Articolo metodologico

Saggio di serial killing utilizzando la misurazione della vitalità delle cellule tumorali basata su impedenza longitudinale - Un metodo utile per valutare le prestazioni delle cellule T

DOI:

10.3791/69623

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30 dicembre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Clinical Pharmacology, LMU University Hospital, 2Department of General, Visceral and Transplantation Surgery, LMU University Hospital, 3German Cancer Consortium (DKTK), Partner Site Munich, a partnership between the DKFZ and the University Hospital of the LMU, 4German Center for Lung Research (DZL), 5Einheit für Klinische Pharmakologie (EKLiP), Helmholtz Zentrum München - German Research Center for Environmental Health Neuherberg

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo presenta un test in tempo reale basato sull'impedenza per quantificare la capacità e la persistenza della serial killing delle cellule CAR T sotto stimolazione antigenica cronica, incorporando un metodo di lavaggio delle placche per un riutilizzo economico delle piastre di saggio.

Abstract

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La terapia con cellule del recettore antigenico chimerico (CAR) ha rivoluzionato il trattamento di specifiche neoplasie ematologiche. Tuttavia, una parte significativa dei pazienti sperimenta ricadute a causa della perdita di antigeni, della riduzione degli antigeni o dell'esaurimento delle cellule T. Queste sfide evidenziano la necessità di saggi funzionali in grado di valutare la capacità di uccidere e la persistenza delle cellule CAR T sotto stimolazione antigenica cronica. I saggi di serial killing, che misurano la capacità delle cellule CAR T di eliminare ripetutamente i bersagli tumorali, offrono preziose informazioni sulla durata e potenza delle risposte delle cellule CAR T.

Qui presentiamo un saggio basato sull'impedenza utilizzando il sistema di Real-Time Cell Analysis (RTCA) per quantificare in vitro l'omicidio seriale mediato dalle cellule CAR T. Le cellule tumorali vengono ripetutamente inseminate e lasciate aderire alle piastre E specifiche per il saggio prima dell'aggiunta delle cellule T CAR a rapporti effettore-bersaglio (E:T) definiti. La piattaforma monitora continuamente la vitalità delle cellule tumorali senza marcatori, catturando la citotossicità dinamica con alta risoluzione temporale. I valori principali includono la cinetica dell'Indice Cellulare (CI), la tassa di uccisione delle cellule tumorali e la clearance del tempo fino all'obiettivo. Il progressivo declino della capacità di uccidere osservato in ripetuti ingaggi tumorali-bersaglio funge da indicatore della disfunzione acquisita delle cellule CAR T, spesso chiamata esaurimento delle cellule T. Insieme, queste metriche permettono una valutazione precisa della funzione delle cellule CAR T in vari rapporti E:T e consentono il confronto diretto tra diverse costruzioni o co-trattamenti delle cellule CAR T nel tempo.

Per aumentare l'efficienza dei costi, abbiamo sviluppato una procedura di lavaggio dei piatti che consente il riutilizzo delle piastre elettroniche senza compromettere le prestazioni o l'integrità dei dati. Il flusso di lavoro ottimizzato riduce i costi del saggio preservando la robustezza analitica. Questo approccio consente una valutazione preclinica accessibile e scalabile della funzione delle cellule CAR T, facilitando miglioramenti nella progettazione della terapia cellulare.

Introduzione

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La terapia con cellule T con recettore dell'antigene chimerico (CAR) ha rivoluzionato l'immunoterapia oncologica con notevole successo clinico in molteplici neoplasie ematologiche come la leucemia linfoide cronica, la leucemia linfoblastica acuta, il linfoma a grandi cellule B e il mielomamultiplo 1,2,3,4,5. Dalle prime approvazioni regolatorie, il numero di prodotti a cellule CAR T e pazienti trattati è aumentatocostantemente 6. A seconda del prodotto specifico e dell'indicazione clinica, le dosi tipiche di infusione variano da circa 2 × 106a 5 × 108cellule T CAR+ perpaziente 7. Dosi elevate di infusione sono necessarie per ottenere un'efficace eliminazione tumorale e un controllo a lungo termine della malattia, ma sono associate a sfide cliniche e pratiche. Numeri cellulari elevati possono aumentare il rischio di effetti collaterali gravi come la sindrome da rilascio delle citochine (CRS) e la sindrome da neurotossicità associata alle cellule effettori immunitari (ICANS), entrambe dipendenti dalladose 8. Inoltre, produrre un numero sufficiente di cellule CAR T funzionali è una sfida per pazienti fortemente pretrattati o linfodepleti, e il processo può essere logisticamente impegnativo e costoso per i centridi trattamento 9.

Nonostante queste difficoltà, le terapie con cellule CAR T mirate al CD19 raggiungono tassi di remissione completa del 70%-90% nei pazienti con neoplasie recidivanti o refrattarie delle cellule B, dimostrando un impatto clinicotrasformativo 10,11,12. Tuttavia, la terapia con cellule CAR T affronta sfide rilevanti che ne limitano l'efficacia a lungo termine. Gli ostacoli chiave includono la perdita o la riduzione dell'antigene, la persistenza insufficiente delle cellule CAR T e l'esaurimentofunzionale 9. L'esaurimento delle cellule T CAR - caratterizzato da capacità proliferativa ridotta, attività antitumorale compromessa e scarsa persistenza - rappresenta una causa vitale di non risposta ericaduta 13. Le cellule CAR T esaurite presentano una funzione degli effettori ridotta, un'espressione persistente di recettori inibitori e una produzione difettosa di citochine dovuta all'esposizione cronica agli antigeni e ai microambienti tumoraliimmunosoppressivi 14. Studi clinici hanno dimostrato che la perdita della persistenza funzionale delle cellule CAR T è associata a un aumento del rischio diricaduta 11,15,16,17. Poiché un'attività in vivo prolungata sembra essere un importante indicatore di successo terapeutico, comprendere la durabilità e la capacità di uccidere sostenuta dei prodotti a cellule CAR T è un obiettivo importante sia nella ricerca preclinica che traslazionale. Di particolare interesse è la capacità delle cellule T CAR di riconoscere e lisare ripetutamente le cellule tumorali per lunghi periodi - la cosiddetta 'serial killing' - poiché questa proprietà fornisce una misura funzionale di persistenza e resistenzaall'esaurimento 18.

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per eseguire saghi di serial killing utilizzando la piattaforma di impedenza xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA), inclusa una procedura di lavaggio opzionale che consente il riutilizzo delle piastre di saggio, note anche come piastre E, migliorando così l'efficienza dei costi senza compromettere le prestazioni del saggio. La motivazione per sviluppare un tale protocollo deriva dalle limitazioni dei saghi convenzionali di citotossicità, che tipicamente offrono solo letture statiche e di endpoint. Approcci comuni, come il rilascio del cromo-51, i saggi di lattato deidrogenasi (LDH) o i saggi di vitalità basati su citometria di flusso richiedono etichette, richiedono flussi di lavoro intensivi e sono limitati a punti temporalidefiniti 18,19. Ancora più importante, non riescono a catturare facilmente la cinetica dinamica di uccisione durante stimolazioni prolungate o più cicli di esposizione ad antigeni, una situazione direttamente collegata alla persistenza delle cellule CAR T e all'esaurimentofunzionale 18.

La piattaforma xCELLigence RTCA colma queste lacune fornendo un monitoraggio cinetico, senza etichettatura e in tempo reale, della vitalità della cella target tramite impedenzaelettrica 20. Le cellule target tumorali aderenti vengono inserite su piastre E rivestite di microelettrodi d'oro, dove il loro attacco e proliferazione aumentano l'impedenza misurata, riportata come Indice Cellulare (CI)21. Con l'uccisione mediata da CAR T, le cellule bersaglio vengono uccise e si staccano, portando a un rapido calo dell'impedenza20. Questa lettura in tempo reale consente una valutazione continua della citotossicità per ore o giorni senza la necessità di ulteriori etichette oreagenti 22. Le cellule T CAR, essendo non aderenti, non contribuiscono al segnale di impedenza, permettendo una separazione netta tra letture di effettore ebersaglio 23. Poiché i dati vengono registrati in modo continuo, i ricercatori possono condurre protocolli di stimolazione a più round in cui le cellule CAR T vengono ripetutamente trasferite ed esposte a nuove cellule tumorali bersaglio, consentendo una misurazione diretta di come evolve la capacità di uccidere neltempo 24. Questo imita gli incontri ripetuti con l'antigene che le cellule CAR T sperimentano in vivo e fornisce una lettura funzionale delle loro capacità citotossiche.

Questo saggio di serial killing basato sull'impedenza è ideale per ricercatori che valutano la funzione delle cellule CAR T in contesti preclinici, inclusa ottimizzazione dei costrutti, confronti funzionali e test di potenza. Questo protocollo richiede il sistema xCELLigence RTCA e l'uso della E-Plate 96. Sebbene ampiamente applicabile a modelli tumorali aderenti, non è direttamente adatto alle colture in sospensione senza strategie di immobilizzazione o ancora. Poiché le misurazioni di impedenza da sole riflettono solo l'aderenza e la vitalità della cellula bersaglio, si raccomandano analisi complementari come la citometria a flusso o i saggi sulle citochine per caratterizzare completamente l'attivazione, la proliferazione e la dinamica di esaurimento delle cellule CAR T. Il protocollo include passaggi designati che permettono il prelievo di cellule e sopranattivi per queste letture aggiuntive, consentendo una valutazione più completa della funzionalità delle cellule CAR T.

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Protocollo

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NOTA: Questo protocollo è stato ottimizzato per l'E-Plate 96 e richiede il sistema xCELLigence RTCA. Le cellule tumorali aderenti vengono seminate durante la notte in anticipo per raggiungere la fase di crescita logaritmica al momento dell'aggiunta delle cellule CAR T. A seconda della linea cellulare tumorale e della densità di semina, questo intervallo può essere ridotto a 6-9 ore, permettendo l'aggiunta di effettori nello stesso giorno. Se viene eseguito quest'ultimo flusso di lavoro, la timeline nominale giorno per giorno descritta nel protocollo viene modificata e gli utenti dovrebbero adattare di conseguenza il programma. Le cocolture vengono mantenute per 48 ore prima che le cellule CAR T vengano trasferite su cellule tumore appena placcate, richiedendo due posizioni di piastra sullo strumento xCELLigence e un'aggiunta alternata di placcatura cellulare tumorale ed aggiunta di effettori a giorni alterni. Le cellule CAR T dovrebbero essere generate secondo i SOP istituzionali o protocolli stabiliti. In breve, le cellule T del sangue periferico vengono isolate secondo standard etici approvati, trasdotte in condizioni di biosicurezza appropriate e valutate per efficienza e vitalità della trasduzione tramite citometria di flusso o saghi QC equivalenti. I saggi xCELLigence non devono essere eseguiti quando l'efficienza di trasduzione CAR è inferiore al 20%, poiché efficienze inferiori possono portare a un aumento della morte di fondo e inspecifica da parte delle cellule non trasdotte, che possono distorcere le curve di crescita tumorale. Tutte le manipolazioni delle celle devono essere eseguite in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare. I mezzi possono essere utilizzati secondo gli standard del laboratorio o come raccomandato dal fornitore. Salvo diversa specificazione, le cellule vengono incubate a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂. Sebbene ottimizzato per le cellule T CAR, questo metodo può essere applicato anche ad altre celle effettori basate sulla sospensione e a bersagli aderenti.

1. Preparazione e blanking (Giorno 1)

  1. Preparazione del piatto
    1. Aggiungere 50 μL di mezzo tumorale sul fondo di ogni pozzetto della piastra E 96.
      NOTA: Fai attenzione a non graffiare il fondo del pozzo perché potrebbe danneggiare la placca.
    2. Posizionare la piastra E nell'incubatrice, posizionandola sulla stessa fessura per la macchina da utilizzare per le misurazioni.
    3. Incubare la piastra elettronica per 30 minuti a 37 °C per portarla alla temperatura e al pH appropriati.
  2. Configurazione degli strumenti
    1. Nel frattempo, avvia RTCA Software Pro (Versione 2.6.1) e seleziona un percorso file per salvare l'esperimento.
    2. Inserisci il nome dell'esperimento nel campo "RTCA Operator" e salva.
    3. Seleziona i pozzi da misurare.
    4. Assegna i nomi delle cellule nella scheda Cellule e i tipi di trattamento nella scheda Trattamento .
  3. Programma di misurazione
    1. Imposta il programma con i seguenti passaggi:
      Nome Passo = Vuoto ; Sweep = 1 ; intervallo = 1 ; Durata = 0:00
      Nome Passo = Cellule Tumorali ; Sweep = 250-300 ; Intervallo = 15 min; Durata = minimo 24 ore
      Nome Passo = Trattamento ; Sweep = fino a 2500 ; Intervallo = 5 min; Durata = minimo 72 h
    2. Premi Applica e assicurati che Auto non venga selezionato per nessun passaggio.
  4. Passaggio di svuotamento
    1. Dopo i 30 minuti di incubazione della piastra E a 37 °C, premi il modulo PLAY/RUN per iniziare il passaggio vuoto.
    2. Aspetta che il software segni il passaggio FATTO (circa 1-2 minuti).
    3. Sblocca la culla e rimuovi la piastra E solo quando sei pronto a procedere con la semina delle celle.

2. Round 1: Semina delle cellule tumorali (Giorno 1)

  1. Semina delle cellule tumorali
    1. Prepara una sospensione di cellule tumorali in 50 μL di mezzo appropriato per pozzo.
    2. Rimuovere la piastra E dall'incubatrice e seminare le cellule in triplice.
  2. Misurazione iniziale
    1. Riporta immediatamente la piastra E alla macchina e blocca la culla.
    2. Aspettare 5-10 minuti prima della prima misurazione per bilanciare la temperatura e il pH della piastra E, poi cliccare sul pulsante PLAY/RUN per iniziare la misurazione (Passo 2 del programma = Cellule Tumorali).
    3. Incubare la piastra E durante la notte per consentire l'adesione cellulare. Monitorare l'Indice Cellulare (IC) non normalizzato. Quando l'IC entra nella fase di crescita logaritmica, si procede al passo successivo. Questa fase dipende dalla linea cellulare utilizzata e può essere influenzata dal numero di cellule seminate. Le celle BxPC3 (ATCC CRL-1687) sono state seminate a 20.000 cellule per pozzo, con una crescita in fase logaritrica tipicamente raggiunta dopo 6-18 ore.

3. Round 1: trattamento delle cellule T CAR (Giorno 2)

  1. Preparazione e semina delle cellule T
    1. Preparare il numero richiesto di cellule CAR T in 100 μL/pozzetto in un mezzo umano di cellule T senza citochine di espansione (ad esempio IL-2, IL-7, IL-15 ecc.).
      NOTA: L'efficienza di trasduzione CAR viene misurata una volta all'inizio dell'esperimento. Il rapporto effettore-bersaglio desiderato (E:T) è stabilito in base al numero di cellule T CAR⁺ rispetto alle cellule tumorali inizialmente placcate. Ad esempio, per un rapporto E:T 1:1 con il 50% di cellule T CAR⁺ e 20.000 cellule tumorali BxPC3, dovrebbero essere placcate 40.000 cellule T totali. Il rapporto E:T si riferisce quindi alla condizione iniziale all'inizio del saggio di omicidio seriale; a meno che non vengano effettuate ulteriori misurazioni, le variazioni di E:T durante i round successivi rimangono sconosciute. I cambiamenti nella proliferazione o nella sopravvivenza delle cellule T nel tempo, e quindi nel rapporto E:T, sono considerati parte della lettura delle uccisioni seriali. Se le cellule T vengono divise tra i round, l'E:T viene ricalcolato proporzionalmente (ad esempio, una divisione 1:1 dopo il round 3 riduce un E:T iniziale 2:1 a 1:1 per il round 4). Se la dinamica E:T tra i proiettili è di interesse, possono essere placcati pozzi aggiuntivi opzionali per misurazioni intermedie della percentuale CAR o della funzione dell'effettore. La rimozione delle sfere di stimolazione anti-CD3/CD28 tramite separazione magnetica può aiutare a ridurre l'uccisione inspecifica. Si raccomanda inoltre di utilizzare le cellule T nella fase di crescita logaritmica (tipicamente tra 5 e 20 giorni dopo la stimolazione) e di espandere le cellule con citochine almeno due giorni prima del saggio, anziché il giorno prima.
    2. Regolare l'efficienza della trasduzione CAR tra i gruppi sperimentali alla percentuale comune più bassa mescolando con cellule T non trasdotte, basandosi sull'analisi dell'efficienza di trasduzione.
      NOTA: Se tutti i gruppi hanno la stessa efficienza di trasduzione, non è necessario alcun aggiustamento. Se le percentuali di CAR⁺ differiscono, il numero di cellule T da placcare viene calcolato in modo che ogni gruppo inizi con lo stesso numero effettivo di celle CAR⁺ e celle CAR. Questo avviene moltiplicando il numero desiderato di cellule CAR⁺ (basato sul rapporto E:T e sulla semina tumorale) per 100 e dividendo per la percentuale misurata di CAR⁺ per ogni gruppo, quindi aggiungendo le cellule T non trasdotte se necessario per corrispondere al numero totale di cellule T. Ad esempio, se un gruppo ha il 50% di cellule T CAR⁺, 40.000 cellule T vengono placcate (20.000 CAR⁺ + 20.000 CAR-), mentre un gruppo con il 60% di cellule T CAR⁺ placcherebbe 33.333 cellule T per fornire 20.000 cellule CAR⁺, aggiungendo 6.667 cellule T non trasdotte per corrispondere al numero totale di cellule T del primo gruppo (totale 40.000).
    3. Opzionalmente, se si vuole studiare il trattamento con citochine o composti, si aggiungono 20 μL di una soluzione composta da mezzo di cellule T umane e dalla citochina o composto desiderato a 11 volte la concentrazione finale prevista. Questo volume viene aggiunto sopra i 200 μL standard già presenti in ogni pozzo (50 μL per il blanking, 50 μL per l'inseminazione delle cellule tumorali e fino a 100 μL per l'aggiunta di cellule T). Secondo il produttore, l'E-Plate 96 supporta un volume massimo di 243 μL ± 5 μL per pozzo, rendendo un volume totale di 220 μL accettabile per trattamenti opzionali di questo tipo.
  2. Semina e misurazione delle cellule T
    1. Rimuovere la piastra E sbloccando la culla solo quando è pronto ad aggiungere cellule T.
    2. I semi hanno preparato le cellule T direttamente sulle cellule tumorali.
    3. Blocca la culla all'interno del dispositivo di misura e annulla il Passaggio 2 nel software RTCA.
      NOTA: Se il passaggio 2 non viene abortito, il sistema continuerà a misurare il passaggio precedente e si fermerà solo quando quel passaggio sarà completato, il che comporta la perdita di punti dati.
    4. Aspetta che il Passo 2 venga segnato FATTO.
    5. Clicca sul pulsante PLAY/RUN per iniziare il passo 3 (Trattamento) e conferma il prompt cliccando OK.
      NOTA: Consentire un periodo di equilibrio di 15-30 minuti dopo la maneggiatura (ad esempio, dopo la semina o il trasferimento delle celle) prima di iniziare il passo successivo di misurazione (prima del passo 3.2.5) aiuta a minimizzare la deviazione iniziale causata da fluttuazioni di temperatura o pH nelle curve di crescita.

4. Round 2: Semina delle cellule tumorali (Giorno 3)

  1. Preparare una nuova piastra E xCELLigence a 96 pozzi come descritto nei passaggi 1.1 e 1.4.
  2. Seme di cellule tumore fresche come descritto nel passo 2.
  3. Incubare la piastra E durante la notte per consentire l'adesione cellulare.

5. Round 2: Trasferimento delle cellule T CAR alla seconda piastra E (Giorno 4)

  1. Trasferire il contenuto di ciascun pozzo in un pozzetto corrispondente di una piastra a 96 pozzi a U-bottom utilizzando una pipetta multicanale. Fai attenzione a non toccare gli elettrodi nella parte inferiore della piastra E.
  2. Centrifuga a temperatura ambiente, 400 × g per 5 minuti.
  3. Aspirare con cura il soprantantante e trattenerlo per il test immunosorbente legato agli enzimi (ELISA) se necessario.
  4. Risospendere la pellet cellulare in 100 μL di mezzo fresco senza citochine di espansione.
    NOTA (opzionale): Le cellule T possono ora essere smembrate (ad esempio, 50 μL = 1:2) e utilizzate per ulteriori analisi, come la citometria a flusso. La divisione delle cellule T si aggiusta per la loro proliferazione durante il saggio di uccisione xCELLigence. Aiuta a ridurre il numero necessario di cicli finché non diventa evidente la stanchezza. Si consiglia di testare i rapporti di divisione tra 2 e 4.
  5. Aggiungere 100 μL/cellule T al secondo ciclo di cellule T al secondo ciclo tumorale (50 μL se suddiviso 1:2), assicurando che il mezzo e, se applicabile, le citochine/composti siano completamente riforniti.

   

6. Continuazione del saggio sull'omicidio seriale (giorni 5 - 10 e oltre)

  1. Ripeti i passaggi 4 e 5 per ulteriori round di uccisioni secondo necessità con intervalli di 48 ore.
  2. Monitorare l'attività di uccisione e la persistenza delle cellule T in ogni stadio utilizzando letture xCELLigence e saggi supplementari come ELISA o citometria a flusso.

7. Raccolta dati e gestione delle piastre elettroniche

  1. Dopo la durata di misurazione desiderata, premi STOP nel software.
  2. Esportare dati normalizzati al punto temporale di aggiunta della cella effettore e non mediati per consentire una tracciatura accurata della media ± SEM nel software di analisi (R, GraphPad Prism, ecc.). Esporta il dataset mediato se lo desideri.
  3. Sblocca e rimuovi la piastra E. Rilascia l'esperimento nel software.
  4. Pulire o conservare la piastra E nell'incubatore per ulteriori analisi (ad esempio, soprantantante per ELISA o raccolta cellulare per citometria a flusso).

8. Opzionale: lavaggio delle piastre elettroniche per il riutilizzo

NOTA: Questo passaggio opzionale consente il riutilizzo delle piastre E xCELLigence per ridurre i costi sperimentali. Il riutilizzo è raccomandato solo se le proprietà elettriche della piastra E rimangono stabili durante gli esperimenti e finché i singoli pozzi non rientrano nell'intervallo di base accettabile. Segui tutte le procedure di sicurezza, soprattutto quando manipolassi l'idrossido di sodio (NaOH). Ispezionare visivamente le piastre E dopo il lavaggio per rilevare eventuali difetti negli elettrodi.

  1. Scartare tutto il contenuto della piastra E senza toccare il fondo della piastra E.
  2. Lavare ogni pozzo tre volte con acqua deionizzata da 200 μL.
  3. Aggiungi 200 μL di 0,1 M NaOH a ciascun pozzo.
    ATTENZIONE: NaOH è corrosivo. Assicurati che vengano seguite le linee guida locali sulla sicurezza. Indossa guanti, cappotto e occhiali di sicurezza. Maneggia 1 M NaOH in un armadietto di sicurezza. Getta i rifiuti di NaOH nel lavandino con l'acqua che scorre per garantire una corretta diluizione. Mai mescolare acidi e basi concentrate. Non aggiungere acqua all'acido; Solo acido all'acqua.
  4. Incubare la piastra E a temperatura ambiente per 5 minuti.
  5. Lava ogni pozzo almeno tre volte con acqua deionizzata, assicurandoti che tutti i residui di NaOH vengano rimossi.
  6. Asciuga la piastra E tamburellandola delicatamente su un foggietto, seguita dall'asciugatura all'aria.
  7. Sterilizza la piastra E sotto luce UV all'interno di un armadietto di biosicurezza per almeno 1 ora o un dispositivo di irradiazione UV.
    NOTA: Posiziona la piastra E in modo che i pozzi siano rivolti direttamente verso l'alto. La luce UV non penetra i fondi dei pozzi in plastica.

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Risultati

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L'esecuzione efficace del protocollo produce letture riproducibili basate su impedenza che riflettono la vitalità delle cellule tumorali e la citotossicità delle cellule CAR T nel tempo. La crescita cellulare e la citotossicità sono state valutate utilizzando il sistema commerciale RTCA. I dati sono stati espressi come indice cellulare normalizzato (NCI), calcolato dividendo l'IC in ogni momento temporale per l'IC in un tempo di normalizzazione selezionato. Il tempo di normalizzazione è impostato immediatamente prima del...

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Discussione

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Questo protocollo descrive un metodo per valutare la citotossicità mediata dalle cellule CAR T su più cicli di esposizione antigenica utilizzando la piattaforma xCELLigence RTCA. Consentendo la misurazione longitudinale della vitalità delle cellule tumorali tramite impedenza, questo approccio cattura le risposte citotossiche ripetitive – chiamate serial killing – in un formato continuo e senza etichetta. Il protocollo è progettato per monitorare come la funzione degli effettori delle cel...

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Dichiarazioni

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SK ha ricevuto onorari da Plectonic, TCR2 Inc., Miltenyi, Galapagos, Cymab, Novartis, Regeneron, BMS e GSK. SK è inventore di diversi brevetti nel campo dell'immuno-oncologia. SK ha ricevuto le tasse di licenza da TCR2 Inc e Carina Biotech. SK ha ricevuto supporto alla ricerca da TCR2 Inc., Tabby Therapeutics, Catalym GmbH, Plectonic GmbH e Arcus Bioscience per lavori non correlati al manoscritto. Tutti gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

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TT, SM e NTTN hanno ricevuto sovvenzioni dalla Else-Kröner Fresenius Stiftung (IOLIN). NTTN ha ricevuto ulteriori sovvenzioni dalla Friedrich-Baur-Stiftung e dalla German Cancer Aid (AvantCAR.de). MPT è sostenuto dalla Monika Kutzner Foundation e dal Consiglio Europeo della Ricerca (MSCA Fellowship 101106951). SK è supportata dal programma internazionale di dottorato 'i-Target: immunotargeting of cancer' (finanziato dalla Rete d'Élite della Baviera), dal Centro Bavarese di Ricerca sul Cancro (BZKF) (TANGO a S.K.), dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, numero di borsa: KO5055-2-1 e KO5055/3-1), dalla Melanoma Research Alliance (numero di borsa 409510), dalla Marie Sklodowska-Curie Training Network for Optimizing Adoptive T Cell Therapy of Cancer (finanziata dal programma Horizon 2020 dell'Unione Europea; sovvenzione 955575). Rete di formazione Marie Sklodowska-Curie per il monitoraggio e il controllo delle cellule immunitarie terapeutiche nel cancro (finanziata dal Programma Horizon dell'UE, borsa 101168810), Else Kröner-Fresenius-Stiftung (IOLIN), German Cancer Aid (AvantCAR.de), Wilhelm-Sander-Stiftung, Ernst Jung Stiftung, Strategia Istituzionale LMUexcellent della LMU Monaco (nell'ambito dell'Iniziativa Tedesca per l'Eccellenza), l'Iniziativa Go-Bio, il m4-Award del Ministero bavarese per gli Affari Economici, Bundesministerium für Bildung und Forschung, il Programma EUROSTAR, il Consiglio Europeo della Ricerca (Starting Grant 756017, PoC Grant 101100460 e CoG 101124203), dalla SFB-TRR 338/1 2021-452881907, dalla Fondazione Fritz-Bender, dalla Deutsche José Carreras Leukämie Stiftung, dalla Fondazione Hector, dalla Fondazione Bavarese per la Ricerca (BAYCELLATOR), dalla Fondazione Monika-Kutzner, dalla Fondazione Bruno e Helene Jöster (360° CAR), dalla Fondazione Dr. Rurainski e dalla Fondazione Brigitte e Dr. Konstanze Wegener

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BxPC3ATCCCRL-1687
E-Plate 96Agilent 300600910
RTCA software Pro (Basic) Agilent N/AVersione 2.6.1
xCELLigence RTCA MP - (Placche multiple)Agilent N/A

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  3. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).
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