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Articolo metodologico

Generazione e manipolazione genetica degli organoidi cervicali umani

731 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/69617

⸱

10 marzo 2026

 ,  ,  , 
1Department of New Biology, DGIST, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Kyungpook National University Chilgok Hospital, 3Clinical Omics Institute, Kyungpook National University, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Kyungpook National University School of Medicine, 5New Biology Research Center, DGIST, 6Graduate Program in Biomedical Science & Engineering, DGIST

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un protocollo dettagliato per stabilire e manipolare geneticamente gli organoidi cervicali umani.

Abstract

Il cancro cervicale è il quarto cancro più comune nelle donne e colpisce più frequentemente l'ectocervice uterina. L'ectocervice uterina è rivestita da epitelio squamoso stratificato, composto da cellule basale e cellule parabasale e suprabasale differenzianti. La rigenerazione osservata dopo la conizzazione cervicale suggerisce la presenza di una robusta attività delle cellule staminali. Tuttavia, la nostra comprensione dell'identità e dei meccanismi regolatori delle cellule staminali cerviali e del loro processo di trasformazione maligna è stata limitata a causa dell'accesso limitato ai tessuti cervicali umani e della mancanza di sistemi ottimali per valutare l'attività delle cellule staminali nell'ectocervice uterina. Gli organoidi cervicali umani recentemente istituiti possono aiutare a superare queste limitazioni e offrire nuove opportunità per studiare la fisiologia e la patologia cervicale. Tuttavia, non esiste un metodo standardizzato per isolare e stabilire organoidi cervicali umani. Qui descriviamo un metodo per stabilire organoidi ectocervicali umani. In particolare, presentiamo un protocollo per isolare singole cellule dall'epitelio ectocervicale umano. Incubando tessuto cervicale in una soluzione enzimatica ottimizzata, rimuoviamo l'epitelio cervicale per massimizzare la resa cellulare minimizzando al contempo l'inquinamento da fibroblasti. Illustriamo inoltre le condizioni per la coltivazione degli organoidi cervicali umani utilizzando una formulazione ottimizzata di mezzo. Inoltre, dettagliamo le procedure per il passaggio e la manipolazione genetica degli organoidi cervicali. Questo protocollo offre un approccio altamente efficiente per stabilire organoidi cervicali umani e utilizzarli per studiare le cellule staminali cervicali e le malattie.

Introduzione

L'ectocervice uterina è il sito più comune per il cancrocervicale 1,2. Sebbene il cancro cervicale sia diminuito dopo l'introduzione della vaccinazione contro il papilloma umano (HPV) nei paesi sviluppati, a livello globale rimane ancora il quarto cancro più comune tra le donne 3,4. Inoltre, l'incidenza delle lesioni precancerose cervicali continua ad aumentare in alcunipaesi 5,6. Sebbene la lesione intraepiteliale squamosa di basso grado (LSIL) spesso regredisca da sola, la lesione intraepiteliale squamosa di alto grado (HSIL) comporta un rischio di progressione verso un cancro invasivo e tipicamente richiede intervento chirurgico, come escissione o conizzazione. Queste procedure possono accorciare l'ectocervice e aumentare il rischio di aborto spontaneo o partopretermine 7,8. Una comprensione più profonda della biologia cervicale, unita allo sviluppo di terapie rigenerative, potrebbe aiutare ad affrontare queste sfide, ma richiede sistemi modello robusti e fisiologicamente rilevanti.

I modelli animali hanno fatto avanzare significativamente la nostra comprensione dell'omeostasi cervicale, dei meccanismi delle malattie e delle strategie terapeutiche. Tuttavia, le loro differenze intrinseche rispetto alla biologia e alla patologia umana limitano il loro valore traslazionale. In alternativa, gli organoidi sono emersi come potenti piattaforme per modellare la biologia umana e le malattie. Gli organoidi sono microstrutture tridimensionali derivate dalle cellule staminali che riproducono l'istologia e le firme molecolari del loro tessutod'origine 9,10,11. Sono stati impiegati per identificare cellule staminali umane diverse in più tessuti, tra cui trachea, esofago ecervice 12,13,14. Inoltre, gli organoidi permettono la manipolazione genetica, consentendo la modellazione della patogenesi di diverse malattie, inclusi tumori efibrosi 15,16,17. Inoltre, gli organoidi rappresentano una piattaforma efficace per lo screening dell'efficacia e della tossicità di farmaci o terapiecellulari 18,19,20,21.

Recentemente, due gruppi indipendenti hanno stabilito sistemi organoidi cervicaliumani 22,23. Sulla base di questi progressi, abbiamo migliorato significativamente l'efficienza della coltura organoide cervicale e identificato cellule staminali cervicaliumane 13. Inoltre, staccando l'epitelio cervicale, abbiamo minimizzato l'inclusione di fibroblasti sottostanti all'epitelio cervicale. Utilizzando organoidi cervicali con manipolazione genetica, abbiamo scoperto il ruolo dei metaboliti microbici e delle loro vie a valle nel mantenimento dell'omeostasi cervicale e nella prevenzione della progressione precancerosa. Pertanto, un protocollo standardizzato e ottimizzato per generare, mantenere e modificare geneticamente gli organoidi cervicali sarà uno strumento essenziale per studiare la biologia e la patologia cervicale.

In questo articolo presentiamo un protocollo dettagliato e ottimizzato per generare e far passare organoidi cervicali umani. Descriviamo anche un protocollo per la loro manipolazione genetica tramite elettroporazione.

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Protocollo

L'isolamento cellulare e la coltura organoide utilizzando tessuti cervicali umani sono stati approvati e condotti in conformità con tutte le normative etiche pertinenti dai comitati interni di revisione del DGIST, Daegu, Corea, e del Chilgok Kyungpook National University Hospital, Gyeongsangbuk-do, Corea (DGIST-20210401-BR-112-01 e KNUCH-2020-12-020-001). I tessuti ectocervicali umani sono stati forniti dal Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia dell'Ospedale Nazionale Universitario Chilgok Kyungpook. Tessuti cervicali sani sono stati prelevati da pazienti sottoposti a isterectomia laparoscopica totale per le loro malattie uterine benigne. È stato ottenuto il consenso informato da tutti i pazienti.

1. Isolamento unicellulare dai tessuti ectocervicali

NOTA: Questo protocollo inizia con un campione di biopsia dell'ectocervice umana di circa 5 mm × 5 mm × 5 mm di dimensione (Figura 1).

  1. Inserire il tessuto biopsiato in una piastra di Petri da 10 cm e lavarlo una volta con DPBS gelato (senza calcio né magnesio) per rimuovere sangue e detriti.
    NOTA: I tessuti cervicali umani sono stati trasportati in laboratorio entro 3 ore dall'intervento in DMEM/F12 Avanzato gelido e processati immediatamente all'arrivo.
  2. Trasferire il tessuto in un tubo da 1,5 mL contenente 1 mL di soluzione di Dispasi (2,4 U/mL) e incubare per 1 ora a 37 °C con una delicata agitazione su un tubo rotatore (20 giri al minuto).
    NOTA: La soluzione di Dispasi (2,4 U/mL) è stata preparata appena prima dell'uso, dissolvendo la polvere di Dispasi fino alla concentrazione di lavoro in DPBS gelato.
  3. Trasferire il campione in una nuova piastra di Petri da 10 cm. Separare con cura lo strato epiteliale bianco dal resto del tessuto usando una pinza.
  4. Usa pinze affilate per staccare delicatamente la superficie epiteliale come un foglio intatto. Trasferire immediatamente lo strato epiteliale isolato in un tubo conico da 50 mL tenuto sul ghiaccio.
    NOTA: Se l'epitelio superficiale non si stacca facilmente, raschiare la superficie con una pinza a estremità smussata.
  5. Aggiungere 1 mL di una soluzione dissociativa ricombinante a base di tripsina al campione sbucciato o raschiato e trasferire l'intera miscela in un tubo conico da 50 mL.
  6. Tieni il tessuto rimanente del passaggio precedente nell'altro tubo conico da 50 mL.
  7. Incubare il tubo conico da 50 mL contenente epitelio cervicale a 37 °C per 5 minuti con una lieve agitazione su un tubo rotatore (20 giri al minuto).
  8. Aggiungere 10 mL di tampone bloccante fresco e ghiacciato (PBS con siero di vitello bovino al 2% (BCS)) alla sospensione cellulare per fermare la reazione enzimatica.
  9. Centrifuga il tubo a 450 × g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere e scartare con attenzione il soprantagente.
    NOTA: Se il sangue viene osservato visivamente nel tessuto dissociato o il tessuto appare appiccicoso, procedere con il seguente passaggio. Altrimenti, vai al passo 1.13.
  10. Aggiungere 1 mL di buffer di lisi 1X per globuli rossi e 20 μL di DNasi (10 U/μL di stock) al pellet. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti per lisare i globuli rossi e scomporre il DNA appiccicoso.
  11. Aggiungere 10 mL di Blocking Buffer gelato (PBS con siero bovino al 2% (BCS)) alla sospensione cellulare per fermare la reazione enzimatica.
  12. Centrifuga il tubo a 450 × g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere e scartare con attenzione il soprantagente.
  13. Lava la pellet cellulare con il tampone bloccante gelato (PBS con siero per vitelli bovini al 2% (BCS)).
  14. Centrifuga il tubo a 450 × g per 5 minuti. Rimuovere e scartare con attenzione il soprantagente.
  15. Risospendere la pellet cellulare in 200-500 μL di mezzo organoide coltura.
  16. Contare il numero cellulare utilizzando l'emocitometro con soluzione di tripano blu. La resa cellulare attesa è compresa tra 50.000 e 500.000 cellule per campione di biopsia.

2. Semina e coltura dell'organoide ectocervicale

  1. Sospendere 500-2.000 cellule vitali in un volume finale di 50 μL di mezzo di coltura organoide (composizione descritta nella lista dei materiali) in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL. La vitalità cellulare è stata valutata con esclusione del blu di tripano prima della semina.
  2. Aggiungere 50 μL di una matrice di membrana basale (ad esempio, Matrigel) alla sospensione cellulare. Mescola delicatamente sul ghiaccio per evitare la formazione di bolle e dispensa la miscela da 100 μL all'interno di un inserto di coltura cellulare posizionato in una piastra a 24 pozzi. Tutte le procedure che coinvolgevano la gestione della matrice della membrana basale venivano eseguite su ghiaccio o a 4 °C per prevenire la gelificazione prematura, salvo diversa specificazione.
  3. Incubare la piastra per 20-30 minuti a 37 °C finché la miscela matrice-cellula della membrana basale non si solidifica.
  4. Una volta che la miscela si è solidificata, si aggiungono 400 μL di mezzo di coltura organoide al pozzo sotto l'inserto.
  5. Coltivare gli organoidi per 1-2 settimane fino a raggiungere un diametro medio di 150-250 μm (il diametro massimo è circa 500 μm).
    NOTA: Quando gli organoidi raggiungono una dimensione appropriata e mostrano il motivo lamellare concentrico delle microstrutture simili a pelle di cipolla, considera il passaggio se necessario.

3. Dissociazione organoidale e risemina

  1. Aggiungi 1 mL di soluzione di Dispasi (2,4 U/mL) sopra l'inserto di coltura cellulare e dissocia delicatamente la matrice della membrana basale usando una pipetta.
  2. Trasferire la miscela della matrice di membrana dispasata-basale in un tubo da 15 mL e incubare per 1 ora a 37 °C.
  3. Aggiungere 10 mL di tampone bloccante fresco e ghiacciato (PBS con siero di vitello bovino al 2% (BCS)) alla sospensione cellulare per fermare la reazione enzimatica.
  4. Centrifuga il tubo a 450 × g per 5 minuti a 4 °C.
  5. Rimuovere il sovrantantante e risospendere il pellet a 200 μL di TrypLE Express.
  6. Incubare per 5 minuti a 37 °C.
  7. Aggiungi 1 mL di tampone bloccante il freddo (PBS con siero per vitelli bovini al 2% (BCS)) e pipetta delicatamente per neutralizzare l'enzima.
  8. Filtrare la sospensione attraverso un colino a celle da 40 μm per ottenere singole cellule.
  9. Centrifuga il tubo a 450 × g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere e scartare con attenzione il soprantagente.
  10. Risospendere la pellet cellulare in 200-500 μL di mezzo organoide coltura.
  11. Contare il numero cellulare utilizzando l'emocitometro con soluzione di tripano blu. La resa attesa delle celle è compresa tra 50.000 e 500.000 celle per pozzo di inserto di colture cellulari a 24 pozzi.
  12. Poi si risospendono 500-2.000 cellule in 50 μL di mezzo di coltura organoide (composizione descritta nella lista dei materiali). Aggiungere 50 μL di matrice della membrana basale alla sospensione cellulare. Mescola delicatamente, evita la formazione di bolle e dispensa la miscela da 100 μL all'interno di un inserto di coltura cellulare posizionato in una piastra a 24 pozzi.
  13. Incubare la piastra per 20-30 minuti a 37 °C finché la miscela matrice-cellula della membrana basale non si solidifica.
  14. Una volta che la miscela è completamente solidificata (tipicamente dopo 20-30 minuti a 37 °C), aggiungere 400 μL di mezzo di coltura organoide nel pozzo sotto l'inserto.
  15. Coltivare gli organoidi per 1-2 settimane in mezzo di coltura organoidi (composizione descritta nella lista dei materiali) utilizzando un metodo 3D extracellulare incorporato nella matrice. Mantenere le colture a 37 °C, 5% di CO₂ in un incubatore umidificato. Sostituire il mezzo ogni 2-3 giorni e monitorare la crescita finché gli organoidi non raggiungono un diametro medio di 150-250 μm.
  16. Spostare gli organoidi per il prossimo turno quando raggiungeranno una dimensione adeguata e mostrare il motivo lamellare concentrico di microstrutture simili a pelli di cipolla, se necessario.

4. Manipolazione genetica degli organoidi cervicali umani tramite elettroporazione

NOTA: Questo protocollo si basa sull'uso di un Lonza Amaxa 4D-Nucleofector e del kit P4 Primary Cell 4D-Nucleofector X (#V4XP-4032).

  1. Dopo l'isolamento dalla sospensione delle cellule cervicali umane, trasferire 100.000-200.000 cellule a ciascun tubo da 1,5 mL.
  2. Centrifuga i tubi a 450 × g per 3 minuti a 4 °C. Rimuovere e scartare con attenzione il soprantagente.
  3. Risospendere il pellet cellulare in 20 μL della miscela Soluzione/Integratore Nucleofector dal kit P4 Primary Cell 4D-Nucleofector X. La miscela viene preparata combinando 16,4 μL di soluzione nucleofecttrice e 3,6 μL di integratore per provetta.
  4. Aggiungi 300 nM di oligo siRNA di controllo o bersaglio a ciascun tubo contenente le cellule risospese. Mescola delicatamente con la pipetta.
    NOTA: Il volume dell'oligo del siRNA non deve superare i 2 μL per provetta.
  5. Trasferire con cura la miscela di nucleofezione (20 μL di cellule risospese in miscela di soluzione nucleofector/integratore + fino a 2 μL di siRNA; totale 20-22 μL) nei vasi cuvette di elettroporazione provenienti dal kit P4 della cellula primaria 4D-nucleofector X.
  6. Tocca delicatamente i vasi Nucleocuvette per assicurarti che il campione copra il fondo della cuvetta.
  7. Chiudi il coperchio dei Vasi Nucleocuvette e inseriscilo nel contenitore di un'unità 4D-Nucleofector alimentata.
    NOTA: Assicurarsi la corretta orientazione dei vasi nucleocuvette nel contenitore di contenimento.
  8. Avvia il processo di nucleofezione. Imposta il codice impulso EA-125 per ogni cuvette con il processo della cella primaria P4.
  9. Dopo il completamento, rimuovi con cura i vasi Nucleocuvette dal contenitore di sicurezza.
  10. Incubare i vasi nucleocuvette a temperatura ambiente per 10 minuti per permettere alle cellule di stabilizzarsi.
  11. Apri il coperchio dei vasi Nucleocubette, aggiungi 180 μL di mezzo di coltura organoide preriscaldato a 37 °C a ogni cuvetta e trasferisci delicatamente la sospensione cellulare in un nuovo tubo da 1,5 mL per la risospensione.
  12. Prendere un volume di sospensione cellulare contenente 500-2.000 cellule e risospenderlo in un mezzo di coltura organoide fino a un volume finale di 50 μL.
    NOTA: Non scartare le celle rimanenti del passo 4.12. Saranno usati nel passo 4.14.
  13. Coltivare gli organoidi seguendo il protocollo del Metodo 2: Semina e Cultura degli organoidi dell'ectocervice. Confronta gli effetti del siRNA valutando diversi fattori, inclusi il numero, la dimensione e la struttura degli organoidi risultanti.
  14. Distribuire le cellule rimanenti dello step 4.12 in una piastra di attacco ultra-bassa a 96 pozzi e incubare per 48 ore a 37 °C.
  15. Dopo 48 ore, trasferire le celle in un tubo da 1,5 mL e centrifugare a 450 × g per 3 minuti. Scartate il soprannatante.
  16. Utilizzare la pellet cellulare per esperimenti PCR in tempo reale per confermare il knockdown dei geni target e per valutare eventuali cambiamenti nell'espressione genica.
    NOTA: Tutti i tessuti cervicali umani e le sospensioni cellulari dovrebbero essere maneggiati come materiale potenzialmente contagioso. Eseguire tutte le procedure che coinvolgono campioni umani primari in un armadietto di biosicurezza certificato secondo le pratiche BSL-2 e in conformità con le normative etiche e di biosicurezza istituzionali. Indossare dispositivi di protezione individuale adeguati (camice da laboratorio, guanti e protezione oculare) e disinfettare superfici e attrezzature di lavoro dopo l'uso con un disinfettante approvato dall'istituzione. I reagenti enzimatici (ad esempio, enzimi dispasi e dissociatori come TrypLE Express) possono causare irritazione della pelle e degli occhi e possono generare aerosol durante la pipettatura; evitare la generazione di aerosol, tenere i tubetti chiusi quando possibile e risciacquare immediatamente con acqua in caso di contatto, seguendo le procedure di esposizione istituzionale e le indicazioni SDS del produttore. Smaltire tutti i rifiuti biologici (inclusi materiali contenenti matrice e plastiche contaminate) secondo le linee guida istituzionali. Per l'elettroporazione del siRNA, segui le istruzioni di sicurezza elettrica del produttore: assicurati che le cuvette siano correttamente posizionate e che il coperchio sia completamente chiuso prima di iniziare gli impulsi, evita di usare il dispositivo con guanti bagnati o vicino a fuoriuscite, ispeziona il dispositivo e gli accessori per eventuali danni ed evita il contatto diretto con gli elettrodi della cuvetta immediatamente dopo l'impulso.

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Risultati

Cultura organoidale cervicale umana 3D

I tessuti ectocervicali umani appena isolati sono stati dissociati in singole cellule nell'ordine sopra menzionato, che sono poi state placcate sopra inserti di coltura cellulare a 24 pozzi e coltivate per formare organoidi cervicali come descritto in questo protocollo (Figura 1). Gli organoidi cervicali umani crescono fino a 500 μm di diametro da singole cellule in 2 settima...

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Discussione

In questo manoscritto, descriviamo il protocollo per stabilire e far passare organoidi cervicali umani. Forniamo inoltre un protocollo per manipolarle geneticamente, il che avanza significativamente nello studio della biologia e patologia cervicale. Sebbene abbiamo ottimizzato il protocollo specificamente per gli organoidi uterini umani, il nostro protocollo può essere applicato ad altri sistemi organoidi con lievi modifiche.

Le informazioni essenziali per sta...

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Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del Ministero della Salute e del Welfare (RS-2024-00439434 per Y. Jeong).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Kit P4 Nucleofector X per cellule primarieLonzaV4XP-4032
Piastra di attacco ultrabassa a 96 pozziSPL39796
Filtro cellulare 40 & micro; mSPL93040
Tubo conico da 50 mL 500/scatolaSLPSPL50050
Tubo conico da 15 mlSarstedt62.554.502
Tubo CryoPure 1,8 mL - biancoSarstedt72.379P
37 & deg; C, 5% CO2   incubatoreEppendorf9734IQ905476
Inserto per coltura cellulareSPL37024
Amaxa 4D-NucleofectorLonzaAAF-1003X
Buffer di blocco (2% BCS in DPBS)Gibco / WelgeneBCS: 26010074; DPBS: LB001-02
Polvere Dispase IIGibco17105041
DNAse IEnzimomicaM059L
MatrigelCorning356231
Buffer di lisi dei globuli rossiBiosesangR2015
TrypLE ExpressGibco12605
Buffer di lavaggio (HBSS)JBIBL003-1
DMEM/F12 avanzatoGibco12634028
Integratore GlutaMAXGibco35050-061
Penicillina e dash; StreptomicinaBiowestL0022-100
HEPESGibco15630-080
Supplemento B27Gibco17504044
NogginPeproTech118214
N-acetil-l-cisteinaSigmaA9165
Y-27632Tecnologie STEMCELL72307
FGF2PeproTech100-18B-50UG
FGF7PeproTechAF-100-19-250UG
A83-01SelleckchemS7692 
ForskolinSigmaF6886
Neuregulin 1PeproTech100-03-50UG
NGFPeproTechAF-450-01-100UG
R-spondinSinobiologico11083-HNAS
HGFPeprotech100-39H-250ug
FGF10Peprotech100-26
Petridish 35 mm SPL10035
forte>
NomeCompagniaNumero catalogoforte
DMEM/F12 avanzatoGibco12634028
Integratore GlutaMAXGibco35050-0611x
Penicillina e dash; StreptomicinaBiowestL0022-1001x
HEPESGibco15630-08010 mM
Supplemento B27Gibco175040441x
senza vitamina A
NogginPeproTech118214100 ng/ml
N-acetil-l-cisteinaSigmaA91651 mM
Y-27632Tecnologie STEMCELL7230710 uM
FGF2PeproTech100-18B-50UG50 ng/ml
FGF7PeproTechAF-100-19-250UG25 ng/ml
FGF10Peprotech100-26100 ng/ml
A83-01SelleckchemS7692 500 nM
ForskolinSigmaF688610 & mu; M
Neuregulin 1PeproTech100-03-50UG50 ng/ml
NGFPeproTechAF-450-01-100UG20 ng/ml
R-spondinSinobiologico11083-HNAS100 ng/ml
HGFPeprotech100-39H-250ug25 ng/ml

Riferimenti

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