Procedure per l'identificazione degli inibitori dell'ingresso del SARS-CoV-2 come potenziali antivirali utilizzando pseudovirus basati su MLV

Sommario

Questo articolo descrive la metodologia per generare particelle pseudotipate di SARS-CoV-2 utilizzando un sistema di segnalazione luciferasi e il suo impiego per identificare gli inibitori di ingresso. Questi protocolli sono dimostrati utilizzando due diversi inibitori di ingresso, una proteina di fusione umana ACE2-Fc ricombinante e il composto a piccole molecole arbidolo.

Abstract

Il virus SARS-CoV-2 è un patogeno zoonotico emergente che ha causato un enorme carico di malattie e mortalità in tutto il mondo sin dalla sua comparsa nel 2019. Piattaforme sicure e accessibili per valutare l'ingresso virale e i potenziali composti antivirali rimangono essenziali per la scoperta continua di farmaci contro varianti emergenti. Questo articolo descrive un protocollo altamente ottimizzato per generare particelle pseudotipate basate sul virus della leucemia murina (MLV) che esprimono la proteina spike SARS-CoV-2 e trasportano un gene reporter della luciferasi, consentendo lo studio dell'ingresso virale in condizioni di biosicurezza livello 2. I metodi descritti dettagliano l'uso di linee cellulari ottimizzate, l'elevata efficienza di trasfezione tramite reagenti economici, la produzione di pseudovirus altamente efficaci e la titolazione dell'infettività per determinare il minimo input virale per i test di screening. I risultati rappresentativi dimostrano un'attività robusta della luciferasi nelle cellule infette rispetto ai controlli non contaminati, mentre i pseudovirus senza picchi di controllo e VSV-G confermano la specificità del saggio. Inoltre, il sistema supporta lo screening dei composti quantificando gli effetti inibitori sull'ingresso virale e valutando la citotossicità utilizzando un saggio di viabilità MTT. Nel complesso, questo protocollo riproducibile e scalabile fornisce una piattaforma affidabile per lo screening a media e alta produttività di nuovi inibitori di ingresso virale, contribuendo all'identificazione di candidati antivirali e promuovendo la ricerca sui meccanismi di ingresso del SARS-CoV-2.

Introduzione

L'emergere del Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) durante la fine del 2019 ha portato a una pandemia globale che ha causato milioni di decessi in tutto il mondo e continua a rappresentare una minaccia grazie a nuove varianti con maggiore trasmissibilità e potenziale di fuga^{immunitaria 1}. Come virus a RNA avvolto della famiglia Coronaviridae, il SARS-CoV-2 utilizza la sua glicoproteina trimerica spike (S) per mediare l'ingresso della cellula ospite legandosi al recettore dell'enzima convertitore dell'angiotensina 2 (ACE2) e subendo attivazione proteolitica da parte di TMPRSS2 e di altre proteasi ospiti ^2,3. Sebbene siano state sviluppate diverse opzioni di trattamento per gestire i sintomi del COVID-19, l'evoluzione continua e lo sviluppo rapido delle varianti virali evidenziano l'urgente necessità di sistemi sicuri e scalabili per studiare l'ingresso virale e valutare nuovi composti antivirali che mirano a questo primo passaggio^{dell'infezione 4}.

Il virus SARS-CoV-2 rimane classificato come agente di biosicurezza livello 3 in^alcuni territori a causa del suo alto potenziale di trasmissione. Pertanto, qualsiasi compito di laboratorio replicativo richiede una struttura BSL-3 ad alto contenimento, ostacolando la capacità della maggior parte dei laboratori sul campo di condurre ricerche scientifiche con questo virus. I sistemi basati su virus pseudotipati, noti anche come pseudovirus (PV), offrono un'alternativa pratica che consente studi di ingresso virale in laboratori di livello di biosicurezza 2 (BSL-2), ampliando l'accessibilità per gli sforzi di ricerca^{globali 6}. Le particelle pseudotipate contenenti la proteina spike SARS-CoV-2 non sono replicanti, rendendole un surrogato sicuro per valutare l'ingresso del virus e lo screening per inibitori di piccole^{molecole 7}. Queste particelle possono essere ingegnerizzate per trasportare un gene di luciferasi o di segnalazione fluorescente, consentendo una rapida e quantitativa rilevazione dell'infezione misurando il segnale di segnalazione nelle cellule infette. I sistemi basati sul virus della leucemia murina (MLV) o sulle spine dorali dei lentivirus sono stati ampiamente utilizzati per studiare l'ingresso di SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2, virus Ebola, tra gli^altri 8,9,10,11.

In questi protocolli, descriviamo la generazione di PV basati su MLV utilizzando un sistema a tre plasmidi, basandoci sul lavoro riportato da Millet e^{Whittaker 8}. I plasmidi utilizzati includono un plasmide di confezione che codifica i geni centrali MLV gag-pol (pCMV-MLVgagpol), un vettore di trasferimento che codifica il gene reporter luciferasi (pTG-Luc) e un plasmide che esprime la glicoproteina spike del SARS-CoV-2 corrispondente alla variante originale di Wuhan-Hu-1. Inoltre, i pseudovirus vengono inoltre generati utilizzando la G-glicoproteina del virus della stomatite vescicolare (VSV-G), che sarà utilizzata successivamente come contro-screening dei potenziali colpi. I pseudovirus vengono prodotti nelle cellule derivate da HEK293 e utilizzati per infettare cellule altamente suscettibili che esprimono stabilmente hACE2 e TMPRSS2. L'efficienza della trasfezione viene inizialmente valutata utilizzando un plasmide che esprime una proteina fluorescente verde (GFP). Successivamente, utilizzando condizioni di trasfezione ottimizzate, i PV vengono generati co-transfettando questi tre plasmidi, seguiti dalla titolazione dei virus risultanti. Utilizzando la quantità appropriata di PV, viene eseguito un test su piastre da 96 pozzi per selezionare composti in grado di inibire l'ingresso dei virus. Questo protocollo utilizza polietilenimina ramificata (PEI) come reagente di trasfezione economico, consentendo un'implementazione più semplice delle procedure.

Protocollo

1. Trasfezione ad alta efficienza di celle derivate da HEK293T utilizzando polietilenemina ramificata (PEI)

NOTA: Eseguire tutti i passaggi in un armadietto di biosicurezza utilizzando la tecnica asettica standard e le procedure BSL-2. Utilizzare cellule derivate dalla HEK293T per la trasfezione e la generazione di virus pseudotipati. In questo metodo le cellule vengono trasfettate in piastre a 6 pozzi trattate con colture cellulari. La soluzione stock PEI è preparata come descritto in precedenza da Yang e colleghi (2017)¹². Prima di procedere con la tripla trasfezione per generare il pseudovirus, è consigliabile ottimizzare la migliore proporzione di DNA tra PEI e plasmide per garantire un'alta efficienza di trasfezione (oltre il 70-80%). Questa ottimizzazione dovrebbe essere effettuata tramite la trasfezione di un plasmide espresso una proteina fluorescente verde (GFP) e poi il controllo della proporzione di cellule fluorescenti utilizzando un microscopio a fluorescenza. Per questa ottimizzazione, mantenere costante il DNA plasmidico a 2,5 μg per pozzo e testare diverse quantità di PEI, nell'intervallo 1-20 μL. Ecco le migliori condizioni per questi lotti di cellule e PEI, costituiti da 5 μL di soluzione stock PEI (1 mg/mL) e 2,5 μg di plasmide che esprime GFP per pozzo in una piastra a 6 pozzi.

1. Seminare 7,5 x^{10 5} cellule derivate da HEK293 per pozzo in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzi, in un volume totale di 2 mL per pozzo di mezzo completo (DMEM-C: Dulbecco's Modified Eagle's Medium integrato con siero bovino inattivato al calore (FBS), 20 mM 4-(2-idrossietil)-1-piperazina-acido etanosulfonico (HEPES), 100 IU/mL di penicillina e 100 μg/mL di estreptomicina) 24 ore prima della trasfezione.
   NOTA: Quando si seminano le cellule, si evita di muovere la piastra di coltura in movimenti circolari, poiché ciò può causare aggregazione cellulare al centro dei pozzi, con conseguente distribuzione cellulare irregolare e conseguente riduzione dell'efficienza di trasfezione. Una sola lastra a 6 pozzi è sufficiente per un esperimento, inclusa una lama come controllo cellulare (non trasfettato), e il resto della piastra per testare diverse proporzioni di DNA plasmide PEI.
2. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO₂ durante la notte. Il giorno successivo, assicurati che le celle siano circa al 50-60% confluenti.
3. Il giorno della trasfezione, preparare i complessi di DNA PEI-plasmidi in tubi microcentrifuga sterili da 1,5 mL.
   1. Per ogni pozzo, preparare un tubo di soluzione PEI contenente 5 μL di stock PEI (1 mg/mL) in 50 μL di mezzo sirico ridotto e un tubo per soluzione di DNA contenente 2,5 μg del plasmide che esprime GFP, in 50 μL dello stesso mezzo.
   2. Se si devono trasfettare diversi pozzi, le soluzioni possono essere scalate di conseguenza. Mescola brevemente ogni tubo con vortice e gira giù per 5 secondi. Incubare i tubi a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti.
4. Durante questa incubazione, si rimuove con cura il mezzo da ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzi, evitando la rottura del monostrato cellulare. Sostituisci con cura 1 mL/pozzo di mezzo di transfezione completo (DMEM-T, uguale al DMEM-C, ma senza antibiotici).
5. Prepara il complesso di trasfezione. Dopo l'incubazione di 10 minuti, si aggiungono i 50 μl del tubo della soluzione di DNA al tubo della soluzione PEI. Mescola velocemente pipettando su e giù sei volte e incuba a RT per esattamente 3 minuti. Procedi immediatamente ad aggiungere un complesso a punto a basso alle cellule di ciascun pozzo corrispondente.
6. Sigilla i bordi della piastra con parafilm e centrifuga a 1.000 x g per 30 minuti a RT, senza freno, usando un rotore oscillante e un secchio per piastre.
7. Dopo la centrifugazione, rimuovere delicatamente il parafilm e incubare la piastra a 37 °C, 5% CO₂ per 3 ore.
8. Dopo l'incubazione, rimuovere delicatamente il mezzo di trasfezione da ogni pozzo e sostituirlo lentamente con 2 mL di DMEM-C preriscaldato per pozzo.
9. Incubare le cellule trasfettate a 37 °C con il 5% di CO₂ per 48 ore.
10. Valutare l'efficienza della trasfezione tramite espressione GFP utilizzando la microscopia a fluorescenza. La frequenza delle celle fluorescenti dovrebbe essere superiore al 70-80% (Figura 1). Questo è fondamentale per l'efficienza del metodo successivo nella sezione 2.

2. Generazione di particelle pseudovirali pseudotipizzate da SARS-CoV-2 e VSV-G

NOTA: Questo Metodo utilizza la stessa procedura della sezione 1, tranne che invece di utilizzare il plasmide GFP, le cellule saranno co-trasfettate con i tre plasmidi necessari per generare virus pseudotipizzati, utilizzando le condizioni ottimali di trasfezione per garantire un'elevata efficienza di trasfezione. Il protocollo utilizza inoltre cellule derivate da HEK293T in piastre a 6 pozzi, sufficienti per le seguenti tre condizioni richieste: a) cellule non trasfettate (un pozzo), b) cellule trasfettate solo con il plasmide di imballaggio MLV e il vettore di trasferimento del rapportatore luciferasi (un pozzo; pseudovirus senza spike) e c) cellule trasfettate con questi due plasmidi e il plasmide che esprime spike per generare virus pseudotipati SARS-CoV-2 (quattro pozzi). Il plasmide che esprime il picco utilizzato qui codifica lo spike del ceppo di Wuhan del SARS-CoV-2, e contiene modifiche di sequenza per consentire una presentazione efficiente della proteina nelle PV. Il pseudovirus senza spike-less sarà necessario come controllo più avanti durante le infezioni, per convalidare l'ingresso dipendente dallo spike-based nelle cellule permissive. Analogamente, i VSV-G-PV vengono generati utilizzando lo stesso disegno sperimentale per essere utilizzati successivamente come contro-screening di potenziali composti inibitori. Se è necessario un volume maggiore di pseudovirus, il protocollo può essere scalato fino a due piastre da 6 pozzi, cosa che può essere pratica anche per la fase di centrifugazione delle piastre.

1. Il giorno prima della trasfezione, semi le cellule derivate dalla HEK293T in due piastre da 6 pozzi, come descritto nella sezione 1. Utilizzare una piastra per la generazione di SPIKE-PV e l'altra per i VSV-G-PV.
2. Il giorno della trasfezione, prepara le miscele di trasfezione come mostrato nella Tabella 1, seguendo il passo 1.3.
   NOTA: La soluzione PEI è preparata come precedentemente^{riportato 12}. I plasmidi pCMV-MLVgagpol e pTG-Luc sono stati ottenuti da Millet e Whittaker⁸. Il plasmide pVSV-G è stato ottenuto da Gee et al 2020¹³. Tutti i plasmidi dovrebbero essere preparati in anticipo come preparazioni di alta qualità, prive di endotossine. Si consiglia l'uso di kit maxiprep disponibili in commercio, con un passaggio finale di filtrazione sterile tramite filtro a siringa a basso legame da 0,2 μm.
3. Mescola ogni tubo come descritto nella sezione 1 e incuba a RT per 10 minuti.
4. Durante questa incubazione, si rimuove con cura il mezzo da ciascun pozzo delle placche a 6 pozzi, evitando la rottura del monostrato cellulare. Sostituire lentamente con 1 mL di mezzo DMEM-T preriscaldato per ogni pozzo, assicurandosi che il mezzo scorra lungo la parete del pozzo e non direttamente sulle celle.
5. Preparare i complessi di trasfezione come descritto nella sezione 1 e le cellule trasfectate utilizzando il protocollo precedentemente descritto.
6. Dopo l'incubazione di 48 ore post-trasfezione, raccogliere i soprantatori, trasferirli in tubi centrifughe conici sterili da 50 mL e centrifugare a 290 x g per 7 minuti a 4 °C. Raccogli il soprandanante senza cellule e filtralo usando un'unità di filtro sterile a polofluoro di polivinilidene (PVDF), con un topo di 0,45 μm. Prepara aliquote di 1 mL e conservale a -80 °C.
   NOTA: Le particelle pseudotipate restano stabili a -80 °C per diversi mesi. Evita cicli ripetuti di gelo-scongelamento per preservare l'infettività.

	Per i picchi di picco PV del SARS-CoV-2 (per pozzo)	Per VSV-G-PV (per pozzo)	Per PV senza picchi (per pozzo)
Soluzione PEI:
PEI (1 mg/ml)1	5 μL	5 μL	5 μL
Mezzo sirico ridotto	45 μL	45 μL	45 μL
Soluzione di DNA plasmideo:2
pCMV-MLVgagpol	0,79 μg	0,79 μg	0,79 μg
pTG-luc	0,92 μg	0,92 μg	0,92 μg
Spike pUNO1	0,79 μg	-	-
pVSV-G	-	0,79 μg	-
Mezzo sirico ridotto	a 50 μL	a 50 μL	Fino a 50 μL

Tabella 1: Preparazione di miscele di trasfezione per la generazione di PV.

3. Titolazione delle particelle pseudotipate SARS-CoV-2 e VSV-G

NOTA: Questo passaggio è essenziale per confermare che le particelle pseudotipate prodotte siano infettive e per determinare il volume effettivo minimo richiesto per applicazioni a valle come lo screening dei composti. La titolazione dovrebbe essere effettuata per ogni nuovo lotto di pseudovirus. A tal fine, le cellule altamente suscettibili all'infezione da SARS-CoV-2 (cellule HSI) sono infettate da quantità decrescente dei virus pseudotipati. L'ingresso dei pseudovirus, mediato dall'interazione spike-umano ACE2, o da VSV-G con altri recettori cellulari, viene monitorato 72 ore dopo con la rilevazione dell'attività della luciferasi in un saggio di luminescenza.

1. Il giorno prima della trasduzione, seminare 2,5 x^{10 4} cellule HSI per pozzo in una piastra di coltura tissutale a 96 pozzi, in 50 μL di mezzo completo (DMEM-C). Preparare tre pozzi per ciascuna quantità di pseudovirus da testare e includere pozzi per l'infezione, anche per pseudovirus senza spike, e per cellule non infette. Incubare la piastra a 37 °C con il 5% di CO₂ durante la notte.
2. Il giorno della trasduzione, scongelare un'aliquota di ogni lotto di pseudovirus da testare sul ghiaccio e mescolare delicatamente per inversione. Includere anche un'aliquota del controllo senza picchi. Aggiungere direttamente a ogni pozzo diverse quantità della preparazione pseudovirale (100, 50, 25, 12,5, 6,2, 3,1, 1,5 e 0,8 μL). Regolare i volumi di tutti i pozzi a 150 μL con DMEM-C.
3. Sigilla la piastra con parafilm e centrifuga a 2.500 × g per 45 minuti in RT, senza freno.
4. Rimuovere il sigillo del parafilm e incubare la piastra per 72 ore a 37 °C, 5% CO₂.
5. Dopo l'incubazione, prepararsi per il test della luciferasi seguendo le istruzioni del produttore. Scongelare il substrato luciferasi (immagazzinato a -80 °C) e 5x tampone di lisi per il saggio luciferasi (conservato a -20 °C) e si equilibrano a RT (10-15 min).
6. Diluire il tampone di lisi del saggio luciferasi a 1x con acqua sterile. Prepara almeno 3 mL.
7. Aspirare lentamente e con attenzione e scartare il soprannatante di ogni pozzo usando una pipetta multicanale.
8. Aggiungi 30 μL di 1x lysis buffer a ciascun pozzo usando una pipetta multicanale. Inserire la piastra in un agitatore di piastre per 10 minuti a 150 giri/min, in RT. Verificare la lisi completa al microscopio rovesciato (tutte le cellule devono essere lisate e non distinguibili all'esame visivo).
   NOTA: Preparare in anticipo il lettore di microplacche per effettuare il rilevamento della luminescenza immediatamente dopo l'aggiunta del substrato, al fine di garantire la coerenza ed evitare il decadimento del segnale.
9. Trasferire i lisati su una piastra opaca bianca a 96 pozzi.
10. Aggiungi 50 μL di substrato di luciferasi in ogni pozzo e mescola brevemente muovendo la piastra in un movimento circolare. Metti la piastra nel luminometro e misura la luminescenza.
11. Analizza i dati ottenuti.
    1. Verifica che i controlli forniscano i valori di luminescenza attesi. Assicurarsi che le cellule non infette diano valori di luminescenza di fondo molto bassi.
       NOTA: Le cellule infettate da pseudovirus senza spik dovrebbero indicare valori a livello di cellule non infette, mentre quelle infettate con quantità decrescenti di pseudovirus con spik presenting dovrebbero mostrare valori elevati di luminescenza dipendenti dalla dose (Figura 2). I valori di luminescenza generati dai VSV-G-PV sono solitamente molto più alti rispetto a quelli degli spike-PV, circa uno o due ordini di grandezza.
    2. Per gli screening successivi, si seleziona la quantità di pseudovirus che genera un segnale almeno cento-mille volte quello delle cellule non infette.

4. Screening di composti per l'inibizione dell'ingresso di pseudovirali tramite spike-PV

1. Seme 2,5 x 10⁴ celle HSI per pozzo in 50 μL di mezzo completo (DMEM-C) in una piastra da 96 pozzi, come descritto nella sezione 3. Incubare durante la notte a 37 °C, 5% di CO₂.
   1. Si consideri un disegno a piastra che include le colonne da 1 a 11 per i composti più pseudovirus, e la colonna 12 per i controlli. Nella colonna 12, assegnare quattro pozzi per il controllo virale (solo pseudovirus) e quattro pozzi per cellule non contaminate e non trattate.
2. Il giorno successivo, si preparano diluizioni seriali (1:3) dei composti da testare, a partire da 50 μM (concentrazioni finali durante le infezioni: 50, 16,6, 5,5, 1,8, 0,6, 0,2 e 0,06 μM), in DMEM-C contenente lo 0,5% di DMSO.
   1. Per comodità, si preparano le diluizioni in una "piastra di diluizione" separata da 96 pozzi, dove le diluizioni seriali vengono prima effettuate e poi trasferite (50 μL) sulla lastra contenente le celle.
   2. Se il numero di composti è molto elevato, nell'ordine di centinaia o più, si riduce questa prima serie di diluizione a circa 4 punti, usando un singolo pozzo per ogni punto di diluizione, e si considera una pre-schermatura. Successivamente, si ritestano i potenziali risultati usando diluizioni seriali a 7 punti, 1:3, con tre repliche, partendo dalla stessa concentrazione di 50 μM.
3. Una volta pronte le diluizioni dei composti, aspirare delicatamente il mezzo delle cellule usando una pipetta multicanale e aggiungere 50 μL di diluizioni composte ai pozzi corrispondenti. Incubare per 1 ora a 37 °C, 5% CO₂. Per i controlli nella colonna 12, aggiungi solo DMEM-C.
4. Senza rimuovere i composti, si aggiungono a ciascun pozzo la quantità predeterminata di pseudovirus SARS-CoV-2 pseudotipato, in un volume di 50 μL di mezzo completo, contenente i composti alle stesse concentrazioni. Sigilla le piastre con parafilm.
5. Centrifugare la piastra a 2.500 × g per 45 minuti a RT senza freno, poi rimuovere il parafilm e incubare a 37 °C, 5% di_CO2 per 72 ore.
6. Procedere con la quantificazione dell'infettività basata sulla luciferasi come descritto nella sezione 3.
7. Esegui l'analisi dei dati.
   1. Esporta i valori di luminescenza in un foglio di calcolo per formattare i dati da importare successivamente in software di analisi e grafica.
   2. Prepara grafici a barre che rappresentino la media di ogni punto di concentrazione, incluso l'errore standard delle barre medie. Traccia anche i valori ottenuti da controlli positivi (solo PV) e negativi (cellule non infette).
      NOTA: I risultati del test sono considerati validi se 1) le cellule non infette mostrano valori molto bassi, 2) i controlli PV mostrano valori elevati, 3) il controllo positivo dell'inibizione (cioè arbidolo o hACE2-Fc) mostra inibizione dell'infezione, in modo dipendente dalla dose (Figura 3A, B).
   3. Successivamente, osserva i valori prodotti da composti sconosciuti per valutare se c'è inibizione e se c'è un effetto doso-dipendente. Se sì, allora sottoporre questi composti a ulteriori analisi di conferma.
      NOTA: Per ulteriori conferme dei potenziali successi, segui i passaggi seguenti. Per prima cosa, ritestare i potenziali composti di colpi come suggerito nel passo 4.2. Se l'effetto risposta alla dose viene confermato, si effettua un controscreening utilizzando la stessa serie di diluizione ma infettando con i VSV-G-PV. Questo test è importante per verificare se l'inibizione dell'ingresso sia specifica per l'interazione spike-ACE2, e non dovuta a interferenze in altri passaggi successivi durante la produzione della luciferasi nelle cellule infette (Figura 3A, B). Qui, il composto positivo non dovrebbe mostrare attività inibitoria contro i VSV-G-PV. Se ciò accade, allora la stessa serie di concentrazioni dovrebbe essere testata per la citotossicità utilizzando un saggio di vitalità cellulare (test MTT, mostrato nella sezione 5). In sintesi, un potenziale composto di colpo dovrebbe mostrare inibizione di SARS-CoV-2-spike-PV, e nessuna o minore inibizione di VSV-G-PV, e nessuna, o almeno un'inibizione molto più debole, della vitalità delle cellule. Regolare una curva dose-risposta utilizzando i dati di luminescenza permetterà di stimare la concentrazione inibitoria mezza massimale (IC₅₀) per l'inibizione delle PV e una concentrazione citotossica mezza massimale (CC₅₀) dal test di viabilidade. Il rapporto CC₅₀ / IC₅₀ viene utilizzato per calcolare l'indice di selettività (SI), che è un indicatore importante della potenziale utilità del composto positivo. Per l'analisi delle curve dose-risposta e la stima dell'IC₅₀ e del CC₅₀ sono state descritte procedure molto^{dettagliate 14}.

5. Saggio di vitalità cellulare basato su MTT

1. Semina 2,5 x 10⁴ celle HSI per pozzo in 50 μL di DMEM-C in una piastra a 96 pozzi. Incubare la piastra durante la notte a 37 °C, 5% CO₂. Assicurati che le cellule siano in confluenza circa al 50% il giorno dopo. Preparare abbastanza pozzi, considerando tutte le diverse concentrazioni del composto da valutare, cellule non trattate e pozzi vuoti contenenti solo mezzo, in triplice. Testare i composti potenziali colpit alle stesse concentrazioni valutate nel test di inibizione dell'ingresso PV.
2. Dopo l'incubazione, rimuovere con cura il mezzo e sostituirlo con 100 μL di mezzo completo contenente diverse concentrazioni del composto da valutare, con lo 0,5% di DMSO.
3. Centrifugare la piastra a 2.500 × g per 45 minuti a RT senza freno e incubare per 72 ore a 37 °C, 5% di CO₂. Questo passaggio è incluso per gestire le celle esattamente come fatto nella sezione precedente, tranne l'aggiunta dei PV.
4. Prepara una soluzione MTT da 0,5 mg/mL usando DMEM. Sterilizza filtrando fino a 0,2 μm e lascia al buio.
   NOTA: il bromuro di tetrazolio (4,5-Dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio (MTT) è sensibile alla luce. Dovrebbe essere tenuto congelato, al buio.
5. Rimuovere con attenzione il mezzo da ogni pozzo e sostituirlo con 100 μL di soluzione MTT. Incubare per 2 ore a 37 °C, 5% CO₂.
6. Durante questa incubazione, preparare una soluzione di solubilizzazione contenente 40 mM di HCl in alcol isopropilico.
7. Rimuovere con cura la soluzione MTT utilizzando una pipetta multicanale, senza disturbare i cristalli di formazan sul fondo di ogni pozzo.
8. Aggiungere 100 μL della soluzione di solubilizzazione in ciascun pozzo. Avvolgi il piatto nella carta stagnola e mettilo su uno shaker a 150 giri/min per 15 minuti.
9. Registrare assorbanza a 570 nm e 630 nm.
10. Esegui l'analisi dei dati.
    1. Utilizzando i valori grezzi della densità ottica, si sottraggono i valori ottenuti a 630 nm da quelli ottenuti a 570 nm per ogni pozzo. Poi si mediano i valori corretti dei pozzi delle celle non trattate. Considera queste cellule non trattate al 100% vitali.
    2. Poi normalizza i valori delle cellule trattate rispetto ai pozzi delle cellule non trattate, usando la formula:
       Fattibilità (%) =
11. Traccia le percentuali di vitalità come barre che rappresentano la media delle repliche ±± errore standard della media. Eseguire ulteriori analisi statistiche per confrontare i gruppi utilizzando procedure implementate in un software di analisi dei dati e graficazione, confrontando le vitalità a diverse concentrazioni con il controllo delle cellule non trattate.
12. Confrontare le medie di ogni punto di concentrazione con quelle delle cellule trattate solo con DMSO utilizzando il post-test non parametrico di Kruskal-Wallis con Dunn (le differenze sono considerate significative ai valori p < 0,05). Per tracciare una curva dose-risposta e stimare il CC₅₀ dei valori OD, controlla la procedura riportata^{altrimenti 14}.

Risultati

Diversi metodi di trasfezione sono stati segnalati come fonte di PV, tra cui fosfato di^{calcio 15}, metodi a base di^{lipidi 16} e PEI, sia lineari che ramificati. Questo articolo mostra che la trasfezione di cellule derivate da HEK293T con PEI ramificata consente una trasfezione ad alta efficienza (Figura 1), solitamente paragonabile ai metodi di trasfezione con agenti di trasfezione a base di lipidi disponibili co...

Discussione

Questa versatilità del sistema MLV per generare pseudotipi per altri virus è stata segnalata da altri virus importanti, come il virus Ebola¹⁸, MERS-CoV⁸, SARS-CoV¹⁹, il virus La^{Crosse 20}, l'Hantavirus²⁰, il virus^{Visna 21}, l'Arenavirus^22, il virus^{influenzale 23} e altri. Questi pseudotipi sono stati m...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0.2 & micro; m Filtri a siringhe a basso legame proteico	Thermo Scientific	720-1320	Filtri a siringa (0.2 & mu; m,13 mm, PES, sterile)
Soluzione 1X con tripsina-EDTA allo 0,25%	Gibco	25200-056	Tripsina-EDTA (0,25%), fenolo rosso
0,45 & micro; m Unità di Filtro a Tampotutto PVDF	Avantor	514-1045	Sistemi di filtrazione a vuoto con tavolo (PVDF, 250 ml, 50 mm, 0,45 & micro; m)
Tubi microcentrifughe sterili da 1,5 mL	Eppendorf	30123611	Safe-Lock  Valvole
Soluzione 100 X di penicillina per Streptomycina	Corning	30-002-CI	Soluzione di penicillina-streptomicina, 100x
5 X tampone di lisi per il saggio luciferasi	Promega	E2650	parte del sistema Promega Bright-Glo Luciferase
Tubi conici sterili da 50 mL	Corning	352070	Tubo centrifuga PP ad alta chiarezza da 50 mL, fondo conico, sterile
Piastre di coltura tissutale a 6 pozzi	Thermo Scientific	140675	Multiplatti trattati con coltura cellulare
Piastre di coltura tissutale a 96 pozzi	Thermo Scientific	168055	Nunc™ Microwell & trade; Micropiastra a fondo piatto trattato con delta Nunclon 96-Well,
Cloridrato di arbidolo	Sigma-Aldrich	SML0860
Polietilenimina ramificata, 25 kDa	Sigma-Aldrich	408727
Microscopio laser confocale   (FV 3000)	Olympus Co.	SKU: FV3000
Dimetilsolossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM (Eagle Medium modificato di Dulbecco) con: alto livello di glucosio, L-glutamina, fenolo rosso, piruvato di sodio)	Gibco	11995-065
Siero Fetale Bovino (FBS)	Gibco	26140-079	Inattivazione termica (56° C, 30 min)
Cellule derivate da HEK293T (linea cellulare Lenti-X 293T)	Biografia di Takara	632180	Subclone altamente trasfetto della linea cellulare HEK293 e supporta alti livelli di espressione proteica virale
HEPES Buffer	Gibco	15630-080
Cellule altamente suscettibili all'infezione (293T-ACE2. TMPRSS2 (mCherry) Linea Cellulare)	Risorse BEI	NR-55293	HEK293T linea cellulare modificata per esprimere stabilmente ACE2 e TMPRSS2
Acido cloridrico	Sigma-Aldrich	H1758-500ML
Microscopio a contrasto di fase invertito	Olympus Co.	SKU: 2404040005
Isopropanolo	Sigma-Aldrich	I9516-500ML
Substrato di luciferasi	Promega	E2650	parte del Sistema di Analisi della Luciferasi a Bright-Glo
Lettore di micropiastre con rilevamento della luminescenza	Agilent BioTek	BTH1MG
MTT [bromuro 3-(4,5-Dimetiltiazolo-2-il)-2,5-difeniteltetralio]	Sigma-Aldrich	M2128
Piastre opachi bianche a 96 pozzi	Corning	3917	Micropiastre in polistirorene a fondo piatto solido a 96 pozzi trattate con TC
Parafilm	Bemis	PM999
plasmide pcDNA3-EGFP	Addgene	13031	pcDNA3-EGFP fu un dono di Doug Golenbock (plasmide Addgene # 13031 ; http://n2t.net/addgene:13031 ; RRID:Addgene_13031)
pCMV-MLVgagpol plasmide	-	-	Gentilmente donato dal Dr. Gary Whittaker
Soluzione salina tamponata con fosfato senza Ca2+ e Mg2+ (PBS)	Corning	21-040-CV	Soluzione salina tamponata con fosfato, 1X senza calcio e magnesio
Sistema di plasmidi Promega PureYield Maxiprep	Promega	A2393
Plasmide pTG-Luc	-	-	Gentilmente donato dal Dr. Gary Whittaker
Plasmide del pUNO1-SARS-CoV-2 Spike (Wuhan)	Invivogen	P1-Spike
plasmide pVSV-G	Addgene	138479	pVSV-G fu un dono di Akitsu Hotta (plasmide Addgene # 138479 ; http://n2t.net/addgene:138479 ; RRID:Addgene_138479)
Proteina di fusione ACE2-Fc umana ricombinante	Invivogen	FC-HACE2
Mezzo sirico ridotto (Opti-MEM)	Gibco	31985-070	Medium Siero Ridotto Opti-MEM