Il protocollo attuale stabilisce una pipeline completa per l'analisi del processo di RNA-seq in massa, dai dati grezzi all'analisi dell'arricchimento funzionale.
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Articolo metodologico
* These authors contributed equally
Il protocollo attuale stabilisce una pipeline completa per l'analisi del processo di RNA-seq in massa, dai dati grezzi all'analisi dell'arricchimento funzionale.
Il fegato grasso non alcolico (NAFL) è solitamente considerato una condizione benigna; tuttavia, una volta che progredisce verso la steatoepatite non alcolica (NASH), i pazienti affrontano un rischio significativamente aumentato di sviluppare malattie epatiche in stadio terminale. Molti studi stanno cercando di chiarire il meccanismo molecolare alla base della transizione da NAFL a NASH. Le tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento (come l'RNA-seq in massa) hanno fornito ai ricercatori una comprensione più profonda esaminando il trascrittoma, rivelando l'espressione delle molecole, l'attivazione delle vie di segnalazione e altri fattori associati alla progressione della malattia. Esiste una grande quantità di dati open source che i ricercatori possono analizzare per identificare potenziali bersagli per il trattamento delle malattie. Tuttavia, la ricerca correlata è limitata dalla mancanza di un processo efficiente e affidabile per l'analisi a monte del trascritoma. Qui, viene fornita una pipeline di analisi upstream altamente riproducibile e intuitiva e successivamente correlata di analisi genica differenziale per ottenere un'elaborazione standardizzata e un analisi approfondita di dati privati o pubblici. La pipeline è suddivisa in quattro fasi: (1) controllo qualità dei dati; (2) mappatura genica; (3) analisi genica differenziale; e (4) analisi funzionale. Questo processo mira a scoprire i meccanismi molecolari della trasformazione delle malattie e ad assistere i ricercatori nello screening di potenziali target farmacologici e approcci terapeutici attraverso l'analisi dei dati Bulk RNA-seq.
La fegato grasso non alcolica (NAFLD) è la malattia cronica epatica più diffusa a livello globale, colpendo più di un quarto della popolazione. La sua incidenza è aumentata drasticamente negli ultimi decenni 1,2,3. Il crescente carico di malattie, in particolare la sua forma più avanzata, la steatoepatite non alcolica (NASH), rappresenta una grande sfida sanitaria globale e un pesante onereeconomico 4. La prima fase della NAFLD è il fegato grasso non alcolico (NAFL), accompagnato da infiammazione e fibrosi che possono ....
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A scopo dimostrativo, il dataset pubblicamente disponibile PRJNA1023502 generato da Lan Bai et al. è stato utilizzato per illustrare ogni fase sia delle analisi upstream chedownstream 20. Poiché questo dataset proviene dal database NCBI SRA ad accesso aperto, non sono necessarie ulteriori autorizzazioni o approvazioni etiche. Consulta la Tabella dei Materiali per verificare tutte le versioni richieste del software e dei R-package. Il dataset pubblicamente disponibile PRJNA1023502 comprende 6 campioni di RNA epatico non NASH, 6 NAFL e 6 NASH RNA-seq. In questo protocollo, il dataset è stato util....
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Il flusso di lavoro di analisi upstream per il RNA-seq in massa è illustrato nella Figura 1A. Questo flusso di lavoro esegue sequenzialmente i seguenti passaggi chiave su una piattaforma Linux: innanzitutto, un rigoroso controllo qualità dei dati grezzi di sequenziamento viene eseguito usando fastp per rimuovere letture e sequenze di adattatore di bassa qualità; successivamente, HISAT2 allinea le letture di alta qualità al genoma di riferimento, con Samtools che converte e ordina i file di a.......
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L'analisi dei dati RNA-seq in blocco è caratterizzata come un compito interdisciplinare che integra genomica, bioinformatica, statistica e informatica. Un flusso di lavoro analitico completo comprende molteplici fasi a monte e a valle, inclusi la pre-elaborazione dei dati grezzi, il controllo di qualità, l'allineamento delle sequenze, la quantificazione a livello genico, la normalizzazione dei dati, l'analisi dell'espressione differenziale e l'interpretazione biologica. Tra questi passag.......
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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Gli autori desiderano ringraziare i responsabili dei database pubblici utilizzati in questo studio.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| biomaRt | Bioconduttore | 2.64.0 | Annotazione genica da Ensembl |
| clusterProfiler | Bioconduttore | 4.16.0 | Analisi dell'arricchimento funzionale |
| DESeq2 | Bioconduttore | 1.48.1 | Analisi differenziale dell'espressione |
| FactoMineR | AgroParisTech | 2.11.0 | PCA e analisi multivariata |
| fastp | OpenGene | 1.0.1 | Controllo qualità e filtraggio dei dati FASTQ |
| Conteggio delle funzionalità | Divisione Bioinformatica, Istituto Walter ed Eliza Hall di Ricerca Medica | 2.0.0 | Contare il numero di letture mappate su ciascun gene per la quantificazione dell'espressione genica |
| ggplot2 | Ipotesi | 3.5.2 | Visualizzazione dei dati |
| ggrepel | Kamil Slowikowski | 0.9.6 | Etichette di testo non sovrapposte |
| ggridges | Claus O. Wilke | 0.5.6 | Crea grafici di cresta |
| HISAT2 | Università Johns Hopkins | 2.2.1 | Allinea le letture filtrate di alta qualità al genoma di riferimento |
| R | R Core Team | 4.5.0 | Un ambiente per il calcolo, l'analisi e la visualizzazione dei dati |
| RColorBrewer | Erich Neuwirth | 1.1.3 | Palette di colori per la tracciatura |
| samtools | Flusso di lavoro sulla Genomica su larga scala | 1.22.0 | Converti ed elabora file SAM per un recupero e un accesso efficienti |
| Kit degli Attrezzi SRA | Centro Nazionale per l'Informazione Biotecnologica | 3.2.1 | Ottenere e pre-processare i dati grezzi di sequenziamento dal database NCBI SRA |
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