Modelli animali standardizzati indotti da instabilità per studi preclinici sull'osteoartrite

Sommario

Questo protocollo mira a stabilire modelli animali adatti per la ricerca sull'osteoartrite.

Abstract

Essendo il disturbo articolare più diffuso a livello mondiale, l'osteoartrite del ginocchio (OA) rappresenta un peso significativo per la salute globale, stimolando ricerche approfondite sulla sua patogenesi e sulle strategie di trattamento. Nonostante numerosi studi, le metodologie standardizzate per l'istituzione dei modelli rimangono carenti. Pertanto, per colmare questa lacuna, presentiamo protocolli completi e riproducibili per sviluppare modelli animali di osteoartrite indotti da instabilità, in particolare il modello di Destabilizzazione del Menisco Mediale (DMM) nei topi e il modello della Lesione del Menisco Mediale (MMT) nei ratti. Inoltre, descriviamo una procedura semplice e facilmente implementabile per valutare le soglie del dolore postoperatorio e la stabilità dell'andatura spaziale, volta a promuovere la coerenza metodologica nella ricerca preclinica sull'OA. La validazione istologica e comportamentale ha confermato il successo di entrambi i modelli, poiché i punteggi dell'Osteoarthritis Research Society International (OARSI) sono stati notevolmente elevati, la lunghezza del passo è stata significativamente alterata e le soglie di dolore meccanico sono state sostanzialmente ridotte nei gruppi DMM e MMT rispetto ai controlli, indicando una marcata degenerazione articolare e ipersensibilità. Questi risultati di validazione sottolineano la riproducibilità e la rilevanza traslazionale dei due modelli. Pertanto, fornendo documentazione video dettagliata, questo lavoro promuove la standardizzazione procedurale e facilita la coerenza tra laboratori, migliorando così l'affidabilità e la comparabilità dei risultati della ricerca in OA.

Introduzione

L'osteoartrite (OA) è un disturbo articolare degenerativo altamente diffuso e una delle principali cause di disabilità a livello^{mondiale 1,2}. Nonostante ricerche approfondite, lo sviluppo di efficaci farmaci modificanti dell'artrosi (DMOAD) è stato relativamente^{lento 3}. È ora ampiamente riconosciuto che l'AA è una malattia multifattoriale che coinvolge complessi cambiamenti patologici su molteplici tessuti periarticolari, inclusi cartilagine articolare, osso sottocondrale, tendini e^{sinovio 4,5}. Una ricerca preclinica efficace sui diversi processi patologici dell'artrosi richiede l'uso di modelli animali ben definiti e appropriati. Sebbene siano stati stabiliti e riportati diversi modelli animali di OA 6,7,8,9,10,11, molti studi continuano a utilizzare modelli animali inadatti, limitando la rilevanza traslazionale dei loro risultati. Per affrontare questa questione, presentiamo modelli standardizzati di OA indotta da instabilità, inclusi i procedimenti di Destabilizzazione Riproducibile del Menisco Mediale (DMM) e Lesione del Menisco Mediale (MMT), in formato video per fungere da riferimento pratico per la ricerca preclinica sull'OA e la standardizzazione dei modelli.

Come riportato in studi precedenti, l'instabilità meniscala è un fattore importante che contribuisce alla degenerazione dell'articolazione del ginocchio nei casi clinici. Pertanto, l'instabilità meniscal indotta chirurgicamente in topi e ratti rappresenta un approccio efficace per l'induzione sperimentale dell'OA. In questo contesto, presentiamo due modelli rappresentativi di OA indotta da instabilità, inclusi il modello DMM nei topi e il modello MMT nei ratti. Il modello DMM nei topi è particolarmente prezioso per indagare i meccanismi molecolari dell'OA, poiché i topi sono suscettibili alla manipolazione transgenica, e questo modello mostra una progressione graduale e prolungata della malattia, imitando da vicino l'OA umana. Tuttavia, è importante notare che il modello DMM è meno adatto per studi focalizzati sulle alterazioni patologiche dell'osso sottocondrale, dove modelli alternativi possono offrire una maggiore rilevanza traslazionale.

Inoltre, abbiamo stabilito il modello MMT nei ratti per integrare il modello DMM del muro. La procedura MMT induce danni strutturali più estesi che coinvolgono sia la cartilagine articolare che l'osso sottocondrale, riflettendo così meglio le caratteristiche patologiche avanzate dell'artrosi osservate in contesti clinici. Questo rende il modello MMT del ratto particolarmente adatto per la bioingegneria e la ricerca traslazionale, inclusa la valutazione di biomateriali, terapie rigenerative e sistemi di somministrazione di farmaci mirati alla riparazione articolare. Sebbene le tecniche chirurgiche MMT e DMM siano state descritte in studi precedenti, rimane la mancanza di un protocollo visivo completo e passo dopo passo che garantisca standardizzazione, riproducibilità e precisione tecnica nei laboratori di ricerca. Pertanto, per colmare questa lacuna, abbiamo sviluppato una dimostrazione dettagliata basata su video che illustra ogni fase critica dell'istituzione del modello, dalla preparazione animale alla cura post-operatoria. Inoltre, introduciamo due metodi di valutazione comportamentale comunemente utilizzati, uno per valutare la soglia del dolore e un altro per analizzare la stabilità spaziale dell'andatura, al fine di fornire un quadro coerente per la valutazione funzionale dopo l'induzione dell'OA. Pertanto, integrando protocolli chirurgici e comportamentali, questo manoscritto mira a promuovere la standardizzazione metodologica nella ricerca preclinica sull'OA, migliorando così la comparabilità dei dati e la rilevanza traslazionale tra gli studi.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le linee guida del Comitato per l'Etica e il Benessere Animale dell'Università Medica Cinese dello Zhejiang e sono state approvate secondo il numero di protocollo IACUC-20251020-11. Per l'intervento DMM, sono stati utilizzati maschi C57BL/6 topi di età compresa tra 10 e 12 settimane, mentre maschi di ratti Sprague-Dawley del peso 200-225 g sono stati selezionati per la procedura MMT. Tutti gli animali sono stati ospitati in condizioni specifiche prive di patogeni (SPF) e hanno concesso un periodo di acclimatazione di una settimana prima della sperimentazione. Furono mantenute le condizioni standard di allevamento, con cibo, acqua e lettiera sostituiti almeno due volte a settimana per garantire il benessere animale e la coerenza sperimentale.

1. Preparazione degli animali

1. Somministrare analgesia adeguata (ad esempio, buprenorfina) prima dell'intervento secondo le linee guida istituzionali. Anestetizzare l'animale con un anestetico inalatorio (ad esempio, isoflurano al 2% a 0,4 L/min con un flusso di gas fresco di 4 L/min in una camera di induzione) e mantenere l'anestesia durante tutta la procedura tramite un cono nasale. Conferma la profondità dell'anestesia assicurandoti che non si tratti di riflesso di astinenza del pedale.
2. Applica una striscia da 2-3 mm di unguento oftalmico lubrificante nel sacco congiuntivale della palpebra inferiore e massaggia delicatamente la palpebra per garantire una distribuzione uniforme della pomata sulla superficie oculare.
3. Radere il pelo intorno all'articolazione destra del ginocchio e disinfettare il sito chirurgico con una procedura di pulizia in tre fasi con povidone-iodio seguita dal 70% di etanolo. Posiziona l'animale su un tavolo operatorio sterile.

2. Chirurgia DMM nei topi

NOTA: Questa procedura induce la destabilizzazione articolare tramite la taglia del legamento meniscotibiale mediale (MMTL), evidenziato in rosso nella Figura 1, che normalmente ancora il menisco mediale all'altopiano tibiale.

1. Posizionare il topo anestetizzato in orientamento supino e fare una piccola incisione cutanea parapatulare mediale (circa 3-5 mm) sopra il ginocchio destro.
2. Disseziona con cura i tessuti molli sovrastanti per esporre la capsula articolare. Effettua un'incisione mediale al tendine rotulao e sposta delicatamente la rotula lateralmente per visualizzare l'articolazione del ginocchio. Confermare che la MMTL appare come una sottile banda ligamentosa che collega il corno anteriore del menisco mediale al plateau tibiale. Utilizza uno stereomicroscopio per migliorare la visualizzazione e ridurre al minimo il rischio di danneggiare la cartilagine articolare.
3. Taglia con cura l'attacco tibiale della MMTL usando micro-forbici, una lama #11 o un ago piegato per siringa. Quando si utilizza un ago piegato per siringa, il bordo smussato aiuta a proteggere la cartilagine articolare sottostante. Confermare la transezione riuscita osservando la conseguente destabilizzazione del menisco mediale.
4. Chiudi la capsula articolare incisa usando 8-0 suture assorbibili, seguite dalla chiusura dell'incisione cutanea con clip per ferite o suture 6-0.
   NOTA: Fai attenzione a evitare di perforare o danneggiare la cartilagine articolare durante la sutura e assicurati che la tenuta articolare sia mantenuta correttamente durante la chiusura dell'incisione.
5. Lascia che l'animale si riprenda su una borsa riscaldante e monitora attentamente finché non recupera la piena mobilità.

3. Chirurgia MMT nel ratto

NOTA: Questa procedura induce l'OA creando una lacerazione completa del menisco mediale dopo la transezione del legamento collaterale mediale (MCL), generando così instabilità articolare e degenerazione progressiva della cartilagine.

1. Posizionare il ratto anestetizzato in modo appropriato e eseguire un'incisione parapatulare mediale, lunga circa 6-8 mm, sopra il ginocchio destro.
2. Eseguire una dissezione contusiva per separare gli strati muscolari ed esporre chiaramente il MCL (Figura 2).
3. Usando forbici chirurgiche, trancetta completamente il MCL a metà del lotto.
4. Ritrai delicatamente il MCL tagliato per esporre il menisco mediale sottostante. Utilizzando pinze sottili, afferra il menisco ed esegui una transezione a spessore completo nella sua regione più stretta per creare una lacerazione completa.
5. Riposizionare i tessuti molli e chiudere l'incisione a strati, utilizzando suture assorbibili 5-0 per muscolo e fascia, seguite da clip per ferite o suture 5-0 non assorbibili per la chiusura della pelle.
6. Permettere all'animale di recuperare seguendo la stessa procedura descritta nel passo 2.5.

4. Valutazioni comportamentali

1. Effettuare valutazioni di base prima dell'intervento e revisioni ripetute nei momenti postoperatori designati (ad esempio, 2, 4 e 8 settimane).
   NOTA: Per minimizzare la variabilità tra operatori, test comportamentali sono stati eseguiti dallo stesso operatore addestrato che era stato accecato al raggruppamento sperimentale. Ogni misurazione è stata ripetuta tre volte per animale e il valore medio è stato utilizzato per l'analisi.
   1. Test semplificato della soglia meccanica di prelievo
      1. Posiziona i topi in singoli scomparti su una piattaforma rialzata a rete metallica e lasciali acclimatarsi per almeno 30 minuti prima del test. La sensibilità meccanica al dolore viene poi valutata utilizzando un anestesiometro elettronico von Frey.
      2. Utilizzando un filamento di Von Frey, applica la sonda sulla superficie plantare della zampa posteriore destra del topo e aumenta gradualmente la forza¹².
      3. Annota la risposta, notando che una reazione positiva è indicata da un improvviso ritiro della zampa, un sussulto o un leccamento. Valutare la presenza o l'assenza di una risposta coerente per valutare i cambiamenti di sensibilità nel tempo.
   2. Analisi dell'andatura
      1. Utilizzare un sistema automatizzato di analisi del passo per la valutazione.
      2. Permettere all'animale di camminare volontariamente sul corridoio di vetro dell'apparecchio. Definisci una prova valida come quella in cui l'animale si muove a un ritmo costante senza fermarsi. Aspetta che il software di sistema identifichi automaticamente le impronte di zampa e calcoli più parametri di camminata. Analizza le metriche chiave per l'arto posteriore destro (operato), inclusa la durata della fase della posizione, la velocità di movimento e la pressione della zampa, e confrontale con quelle dell'arto controlaterale e dei controlli a sham-operate.
         NOTA: Tutti gli animali sono stati acclimatati all'apparato di test con sessioni di addestramento quotidiane prima della valutazione di base. Per ogni animale sono state registrate tre prove per ogni momento di tempo, e sono state considerate valide solo le prove in cui l'animale ha mantenuto una velocità costante senza pause. Tutte le misurazioni sono state eseguite da operatori addestrati secondo un progetto doppio cieco per minimizzare la variabilità tra operatori, e le prove ripetute sono state mediate per garantire la riproducibilità dei dati.

Risultati

Caratterizzazione e validazione del modello murino DMM OA
Dopo un periodo di acclimatazione di 1 settimana, il modello di osteoartrite (OA) indotta da DMM nei topi è stato stabilito seguendo la procedura illustrata nella Figura 1. Valutazioni patologiche e comportamentali sono state effettuate due settimane dopo l'intervento. Come mostrato nella Figura 2A, i cambiamenti degenerativi più evidenti erano localizzati all'articolazione femorotibia...

Discussione

Questo protocollo fornisce un quadro standardizzato per l'induzione e la valutazione di due modelli chirurgici di OA ampiamente utilizzati. Questi modelli sono particolarmente preziosi perché replicano fedelmente le caratteristiche fisiopatologiche dell'OA post-traumatica umana, offrendo così una forte rilevanza traslazionale. Il modello DMM prevede la transezione del legamento meniscotibiale mediale, mentre il modello MMT prevede una lacerazione diretta del menisco mediale. Nel nostro l...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sistema di analisi dell'andatura	Shanghai Xin Ruan Information Technology Co., Ltd	XR-FP202
Liposico			Unguento oftalmico
Topi	Istituto di Animali Modello di Nanchino	C57/BL6
Sistema di test del dolore	Shanghai Xin Ruan Information Technology Co., Ltd	XR-XZD	anestesiometro elettronico di von Frey
Topo	Istituto di Animali Modello di Nanchino	S/D