Method Article

Procedure per l'identificazione degli inibitori dell'ingresso del SARS-CoV-2 come potenziali antivirali utilizzando pseudovirus basati su MLV

DOI:

10.3791/69628

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February 27th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Biología Celular y Molecular de enfermedades, Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT AIP), 2Maestría en Ciencias Biomédicas, Universidad de Panama, 3Sistema Nacional de Investigación (SNI), SENACYT

In This Article

Summary

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Questo articolo descrive la metodologia per generare particelle pseudotipate di SARS-CoV-2 utilizzando un sistema di segnalazione luciferasi e il suo impiego per identificare gli inibitori di ingresso. Questi protocolli sono dimostrati utilizzando due diversi inibitori di ingresso, una proteina di fusione umana ACE2-Fc ricombinante e il composto a piccole molecole arbidolo.

Abstract

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Il virus SARS-CoV-2 è un patogeno zoonotico emergente che ha causato un enorme carico di malattie e mortalità in tutto il mondo sin dalla sua comparsa nel 2019. Piattaforme sicure e accessibili per valutare l'ingresso virale e i potenziali composti antivirali rimangono essenziali per la scoperta continua di farmaci contro varianti emergenti. Questo articolo descrive un protocollo altamente ottimizzato per generare particelle pseudotipate basate sul virus della leucemia murina (MLV) che esprimono la proteina spike SARS-CoV-2 e trasportano un gene reporter della luciferasi, consentendo lo studio dell'ingresso virale in condizioni di biosicurezza livello 2. I metodi descritti dettagliano l'uso di linee cellulari ottimizzate, l'elevata efficienza di trasfezione tramite reagenti economici, la produzione di pseudovirus altamente efficaci e la titolazione dell'infettività per determinare il minimo input virale per i test di screening. I risultati rappresentativi dimostrano un'attività robusta della luciferasi nelle cellule infette rispetto ai controlli non contaminati, mentre i pseudovirus senza picchi di controllo e VSV-G confermano la specificità del saggio. Inoltre, il sistema supporta lo screening dei composti quantificando gli effetti inibitori sull'ingresso virale e valutando la citotossicità utilizzando un saggio di viabilità MTT. Nel complesso, questo protocollo riproducibile e scalabile fornisce una piattaforma affidabile per lo screening a media e alta produttività di nuovi inibitori di ingresso virale, contribuendo all'identificazione di candidati antivirali e promuovendo la ricerca sui meccanismi di ingresso del SARS-CoV-2.

Introduction

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L'emergere del Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) durante la fine del 2019 ha portato a una pandemia globale che ha causato milioni di decessi in tutto il mondo e continua a rappresentare una minaccia grazie a nuove varianti con maggiore trasmissibilità e potenziale di fugaimmunitaria 1. Come virus a RNA avvolto della famiglia Coronaviridae, il SARS-CoV-2 utilizza la sua glicoproteina trimerica spike (S) per mediare l'ingresso della cellula ospite legandosi al recettore dell'enzima convertitore dell'angiotensina 2 (ACE2) e subendo attivazione proteolitica da parte di TMPRSS2 e di altre proteasi ospiti....

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Protocol

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1. Trasfezione ad alta efficienza di celle derivate da HEK293T utilizzando polietilenemina ramificata (PEI)

NOTA: Eseguire tutti i passaggi in un armadietto di biosicurezza utilizzando la tecnica asettica standard e le procedure BSL-2. Utilizzare cellule derivate dalla HEK293T per la trasfezione e la generazione di virus pseudotipati. In questo metodo le cellule vengono trasfettate in piastre a 6 pozzi trattate con colture cellulari. La soluzione stock PEI è preparata come descritto in precedenza da Yang e colleghi (2017)12. Prima di procedere con la tripla trasfezione....

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Results

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Diversi metodi di trasfezione sono stati segnalati come fonte di PV, tra cui fosfato dicalcio 15, metodi a base dilipidi 16 e PEI, sia lineari che ramificati. Questo articolo mostra che la trasfezione di cellule derivate da HEK293T con PEI ramificata consente una trasfezione ad alta efficienza (Figura 1), solitamente paragonabile ai metodi di trasfezione con agenti di trasfezione a base di lipidi disponibili co.......

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Discussion

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Questa versatilità del sistema MLV per generare pseudotipi per altri virus è stata segnalata da altri virus importanti, come il virus Ebola18, MERS-CoV8, SARS-CoV19, il virus LaCrosse 20, l'Hantavirus20, il virusVisna 21, l'Arenavirus22, il virusinfluenzale 23 e altri. Questi pseudotipi sono stati m.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Ringraziamo il Sistema Nacional de Investigación (SNI) e la Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT, Panama) per il supporto finanziario nell'ambito dei contratti SENACYT n.031-2022 e SNI n.050-2023. Siamo inoltre molto grati al dottor Gary Whittaker per la donazione dei plasmidi pCMV-MLVgagpol e pTG-Luc.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 & micro; m Filtri a siringhe a basso legame proteico  Thermo Scientific720-1320Filtri a siringa (0.2 & mu; m,13 mm, PES, sterile)
Soluzione 1X con tripsina-EDTA allo 0,25%Gibco25200-056Tripsina-EDTA (0,25%), fenolo rosso
0,45 & micro; m Unità di Filtro a Tampotutto PVDF  Avantor514-1045Sistemi di filtrazione a vuoto con tavolo (PVDF, 250 ml, 50 mm, 0,45 & micro; m)
Tubi microcentrifughe sterili da 1,5 mLEppendorf30123611Safe-Lock  Valvole
Soluzione 100 X di penicillina per StreptomycinaCorning30-002-CISoluzione di penicillina-streptomicina, 100x
5 X tampone di lisi per il saggio luciferasi  PromegaE2650parte del sistema Promega Bright-Glo Luciferase
Tubi conici sterili da 50 mLCorning 352070Tubo centrifuga PP ad alta chiarezza da 50 mL, fondo conico, sterile
Piastre di coltura tissutale a 6 pozziThermo Scientific140675Multiplatti trattati con coltura cellulare
Piastre di coltura tissutale a 96 pozziThermo Scientific168055Nunc™ Microwell & trade; Micropiastra a fondo piatto trattato con delta Nunclon 96-Well,
Cloridrato di arbidoloSigma-AldrichSML0860
Polietilenimina ramificata, 25 kDaSigma-Aldrich408727
Microscopio laser confocale   (FV 3000)Olympus Co.SKU: FV3000
Dimetilsolossido (DMSO)Sigma-AldrichD8418
DMEM (Eagle Medium modificato di Dulbecco) con: alto livello di glucosio, L-glutamina, fenolo rosso, piruvato di sodio)Gibco11995-065
Siero Fetale Bovino (FBS)Gibco26140-079Inattivazione termica (56° C, 30 min)
Cellule derivate da HEK293T (linea cellulare Lenti-X 293T)Biografia di Takara632180Subclone altamente trasfetto della linea cellulare HEK293 e supporta alti livelli di espressione proteica virale
HEPES BufferGibco15630-080
Cellule altamente suscettibili all'infezione (293T-ACE2. TMPRSS2 (mCherry) Linea Cellulare)Risorse BEINR-55293HEK293T linea cellulare modificata per esprimere stabilmente ACE2 e TMPRSS2
Acido cloridrico  Sigma-AldrichH1758-500ML
Microscopio a contrasto di fase invertito Olympus Co. SKU: 2404040005
IsopropanoloSigma-AldrichI9516-500ML
Substrato di luciferasiPromegaE2650parte del Sistema di Analisi della Luciferasi a Bright-Glo
Lettore di micropiastre con rilevamento della luminescenzaAgilent BioTekBTH1MG
MTT [bromuro 3-(4,5-Dimetiltiazolo-2-il)-2,5-difeniteltetralio]Sigma-AldrichM2128
Piastre opachi bianche a 96 pozziCorning3917Micropiastre in polistirorene a fondo piatto solido a 96 pozzi trattate con TC
ParafilmBemisPM999
plasmide pcDNA3-EGFPAddgene13031pcDNA3-EGFP fu un dono di Doug Golenbock (plasmide Addgene # 13031 ; http://n2t.net/addgene:13031 ; RRID:Addgene_13031)
pCMV-MLVgagpol plasmide--Gentilmente donato dal Dr. Gary Whittaker 
Soluzione salina tamponata con fosfato senza Ca2+ e Mg2+ (PBS)Corning21-040-CVSoluzione salina tamponata con fosfato, 1X senza calcio e magnesio
Sistema di plasmidi Promega PureYield MaxiprepPromegaA2393
Plasmide pTG-Luc--Gentilmente donato dal Dr. Gary Whittaker 
Plasmide del pUNO1-SARS-CoV-2 Spike (Wuhan)InvivogenP1-Spike
plasmide pVSV-GAddgene138479pVSV-G fu un dono di Akitsu Hotta (plasmide Addgene # 138479 ; http://n2t.net/addgene:138479 ; RRID:Addgene_138479)
Proteina di fusione ACE2-Fc umana ricombinanteInvivogenFC-HACE2
Mezzo sirico ridotto (Opti-MEM)Gibco31985-070Medium Siero Ridotto Opti-MEM

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, J., et al. SARS-CoV-2 and emerging variants: Unmasking structure, function, infection, and immune escape mechanisms. Front Cell Infect Microbiol. 12, 869832(2022).
  2. Jackson, C. B., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. Mechanisms of SA....

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SARS CoV 2 EntryPseudovirus AssayEntry InhibitorsAntiviral ScreeningMLV PseudovirusesSpike ProteinLuciferase ReporterHigh Throughput ScreeningCell TransfectionViral Entry Mechanisms

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