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Articolo di ricerca
L'esposizione a PM2.5 induce un danno testicolare ritardato nei modelli di ratto attraverso risposte infiammatorie sostenute, aumento dell'apoptosi delle cellule germinali, ridimensionamento di Connexin-43/Occludin e segnalazione coerente con l'attivazione della via JNK, evidenziando la minaccia a lungo termine per la salute riproduttiva maschile.
Il particolato fine (PM2.5) è sempre più implicato nella compromessa riproduttiva maschile. Tuttavia, poiché la maggior parte delle ricerche rimane focalizzata su dati acuti, ritardati, persistenti o progressivi i danni post-esposizione — critici per la valutazione del rischio a lungo termine — restano poco compresi. Abbiamo stabilito un modello di ratto risolto nel tempo per determinare se il danno persiste o peggiora dopo l'esposizione. Settantadue maschi di ratti Sprague-Dawley sono stati randomizzati in nove gruppi (controllo; veicolo a 24 ore, 1, 2 e 4 mesi; PM2,5 negli stessi momenti) e ha ricevuto PM2,5 intranasale a 5 mg/kg/giorno per 7 giorni. Abbiamo quantificato la qualità degli spermatozoi e gli indici degli organi riproduttivi, esaminato l'istologia e l'ultrastruttura testicolare, misurato testosterone sierico, FSH, LH ed E2, profilato gli mRNA delle citochine infiammatorie (IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ, valutato l'apoptosi germinale tramite TUNEL e valutato proteine giuntali e legate allo stress (Connexin-43, Occludin, JNK). L'esposizione a PM2.5 ha portato a cali sostenuti della concentrazione e motilità degli spermatozoi, insieme a un aumento delle malformazioni e dell'atrofia testicolare ed epididimale che non si è ripresa nei 4 mesi post-esposizione. L'istologia ha mostrato un progressivo assottigliamento dell'epitelio seminifero e una degenerazione ultrastrutturale. Era evidente anche una disordinazione endocrina, con riduzione del testosterone e gonadotropine alterate. Meccanicamente, l'esposizione a PM2.5 ha mantenuto un'espressione elevata di IL-1β e IL-6, ha promosso l'apoptosi delle cellule germinali e ha ridimensionato Connexin-43 e Occludin, mostrando al contempo schemi coerenti con l'attivazione della via JNK. Insieme, questi risultati dimostrano una tossicità testicolare ritardata e progressiva dopo la fine dell'esposizione a PM2.5 e suggeriscono che preservare l'integrità giuntale e mirare al JNK può mitigare i danni riproduttivi a lungo termine.
PM2.5, una miscela complessa di particolato fine con un diametro aerodinamico di ≤2,5μm, ha origine dalle emissioni industriali, dai gas di scarico dei veicoli e dalla combustione della biomassa, ed è emersa come un importante inquinante ambientaleglobale 1. Studi epidemiologici collegano l'esposizione a PM2.5 a malattie respiratorie ecardiovascolari 2, così come a compromessi del sistemariproduttivo 3. L'impatto sulla fertilità maschile è particolarmente preoccupante a causa delle evidenze che l'inquinamento atmosferico può ridurre la qualità dellospermatozoo 4. I fattori maschili contribuiscono a oltre la metà dei casi di infertilità a livello globale, e diversi studi riportano cali significativi nei parametri degli spermatozoi negli ultimi decenni5. Analisi globali recenti confermano ulteriormente un calo diffuso della qualità dello spermatozoo in piùregioni 6. Sebbene fattori come fumo, uso di alcol, radiazioni ed esposizione a sostanze chimiche siano rischiconsolidati 7, il PM2.5 è emerso come un tossico riproduttivo aggiuntivo che colpisce itesticoli 8.
I testicoli sono altamente sensibili ai tossici ambientali grazie alla loro struttura fisiologica unica e all'attività spermatogenica continua. Ricerche precedenti hanno indicato che l'esposizione a PM2.5 può indurre danni ai testicoli attraverso molteplici percorsi, come stress ossidativo, risposte infiammatorie e alterazione della barrieraemato-testicologene 9. Questi effetti acuti sono caratterizzati da una riduzione della qualità degli spermatozoi, istologia testiculare anomala e squilibriormonali 10. Tuttavia, la maggior parte degli studi si concentra sulle lesioni immediate, lasciando gli effetti a lungo termine o ritardati poco caratterizzati.
I modelli attuali di esposizione a PM2.5 presentano limitazioni intrinseche: l'inalazione a tutto il corpo imita l'esposizione naturale ma richiede attrezzature specializzate e manca di precisione didosaggio 11, mentre l'instillazione intratracheale garantisce il controllo della dose ma è invasiva e non replica la deposizione fisiologicadi particelle 12. Il nostro modello intranasale a risoluzione temporale evita questi svantaggi: la sua somministrazione non invasiva si allinea con i modelli di deposizione delle vie respiratorie superiori, consente un controllo preciso della dose e supporta il campionamento a lungo termine multi-punti temporali per catturare lesioni ritardate, che superano la capacità dei modelli tradizionali focalizzati sugliacuti 13.
La nostra dose di 5 mg/kg/giorno di PM2.5 si allinea con i paradigmi di esposizione subacuta ai roditori dimostrati per suscitare risposte riproduttive e, tramite conversione della superficie corporea, approssima una dose equivalente umana ~6 volte superiore rispetto allo standard ambientale per accelerare manifestazioni di tossicitàa lungo termine 14. Si applicano considerazioni di specie: sebbene i ratti condividano la fisiologia testiculare conservata con gli esseri umani, il loro ciclo spermatogenico più breve può accelerare la progressione del danno osservata nei nostri15 punti temporali, e la consegna intranasale differisce dal deposito delle malattie respiratorie inferiori umane, anche se la diffusione sistemica di tossine ai testicoli è confermata.
Gli effetti ritardati dell'esposizione a sostanze tossiche ambientali sono fondamentali per valutare i rischi riproduttivi a lungo termine, poiché possono rivelare danni irreversibili non evidenti nelle osservazioni a brevetermine 16. Ad esempio, alcuni tossici possono causare lesioni latenti ai testicoli, che si manifestano o peggiorano gradualmente nel tempo, anche dopo che l'esposizione si interrompe, potenzialmente portando a una disfunzione riproduttivacronica 17. Data l'ubiquità e la persistenza del PM2.5, determinare se la sua tossicità riproduttiva continua o peggiora dopo l'esposizione è fondamentale18.
Infiammazione sostenuta, stress ossidativo e meccanismi di riparazione compromessi sono possibili fattori che causano effetti ritardati. La regolazione all'alza indotta da PM2.5 di IL-1β, IL-6 e TNF-α può mantenere l'infiammazione cronica, interrompere la spermatogenesi e promuovere l'apoptosi dellecellule germinali 19. Il danno a proteine chiave della giunzione, come Connexin-43 e Occludin, compromette la barriera emato-testicolo e può impedire il recuperofunzionale 20. L'attivazione della via della chinasi C-Jun N-terminale (JNK), un mediatore dello stress e della segnalazione apoptotica, è stata anch'essaimplicata 21.
Nonostante il crescente riconoscimento della tossicità riproduttiva del PM2.5, esiste una significativa lacuna di conoscenza riguardo alle dinamiche temporali del danno testicolare dopo la cessazione dell'esposizione. In particolare, resta incerto quanto a lungo persistano le lesioni testicolari, se peggiorino nel tempo e quali vie molecolari alimentino questi effettiritardati 22. Affrontare queste domande è fondamentale per sviluppare strategie preventive e terapeutiche mirate per mitigare i danni riproduttivi maschili indotti da PM2.5.
Rimangono lacune significative riguardo alla durata, alla progressione e ai meccanismi della lesione testicolare indotta da PM2.5 dopo la cessazione dell'esposizione. Questo studio affronta queste lacune valutando gli endpoint riproduttivi; istopatologia; profili ormonali—in particolare l'ormone follicolo-stimolante (FSH), l'ormone luteinizzante (LH) ed estradiolo (E2); infiammazione; apoptosi; e l'espressione della proteina barriera in più momenti dopo l'esposizione. I risultati forniscono una panoramica sui rischi riproduttivi a lungo termine del PM2.5 e informano le strategie di salute pubblica per proteggere la fertilità maschile.
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Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con le normative istituzionali e sono state approvate dal Comitato Etico Animale del Fujian Health College (Approvazione del Progetto n.: DW2024-01).
Sicurezza e rifiuti pericolosi
Reagenti tossici come formalina, osmio, tetrossido e cloroformio sono stati maneggiati in una cappa elettrica certificata indossando l'attrezzatura di protezione individuale appropriata. I rifiuti organici alogenati e le soluzioni contenenti osmio venivano raccolti in contenitori designati e smaltiti secondo i requisiti istituzionali. Il pentobarbital sodio è stato registrato come sostanza controllata e i taglienti sono stati maneggiati in sicurezza durante tutto lo studio.
Materiale e manipolazione PM2.5
Per il dosaggio veniva utilizzato un materiale di riferimento standard PM2.5. Seguendo procedure consolidate di preparazione delle particelle, la polvere secca è stata sospesa in PBS sterile alla concentrazione richiesta e sonicata in un bagno d'acqua per 10-15 minuti immediatamente prima dell'uso, senza tensioattivo. Le sospensioni di lavoro venivano preparate ogni giorno fresche. I livelli di endotossine sono stati valutati tramite il test del lisato di amoebociti di limulus e sono risultati non rilevabili. Quando necessario, sono stati inclusi i controlli polimyxin-B per escludere gli effetti guidati da LPS.
Costruzione di modelli animali in vivo
Settantadue maschi di ratti Sprague-Dawley con SPF (2 mesi, 190 ± 10 g) sono stati ospitati in condizioni standard e randomizzati in nove gruppi (n = 8 per gruppo), costituiti da un gruppo di controllo, gruppi di veicoli campionati a 24 ore, 1, 2 e 4 mesi, e gruppi esposti a PM2,5 negli stessi momenti. PM2.5 è stato somministrato per via intranasale a 5 mg∙kg-1∙day-1 in 10-20 μL per naris sotto anestesia leggera di isoflurano una volta al giorno per 7 giorni. Dopo la somministrazione, i ratti sono stati messi in posizione supina per 1-2 minuti per facilitare l'inalazione. Gli animali venivano mantenuti fino all'eutanasia nei momenti designati dopo l'esposizione, e la massa corporea veniva registrata per i calcoli dei coefficienti degli organi. Gli endpoint includevano coefficienti d'organo, qualità degli spermatozoi, istologia e ultrastruttura, ormoni riproduttivi sierici e saggi molecolari.
Morfologia degli organi riproduttivi e valutazione della qualità dello spermatozoo
Testicoli ed epididimi sono stati dissezionati sotto anestesia pentobarbital profonda, sottoposti a lavaggio e pesati per calcolare i coefficienti degli organi. Gli spermatozoi sono stati raccolti dall'epididimo della cauda tritando in tampone preriscaldato a 37 °C. La concentrazione è stata determinata utilizzando un emocitometro. La motilità è stata valutata esaminando almeno 200 spermatozoi su cinque o più campi non sovrapposti su vetrine preriscaldate. La morfologia è stata valutata dopo fissazione, spalmatura e colorazione con eosina-nigrosina o Diff-Quik, con almeno 200 spermatozoi per ratto. Tutte le valutazioni sono state cieche e le repliche tecniche sono state mediate per ottenere un valore per ogni animale.
Analisi istologica e ultrastrutturale del tessuto testicolare
I testicoli sono stati fissati in formalina tamponata al 10% di neutro, processati tramite etanolo e xilene gradati, incorporati nella paraffina e sezionati a 5 μm per la colorazione con HE. Le sezioni colorate sono state valutate utilizzando campionamento casuale sistematico, con esclusioni applicate per tagli obliqui, artefatti o scarsa fissazione. I diametri dei tubuli venivano calcolati da assi ortogonali e lo spessore epiteliale veniva misurato in punti equidistanti. Le analisi sono state cieche e sono stati valutati almeno 10 tubuli per ratto.
Per il TEM, piccoli blocchi tissutali sono stati fissati nel glutaraldeide, post-fissati nel tetrossido di osmio, disidratati, infiltrati con resina e polimerizzati. Le sezioni ultrasottili sono state colorate con acetato di uranile e citrato di piombo e fotografate a 60-120 kV con impostazioni costanti. La QC includeva la valutazione dell'integrità della membrana e del mitocondrio e l'evitamento di artefatti di estrazione.
Saggio immunoenzimatico legato (ELISA)
Il sangue è stato raccolto dall'aorta addominale sotto anestesia entro una finestra mattutina fissa per controllare la variazione circadiana. Dopo coagulazione e centrifugazione, il siero veniva allicitamente rimosso e conservato a −80 °C. Testosterone, FSH, LH ed E2 sono stati quantificati utilizzando una piattaforma immunotestificata validata. I campioni venivano eseguiti in duplicata con controlli appropriati e la precisione del test rispettava le specifiche della piattaforma. Sono stati esclusi campioni emolizzati o lipemi.
Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR)
L'RNA totale è stato estratto dal tessuto testicolare utilizzando fenolo-cloroformio e purificato tramite precipitazione con isopropanolo e lavaggio con etanolo. La qualità dell'RNA è stata verificata spettrofotometricamente. È stato sintetizzato il cDNA e la RT-qPCR è stata eseguita con chimica a base di colorante in condizioni cicliche standard, seguita dall'analisi della curva di fusione. I livelli di espressione sono stati normalizzati in GAPDH utilizzando il metodo 2−ΔΔCq .
Analisi del western blot
I lisati proteici sono stati preparati in tampone RIPA con inibitori proteasi, quantificati tramite test BCA e denaturati in tampone di carico. Il trasferimento SDS-PAGE e PVDF veniva eseguito in condizioni controllate. Le membrane sono state bloccate, incubate con anticorpi primari per Connexin-43, Occludin, JNK e GAPDH, seguite da anticorpi secondari coniugati con HRP. Le bande venivano rilevate tramite chemiluminescenza e la densitometria prevedeva la sottrazione di fondo, la normalizzazione a GAPDH e la scala al gruppo di controllo.
Analisi statistica
I dati sono stati riportati come media ± SD. È stata utilizzata una ANOVA unidirezionale con il test post hoc di Tukey o il test t di Student, dove appropriato, mentre i dati non parametrici sono analizzati tramite il test Mann-Whitney U . Un valore p < 0,05 è stato considerato significativo.
Completamento e bonifica
Tutti i rifiuti chimici pericolosi venivano registrati e smaltiti in modo appropriato. I dati grezzi, inclusi i risultati degli strumenti e i file di analisi, venivano archiviati con le relative note per garantire la tracciabilità.
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Deterioramento persistente della funzione riproduttiva maschile nei ratti, caratterizzato da una riduzione della qualità degli spermatozoi e compromesso sviluppo degli organi riproduttivi dovuto all'esposizione a PM2.5
Sono stati esaminati l'impatto di PM2.5 sulla funzione riproduttiva maschile, sulla qualità degli spermatozoi, sui coefficienti degli organi riproduttivi e sugli indicatori correlati in nove gruppi di ratti maschi. Le analisi sono state effettuate in relazione a...
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L'esposizione a breve corso a PM2.5 è stata seguita da un progressivo deterioramento post-esposizione della funzione riproduttiva maschile nell'arco di 1-4 mesi. Questi risultati supportano la tossicità riproduttiva dipendente dal tempo che persiste dopo la cessazione del dosaggio ed estendono le osservazioni precedenti di compromissione riproduttiva associata aPM2.5 23.
Per migliorare la riproducibilità, abbiamo standardizzato quattro ...
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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Natural Science Foundation della provincia del Fujian, Cina (Grant No:2023J01170).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tetrossido di osmio all'1% | TCI, Cina | O0308 | Per la post-fissazione nell'analisi TEM del tessuto testicolare |
| formalina tamponata al 10% neutro | Solarbio, Cina | PC0020 | Per fissare campioni di tessuto testicolare nella colorazione HE |
| 2,5% glutaraldeide | Solarbio, Cina | G1102 | Per la fissazione di campioni di tessuto testicolare nell'analisi TEM |
| etanolo al 75% | Acros Organics, USA | 61509-0040 | Per purificare l'RNA precipitato in RT - qPCR |
| Imager Automatico a Chimiluminescenza | Bio-Rad, USA | ChemiDoc | Utilizzato per l'imaging automatico dei segnali chemiluminescenti nel Western blotting. |
| Kit per il test proteico BCA | Solarbio, Cina | PC0020 | Per determinare la concentrazione totale di proteine nell'analisi Western blot |
| Buffer di blocco | Non specificato | T7131A | Utilizzato nell'analisi Western blot per eliminare il legame non specifico |
| Cloroformio | Acros Organics, USA | 327270010 | Utilizzato nella separazione dell'RNA durante RT - qPCR |
| Connexin - 43 | Abcam, USA | ab11370 | Rileva l'espressione e la distribuzione di una proteina chiave della barriera sanguino-testicolose per aiutare a valutare l'integrità della barriera |
| Kit ECL | Biosharp, Cina | BL520B | Per visualizzare le bande proteiche nell'analisi del Western blot |
| Kit ELISA (per testosterone, FSH, LH, E2) | Abcam, Regno Unito | ab108666; ab108702; ab108651; ab108667 | Per rilevare gli ormoni riproduttivi sierici |
| Eosina | Solarbio, Cina | G1002 | Utilizzato nella colorazione HE del tessuto testicolare |
| Resina epossidica | Solarbio, Cina | GP2001 | Per l'inserimento di campioni di tessuto testicolare nell'analisi TEM |
| GAPDH | Abcam, USA | ab128915 | Valuta l'apoptosi delle cellule testicolari indotta da PM2.5 e fornisce una base morfologica per studiarne l'impatto sull'apoptosi cellulare testicolare |
| Ematossilina | Solarbio, Cina | G1077 | Utilizzato nella colorazione HE del tessuto testicolare |
| Sistema di imaging | Nikon, Giappone | Nikon DS-U3 | Utilizzato per l'imaging di campioni al microscopio. |
| Isopropanolo | Acros Organics, USA | AC447080025 | Utilizzato nella precipitazione dell'RNA durante RT - qPCR |
| JNK | Abcam, USA | ab124956 | Esplora il meccanismo molecolare della lesione testicolare causata da PM2.5 e identifica i tipi cellulari in cui è attivata |
| Lettore di microplacche | DISPOSITIVI MOLECOLARI, USA | SpectraMax iD3 | Utilizzato per rilevare segnali in micropiastre (ad esempio, assorbenza, fluorescenza). |
| Occludin | Abcam, USA | ab31721 | Comprende il grado di danno della barriera sanguigno-testecolare ed esplora le interazioni tra le proteine rilevanti |
| Microscopio ottico | Chongqing Opto - Strumento elettronico, Cina | BDS200 | Utilizzato per osservazioni microscopiche ottiche generali. |
| Microtomo patologico | Shanghai Kaiyu Instrument, Cina | RM2016 | Utilizzato per tagliare sezioni di tessuti patologici. |
| Pentobarbital sodio | Solarbio, Cina | G1102 | Usato per iniezioni intraperitoneali nei ratti prima della raccolta del sangue |
| Materiale di riferimento standard PM2.5 | Istituto Nazionale di Metrologia, Cina | GBW13643 | Per l'esposizione a PM2.5 nel gruppo sperimentale |
| Membrana di difluoruro di polivinilidene (PVDF) | Thermo Fisher, USA | 88585 | Utilizzato nell'analisi Western blot per il trasferimento proteico |
| Kit per reagenti PrimeScript RT | TAKARA, Giappone | RR037Q | Per la sintesi del cDNA in RT - qPCR |
| Sistema PCR in tempo reale | Roche, Svizzera | LightCycler 480 | Utilizzato per la reazione a catena della polimerasi in tempo reale per l'analisi dell'espressione genica. |
| Buffer di lisi RIPA | TAKARA, Giappone | RR9161 | Per l'estrazione di proteine nell'analisi del Western blot |
| Shaker | Thermo, USA | MAXQ-4000 | Usata per scuotere campioni in esperimenti. |
| SPSS | IBM, USA | 28 | Per l'analisi dei dati |
| Soluzione salina sterile | Solarbio, Cina | S8160 | Utilizzato nel trattamento di gruppi di veicoli |
| Kit TB Green Premix Ex Taq II | TAKARA, Giappone | RR820S | Utilizzato in RT - qPCR |
| Microscopio elettronico a trasmissione (TEM) | Hitachi, Giappone | HT7800/HT7700 | Utilizzato per l'osservazione ultrastrutturale su scala nanometrica. |
| Reagente Trizol | Ambion, Cina | 15596018 | Per estrarre l'RNA totale in RT - qPCR |
| Ultramicrotomo | Leica, Germania | Leica UC7 | Usato per tagliare sezioni ultra-sottili per TEM. |
| Sistema Universale di Trasferimento Proteico / Macchina Blot per il Trasferimento Proteico | Bio-Rad, USA | Trans-Blot Turbo | Utilizzato per il trasferimento proteico nel Western blotting. |
| Microscopio ottico verticale | Nikon, Giappone | Nikon Eclipse E100 | Utilizzato per l'osservazione microscopica ottica verticale. |
| Acetato di uranyle | Merck, Germania | 201030 | Per la colorazione di sezioni ultrasottili nell'analisi TEM del tessuto testicolare |
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