Questo protocollo descrive un modo conveniente per eseguire un test di sforzo per la glicolisi al fine di quantificare la riprogrammazione metabolica nella microglia primaria del topo. Dopo l'isolamento e la stimolazione infiammatoria, il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) viene misurato utilizzando reagenti appena preparati e regolati per il pH, seguiti dalla normalizzazione proteica per consentire una valutazione accurata e riproducibile degli spostamenti glicolitici.
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Articolo metodologico
Indagine della glicolisi nella microglia primaria tramite test di flusso extracellulare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le microglie, le cellule macrofagiche residenti del sistema nervoso centrale, alterano dinamicamente i loro programmi metabolici in risposta a segnali fisiologici e patologici. Comprendere questi cambiamenti metabolici è fondamentale per chiarire il loro ruolo nell'infiammazione. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per valutare il profilo glicolitico della microglia primaria isolata dalle cortecce cerebrali neonatali del topo utilizzando un test di sforzo per glicolisi su un analizzatore di flusso extracellulare. Questo test consente una misurazione in tempo reale dell'ECAR, un indicatore dell'attività glicolitica associata a un pH basso, come il lattato. Il nostro approccio prevede il trattamento della microglia coltivata in diverse condizioni per esaminare come le vie metaboliche vengano alterate in risposta a vari stimoli, inclusi quelli pro-infiammatori. In modo unico, il nostro laboratorio prepara soluzioni fresh stock di diversi reagenti, tra cui glucosio, oligomicina e 2-desossiglucosio (2DG), per colpire i diversi aspetti del percorso, con un'attenta regolazione del pH per ogni reagente per garantire accuratezza sperimentale e riproducibilità. Questo metodo fornisce una piattaforma solida per l'indagine della glicolisi nella microglia primaria e offre una visione dei loro stati funzionali in condizioni infiammatorie o legate alla malattia.
Introduzione
Le cellule del sistema nervoso centrale modificano il modo in cui producono energia in risposta a condizioni normali emalattiche 1,2. Tra le principali vie metaboliche, la glicolisi e la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) sono vie chiave che regolano le funzioni delle cellule immunitarie - esse subiscono rispettivamente una reazione robusta e immediata a condizioni pro-infiammatorie e antinfiammatorie. Pertanto, le cellule immunitarie possono passare tra vie metaboliche in risposta ai segnali infiammatori e agli stati<....
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Protocollo
Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con le linee guida del Canadian Council on Animal Care e hanno ricevuto l'approvazione del Comitato per la Cura degli Animali della Memorial University of Newfoundland secondo il protocollo numero 22-01-DK.
1. Preparativi prima dell'inizio degli esperimenti
- Prepara la soluzione per la dissezione aggiungendo 10 mM di HEPES a 1x HBSS senza Ca2+ e Mg2+.
- Prepara la soluzione digerente (per 2–3 cervelli) combinando 1 mL di tripsina al 2,5% (10 volte stock, non diluita), 2 mL di soluzion....
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Risultati
Il test di stress extracellulare basato su flusso di glicolisi misura con successo il profilo glicolitico delle microglie primarie. Il saggio misura la glicolisi basale, cioè la glicolisi dopo l'iniezione di glucosio, la capacità glicolitica dopo l'iniezione di oligomicina e l'inibizione della glicolisi dopo l'iniezione di 2DG. Per il nostro esperimento, abbiamo confrontato microglie primarie di controllo (non trattate) e trattate con LPS. Abbiamo osservato lievi cambiamenti morfologici .......
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Discussione
La risposta microgliale durante la neuroinfiammazione è accompagnata da un profondo riprogrammazione metabolica che permette a queste cellule di soddisfare le esigenze energetiche e biosintetiche del loro stato funzionale. Il test di stress della glicolisi basato su flusso extracellulare offre un metodo sensibile e in tempo reale per misurare il flusso glicolitico, permettendoci di analizzare come la microglia primaria adatta il proprio metabolismo in condizioni pro-infiammatorie. In que.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interessi da dichiarare.
Ringraziamenti
Il lavoro è finanziato tramite una sovvenzione CIHR a DKK. L'RTI al Dr. Craig Moore per l'analizzatore XFe24 del saggio Seahorse è molto riconosciuta.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione 1M HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| 1X HBSS | Gibco & nbsp; | 14175-079 | |
| 2,5% di tripsina | Gibco & nbsp; | 15090-046 | |
| 2DG | Millipore sigma | D6134 | |
| Antibiotico/Antimicotici | Gibco | 15240-062 | |
| D & ndash; (+)Glucosio, anidro | Termoscientifica | A16828.36 | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| DNasi I | Millipore sigma | 11284932001- Roche | |
| FBS | Fisherbrand | FB12999102 | |
| Glutamax | Gibco & nbsp; | 35050-061 | |
| Kit L-Lattato | Abcam | AB65330 | |
| LPS | Sigma Aldrich | L4391 | |
| MEM, NEAA&NBSP; | Gibco & nbsp; | 11140-050 | |
| Oligomicina A | Millipore sigma | 495455 | |
| Penicillina/Streptomicina | Gibco & nbsp; | 15240-062 | |
| Strisce indicative di pH | Fisherbrand | 13-640-516 | |
| Cavalluccio Marino XFe24 | Tecnologie Agilent | N/A | Nome generico: Analizzatore di flusso extracellulare |
| Micropiastre di coltura cellulare Seahorse 24 V7 PS | Cavalluccio Marino Agilent | 100777-004 | Nome generico: Micropiastre di coltura cellulare a flusso extracellulare |
| Saggio sul cavalluccio marino XF Buffer calibrante (pH 7,4) | Agilent Seahorse & nbsp; | 100840-000 | Nome generico: Buffer calibrante di flusso extracellulare |
| Medium DMEM XF per test di cavalluccio marino (pH 7,4) | Agilent Seahorse & nbsp; | 103575-100 | Nome generico: Mezzi extracellulari per il saggio del flusso |
| Seahorse Kit per il test di flusso extracellulare | Agilent Seahorse & nbsp; | 102342-100 | Nome generico: Targhetta di calibrazione del flusso extracellulare |
| Piruvato di sodio | Gibco & nbsp; | 11360-070 |
Riferimenti
- Prinz, M., Jung, S., Priller, J. Microglia biology: One century of evolving concepts. Cell. 179, 292-311 (2019).
- Tay, T. L., et al. Unique microglia recovery population revealed by single-cell RNAseq following neurodegeneration. Acta Neuropathol. C....
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Ristampe e permessi
