Caratterizzazione dei tratti stomatici ed epidermici tramite peel, clearing e analisi delle immagini basate su IA

Sommario

Questo protocollo presenta un metodo comparativo per valutare i tratti stomatici ed epidermici in due specie distinte utilizzando peeling epidermici, tecniche di clearing e analisi delle immagini assistite dall'IA. L'obiettivo è permettere la quantificazione ad alta produttività e riproducibile delle strutture cellulari alla base della funzione stomatica per applicazioni agricole e ricerche vegetali su larga scala.

Abstract

Una caratterizzazione accurata della morfologia stomata e dei tratti epidermici circostanti è essenziale per comprendere la funzione stomatica. Viene presentato un protocollo comparativo utilizzando due tecniche complementari - peeling epidermici e pulizia delle foglie - per valutare la dimensione, la forma e la densità delle cellule stomatiche ed epidermiche in due specie di dicotiledesi ecologicamente distinte, Fraxinus excelsior e Taraxacum officinale. Il protocollo include passaggi dettagliati per la preparazione del campione, l'imaging e la quantificazione dei tratti utilizzando misurazioni manuali efficaci sia in termini di costi che in termini di lavoro (pulizia e peeling dei tessuti), e analisi delle immagini assistite da IA con il potenziale di facilitare applicazioni ad alto rendimento. Tre strumenti di segmentazione - un modello di rilevamento stomatico basato su YOLOv8, uno strumento generalista di deep learning per la segmentazione cellulare e un classificatore basato su pixel - sono stati valutati per la loro accuratezza e idoneità in vari metodi. Differenze significative nei tratti stomatici ed epidermici sono costantemente osservate tra le tecniche di peeling e clearing sia nelle analisi manuali che in quelle AI. Gli strumenti di IA hanno permesso la quantificazione riproducibile, con il modello di rilevamento degli stomi basato su YOLOv8 (StoManager1) che ha funzionato meglio per i tratti stomatici e uno strumento generalista di deep learning per la segmentazione cellulare (Cellpose) per la segmentazione epidermica. La rilevazione dei tratti basata sull'IA era altamente coerente in T. officinale ma limitata in F. excelsior; i risultati divergevano ancora dalle misurazioni manuali, illustrando come l'anatomia specifica della specie e la qualità dell'immagine influenzino l'adeguatezza del metodo. Questi risultati suggeriscono che, sebbene l'analisi assistita dall'IA fornisca un quadro utile per la quantificazione dei tratti stomatici ed epidermici, la validazione da esperti e i test pilota rimangono essenziali prima di un'applicazione più ampia o ad alto rendimento.

Introduzione

Gli stomi sono pori microscopici nell'epidermide che svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione dello scambio gassoso e della traspirazione delle piante. Pertanto, comprendere la base morfologica del funzionamento degli stomati è fondamentale per migliorare le prestazioni delle^{colture 1}. Sebbene la maggior parte degli studi sulla struttura e funzione degli stomi si concentri esclusivamente sulla morfologia degli stomatici, una piena comprensione della reattività degli stomati richiede anche la caratterizzazione della dimensione e della forma delle cellule epidermiche circostanti. La quantificazione accurata di questi tratti è fondamentale per comprendere le relazioni struttura-funzione alla base dello scambio gassoso e del miglioramento delle colture.

Poiché il miglioramento delle colture si basa sempre più su approcci avanzati di editing genetico, è fondamentale comprendere i tratti morfologici chiave – come gli stomi – che influenzano la fotosintesi, l'efficienza intrinseca dell'uso dell'acqua e il guadagno di carbonio. Questa necessità è particolarmente urgente a causa dei cambiamenti ambientali in corso, poiché la domanda di colture resilienti che mantengano sia la capacità fotosintetica sia la resa cresce di fronte a siccità e ondate di caldo più^{frequenti 2,3}. Di conseguenza, c'è una forte necessità di protocolli standardizzati per l'imaging e l'analisi. La sgommatura degli stomati con vernice/smalto è il metodo più semplice per ottenere impressioni superficiali delle foglie per misurare dimensioni, forme ed densità degli stomi ed^{epidermi 4,5,6}. La sua procedura è rapida, non distruttiva, permettendo un rapido trattamento dei campioni. Il metodo di pulizia dei tessuti è un approccio alternativo che consente la caratterizzazione simultanea della rete venosa e potenzialmente una caratterizzazione più completa dell'idraulica delle foglie.

La pulizia chimica ammorbidisce e rende i tessuti otticamente trasparenti, permettendo l'imaging in situ di stomi e cellule epidermiche senza interruzioni meccaniche. Il clearing è ampiamente applicabile a una gamma di tipi di tessuto, inclusi campioni essiccati o delicati, e può essere utilizzato non solo per l'imaging stomatico ma anche per la visualizzazione di reti di venature, imaging a fluorescenza e strutture anatomiche^interne 7,8,9,10,11,12 , permettendo così di analizzare i tratti stomatici insieme ad altri tratti funzionali. Esistono vari metodi di clearing, che coinvolgono solventi organici, soluzioni acquose, iperidratazione o incorporazione di idrogel 13,14,15. Questi differiscono per durata, compatibilità di imaging e disponibilità di reagenti. Il protocollo utilizzato qui è semplice, conveniente e non richiede competenze specializzate. Entrambe le tecniche sono economiche e rapide rispetto a metodi più laboriosi come la microscopia luminosa o la microscopia elettronica a scansione, che richiedono la fissazione chimica, l'inserimento e la sezionazione dei campioni.

I metodi tradizionali per l'analisi delle caratteristiche stomatiche ed epidermiche spesso si basano sulla segmentazione manuale delle immagini microscopiche, che richiede molta labore, richiede molto tempo e può essere soggetto a bias da parte dell'osservatore, limitando così la capacità di produzione e riducendo l'efficienza della pipeline^{di analisi 16}. Inoltre, caratteristiche anatomiche come i tricomi e le pareti cellulari irregolari presentano ulteriori sfide per una quantificazione coerente dei tratti. Sebbene gli strumenti di analisi automatica delle immagini offrano grande potenziale per l'estrazione dati ad alta produttività, sono stati ottimizzati per tessuti vegetali specifici e non sono facilmente trasferibili tra tipi di foglie e metodi di preparazione. Ad esempio, StoManager1 (Figura Supplementare 1) fornisce un'elevata precisione nel rilevamento degli stomati utilizzando un modello di rilevamento oggetti basato su YOLOv8, ma è specificamente addestrato per i tratti stomati. Cellpose (Figura Supplementare 2) è un modello di segmentazione generalista, pre-addestrato e di grandi dimensioni che funziona bene quando i dati di input somigliano ai suoi modelli pre-addestrati (ad esempio, cito, cito2), originariamente basati su cellule e organelli animali. Ilastik (Figura Supplementare 3) è uno strumento di classificazione basato su pixel che si basa su annotazioni definite dall'utente. Sia Cellpose che Ilastik sono user-friendly, ma ognuno può richiedere riaddestramento o messa a punto fine per adattarsi a variazioni nella qualità dell'immagine, artefatti di sfondo e caratteristiche specifiche del tessuto.

Inoltre, la morfologia stomatica ed epidermica mostra un'elevata variabilità tra le specie¹⁷. Caratteristiche come la densità e la dimensione degli stomi sono particolarmente variabili, ma sono tipicamente inversamente correlate e insieme determinano le differenze tra specie nella cinetica stomata. Gli stomi più grandi possono compensare in parte la densità inferiore, ma generalmente mostrano una cinetica^{più lenta 5}, che può essere svantaggiosa in caso di ondate di calore sempre più frequenti, dove risposte stomatiche rapide sono fondamentali per mantenere l'assimilazione del carbonio e prevenire una perdita eccessiva d'acqua. Nel complesso, questa variabilità complica la misurazione dei tratti stomatiche e può compromettere la validità del protocollo selezionato e la robustezza dei risultati basati sull'IA.

Questo protocollo integra due tecniche classiche di preparazione—peeling epidermici e clearing chimici—con moderni strumenti di intelligenza artificiale (IA) e machine learning (ML) per la segmentazione e la misurazione dei caratteri. Utilizzando due specie di dicotelodesi comuni a domanda di luce con strategie ecologiche contrastanti (F. excelsior e T. officinale), abbiamo esaminato la variabilità dei tratti stomatici ed epidermici per valutare come tre metodi si confrontano e dove potrebbero sorgere potenziali imprecisioni. Sono state valutate le prestazioni di tre strumenti di intelligenza artificiale: StoManager1 (un modello di deep learning basato su YOLOv8 per la rilevazione degli stomati), Cellpose (uno strumento generalista di segmentazione per deep learning) e ilastik (un classificatore basato su pixel per tessuti epidermici). Questo approccio integrativo consente una quantificazione riproducibile e ad alto rendimento di tratti stomatici ed epidermici, offrendo un quadro solido e scalabile per l'analisi fenotipica sia nella ricerca ecologica che agricola. Tuttavia, caratteristiche anatomiche come tricomi densi, cuticole spesse o basso contrasto tra i confini cellulari possono ridurre la precisione della segmentazione e dovrebbero essere considerate nella scelta tra approcci di peeling e clearing e nell'applicazione della quantificazione basata sull'IA.

Per quanto ne sappiamo, questo è il primo protocollo passo dopo passo che confronta direttamente gli approcci di peeling epidermico e clearing chimico in combinazione con molteplici strumenti di segmentazione basati su IA per la quantificazione sia dei tratti stomatici che epidermici. Unendo le tecniche classiche di microscopia con flussi di lavoro ML accessibili, il protocollo riduce il bias dell'utente, aumenta la portata e facilita la fenotipizzazione riproducibile tra specie. Questo rende l'approccio ampiamente applicabile all'ecologia, al miglioramento delle colture e alla ricerca sul cambiamento climatico, fornendo una base per l'espansione continua degli strumenti attraverso il ritraining dei modelli o l'apprendimento per trasferimento.

Protocollo

NOTA: Non sono stati richiesti permessi o approvazioni specifiche per la raccolta delle foglie di T. officinale e F. excelsior , poiché queste specie non protette sono state campionate da aree di giardinaggio accessibili al pubblico. La raccolta di tutti i campioni è stata conforme alle linee guida istituzionali e locali.

1. Raccolta di materiale vegetale

1. Seleziona foglie sane per un'analisi comparativa. Per l'esperimento attuale sono state selezionate foglie mature sane ed esposte al sole di due specie di dicotiledesi con distribuzione stomatica contrastante: l'albero ipostomatoso F. excelsior, che presenta stomi solo sulla superficie inferiore della foglia, e l'erbacea perenne anistomata T. officinale.
2. Per ogni tipo/posizione di campione prendi 3-5 foglie replicate.
3. Stacca la foglia usando forbici pulite o una lametta. Metti immediatamente la foglia tagliata nell'acqua per evitare la disidratazione.
4. Dopo la raccolta, immergi completamente il piccololo in acqua e conservalo a 4°C.
5. Procedere con le sezioni 2 o 3 del protocollo entro 48 ore.

2. Preparazione e osservazione dei peeling per impronte di stomi

NOTA: Tutti i rifiuti chimici generati durante il protocollo di bonifica sono stati gestiti secondo le normative istituzionali e locali sulla sicurezza. Le soluzioni contenenti glutaraldeide venivano raccolte separatamente e smaltite come rifiuti chimici pericolosi. Le soluzioni di idrossido di sodio (NaOH) sono state neutralizzate a pH 6-8 prima dello smaltimento, dove consentito. Soluzioni diluite di candeggina ed etanolo venivano gettate nello scarico con abbondanti quantità di acqua fredda nei luoghi consentiti dalle normative istituzionali e municipali. Le soluzioni TBO venivano raccolte e smaltite come rifiuti chimici secondo le linee guida locali. Gli utenti dovrebbero consultare il proprio ufficio di sicurezza istituzionale per le procedure di smaltimento approvate.

1. Se necessario, risciacqua delicatamente la superficie della foglia scelta con acqua per rimuovere polvere o detriti. Asciuga immediatamente la superficie della foglia con carta filtrante o un tovagliolo morbido per rimuovere l'eccesso di umidità. Non asciugare all'aria, poiché ciò potrebbe causare un restringimento del tessuto, portando a misurazioni imprecise delle dimensioni degli stomi e delle cellule epidermiche.
2. Etichettare il vetrino del microscopio con i dettagli del campione (ad esempio, specie, lato foglia e data di preparazione) utilizzando un pennarello permanente per garantire la tracciabilità di ogni campione durante l'immagini, l'analisi e l'interpretazione dei dati, consentendo così una corretta conservazione del campione per un uso futuro.
3. Per le specie con tricomi non ghiandolari (pelosi), rimuovere i tricomi dalla superficie fogliare con una lametta prima della preparazione del peeling, poiché la loro presenza può oscurare i confini cellulari e ridurre la qualità dell'immagine (Figura 1).
4. Usando un pennello piccolo, applica uno strato sottile e uniforme di smalto trasparente e non estensibile (evita formule "stretch" o "peel-off") sull'area target. Seleziona sempre la parte centrale della foglia per la preparazione della buccia, evitando punta e base.
5. Lascia asciugare completamente lo smalto (tipicamente 2-5 minuti a temperatura ambiente). L'esposizione prolungata può causare decolorazione del tessuto (ad esempio, tonalità rossa sulle foglie più morbide), che può essere visibile nel peeling finale e interferire con le analisi a valle che richiedono una colorazione uniforme.
6. Una volta asciutto, applica una striscia di nastro trasparente sull'area rivestita. Inizia da un bordo dello smalto e stendi gradualmente il nastro sulla superficie, premendo delicatamente per garantire una buona adesione ed evitare bolle d'aria o pieghe. Indossa guanti in nitrilo per evitare impronte digitali.
7. Scolpa con cura il nastro insieme alla pellicola dello smalto (impronta epidermica).
8. Posiziona il nastro (con il lato appiccicoso verso il basso) su un vetrino pulito del microscopio, evitando pieghe o sovrapporzioni.
9. Conserva i vetrini preparati a temperatura ambiente, protetti dalla polvere e dalla luce solare diretta.
10. Esamina il vetrino sotto un microscopio a luce composta a un ingrandimento di 400x. Salva le immagini secondo la guida del software, insieme alla scala corrispondente.

3. Preparazione e visione delle sezioni liberate

1. Taglia di foglie di circa 1^{cm 2}. Esegui tutti i passaggi indossando guanti in nitrile e lavorando sotto una cappa a pompa.
2. Trasferire i campioni in una fiala marcata, coprirli con soluzione fissante (4% aldeide glutarica in 0,1 M fosfato tampone, pH = 6,9) (ATTENZIONE), e conservare a 4°C per 24 ore (Tabella 1, per la preparazione della soluzione fissante).
3. Rimuovere la soluzione fissante con una pipetta e coprire i campioni con acqua distillata. Lascia andare per 30 minuti. Ripeti tre volte (Figura 2A-C).
4. Rimuovere l'acqua e coprire i campioni con una soluzione di 1 M di NaOH (sciogliere 20 g di NaOH in 0,5 L di acqua distillata).
5. Durante il ripulimento delle foglie, la soluzione NaOH diventa verde. Sostituisci la soluzione NaOH una volta al giorno con una soluzione nuova. Continuare per 3-4 giorni, oppure finché i campioni diventano giallo pallido e la soluzione di NaOH rimane trasparente (Figura 2D-F).
6. Rimuovere la soluzione di NaOH e coprire i campioni con candeggina (5% di NaClO). La candeggina domestica commerciale con questa concentrazione è adatta.
7. Incubare i campioni nella candeggina per 1-2 minuti. I campioni diventeranno bianchi e traslucidi (Figura 2G-I).
8. Rimuovi la soluzione precedente e copri i campioni con acqua distillata per 2 minuti. Disidratare i campioni attraverso una serie di etanolo distillato classificato come segue: 75:25, 50:50, 25:75 e 100% etanolo.
9. Rimuovere l'etanolo e coprire i campioni con una soluzione alcolica al 3% di toluidina blu O (TBO, sciogliere 3 g TBO in 100 mL di etanolo al 100%). Partire per la notte.
10. Rimuovi la soluzione di colorazione e copri i campioni con etanolo al 100% per 2 minuti. Ripeti questo passaggio usando una serie gradata di acqua distillata ed etanolo come segue: 25:75, 50:50, 75:25 e infine acqua distillata (Figura 2J-L). Consulta la Figura 3 per gli errori comuni e i passaggi di risoluzione dei problemi associati al processo di clearing.
11. Tieni i campioni in acqua distillata a 4°C fino all'osservazione.
12. Trasferire i campioni su un vetrino di vetro, aggiungere una goccia d'acqua distillata e coprire con un giallo di vetro per una visione microscopica e l'imaging di visualizzazione.
13. Esamina il vetrino sotto un microscopio a luce composta a un ingrandimento di 400x. Salva le immagini secondo la guida del software, insieme alla scala corrispondente. Vedi la Tabella dei materiali per ulteriori informazioni.

4. Analisi e misurazioni delle immagini

1. Usa Fiji²³ (distribuzione ImageJ, versione 1.54p) per l'elaborazione e l'analisi delle immagini.
2. Usando lo strumento Linea, traccia una linea sopra la barra della scala, poi seleziona Analizza > imposta scala, modifica la distanza nota alla lunghezza della barra della scala e cambia l'unità di lunghezza in μm.
3. Vai su Analisi > imposta le misurazioni. Assicurati che siano controllate le opzioni di Area e diametro dei Feret .
4. Usa lo strumento di selezione dei poligoni per delineare l'oggetto di interesse. Registra la misura premendo il tasto M .
5. Misurare i seguenti tratti stomatici ed epidermici nelle Fiji e calcolare sia per campioni eliminati che per le bucce stomatiche (Figura 3).
6. Calcola il numero di stomi (Ns).
   1. Determina l'area media degli stomi (As).
   2. Determinare la larghezza media degli stomi (Ws): usando il diametro minimo di Feret.
   3. Calcola la densità stomatica (SD), seguendo la seguente formula:
      
      ; per unità Ia (l'area di foglia selezionata per le misurazioni, mm²).
   4. Determina l'area media delle cellule epidermiche (Ae).
   5. Determinare la densità cellulare epidermica (ECD) utilizzando la seguente formula:
      

5. Statistiche

1. Utilizzare ANOVA e il test post-hoc HSD di Tukey per testare le differenze tra i gruppi campionari.
2. Effettuare tutte le analisi statistiche in R²¹.
3. Analizza un totale di 3 foglie replicate per specie e osserva 3 bucce da ciascuna foglia.

6. Analisi assistita dall'IA

1. Seleziona gli strumenti di machine learning per la segmentazione.
   1. Seleziona strumenti di segmentazione basati su machine learning appropriati in base alla struttura target (stomi o cellule epidermiche), alla qualità dell'immagine e agli obiettivi di analisi.
   2. Utilizzare un modello di deep learning specifico per stomi per la rilevazione e misurazione automatica dei tratti stomatici e utilizzare strumenti generalisti di deep learning o segmentazione su pixel per la segmentazione delle cellule epidermiche.
   3. Consulta la sezione Strumenti e Software di Machine Learning per implementazioni software specifiche (File supplementare).
   4. Eseguire test pilota su un sottoinsieme di immagini prima di un'analisi su larga scala per valutare le prestazioni di segmentazione e identificare potenziali fonti di falsi positivi.
2. Prepara l'ambiente informatico.
   1. Utilizza una workstation dotata di un processore da 8-12 core, almeno 32 GB di RAM e una GPU NVIDIA compatibile con CUDA con almeno 24 GB di VRAM.
   2. Usa un display ad alta risoluzione (preferibilmente 4K) per facilitare annotazioni e ispezioni visive.
   3. Installare tutti gli strumenti software selezionati secondo le istruzioni degli sviluppatori e registrare le versioni del software per garantirne la riproducibilità.
3. Prepara le immagini per l'analisi del machine learning.
   1. Importare immagini microscopiche in formato TIFF o PNG, utilizzando immagini in scala di grigi a 8 o 16 bit quando possibile.
   2. Assicurati che ogni immagine contenga una barra di scala visibile o sia stata calibrata spazialmente prima dell'analisi.
   3. Seleziona le regioni di interesse con detriti minimi, pieghe o bolle d'aria, illuminazione uniforme e confini cellulari chiaramente definiti.
   4. Escludi immagini con bordi sfocati, ombre forti o basso contrasto, poiché riducono la precisione della segmentazione.
4. Esegui la segmentazione stomatica.
   1. Carica le immagini nel modello di deep learning specifico per stomi (sezione supplementare file 1).
   2. Configurare i parametri di rilevamento, inclusi i limiti di dimensione degli oggetti e le soglie di confidenza, in base alla specie e alla risoluzione dell'immagine.
   3. Esegui il rilevamento automatico per segmentare i complessi stomatiche ed estrarre metriche di output come numero stomatico, area e diametri di Feret.
   4. Maschere di segmentazione per l'esportazione e tabelle di misurazione per l'analisi a valle. Ispezionare visivamente le sovrapposizioni di segmentazione ed escludere manualmente gli oggetti rilevati in modo errato se necessario.
5. Esegui la segmentazione delle cellule epidermiche.
   1. Carica immagini in uno strumento generalista di segmentazione per deep learning o in un classificatore basato su pixel (sezione supplementare file 2 - 4).
   2. Addestrare o affinare il modello utilizzando immagini rappresentative con esempi annotati manualmente di cellule epidermiche, confini cellulari e sfondo.
   3. Esegui segmentazioni per generare maschere oggetto ed esportare le maschere per il post-processing in ImageJ/Fiji o software di analisi immagini equivalente.
   4. Applicare un filtraggio basato su dimensioni o quantile per rimuovere piccoli oggetti falsi positivi e verificare l'accuratezza della segmentazione tramite ispezione visiva prima di estrarre metriche cellulari epidermiche come area cellulare e densità cellulare.
6. Documentare i parametri ed eseguire il controllo qualità.
   1. Registra tutte le versioni del software, le impostazioni dei parametri, le soglie di filtraggio e le specifiche hardware utilizzate durante l'analisi.
   2. Mantenere sovrapposizioni rappresentative di segmentazione per documentare la qualità della segmentazione.
   3. Validare visivamente gli output automatizzati della segmentazione prima dell'analisi statistica o della reportistica dei dati.
7. Preparazione delle immagini per tutte le elaborazioni ML
   1. Imaging campione
      NOTA: Poiché la segmentazione basata su ML si basa su gradienti di intensità, continuità dei bordi e geometria coerente degli oggetti piuttosto che su un contesto biologico, la pre-elaborazione delle immagini e la selezione della regione determinano in modo critico le prestazioni del modello e la struttura degli errori.
      1. Cattura immagini ad alta risoluzione delle superfici delle foglie libere o sbucciate con una barra di scala visibile. Per buoni flussi di lavoro di apprendimento automatico, assicurati che gli oggetti misurabili siano nitidi, continui e ad alto contrasto in tutta l'immagine.
   2. Selezione delle regioni e qualità dell'immagine
      NOTA: Dopo l'acquisizione dell'immagine nella Sezione 6.7.1, le immagini vengono ispezionate visivamente e, dove la scala dell'immagine lo consente, le regioni di interesse prive di artefatti vengono selezionate manualmente per la segmentazione a valle. Seleziona regioni di interesse con manufatti minimi (ad esempio, detriti, pieghe, bolle d'aria, illuminazione irregolare). Per i modelli stomatici (ad esempio, StoManager1), dare priorità alla visibilità chiara dei pori e a una silhouette ben definita della cella di guardia. Per i modelli epidermici (ad esempio, Cellpose, ilastik), assicurarsi gradienti di intensità stabili lungo i contorni cellulari; i bordi discontinui o a basso contrasto riducono sostanzialmente le prestazioni di segmentazione. Le immagini con confini poco definiti dovrebbero essere escluse o rielaborate prima della segmentazione.
   3. Formato file
      Salvate file in formato TIFF o PNG (in scala di grigi a 8 o 16 bit consigliata per la segmentazione).
   4. Miglioramento dell'immagine opzionale
      1. Aumenta il contrasto o sottrai lo sfondo in ImageJ/Fiji se i confini sono deboli.
      2. Concentrati sulla geometria dei bordi, poiché queste possono creare falsi gradienti interpretati come bordi di cella.
      3. Applica tali aggiustamenti in modo coerente su tutte le immagini all'interno di un dataset.
         NOTA: Bisogna prestare particolare attenzione alla geometria dei bordi, poiché ombre, aureole o gradienti di fondo irregolari possono creare transizioni di intensità artificiali che i modelli ML potrebbero fraintendere come bordi cellulari.
8. StoManager1 (versione GUI v1.0.0)
   NOTA: StoManager1 consente il rilevamento, la misurazione e l'analisi automatizzate ad alta produttività degli stomi delle foglie delle piante utilizzando reti neurali convoluzionali (YOLOv8-seg-x). Lo strumento quantifica metriche stomatiche chiave (area, densità, rapporto poro/cellula di guardia, indici di aggregazione, ecc.) da vari tipi di immagini, riducendo lo sforzo manuale e i bias e facilitando studi ecologici e fisiologici su larga scala. È disponibile un'app Windows intuitiva, che non richiede competenze di programmazione se non per la post-elaborazione opzionale (Sezione 1 del file supplementare⁾²³.
   1. Esecuzione di StoManager1: installazione e configurazione
      1. Accesso tramite GitHub (https://github.com/JiaxinWang123/StoManager1) o l'applicazione Windows autonoma ((sezione supplementare file 1)(https://zenodo.org/doi/10.5281/zenodo.7686022)²³.
      2. Garantire versioni compatibili delle librerie (dipendenze da Python); possono verificarsi conflitti se viene installato altro software ML/immagini.
   2. Avvia StoManager1 tramite interfaccia grafica o interfaccia da riga di comando.
   3. Scegli la cartella di input che contiene immagini foglia.
   4. Selezione dei modelli; Controlla il modello YOLOv8-seg-x per metriche più dettagliate basate sulla segmentazione. Lascialo deselezionato per il modello di bounding box (YOLOv3), meno metriche.
   5. Accordatura dei parametri; Regola le soglie di rilevamento, la risoluzione dell'immagine, la dilatazione della maschera e i limiti di dimensione degli oggetti secondo necessità per la tua modalità/specie di imaging. Si prega di utilizzare parametri predefiniti quando alcuni oggetti stomi rimangono non rilevati, principalmente (1) diminuire la soglia di fiducia nel rilevamento per recuperare più stomi veri mentre si verifica la rilevazione di falsi positivi; e (2) aumentare la risoluzione dell'immagine, poiché un valore maggiore può migliorare la rilevazione di piccoli stomi a scapito di una maggiore domanda computazionale.
   6. Segmentazione delle run:
      1. Clicca su " Avvia processo" per rilevare, segmentare e misurare stomi e stomi interi.
      2. Clicca su " Analisi Statistica" per elaborare le statistiche a livello di gruppo.
   7. Raccogli i risultati. L'output viene salvato su YOUR_OUTPUT_PATH/Predict-output/Output_csv/ (modalità segmentazione) o direttamente su YOUR_OUTPUT_PATH (modalità bounding box). I file CSV contengono metriche per oggetto e riassuntive; vengono inoltre generate maschere e immagini risultati.
   8. Avvia l'elaborazione batch.
   9. Al completamento, raccogli l'output: maschere di segmentazione e file CSV per ogni immagine. I risultati per immagine includono: numero e area stomatica, diametro di Feret (max/min), metriche delle cellule di guardia, indici di aggregazione/uniformità/divergenza e rapporti poro/cellula di guardia.
   10. Ripassa i risultati usando Excel, R o Python per ulteriori statistiche e visualizzazioni.
   11. Controllo qualità; Ispeziona visivamente maschere e sovrapposti. Rimuovere gli oggetti fuori dagli oggetti per dimensione, forma o cura manuale se necessario (vedi sotto).
       NOTA: Protocolli dettagliati e passaggi di post-elaborazione per Cellpose e ilastik sono forniti nel file supplementare. Per prestazioni ottimali con grandi dataset e immagini complesse, consigliamo un sistema con un processore da 8-12 core, almeno 32 GB di RAM e una GPU NVIDIA CUDA con almeno 24 GB di VRAM. Un display grande e ad alta risoluzione (preferibilmente 4K) è anche fortemente raccomandato per annotazioni e visualizzazioni efficienti.

Risultati

Confronto dei risultati tra peeling e clearing

Sia T. officinale che F. excelsior hanno mostrato variabilità nei tratti stomatici ed epidermici a seconda che i campioni fossero eliminati o sbucciati (Figura 4). I campioni eliminati generalmente fornivano confini cellulari più nititi e una visualizzazione più chiara della forma della cellula di guardia e dell'apertura dei pori, anche se strati tissutali sovrapposti occasionalmente oscuravano stomi più piccoli e stime di dimensione distorte verso l'alto. In F. excelsior, l'area media e la larghezza degli stomi erano significativamente più elevate nei campioni eliminati rispetto alle pellicce, mentre in T. officinale non sono state osservate differenze significative. La densità stomatica era significativamente più alta nei campioni sbucciati di F. excelsior, mentre non è stato rilevato alcun effetto metodo in T. officinale. L'area cellulare epidermica non differiva tra i metodi in entrambe le specie, ma la densità cellulare epidermica era leggermente superiore nei campioni sbucciati di F. excelsior.

Nel complesso, le differenze dipendenti dal metodo erano specifiche per caratteri e specie, suggerendo che la sbucciatura rappresenta un'opzione affidabile per le misurazioni stomatiche, in particolare quando gli stomi variano di dimensione (ad esempio, nelle foglie in sviluppo), mentre i tratti epidermici sono stati in gran parte inalterati (Figura 5).

I risultati dell'IA e come risuonano con i metodi di peeling e clearing

Il modello specifico per stomi StoManager1 ha rilevato gli stomi in modo più affidabile su immagini sbucate (Figura 6), mentre le prestazioni sono diminuite notevolmente sui campioni eliminati (Figura 7). Per valutare ulteriormente le prestazioni di StoManager1 tra i metodi di preparazione, abbiamo confrontato la rilevazione dei tratti stomatici in T. officinale e F. excelsior utilizzando sia peeling che immagini chiarite (Figura 8). In T. officinale, il modello rilevava in modo affidabile la presenza e la densità stomatiche attraverso i metodi di preparazione. Tuttavia, i valori risultanti differivano significativamente dalle misurazioni manuali (Tabella 2 e Figure 5 e 8). La maggior parte dei tratti stomatici differiva significativamente (p < 0,05) tra campioni sbucciati e smalti (Figura 8), indicando che le pipeline di rilevamento IA sono altamente sensibili ai metodi di preparazione e richiedono una validazione accurata prima di un'applicazione su larga scala. Al contrario, in F. excelsior, la rilevazione era limitata alla superficie abassiale a causa dell'assenza di stomi adassiali, e nei campioni eliminati la rilevazione era incoerente, con frequenti falsi positivi (Figura 8). Questi risultati evidenziano la forte influenza delle caratteristiche anatomiche specifiche per specie e della qualità dell'immagine sull'efficacia delle analisi basate sull'IA. Strumenti di ML generalisti come Cellpose (Figura 9A) e Ilastik (Figura 9B) segmentavano le cellule epidermiche in modo più efficace su immagini sblamate che su immagini cancellate. Tuttavia, entrambi gli strumenti hanno prodotto numerosi falsi positivi con entrambe le tecniche di preparazione (peeling e clearing), specialmente in condizioni di basso contrasto o quando i contorni cellulari erano sfocati. In tali casi, contorni stomatici o epidermici indistinti venivano spesso sovrasegmentati in più minuscoli oggetti erroneamente classificati come singole cellule epidermiche (vedi Figura 10). Di conseguenza, il post-processing è essenziale, non solo la rimozione degli outlier ma anche il filtraggio tramite quantile superiori, per mantenere le celle identificate in modo affidabile.

Figura 1: Bucce stomatiche di F. carica prima e dopo la rimozione dei tricomi con una lametta . I grandi tricomi possono lasciare impronte sulla buccia, formando sacche d'aria che causano superfici irregolari e ostacolano la messa a fuoco coerente (visibili come grandi punti grigi). F. carica fu inclusa come eccezione per estendere il protocollo alle foglie peluse. (A) A un ingrandimento di 200x, l'immagine prima della rimozione del tricoma è parzialmente ostacolata dalle impronte del tricome. (B) La qualità dell'immagine migliora dopo la rimozione dei tricomi. (C) A un ingrandimento di 400x prima della rimozione del tricoma l'immagine è in gran parte ostacolata dalle impronte del tricomico. (D) L'ostruzione è minima nell'immagine dopo la rimozione dei tricomi con una lametta. Le barre della scala 100 μm (A, B) e 50 μm (C, D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Fasi consecutive del protocollo di compensazione. Immagini rappresentative di T. officinale, F. excelsior e F. carica illustrano le fasi successive del protocollo di clearing. (A-C) Foglie fresche. (D-F) se ne va dopo aver scoperto con NaOH. (G-I) se ne va dopo aver sbiancato con NaClO. (J-L) foglie dopo aver tingito con toluidina blu O. Questo supporto visivo mostra l'aspetto previsto del campione prima di passare al passo successivo e evidenzia la variabilità del protocollo tra le specie. F. carica è stata inclusa come specie eccezionale per dimostrare l'applicabilità del protocollo in una gamma più ampia di morfologie di foglie e vene. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Esempi di misurazioni di caratteristiche stomatiche ed epidermiche. I tratti misurati sono illustrati nell'immagine come segue: As = area stomale; Ls = lunghezza stomale; Ws = larghezza stomale; A e = area cellulareepidermica. La densità stomatica e quella epidermica sono state calcolate all'interno dell'area segnata, come descritto nel protocollo. Immagine a 400x di ingrandimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Confronto delle immagini ottenute con il protocollo di clearing e il protocollo di peeling. Immagini rappresentative di T. officinale e F. excelsior che confrontano immagini di clearing e peeling stomatico che mostrano la visibilità e la variabilità della dimensione e densità delle cellule degli stomi ed epidermide. Barra di scala 50 μm e le immagini vengono scattate con un ingrandimento di 400x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Differenze nei risultati manuali di misurazione dei tratti tra protocollo di clearing e peeling. Diagrammi a scatole che mostrano differenze nei tratti stomatici ed epidermici tra i metodi di clearing e peeling epidermico in T. officinale e F. excelsior. (A) area media degli stomi: (B) larghezza media degli stomi, (C), densità stomale (D), area media delle cellule epidermiche, e (E) densità cellulare epidermica. Gli asterischi indicano livelli di significatività statistica (P < 0,05; *P < 0,01; **P < 0,001). La significatività statistica è stata valutata utilizzando ANOVA unidirezionale seguita dal test post-hoc HSD di Tukey. Dimensione del campione per gruppo: n = 3-5. Abbreviazioni: As = area stomale; Ws = larghezza stomale; SD = densità stomace; Ae = area cellulare epidermica; ECD = densità cellulare epidermica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Esempio di risultati di segmentazione utilizzando un modello di rilevamento stomatico su campione peel. Risultato di segmentazione StoManager1 per un campione sbucciato di T. officinale (lato inferiore di una foglia matura esposta all'ombra), che mostra buona accuratezza nella rilevazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Esempio di risultato di segmentazione utilizzando un modello di rilevamento stomatico su campione liberato. Risultato di segmentazione StoManager1 per un campione liberato di T. officinale (lato inferiore di una foglia matura esposta all'ombra), mostrando una minore accuratezza di rilevamento rispetto ai campioni sbucciati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Differenze nei risultati di misurazione dei tratti assistiti dall'IA tra protocollo di clearing e peeling. Diagrammi a scatola che mostrano misurazioni derivate dall'IA di tratti anatomici stomatiche da immagini elaborate da StoManager1 in T. officinale e F. excelsior. I tratti includono area stomatica (As), larghezza stomatica (Ws), lunghezza stomatica (Ls) e densità stomatica (Ds). Le unità sono come nella Figura 5. La significatività statistica è stata valutata utilizzando ANOVA unidirezionale seguita dal test post-hoc HSD di Tukey. Gli asterischi indicano livelli di significatività statistica (P < 0,05; *P < 0,01; **P < 0,001). Dimensione del campione per gruppo: n = 3-5. Abbreviazioni: As = area stomale; Ws = larghezza stomale; Ls = lunghezza stomaticale; Ds = densità stomale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Screenshot che mostrano la segmentazione con uno strumento di deep learning generalista e un classificatore basato su pixel. Segmentazioni di F. excelsior peeled (superficie fogliare abassiale) con (A) strumento generalista di deep learning (Cellpose (cito2)) e (B) classificatore basato su pixel (ilastik). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Maschera di segmentazione Ilastik per un campione scrostato di F. excelsior (lato abassiale di una foglia), che mostra numerosi falsi positivi. I minuscoli puntini sono erroneamente classificati come cellule epidermiche distinte. Durante la post-lavorazione, è necessaria un'ispezione manuale (visiva) per impostare soglie basate sulla dimensione e filtrare efficacemente i falsi positivi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Soluzione	Preparazione	Volume finale
Base per il buffer 1	7,12 g (Na2HPO 4 *2H 2O) in 200 mL di dist. H2O	200 mL
Base per il buffer 2	7,12 g di Na2HPO 4 *2H2O) in 200 mL di dist. H2O	200 mL
Tampone fosfatico	Mescola 36 mL di base 1, 14 mL di base 2 + 50 mL di dist. H2O	100 mL
Soluzione fissativa	Mescolare 9,25 mL di glutaraldeide al 5% con 12,5 mL di tampone fosfato e 28,25 mL di dist. H2O	50 mL

Tabella 1: Ricetta per la soluzione fissante²⁴. Composizione delle soluzioni utilizzate in questo studio.

Specie	Side	Metodo	Uomo (Come)	IA (As)	Uomo (Ws)	IA (Ws)	Uomo (Ls)	IA (Ls)
Fraxinus	Abassiale	Peeling	177.43	9.32	12.71	2.85	17.58	3.58
Taraxacum	Abassiale	Autorizzato	408.09	18.84	20.1	4.19	26.14	5.39
Taraxacum	Abassiale	Peeling	262.54	13.93	15.18	3.47	22.2	4.68
Taraxacum	Adiasia	Autorizzato	414.48	14.91	20.11	3.44	26.09	5.71
Taraxacum	Adiasia	Peeling	258.72	11.37	15.72	3.3	21.15	4.08

Tabella 2: Confronti indicativi su misurazioni manuali e AI. Risultati scalati da ML (StoManager1). Man e AI indicano, corrispondentemente, i risultati manuali e AI (StoManager1). Le unità sono come nella Figura 5. Le misurazioni manuali e AI differiscono significativamente. Alcuni confronti non sono disponibili per vari motivi, tra cui la mancanza di stomi (ad esempio, F. excelsior adassiale) o il mancato rilevamento (ad esempio, gli stomi erano più difficili da rilevare nei campioni eliminati a causa dei contorni cellulari più sfocati).

Figura supplementare 1: Esempi di errori comuni che si verificano durante la pulizia delle foglie che influenzano i risultati. Immagini mostrate a scopo di risoluzione dei problemi: (A) colorazione irregolare dovuta a una riidratazione incompleta del campione durante la sezione 3.10; (B) danni meccanici derivanti da una cattiva gestione del campione chimicamente molto fragile; (C) tonalità verde al centro del campione dovuta a una rimozione incompleta della clorofilla durante la sezione 3.5. Clicca qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 2: Esempio di interfaccia utente di StoManager1. Screenshot dell'interfaccia utente di StoManager1 che mostra la configurazione degli input e la tabella dei risultati (a sinistra), e le viste micrografiche con immagini originali (in alto a destra) e sovrapposizione di rilevamento stomatico (in basso a destra, superficie adassiale di un campione sbucciato da T. officinale ). Clicca qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 3: Esempio di interfaccia utente di Cellpose. Screenshot della segmentazione di Cellpose in corso tramite l'interfaccia grafica con parametri regolabili (ad esempio, selezione del modello - modello cyto2 pre-addestrato raccomandato o modello addestrato su misura, soglie e calibrazione del diametro cellulare). L'annotazione manuale supervisionata delle cellule epidermiche evidenzia ogni cellula in un colore unico per guidare la calibrazione del modello. La sovrapposizione mostra la segmentazione di un peeling epidermico abaxiale di F. excelsior . Clicca qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 4: Processo di segmentazione Ilastika. La sovrapposizione illustra la classificazione basata su pixel su un'immagine di peeling epidermico abassiale di F. excelsior . (A) Screenshot della segmentazione di ilastik in corso che mostra un addestramento supervisionato con classi etichettate manualmente: cellule epidermiche (gialle), contorni cellulari (blu) e sfondo non epidermico come i tricomi (rosso). (B) Screenshot che mostra solo la classe dell'epidermide (giallo), che illustra come il classificatore isola le singole cellule epidermiche. Si noti la presenza di molteplici rilevazioni "minuscole" di falsi positivi, in particolare in regioni a basso contrasto o illuminazione disomogenea. (C) Screenshot che mostra solo la classe di contorno (blu), che illustra come il classificatore isola i confini cellulari dal tessuto epidermico circostante. Si noti che alcuni contorni sono discontinui e che si verificano molteplici rilevazioni di falsi positivi "minuscoli", in particolare in regioni a basso contrasto o illuminazione disomogenea. (D) Screenshot che mostra la classe di background. La maschera mette in evidenza complessi stomati, tricomi ghiandolari e detriti vari (rosso), escludendo però i corpi cellulari epidermici. Numerose piccole rilevazioni di falsi positivi "minuscoli" sono visibili all'interno delle regioni epidermiche, derivanti da artefatti in scala di grigi e da errata classificazione basata sulla texture. Clicca qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 5: Impostazioni di addestramento Cellpose. Esempio di impostazioni di addestramento Cellpose (GUI) per un campione di T. officinale approvato (entrambe le superfici delle foglie), mostrando i parametri predefiniti del modello prima della regolazione. Viene selezionato il modello cyto2 pre-addestrato, con un tasso di apprendimento di 0,1 e 100 epoche di addestramento (valori predefiniti), che determinano rispettivamente la velocità di aggiornamento dei pesi del modello e il numero di passaggi di addestramento. Questi valori predefiniti sono comunemente modificati (ad esempio, tasso di apprendimento = 0,15; epoche = 12) per ridurre i tempi di addestramento e adattare il modello alla morfologia epidermica delle piante; tuttavia, numeri di epoche più bassi possono ridurre le prestazioni di rilevamento e aumentare i falsi positivi. Clicca qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 6: Maschera "etichetta" di Cellpose. Applicazione della maschera "etichette" Cellpose per un campione di F. excelsior scrostato (superficie fogliare abassiale), mostrando il risultato di un addestramento supervisionato in cui a ciascun oggetto segmentato viene assegnato un identificatore unico. Le cellule epidermiche (marcate e) dominano, mentre le coppie di cellule di guardia stomatiche (marcate g) sono rilevate. I falsi positivi sono evidenti quando i tricomi sono classificati erroneamente come cellule epidermiche (in alto a sinistra) o stomi (in basso centrale), così come falsi negativi in cui le cellule epidermiche rimangono non etichettate in alcune parti dell'immagine. Questo tipo di maschera viene utilizzato per la quantificazione a valle e il perfezionamento di modelli supervisionati. Clicca qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 7: Quantificazione delle cellule epidermiche segmentate in ImageJ/Fiji. Screenshot che mostrano la quantificazione delle cellule epidermiche segmentate dopo la classificazione dei pixel di ilastik per un campione di F. excelsior sbagliato (superficie fogliare abassiale). (A) Nella maschera esportata, ogni cluster di pixel rilevato corrisponde a una singola particella, consentendo l'estrazione automatica di metriche a livello di oggetto (ad esempio, area, perimetro, diametri di Feret). La finestra Risultati (in basso) mostra le misurazioni grezze per migliaia di oggetti; Si noti l'eccezionalmente alto numero di piccole particelle che derivano da rumori di punti "minuscoli" e contorni frammentari, indicando la presenza di numerosi falsi positivi. Questi artefatti richiedono un successivo filtraggio biologicamente informato per isolare le vere cellule epidermiche prima dell'analisi statistica a valle. (B) Filtraggio basato sull'area degli oggetti epidermici segmentati in ilastik in ImageJ/Fiji. Piccoli frammenti e rumore vengono esclusi applicando una soglia minima di area di 150-350 μm², riducendo il numero di particelle rilevate di circa un ordine di grandezza (dieci volte tanto) rispetto alla maschera non filtrata nel pannello A. Sebbene questo passaggio di filtraggio elimini sostanzialmente piccoli falsi positivi, persiste una classificazione imperfetta: contorni frammentati e elementi non epidermici residui rimangono e richiedono ulteriori perfezionamenti, come soglie di circolarità o screening post-biologicamente informato. Clicca qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 8: Post-elaborazione di una maschera "etichetta" di Cellpose in ImageJ/Fiji. Utilizzando il plugin Labels to ROIs per un campione di F. excelsior sbucciato (superficie fogliare abassiale), ogni oggetto segmentato nella maschera viene convertito in una regione di interesse (ROI), permettendo l'ispezione e la misurazione individuale delle cellule epidermiche e dei complessi di cellule di guardia stomatiche. I ROI sono sovrapposti alla micrografia originale (a sinistra), mentre la finestra dei Risultati (in basso a destra) mostra metriche a livello di cellula (ad esempio, area, diametri di Feret, perimetro). Questo passaggio consente una cura biologicamente informata, consentendo agli utenti di verificare se ogni ROI corrisponde a una vera cellula epidermica e di scartare artefatti come tricomi o stomi mal segmentati che persistono dopo il filtraggio della soglia, informando così i successivi passaggi di analisi. Clicca qui per scaricare questa figura.

Discussione

Per misurazioni stomatiche coerenti, dovrebbero essere prelevate sbuccia dalla lamina centrale per ottenere risultati standardizzati, evitando le vene maggiori, poiché la densità stomatica mostra una forte variazione all'interno della foglia, diminuendo verso la base, la punta e i margini^25,26. Le foglie fresche producono le bucce più affidabili, a patto che vengano utilizzati smalti trasparenti non restringenti e nastro trasparente di alta qualità per evitare deformazioni o artefatti. I ritardi oltre ~12 ore riducono la chiarezza dei contorni a causa della disidratazione. Poiché i peeling sono montati temporalmente e possono intrappolare aria, si raccomanda l'imaging precoce, ma la qualità rimane accettabile anche dopo un mese.

Esistono vari metodi di depurazione per tipi specifici di tessuto, obiettivi di imaging e considerazioni di sicurezza 13,14,15. La pulizia chimica è stata eseguita utilizzando un protocollo acquoso basato su NaOH per la sua accessibilità, bassa tossicità e ampia applicabilità tra i tipi di foglie. Poiché le risposte tissutali variano tra specie, sono necessari test e ottimizzazioni. Le foglie sclerofile possono richiedere ≥2 settimane, e il tessuto verde residuo può interferire con la colorazione e oscurare caratteristiche anatomiche (Figura supplementare 1C). Per una pulizia più rapida, la concentrazione di NaOH può essere aumentata a 2,5 M o 5 M. Le foglie morbide diventano fragili dopo lo sbiancamento (Sezione 3.7; Figura supplementare 1B), e l'eccessiva esposizione all'ipoclorito di sodio (NaClO) possono degradare il tessuto o causare separazione degli strati epidermici. Mentre 30 secondi o 2 minuti di sbiancamento sono sufficienti per la maggior parte delle foglie morbide, le specie più resistenti possono richiedere fino a 1^{ora e 27}. Sebbene la pulizia sia più lenta della preparazione della buccia, richiedendo ~5 giorni e senza addestramento specializzato, può essere adattata per specie diverse. I campioni rimossi e colorati possono essere conservati in acqua distillata a 4°C, con la montatura permanente raccomandata per la conservazione a lungo^{termine 15,27}.

StoManager1 specifico per stomi ha rilevato in modo affidabile complessi stomatici nella maggior parte dei tipi di immagine (Figura supplementare 2), con risultati di rilevamento generalmente coerenti con l'annotazione manuale per metodi basati su peel. Tuttavia, le misurazioni dell'area stomática differivano sistematicamente dalle misurazioni manuali (Tabella 2), rendendo necessaria una calibrazione basata su un piccolo sottoinsieme misurato manualmente (ad esempio, 10-20 stomi per specie) prima di un'analisi su larga scala. StoManager1 aumenta notevolmente la produttività, con la verifica manuale richiesta in casi non standard.

La segmentazione simultanea stomi-epidermide è difficile perché la nitidezza ottimale differisce e l'eterogeneità nella morfologia e nella chiarezza della membrana introduce errori di segmentazione. Allo stesso modo, l'addestramento su grandi set di immagini (ad esempio, superfici adassiali/abassiali, peeled/cleared) perde specificità. Non esiste un modello Cellpose pre-addestrato per l'epidermide delle piante; I modelli standard "cito" e "cyto2", addestrati principalmente sulle cellule animali, non funzionano nelle immagini epidermiche. È quindi necessaria una formazione personalizzata per l'affidabilità (Sezione Supplementare 2). Anche dopo l'addestramento, la sovrasegmentazione e i falsi positivi rimangono comuni, in particolare nelle immagini a basso contrasto o non chiarite (Figura supplementare 3).

In ilastik (sezione supplementare 3, figura supplementare 4), dovrebbero essere generate maschere oggetto per le classi cellulari target (ad esempio, classe 1 per l'epidermide), mantenendo però le maschere di classe per audit e correzione manuale. L'elaborazione batch e i successivi flussi di lavoro ImageJ/Fiji possono far risparmiare tempo e ridurre gli errori manuali. Un filtraggio costante per area, deviazione standard o quanti è essenziale per sopprimere il rumore e i rilevamenti spurii. Dopo il filtraggio, l'area mediana delle celle e il conteggio delle celle si avvicinano ai valori manuali. Il benchmarking rispetto alle misurazioni manuali e agli strumenti alternativi di ML (Weka, RootPainter) rimane essenziale per la regolazione dei parametri e la valutazione della qualità della segmentazione. L'elaborazione batch ML richiede molte risorse. L'addestramento stabile e la segmentazione batch su larga scala richiedono una GPU NVIDIA compatibile CUDA e ≥32 GB di RAM. Nei sistemi di fascia media (ad esempio, 16 GB di RAM con grafica integrata), l'addestramento supervisionato richiede tipicamente ~5-10 minuti per <10 immagini e spesso andava in crash quando venivano usate più classi di annotazione o tipi di immagini eterogenee. CUDA aumentava la velocità di elaborazione di ~10-20 volte rispetto all'esecuzione della CPU o della GPU integrata.

Le differenze nelle prestazioni tra Cellpose, ilastik e StoManager1 derivano dalle loro distinte rappresentazioni di caratteristiche. Cellpose prevede campi di flusso vettoriale verso i centri degli oggetti ed è sensibile agli aloni ottici e ai confini di rifrazione brusca, che interrompono il flusso e generano cluster di falsi positivi in F. excelsior risolto. Ilastik, in quanto classificatore a pixel guidato dall'uomo, sovrasegmenta pareti cellulari o aureole in alto rilievo a meno che non venga esplicitamente etichettato come sfondo. StoManager1 rileva complessi stomatici usando schemi di forma a livello di oggetto (celle di guardia accoppiate con un poro centrale) e si comporta bene nelle preparazioni peel, inclusa F. excelsior²⁸; tuttavia, la sfocatura indotta dall'alone influenza la visibilità dei pori durante la chiarezza, producendo falsi negativi piuttosto che una classificazione errata (Fascicolo supplementaresezioni 1 e 3). Di conseguenza, Cellpose e StoManager1 operano come segmentatori automatici, mentre ilastik funziona come classificatore guidato dall'uomo (file supplementaresezione 1-3)^28,.

L'architettura delle cellule specifiche per specie modula le prestazioni dell'IA. In T. officinale, i margini lisci e ellittici delle celle di guardia corrispondono alla distribuzione di addestramento di StoManager1, permettendo la rilevazione su campioni sbucciati (figura supplementare 2), mentre gli strumenti generalisti spesso confondevano celle di guardia e celle di pavimentazione. In F. excelsior, gli stomi incassati e le celle del pavimento ad alto rilievo portano a falsi negativi sulle immagini cancellate. Queste discrepanze riflettono la geometria di imaging dipendente dalla specie e dalla preparazione. Le differenze sistematiche tra misurazioni manuali e derivate dall'IA derivano da due fonti: la mancanza di codifica in scala dall'immagine da parte dell'IA e gli artefatti ottici indotti dalla preparazione. Le strategie di mitigazione includono il triage visivo di sfocature e aureole derivanti dalla preparazione del tessuto, uso preferenziale di peeling nelle condizioni sopra descritte, calibrazione manuale con correzione lineare su un piccolo sottoinsieme di stomi (manuale = a + b × AI). Strategie aggiuntive includono aumenti specifici per taxon e progettazione di classi ausiliarie per l'addestramento (tuttavia, i modelli autoaddestrati probabilmente rimarranno inferiori rispetto ai modelli pre-addestrati su grandi e diversificati dataset) e il filtraggio dei quantili superiori post-segmentazione.

Poiché gli errori di segmentazione dell'IA sono sistematici e non casuali, la post-elaborazione è essenziale. La diagnostica della qualità dell'immagine può seguire un semplice albero decisionale. Inizia controllando il contrasto e la nitidezza epidermica: se è acuto, passa ai falsi positivi; Se sfocato, aspettati piccoli artefatti ad alta frequenza e regola i filtri. Se i falsi positivi (ad esempio, punti, detriti) sono minimi, di solito basta un filtraggio di outlier ±2-3 SD. Se dominano piccoli artefatti, usa il filtraggio basato su quantile. Poi confronta le distribuzioni dei tratti (ad esempio, mediana Ae) con le aspettative biologiche o i dati manuali. Affinare le soglie secondo necessità: mantenere solo quantili superiori del 10-50% in dataset ricchi di artefatti garantisce output significativi (Figure supplementari7 e 8). A causa degli alti tassi di falsi positivi prodotti dagli strumenti di ML epidermico, non è possibile derivare automaticamente stime affidabili della densità stomatica, mentre StoManager1 forniva misurazioni stomatiche^{precise 28} quando i confini erano chiari (vedi Figure 6 e 7). Per la mediana epidermica Ae si è rivelata robusta, meno sensibile a piccoli falsi positivi rispetto alla media.

La scelta del metodo ha influenzato il rilevamento dei tratti. La peeling ha superato la pulizia della densità stomatica esponendo completamente gli stomi (Figura 3), mentre la pulizia spesso oscura gli stomi più piccoli in tessuti stratificati o pigmentati, nonostante a volte conservi meglio la forma stomatica²⁷. Tra gli strumenti di IA, StoManager1 ha fornito costantemente misurazioni stomatiche robuste con minima curazione, in particolare sulle preparazioni^{di peeling 23}, e il peeling ha anche migliorato le misurazioni epidermiche aumentando le cellule correttamente identificate e la copertura^{dell'immagine 2}. I guadagni futuri sono più probabili che derivino da grandi modelli pre-addestrati tassonomicamente diversificati, per essere integrati in pipeline di imaging automatizzati per ecofisiologia e miglioramento delle colture.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Disinfettante detergente liquido NaClO < 5%	Domestos, GB	H000023244	Bruciature cutanee
Disodico fosfato idrogeno diidrato (Na2HPO4. 2H2O)	PENTA, CZ	10028-24-7	NA
Etanolo, absunti al 100% di a.r.	Chem-Lab NV, BE	CL00.0505.1000	Altamente infiammabile
Fiala di vetro 2 mL	VWR Life Science, USA	548-0045
Soluzione al 50% di glutaraldeide	VWR Life Science, USA	23H2856331	Fatale se inalata. Tossico se ingerito.  Indossa guanti protettivi,   abbigliamento,   occhiali.
Vedute per microscopio	Normax, PT	5470308A	NA
Top coat per la cura delle unghie ad asciugare veloce	BK (INEZA), LT	LT-02244	NA
Nikon Eclipse E600 e Nikon DS0Fi1 5 MP	Nikon Corporation, Giappone	https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-e600	NA
Piotetta e punte a pipetta	Termoscientifica, FI	KJ16047	NA
Lame in acciaio a filo singolo	Strumenti di Oxford	51-1625-0182	NA
Diidrogeno fosfato diidrato (NaH2PO4 . 2H2O) puro	PENTA, CZ	13472-35-0	NA
Pellet di idrossido di sodio (NaOH) puri	Merck KGaA, DE	1310-73-2	Ustioni gravi.
Nastro trasparente per la cancelleria	FOROFIS, LV	91231	NA
Blu toluidina, grado generale	ThermoFisher Scientific, GB	2045836	NA