm, Dermacentor variabilis <150 μm. Tutte le specie di zecche sono state mantenute alle stesse condizioni di umidità e temperatura durante l'alimentazione (63% di umidità relativa e 37 °C) (Tabella 1).
Zecche e fonti di sangue usate in questo protocollo
Tutte le zecche sono state prelevate dalla struttura di allevamento delle zecche dell'Oklahoma State University e mantenute a >90% di umidità relativa a 20 °C, con un fotoperiodo chiaro-oscuro di 12:12 ore. Tutte le zecche sono state nutrite con sangue bovino o umano defibrinato nell'ambito di un progetto di ricerca che indagava i livelli di alfa-gal (αGal) in varie specie di zecche. Questo studio ha confrontato gli effetti dell'alimentazione su diverse fonti di sangue all'interno di un progetto più ampio sulla sindrome alfa-gal (AGS) condotto dal gruppo di ricerca. La maggior parte degli esemplari di zecche descritti qui è stata dissezionata prima del completo ingorgo per condurre analisi di quantificazione αGal su zecche parzialmente nutrite (2–5 giorni di alimentazione). Solo un sottoinsieme delle zecche Amblyomma americanum (quelle non necessarie per la quantificazione dell'αGal) è stato autorizzato a nutrirsi fino alla replezione. Sebbene qui non siano presentati confronti dettagliati tra i tassi di alimentazione delle zecche alimentate da bovini e esseri umani, è importante notare che il completo ingorgo (cioè il successo dell'alimentazione) sia stato raggiunto maggiormente nelle zecche nutrite con sangue bovino. Tra le zecche lasciate rimanere nei mangiatoi per periodi prolungati (n = 35), 15 hanno raggiunto il completo ingorgo, con un tasso di successo nell'alimentazione del 42,8%. Di questi, 9 sono stati nutriti con sangue bovino e 6 con sangue umano (60% nutriti con bovini contro 40% con esseri umani).
Tassi di alimentazione delle zecche vs. tassi di successo nell'alimentazione delle zecche
I tassi di alimentazione delle zecche in questo studio sono stati determinati sull'acquisizione di zecche parzialmente nutrite (2–5 giorni di nutrizione), mentre il successo dell'alimentazione è stato definito come un ingorgo completo, tipicamente indicato da un cambiamento nella colorazione alloscuta della femmina (dati disponibili solo per Amblyomma americanum). Le velocità di alimentazione maschile sono state definite come alimentazione continua per più di 2 giorni (2–5 giorni). I tassi complessivi di alimentazione sono stati calcolati combinando i dati delle zecche nutrite con sangue bovino e umano e calcolando le percentuali di zecche che hanno raggiunto 2–5 giorni di alimentazione o un ingorgo completo da zecche poste nelle camere. Le zecche che non si attaccavano o morivano dopo <2 giorni di attaccamento venivano considerate per i calcoli delle velocità di alimentazione. Sebbene non siano presentati dati quantitativi sull'influenza della fonte di sangue sui tassi di alimentazione delle zecche, queste evidenze osservative suggeriscono che, per la maggior parte delle specie di zecche, i tassi di attacco e alimentazione non differiscono sostanzialmente tra sangue bovino e umano durante il periodo di alimentazione di 2–5 giorni. Un'eccezione è stata osservata per Rhipicephalus sanguineus, che ha mostrato tassi di alimentazione più bassi nel sangue umano tra il terzo e il quinto giorno rispetto al sangue bovino. I tassi di alimentazione per tutte le specie di zecche che hanno raggiunto una alimentazione parziale e un ingorgo completo utilizzando questo sistema in vitro di alimentazione delle zecche sono riassunti nella Tabella 1.
Classificazione del peso e dell'alimentazione femminile di Amblyomma americanum
Le femmine parzialmente nutrite di A. americanum sono state classificate in base ai giorni di alimentazione come: (1) non nutrite, (2) 2–3 giorni parzialmente nutrite, (3) 4–5 giorni parzialmente nutrite e (4) gonfie (Figura 5). La fase di alimentazione ingorgata includeva zecche all'inizio della fase di ingorgiamento rapido (con pesi che vanno da 48,9 mg a 109 mg) e zecche completamente gonfie (con pesi che vanno da 272,7 mg a 348,7 mg).
Figura 1: Camera di alimentazione delle zecche - modello 3D e assemblaggio stampato con membrana. Modello 3D esploso e camera assemblata finale che mostra i singoli componenti: (i) corpo della camera (alloggiamento a tick), (ii) anello di supporto del coperchio, (iii) anello di regolazione dell'altezza, (iv) coperchio della piastra di Petri 40 mm x 10 mm e (v) fondo della piastra di Petri da 40 mm x 10 mm con sangue (A). Assemblaggio del modello stampato in 3D e delle singole dimensioni dei pezzi mostrate in mm (B). Camera assemblata stampata in resina grigia a risoluzione 8K (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Preparazione della membrana in silicone e dell'assemblaggio della camera. (i) Una pellicola trasparente da 30 cm × 30 cm fissata con nastro adesivo, assicurando che non si vedano pieghe, (ii) singoli fogli di carta per la pulizia delle lenti posizionati sulla pellicola, distanziati di circa 5 cm, (iii) miscelazione delicata dei componenti in silicone con una spatola con movimenti circolari, (iv) ogni foglio di carta per lenti fissato applicando 1–2 g della miscela di silicone lungo i bordi, (v) la miscela di silicone distribuita uniformemente sulla carta lente usando uno strumento a bordo dritto più grande della carta (l'immagine mostra il bordo di un coperchio di vetro), (vi) si nota la quantità ridotta di miscela di silicone durante la diffusione, il silicone trattenuto sullo strumento viene restituito e ridistribuito per garantire una copertura uniforme (A). Le membrane adeguatamente distribuite non mostravano bolle d'aria o spazi (B). Preparazione della siringa per l'applicazione della colla: (i) una siringa da 1 mL riempita con colla al silicone, (ii) una punta di pipetta da 200 μL inserita nella punta della siringa, (iii) la punta della pipetta avvitata in posizione per garantire una tenuta a prova di perdite, e (iv) il posizionamento della colla sul bordo inferiore della parte i (C). La camera è posta sulla membrana essiccata (D) e un oggetto pesato (un blocco acrilico spesso di 2,5 kg; freccia magenta) posto sopra per garantire un'adesione salda (E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Fasi finali nella preparazione della camera e della membrana prima dell'uso. Rifinitura dei bordi della membrana che circonda la camera usando piccole forbici curve (A), rimozione della pellicola trasparente prima dell'uso della camera (B), assemblaggio finale del modello (C), posizionamento della camera in una piastra di Petri da 40 mm x 10 cm contenente acqua, e uso del coperchio della piastra di Petri come coperchio della camera (D) (i numeri i-v indicano le parti come specificato nella Figura 1A), e coperchi per camere che mostrano fori respiratori (indicati da punte di freccia magenta) (E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Configurazione dell'alimentazione del sangue e posizionamento delle zecche. Camera posta in una ciotola piena di sangue, con l'anello di regolazione dell'altezza evidenziato (frecce magenta) (A). Vista interna della camera contenente un numero uguale di zecche maschi e femmine (B). Camere per zecche posizionate in bagni asciutti con una fonte di umidità, mantenendo un'umidità relativa (HR) del 63% ± 2% e una temperatura di 37 °C ± 1 °C (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Variazione di dimensione e peso di Amblyomma americanum durante l'alimentazione. Sono mostrate la dimensione delle zecche non nutrite e il peso medio delle zecche parzialmente nutrite. Le immagini rappresentano esempi tipici corrispondenti al peso medio registrato a ogni intervallo di alimentazione. La tabella allegata presenta pesi medi, deviazioni standard, numero di zecche analizzate, mediana e quarti 1 e 3 per ogni momento di alimentazione. Le zecche allattate per 2–3 giorni mostravano un peso che va da 7,4 mg (minimo) a 19,2 mg (massimo). Le zecche somministrate per 4–5 giorni variavano da 20,6 mg a 44,8 mg. Le zecche all'inizio della fase di ingorgo rapido e quelle completamente gonfie pesavano tra 48,9 mg e 348,7 mg. Immagine allegata delle femmine di A. americanum allattate 4-5 giorni allattate (punta di freccia gialla) e femmina completamente gonfiata (punta di freccia magenta). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Specie di zecca e sesso | Numero di zecche nutrite/ Numero totale di zecche messe nelle camere (Numero di zecche morte) | Velocità di alimentazione (zecche attaccate 2-5 giorni) | Peso medio (mg) (SD) | Spessore della membrana utilizzato (μm) |
| Femmine di A. americanum | 85/97 (12) | 87.60% | 37.3 (54.40)* | 100 - 200 |
| A. americanum maschi | 19/22 (2) | 86.30% | Non registrato | 100 - 200 |
| Femmine di A. maculatum | 45/66 (21) | 68.20% | 122.4 (141.65) | 100 - 250 |
| Maschi di A. maculatum | 36/47 (11) | 76.60% | Non registrato | Non registrato |
| Femmine di R. sanguineus | 34/60 (26) | 56.60% | Non registrato | 70 - 100 |
| Femmine di I. scapularis | 15/23 (8) | 65.20% | Non registrato | <150 |
| *Il tasso di successo nell'alimentazione valutato in un sottoinsieme di zecche adulte Aa nutrite da bovini è (n=35) del 42,8% | ||||
Tabella 1: Tassi di alimentazione delle zecche e pesi medi.
Figura supplementare 1: Alimentazione a basso volume (100 μL) delle singole zecche già attaccate a un sito della camera 3D. Un piccolo tubo PCR collegato alla base della membrana artificiale con colla siliconica viene riempito con 100 μL di sangue. Clicca qui per scaricare questo file.
Discussione
I sistemi di alimentazione a membrana artificiale per zecche sono strumenti altamente efficaci per la ricerca sulle zecche e sono ampiamente utilizzati in molti laboratori di ricerca come alternative valide all'alimentazione con animalivivi 28,29. Il valore principale di questi sistemi risiede nella loro capacità di fornire o recuperare vari agenti attraverso la farina di sangue, inclusi patogeni, acaricidi, composti derivati dalle zecche e altre molecolemodulatrici 22,23,25,27. L'ottimizzazione dei sistemi di alimentazione a membrana artificiale potrebbe facilitare lo sviluppo di colonie di zecche sostenibili, riducendo così la dipendenza dagli animali vivi.
Il sistema di alimentazione in vitro delle zecche descritto in questo protocollo è stato particolarmente efficace con Amblyomma americanum e Ixodes scapularis adulti. I tassi di successo nell'alimentazione delle zecche sono definiti come la proporzione (o percentuale) di zecche che completano con successo l'alimentazione fino al completo ingorgo. Tuttavia, zecche parzialmente nutrite (tipicamente 3–4 giorni dopo l'inizio) sono spesso sufficienti per affrontare ipotesi sperimentali specifiche per la maggior parte dei laboratori di ricerca sulle zecche che studiano la biologia o la fisiologia delle zecche. In questo protocollo di sistema di alimentazione a membrana artificiale, e per affrontare obiettivi di ricerca specifici nel progetto alpha-Gal (αGal), i termini "tasso di alimentazione delle zecche" sono stati usati per riferirsi all'acquisizione di zecche parzialmente nutrite (2–5 giorni di alimentazione) e "successo nell'alimentazione delle zecche" per indicare l'ingorgorgimento completo in A. americanum. I tassi di alimentazione più alti si sono verificati nelle femmine di A. americanum (87,6%), seguite dai maschi di A. americanum (86,3%), femmine di A. maculatum (68,2%), maschi di A. maculatum (76,6%), femmine di I. scapularis (65,2%) e femmine di R. sanguineus (56,6%), mentre il tasso di successo alimentare di A. americanum è stato del 42,8% (Tabella 1). Le femmine parzialmente nutrite di A. americanum sono state classificate in base ai giorni di alimentazione in 4 categorie (fasi di alimentazione), modificate rispetto alle pubblicazioniprecedenti come segue: (1) non nutrita, (2) 2–3 giorni parzialmente nutrita, (3) 4–5 giorni parzialmente nutrita e (4) ingrossata (Figura 5). La fase di alimentazione ingorgata includeva zecche all'inizio della fase di ingorgiamento rapido (con pesi che variano da 48,9 mg a 109 mg) e zecche completamente gonfie (con pesi che vanno da 272,7 mg a 348,7 mg) (Figura 5). Questo sistema di alimentazione a membrana artificiale ha permesso molteplici studi all'interno dello stesso gruppo di ricerca e collaboratori, permettendo la generazione di zecche parzialmente nutrite su sangue bovino, che sono state successivamente utilizzate per infestare topi e testare l'ipotesi di trasmissione della sindrome alfa-gal (AGS), un'allergia alla carne rossa indotta da morso di zecca, e per uno studio N-glicomico11,21, 37. La comodità dell'allestimento individuale permetteva l'uso di diverse fonti di sangue, e il coperchio trasparente e l'altezza minima della camera facilitavano la visualizzazione delle zecche durante il periodo di alimentazione sotto uno stereomicroscopio con sufficiente distanza di lavoro.
Modifiche recenti all'umidità (da bagno d'acqua, 90% HR, a bagno a secco, 63% ± 2% HR), temperatura (da 37 °C a 35 °C e di nuovo a 37 °C) e spessore della membrana (Tabella 1) hanno permesso l'alimentazione efficace di più specie di zecche. Sebbene temperatura e umidità relativa (HR) siano variabili importanti da controllare nell'alimentazione in vitro delle zecche, lo spessore e la resistenza della membrana sono fattori critici che garantiscono un alimento efficace tra diverse specie di zecche33,38. È essenziale considerare che le zecche con parti boccali corte, come Rhipicephalus sanguineus e Dermacentor variabilis, richiederanno membrane più sottili rispetto a quelle con parti boccalilunghe 39, come Amblyomma spp e Ixodes spp. I tassi di alimentazione più elevati per le zecche si sono verificati in Amblyomma americanum e A. maculatum, con uno spessore di membrana di 100–200 μm; Rhipicephalus sanguineus con spessori compresi tra 70 e 100 μm; Ixodes scapularis con spessori <150 μm, e Dermacentor variabilis <150 μm (Tabella 1). Un fattore chiave da notare nell'alimentazione delle zecche a membrana artificiale è che si verificano ancora fluttuazioni nei tassi di alimentazione. In questo sistema, un leggero cambiamento di temperatura, cioè da 37 °C a 35 °C e di nuovo a 37 °C dopo un paio di giorni, spesso aumenta o ripristina i tassi di alimentazione delle zecche. Inoltre, il passaggio dal bagno a secco al bagno d'acqua produce risultati simili per Amblyomma spp. e Ixodes scapularis; tuttavia, questo effetto non è stato osservato per Rhipicephalus sanguineus, che si nutre più efficacemente al 63% ± al 2% di umidità relativa nei bagni a secco.
Altri sistemi artificiali di alimentazione delle zecche, come quelli adattati dal sistema a flusso continuo a cinque parti sviluppato da Ueti, M. et al. (USDA-ARS) e successivamente modificato per ulteriori specie di zecche da Yamasaki, Y. et al., hanno dimostrato alta efficienza, ottenendo tassi di successo costantemente elevati nell'alimentazionedelle zecche 27,40. Tuttavia, studi che richiedono frequenti accessi al sistema per la dissezione delle zecche parzialmente alimentate rendono questi sistemi meno adatti, poiché le ripetute aperture e chiusure della camera dell'alloggiamento delle zecche possono risultare ingombranti. La camera stampata in 3D descritta in questo protocollo dispone di un coperchio magnetico a blocco sicuro e di singole piastre di Petri, consentendo una semplice manipolazione e ispezione visiva dell'alimentazione delle zecche senza disturbare l'allestimento. Il coperchio trasparente consente un monitoraggio visivo senza disturbi e si fissa saldamente alla camera tramite magneti incorporati, a differenza dei sistemi di alimentazione delle zecche più comuni, come quelli ottimizzati dal design originale di Kröber e Guerin22,29, dove la visualizzazione individuale non è possibile senza rimuovere la camera di alimentazione dal sangue, poiché tutte le unità di alimentazione sono integrate in un'unica piastra e dove vengono utilizzati i metodi per impedire la fuga delle zecche Non permettere la visualizzazione. Inoltre, questo sistema di alimentazione in vitro per zecche può essere ulteriormente perfezionato per fornire volumi di sangue più piccoli e specifici per il sito. Ad esempio, una volta che le zecche femmine sono attaccate a siti di alimentazione definiti, la piastra di Petri inferiore potrebbe essere sostituita con piccoli serbatoi, come la parte superiore di un tubo PCR da 100 μL, contenente meno di 100 μL di sangue posizionato direttamente sotto l'area di attacco (Figura supplementare 1). Questo approccio alimentare a basso volume permetterebbe studi dettagliati sull'acquisizione e trasmissione di patogeni, oltre a indagini sugli effetti dei tossici per zecche e degli anticorpi derivati dall'ospite. Questo protocollo si è dimostrato efficace nell'ottenere zecche parzialmente nutrite da varie specie adulte di zecche. Ai fini di questo studio, i tassi di deposizione delle uova e di ingorgo completo non sono stati valutati in questo protocollo; tuttavia, ulteriori ottimizzazioni sono in corso con l'obiettivo di ottenere la progenie delle zecche, che potrebbe essere raggiunta con Amblyomma americanum e Ixodes scapularis sulla base di osservazioni preliminari. Forse la caratteristica più innovativa di questo sistema è la sua flessibilità per manipolazioni sperimentali su piccola scala, che consente una variazione controllata di trattamenti e condizioni ambientali, supportando al contempo applicazioni di allevamento in colonie.
L'alimentazione in vitro delle zecche è uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano la biologia, la fisiologia e la competenza dei vettori delle zecche. Tuttavia, l'alimentazione con zecche a membrana artificiale è un compito che richiede tempo e fatica. Questo protocollo, che prevede una camera stampata in 3D con un sistema sure-lock e una semplice membrana lavorata in laboratorio, offre una configurazione semplice una volta stampate le camere e preparate le membrane, consentendo un uso prolungato. Inoltre, regolando lo spessore della membrana, il sistema può essere efficacemente adattato a diverse specie di zecche. Ulteriori ottimizzazioni, incluse la dimensione della camera e lo spessore della membrana, possono consentirne l'applicazione in varie fasi di vita della zecchetta.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non sono interessati finanziari rilevanti che siano collegati alla ricerca descritta in questo articolo.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano riconoscere il lavoro diligente degli studenti e operatori universitari, Kara Golden, Sydney Ingham e Omayma Jaddou Najma, che hanno aiutato nell'alimentazione delle zecche e nell'allestimento della camera e della membrana per le zecche.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 mL di siringa Luer-Lok | BD | 309628 | Luer-Lok Tip |
| Silicone trasparente avanzato | General Electric | 2810435 | Silicone trasparente. Questo sigillante forma una barriera impermeabile all'acqua dopo l'indurirezza. |
| Colla epossidica trasparente | JB Weld-Clear | B009EU5ZM0 | Numero di prodotto Amazon |
| Involucro trasparente per alimenti (sigillo aderente) | Felice | CLO00020 | |
| Sangue bovino defibrinato | Laboratori Hemostat | DBB100 | |
| Sangue umano defibrinato | BioIVT | ||
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| Incubatori a bagno a secco | ONiLAB Scientific | HB120-S | Numero prodotto Amazon. Il blocco riscaldante viene invertito per ottenere una superficie piatta. |
| Sale di solfato di gentamicina | Millipore Sigma | G3632-5G | |
| Carta per la pulizia delle lenti | Tiffen | EK1546027T | |
| Punte per micropipette, 200 e mu; L | Biotix uTIP | 63300057 | Per la siringa. Applicatore di silicone per silicone |
| Guanti in nitrilo | Ispira | COBALTO-OG | Numero di prodotto Amazon |
| Nistatina | BioReagenti Fisher | BP2949-5 | |
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| Barche da pesa (capacità di 100 mL) | Pura Ponta | MDO-AZOC-1030 |
Riferimenti
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