Analisi Trascrittomica basata su dati di RNA-seq in blocco

Summary

Il protocollo attuale stabilisce una pipeline completa per l'analisi del processo di RNA-seq in massa, dai dati grezzi all'analisi dell'arricchimento funzionale.

Abstract

Il fegato grasso non alcolico (NAFL) è solitamente considerato una condizione benigna; tuttavia, una volta che progredisce verso la steatoepatite non alcolica (NASH), i pazienti affrontano un rischio significativamente aumentato di sviluppare malattie epatiche in stadio terminale. Molti studi stanno cercando di chiarire il meccanismo molecolare alla base della transizione da NAFL a NASH. Le tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento (come l'RNA-seq in massa) hanno fornito ai ricercatori una comprensione più profonda esaminando il trascrittoma, rivelando l'espressione delle molecole, l'attivazione delle vie di segnalazione e altri fattori associati alla progressione della malattia. Esiste una grande quantità di dati open source che i ricercatori possono analizzare per identificare potenziali bersagli per il trattamento delle malattie. Tuttavia, la ricerca correlata è limitata dalla mancanza di un processo efficiente e affidabile per l'analisi a monte del trascritoma. Qui, viene fornita una pipeline di analisi upstream altamente riproducibile e intuitiva e successivamente correlata di analisi genica differenziale per ottenere un'elaborazione standardizzata e un analisi approfondita di dati privati o pubblici. La pipeline è suddivisa in quattro fasi: (1) controllo qualità dei dati; (2) mappatura genica; (3) analisi genica differenziale; e (4) analisi funzionale. Questo processo mira a scoprire i meccanismi molecolari della trasformazione delle malattie e ad assistere i ricercatori nello screening di potenziali target farmacologici e approcci terapeutici attraverso l'analisi dei dati Bulk RNA-seq.

Introduction

La fegato grasso non alcolica (NAFLD) è la malattia cronica epatica più diffusa a livello globale, colpendo più di un quarto della popolazione. La sua incidenza è aumentata drasticamente negli ultimi decenni ^1,2,3. Il crescente carico di malattie, in particolare la sua forma più avanzata, la steatoepatite non alcolica (NASH), rappresenta una grande sfida sanitaria globale e un pesante onere^{economico 4}. La prima fase della NAFLD è il fegato grasso non alcolico (NAFL), accompagnato da infiammazione e fibrosi che possono ....

Protocol

A scopo dimostrativo, il dataset pubblicamente disponibile PRJNA1023502 generato da Lan Bai et al. è stato utilizzato per illustrare ogni fase sia delle analisi upstream che^{downstream 20}. Poiché questo dataset proviene dal database NCBI SRA ad accesso aperto, non sono necessarie ulteriori autorizzazioni o approvazioni etiche. Consulta la Tabella dei Materiali per verificare tutte le versioni richieste del software e dei R-package. Il dataset pubblicamente disponibile PRJNA1023502 comprende 6 campioni di RNA epatico non NASH, 6 NAFL e 6 NASH RNA-seq. In questo protocollo, il dataset è stato util....

Results

Il flusso di lavoro di analisi upstream per il RNA-seq in massa è illustrato nella Figura 1A. Questo flusso di lavoro esegue sequenzialmente i seguenti passaggi chiave su una piattaforma Linux: innanzitutto, un rigoroso controllo qualità dei dati grezzi di sequenziamento viene eseguito usando fastp per rimuovere letture e sequenze di adattatore di bassa qualità; successivamente, HISAT2 allinea le letture di alta qualità al genoma di riferimento, con Samtools.......

Discussion

L'analisi dei dati RNA-seq in blocco è caratterizzata come un compito interdisciplinare che integra genomica, bioinformatica, statistica e informatica. Un flusso di lavoro analitico completo comprende molteplici fasi a monte e a valle, inclusi la pre-elaborazione dei dati grezzi, il controllo di qualità, l'allineamento delle sequenze, la quantificazione a livello genico, la normalizzazione dei dati, l'analisi dell'espressione differenziale e l'interpretazione biologica. Tra questi passag.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
biomaRt	Bioconduttore	2.64.0	Annotazione genica da Ensembl
clusterProfiler	Bioconduttore	4.16.0	Analisi dell'arricchimento funzionale
DESeq2	Bioconduttore	1.48.1	Analisi differenziale dell'espressione
FactoMineR	AgroParisTech	2.11.0	PCA e analisi multivariata
fastp	OpenGene	1.0.1	Controllo qualità e filtraggio dei dati FASTQ
Conteggio delle funzionalità	Divisione Bioinformatica, Istituto Walter ed Eliza Hall di Ricerca Medica	2.0.0	Contare il numero di letture mappate su ciascun gene per la quantificazione dell'espressione genica
ggplot2	Ipotesi	3.5.2	Visualizzazione dei dati
ggrepel	Kamil Slowikowski	0.9.6	Etichette di testo non sovrapposte
ggridges	Claus O. Wilke	0.5.6	Crea grafici di cresta
HISAT2	Università Johns Hopkins	2.2.1	Allinea le letture filtrate di alta qualità al genoma di riferimento
R	R Core Team	4.5.0	Un ambiente per il calcolo, l'analisi e la visualizzazione dei dati
RColorBrewer	Erich Neuwirth	1.1.3	Palette di colori per la tracciatura
samtools	Flusso di lavoro sulla Genomica su larga scala	1.22.0	Converti ed elabora file SAM per un recupero e un accesso efficienti
Kit degli Attrezzi SRA	Centro Nazionale per l'Informazione Biotecnologica	3.2.1	Ottenere e pre-processare i dati grezzi di sequenziamento dal database NCBI SRA