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Articolo metodologico

Indagine della glicolisi nella microglia primaria tramite test di flusso extracellulare

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DOI:

10.3791/69638

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10 aprile 2026

 , 
1Division of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Memorial University of Newfoundland

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un modo conveniente per eseguire un test di sforzo per la glicolisi al fine di quantificare la riprogrammazione metabolica nella microglia primaria del topo. Dopo l'isolamento e la stimolazione infiammatoria, il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) viene misurato utilizzando reagenti appena preparati e regolati per il pH, seguiti dalla normalizzazione proteica per consentire una valutazione accurata e riproducibile degli spostamenti glicolitici.

Abstract

Le microglie, le cellule macrofagiche residenti del sistema nervoso centrale, alterano dinamicamente i loro programmi metabolici in risposta a segnali fisiologici e patologici. Comprendere questi cambiamenti metabolici è fondamentale per chiarire il loro ruolo nell'infiammazione. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per valutare il profilo glicolitico della microglia primaria isolata dalle cortecce cerebrali neonatali del topo utilizzando un test di sforzo per glicolisi su un analizzatore di flusso extracellulare. Questo test consente una misurazione in tempo reale dell'ECAR, un indicatore dell'attività glicolitica associata a un pH basso, come il lattato. Il nostro approccio prevede il trattamento della microglia coltivata in diverse condizioni per esaminare come le vie metaboliche vengano alterate in risposta a vari stimoli, inclusi quelli pro-infiammatori. In modo unico, il nostro laboratorio prepara soluzioni fresh stock di diversi reagenti, tra cui glucosio, oligomicina e 2-desossiglucosio (2DG), per colpire i diversi aspetti del percorso, con un'attenta regolazione del pH per ogni reagente per garantire accuratezza sperimentale e riproducibilità. Questo metodo fornisce una piattaforma solida per l'indagine della glicolisi nella microglia primaria e offre una visione dei loro stati funzionali in condizioni infiammatorie o legate alla malattia.

Introduzione

Le cellule del sistema nervoso centrale modificano il modo in cui producono energia in risposta a condizioni normali emalattiche 1,2. Tra le principali vie metaboliche, la glicolisi e la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) sono vie chiave che regolano le funzioni delle cellule immunitarie - esse subiscono rispettivamente una reazione robusta e immediata a condizioni pro-infiammatorie e antinfiammatorie. Pertanto, le cellule immunitarie possono passare tra vie metaboliche in risposta ai segnali infiammatori e agli statifunzionali 5. Le microglie, come le loro controparti mieloide, sono metabolicamente legate alle loro funzioni e si adattano rapidamente a diversi percorsi metabolici come carburante metabolico alternativo, dimostrando flessibilitàmetabolica 6,7. La microglia subisce una rapida riprogrammazione metabolica durante l'infiammazione, con glicolisi aumentata che funge da firma metabolica chiave degli statipro-infiammatori. Così, i saggi che identificano la dipendenza cellulare da un fenotipo metabolico ci permettono di indagare i loro stati funzionali in varie condizioni. Nel protocollo attuale, miriamo a determinare se la microglia primaria si basi sull'aumento della glicolisi durante condizioni pro-infiammatorie. Per questo, eseguiamo regolarmente i test di sforzo della glicolisi. Sebbene l'analizzatore Seahorse XFe24 (analizzatore di flusso extracellulare) sia stato ampiamente utilizzato per misurare ECAR in linee cellulari immortalate e cellule trasformate, la microglia primaria presenta sfide tecniche uniche, tra cui rese cellulari limitate, proprietà di adesione variabili e alta sensibilità alle condizioni di coltura, che possono confondere le misurazioni metaboliche. Inoltre, fornisce una misurazione in tempo reale dell'ECAR, consentendo una valutazione precisa della glicolisi guidata dal lattato in più momenti temporali, che non può essere catturata da solo dai test di lattato di endpoint. Il profiling metabolico basato su flusso extracellulare è stato ampiamente adottato nella ricerca sul metabolismo per caratterizzare la bioenergetica cellulare, rendendo questo protocollo particolarmente adatto per studi che indagano i cambiamenti metabolici nelle cellule durante l'attivazione, la modellazione delle malattie o i test farmacologici. I lettori possono determinare l'idoneità in base alla necessità di misurazioni glicolitiche dinamiche ad alta risoluzione all'interno delle cellule primarie.

Il glucosio viene metabolizzato in piruvato tramite glicolisi e poi convertito in lattato nel citoplasma o in CO₂ e acqua nei mitocondri. La conversione del glucosio in lattato porta al rilascio di protoni nello spazio extracellulare, causando acidificazione del mezzo. L'analizzatore di flusso extracellulare quantifica questa acidificazione come ECAR9. Nel test di sforzo per glicolisi, le cellule vengono prima incubate in un mezzo privo di glucosio e piruvato, e la loro ECAR di base viene registrata. La prima iniezione fornisce una quantità saturante di glucosio, che le cellule metabolizzano tramite glicolisi in piruvato, produciendo ATP, NADH, acqua e protoni. L'aumento del rilascio di protoni aumenta l'ECAR, riflettendo la 'glicolisi'. Successivamente, viene aggiunta oligomicina per inibire la sintesi mitocondriale di ATP, costringendo le cellule a fare affidamento esclusivamente sulla glicolisi. Questa variazione del gradiente protonico aumenta ulteriormente l'ECAR ed è misurata come la capacità glicolitica massima della cellula. Infine, viene introdotto il 2DG, un analogo del glucosio. Inibisce in modo competitivo l'esoxinasi, bloccando la glicolisi e riducendo l'ECAR. Questa diminuzione conferma che l'ECAR precedente era dipendente dalla glicolisi. La differenza tra la massima capacità glicolitica e il livello di glicolisi definisce la riserva glicolitica. L'ECAR iniziale prima dell'aggiunta di glucosio rappresenta un'acidificazione non glicolitica da altri processi cellulari (Figura 1).

Abbiamo eseguito un test di sforzo per glicolisi utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare. I valori grezzi dell'ECAR venivano esportati su Excel per l'analisi. Per ogni condizione, abbiamo identificato i punti temporali corrispondenti all'ECAR basale (prima dell'aggiunta del glucosio), alla glicolisi (dopo l'iniezione di glucosio) e alla capacità glicolitica (dopo il trattamento con oligomicina). I valori ECAR dai punti temporali rilevanti all'interno di ogni fase e tra le quattro repliche tecniche sono stati mediati, e la glicolisi è stata calcolata come l'aumento dell'ECAR dopo l'aggiunta di glucosio. La capacità glicolitica è stata calcolata come un aumento dell'ECAR dopo l'aggiunta di oligomicina. La riserva glicolitica è stata calcolata come una diminuzione dell'ECAR dopo l'iniezione di 2DG. Questi valori medi sono stati poi utilizzati per confrontare le risposte metaboliche tra i gruppi.

D'altra parte, per valutare il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e valutare le funzioni mitocondriali, il test da sforzo mitocondriale (Agilent) è l'approccio standard, che misura parametri come la respirazione basale, la respirazione legata ad ATP, la perdita di protoni, la respirazione massima, la capacità respiratoria di riserva e la respirazione non mitocondriale. Queste misurazioni si ottengono iniettando sequenzialmente specifici inibitori mitocondriali, oligomicina (inibitore ATP sintasi), FCCP (Carbonilciuro-4 (trifluorometossi)fenilidrazone), un disaccoppiatore che favorisce la respirazione massima, e rotenone/antimicina A (inibitori complessi I/III), permettendo una valutazione quantitativa della salute mitocondriale e dellabioenergetica 10,11,12,13 . I test ECAR e OCR vengono quindi eseguiti in condizioni diverse.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con le linee guida del Canadian Council on Animal Care e hanno ricevuto l'approvazione del Comitato per la Cura degli Animali della Memorial University of Newfoundland secondo il protocollo numero 22-01-DK.

1. Preparativi prima dell'inizio degli esperimenti

  1. Prepara la soluzione per la dissezione aggiungendo 10 mM di HEPES a 1x HBSS senza Ca2+ e Mg2+.
  2. Prepara la soluzione digerente (per 2–3 cervelli) combinando 1 mL di tripsina al 2,5% (10 volte stock, non diluita), 2 mL di soluzione disseczionale e 200 μL di DNasi I (1 mg/mL).
  3. Prepara mezzo gliale misto integrando DMEM con FBS al 10%, 1x Glutamax e 1x antibiotico/antimicotico.
  4. Prepara il mezzo microgliale integrando DMEM con FBS al 10%, 1 Glutammax, 1 NEAA MEM, 1 piruvato di sodio e 1 volta penicillina/estreptomicina.

2. Impiccatura per colture miste gliali (Figura 2A)

  1. Il giorno 1:
    1. Raccogliere i cuccioli postnatali (P0)-P2 da topi C57BL/6C ed estrarre le cortecce usando un microscopio stereoscopico e rimuovere le meningi. Poi, seziona le cortecce in piccoli pezzi in soluzione disseczionale e trasferiscile in un tubo conico da 15 mL. Lascia che i tessuti si depositino sul fondo del tubo.
    2. Esalta la soluzione per la dissezione e sostituiscila con 3 mL di soluzione digertiva ogni 2–3 cervelli. Triturare delicatamente usando una pipetta sierologica da 2 mL per dissociare il tessuto.
    3. Posizionare i tubi su un rotore all'interno di un incubatore a 37 °C e mescolare triturando con una pipetta sierologica da 2 mL ogni 8 minuti, per un totale di circa 24 minuti.
    4. Dopo la digestione dei tessuti, centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Poi, scartare il sovrantante e risospendere il pellet in 5 mL di mezzo gliale misto.
    5. Utilizzando un ago da 18 g in una siringa da 5 mL, triturare le cellule, poi farle passare attraverso un colino a celle di nylon da 70 μm. Centrifuga di nuovo le celle raccolte a 300 x g per 5 minuti a RT.
    6. Risospendere il pellet in 1 mL di mezzo gliale misto inizialmente e triturare più volte per rimuovere gli agglomeri cellulari, poi risospendere di nuovo in un volume maggiore, arrivando a 12 mL in ogni fiaschetta T75 (consigliati 2–3 cortecce cerebrali per fiaschetta)
      NOTA: Non è necessario rivestire la fiaschetta con poli-D-Lisina o un altro reagente.
  2. Il secondo giorno, cambia tutto il supporto e aggiungi un nuovo mix gliale migliore.
  3. Al terzo giorno, sostituisci circa 2/3 del substrato con substrato gliale misto fresco. Lascia crescere le cellule per altri sette giorni, per un totale di 10 giorni.
    NOTA: A questo punto si può osservare uno strato di astrociti.
  4. Al giorno 6, sostituisci due terzi del substrato con substrato gliale misto fresco. Confermare la presenza di uno strato di astrociti confluente.

3. Ottenere microglia primaria pura (Figura 2A)

NOTA: Intorno al giorno 10, sono visibili piccole cellule rotonde che galleggiano sopra lo strato degli astrociti; queste sono prevalentemente microglie (Figura 2B).

  1. Scuoti la fiaschetta a 250 giri/min per 2 ore a 37 °C. Raccogli tutto il materiale contenente le celle galleggianti in un tubo conico da 15 mL e centrifuga a 300 x g per 10 minuti.
  2. Risospendere il pellet in mezzi microgliali e impiattare circa 250.000 cellule per pozzo nelle micropiastre di coltura cellulare dell'analizzatore di flusso extracellulare.
    NOTA: Circa 3–4 milioni di cellule per mL sono ottenute da tre fiaschette di T75; il rivestimento delle piastre di coltura cellulare con poli-D-lisina o altri reagenti non è un requisito.
  3. Incubare la micropiastra al 5% di CO2 per 30–45 minuti. Dopodiché, cambia nuovamente il substrato per ottenere una coltura pura di microglia e rimuovere eventuali oligodendrociti che potrebbero ancora galleggiare. Le cellule sono pronte per il trattamento il giorno successivo (Figura 2C).
  4. Escludere i quattro pozzi designati come controlli di 'background' dall'innesco delle celle: uno per ogni riga (Figura 3C). Questi pozzi ricevono supporti per il saggio.
    NOTA: Riempire i pozzi inutilizzati con acqua sterile o PBS per prevenire l'evaporazione del substrato, e placcare le celle in un pattern casuale invece che in file o colonne fisse per minimizzare la variabilità basata sulle lastre.

4. Trattamento della microglia primaria con stimoli pro-infiammatori

  1. Al giorno 11, trattare le cellule con 100 ng/mL di lipopolisaccaridi (LPS) per 24 ore. Randomizzare i pozzi di controllo e trattati con LPS per escludere eventuali effetti posizionali.
    NOTA: La durata del trattamento può variare a seconda delle condizioni sperimentali e necessita di ottimizzazione preventiva.

5. Preparazione per il saggio extracellulare di flusso un giorno prima di eseguire l'esperimento

  1. Al giorno 11, aggiungere 1 mL di buffer calibrante alla piastra di calibrazione (formato a 24 pozzi; kit di analisi di flusso extracellulare) in tutti i pozzi. Tieni la piastra durante la notte a 37 °C senzaCO2.
    NOTA: La piastra di calibrazione è composta da 4 pozzi di iniezione. Per il test di sforzo della glicolisi, il glucosio viene aggiunto al porto A, l'oligomicina al porto B e il 2DG viene iniettato nel porto C (vedi Figura 4A).
  2. Prepara soluzioni di glucosio e stock 2DG
    1. Glucosio – Sciogliere 90 mg di glucosio in 2 mL di mezzo extracellulare per il test di flusso (Tabella dei materiali). Inizialmente, sciogliere in circa 1,9 mL in modo che, quando il pH verrà regolato il giorno successivo con 1N NaOH, il volume finale non superi i 2 mL, fondamentale per mantenere la molarità.
    2. 2DG – Sciogliere 328 mg in 2 mL di mezzo extracellulare per il flusso di test.
      NOTA: Conserva sia il glucosio che il 2DG a 4 °C durante la notte
  3. Aliquota 30-40 mL di mezzo per il test in un tubo conico da 50 mL e conserva a 4 °C per eseguire i test il giorno successivo.

6. Saggio di flusso extracellulare (giorno 12)

  1. Al giorno 12, riscaldare il glucosio precostituito, il 2DG e il mezzo di analisi aliquotato a 37 °C. Regolare il pH del glucosio e della 2DG, e quello del mezzo di analisi alquotato, a 7,4 aggiungendo 1N NaOH a incrementi (ad esempio, 5 μL, poi 10 μL).
  2. Vortice brevemente per una miscelazione uniforme finché il pH non supera 7.
    NOTA: Le strisce indicative di pH sono raccomandate per un monitoraggio costante del pH.
  3. Aggiungere 2 μL di soluzione stock di oligomicina da 10 mM in 2 mL di mezzo per il test aggiustato per il pH.
    1. Preparazione della soluzione standard di oligomicina da 10 mM: ricostituire una fiala da 10 mg di oligomicina in 1 mL di DMSO sterile, raggiungendo una concentrazione di 10 mg/mL, e conservare a -80 °C fino a un ulteriore utilizzo.
  4. Estrai le cellule dall'incubatore (dal passo 4) e raccogli il substrato in tubi microcentrifughe da 1,5 mL e centrifuga a 300 x g per 5 minuti.
  5. Raccogli il surnatante (scarta il pellet per eliminare cellule/detriti) e conservalo a -80 °C per le misurazioni del lattato, come menzionato nel Passo 8.
  6. Lava le cellule con 1 mL di mezzo per il test regolato a pH molto delicato per evitare di sollevare le cellule.
  7. Scartare il mezzo di analisi e aggiungere 500 μL di mezzo di test regolato per pH e incubare a 37 °C (senzaCO2) per 45 minuti a 1 ora.
  8. Nel frattempo, aggiungere tutti gli inibitori necessari alla piastra di calibrazione dell'analizzatore di flusso extracellulare nelle rispettive porte: 55 μL di glucosio alla porta A in alto a sinistra in tutti i pozzi, 60 μL di oligomicina nella porta B ai pozzi in alto a destra e 65 μL di 2DG nella porta C ai pozzi in basso a sinistra (inclusi i pozzi di fondo) (vedi Figura 4A).
    NOTA: L'aumento di volume a ogni passaggio è necessario per mantenere la molarità, poiché i volumi aumentano con l'aggiunta precedente di glucosio e oligomicina.
  9. Dopo aver aggiunto gli inibitori, impostare un test di sforzo per glicolisi utilizzando il software Agilent Seahorse Wave (vedi Figura 3). Poi, esegui la targhetta di calibrazione una volta richiesto.
    NOTA: Rimuovere il coperchio superiore dalla piastra e il coperchio rosa tra le piastre prima di inserire la piastra di calibrazione nella macchina. Durante questo passaggio, i sensori di pH eO2 saranno testati e controllati il controllo qualità.
  10. Una volta terminata la calibrazione, la macchina chiederà di scaricare la piastra di calibrazione e caricare la piastra di coltura.
    1. Passo I: Seleziona il modello di prova (Figura 3A)
      1. Apri il software Wave e, dalla sezione Template , scegli il modello di saggio appropriato per l'esperimento.
      2. In questo caso, seleziona "XF Glycolysis Stress Test" sull'analizzatore di flusso extracellulare.
    2. Passo II: Definire gruppi e strategie di iniezione (Figura 3B)
      1. Vai nella scheda Definizioni di Gruppo e crea gruppi sperimentali (ad esempio, Background, Control e LPS).
      2. Definisci la Strategia di Iniezione selezionando i composti da iniettare in ogni porta (ad esempio, glucosio, oligomicina, 2DG per il test di sforzo della glicolisi; queste impostazioni sono preimpostate dal software come predefinite, controlla di conseguenza).
    3. Passo III: Assegnare i gruppi alla mappa delle placche (Figura 3C)
      1. Apri la vista Mappa delle Placche e assegna i pozzi a ciascun gruppo trascinando i nomi dei gruppi (ad esempio, Sfondo = nero, Controllo = verde, LPS = rosso) sulla disposizione delle lastre.
      2. Assicurarsi che i pozzi vuoti/di fondo siano designati per una normalizzazione accurata.
    4. Passo IV: Impostare il protocollo (Figura 3D)
      1. Nella scheda Protocollo , programma i cicli di misurazione e le iniezioni. La sequenza tipica per il test di sforzo della glicolisi include acidificazione non glicolitica, iniezione di glucosio (porto A) → misura la glicolisi, iniezione di oligomicina (porto B) → misura la capacità glicolitica, iniezione di 2-DG (porto C) → misura la riserva glicolitica
      2. Definisci il numero di cicli di misura dopo ogni iniezione e aggiusta il tempismo (ad esempio, 3 cicli di miscelazione da 3 minuti, 2 minuti di attesa, misurazione per 3 minuti).
        NOTA: Per i nostri esperimenti utilizziamo le impostazioni predefinite del software.
      3. Rivedi il tempo totale del test prima di eseguire il saggio.
    5. Passo V: Normalizzazione (Figura 3E)
      1. Normalizzare i dati con valori di concentrazione proteica ottenuti tramite un saggio sull'acido bicinconinico (BCA) all'interno del software Wave utilizzando l'opzione di normalizzazione integrata (ad esempio, per contenuto proteico, numero cellulare o altri metodi disponibili). Le misurazioni della concentrazione proteica sono mostrate nella Tabella 1.
        NOTA: Il protocollo per l'isolamento della proteina per il saggio BCA dopo la misurazione ECAR è descritto nel seguente Passaggio 7.

7. Raccolta di celle per la quantificazione e la normalizzazione dei dati

  1. Una volta completato il test di flusso extracellulare, si rimuove la piastra di coltura e procedi immediatamente con l'estrazione delle proteine oppure conserva la piastra a -80 °C fino a quando non è pronta per l'estrazione proteica.
    NOTA: I saghi proteici ci permettono di normalizzare valori tra diverse condizioni di trattamento (sono uno dei metodi per normalizzare i dati, non l'unico).
  2. Per un isolamento proteico immediato, rimuovere il materiale per il test dai pozzi e lavare una volta con 500 μL di PBS RT (1x) (si consiglia un lavaggio dolce con una sola soluzione per minimizzare la rottura del monostrato cellulare).
  3. Per raccogliere le cellule che potrebbero staccarsi durante questo processo, centrifuga la piastra una volta a 300 × g per 5 minuti, scartare il PBS e risospendere il pellet risultante nel tampone RIPA per garantire misurazioni accurate delle proteine totali.
  4. Aggiungi circa 75–100 μL di buffer RIPA a ciascuno dei pozzi e posiziona la piastra su uno shaker (rotazione bassa-media) per 30 minuti (RT). Successivamente, trasferire il contenuto in un tubo microcentrifuga fresco da 1,5 mL.
    NOTA: Triturare e mescolare bene all'interno dei pozzi prima di trasferire il buffer RIPA nel tubo microcentrifuga da 1,5 ml.
  5. Incubare il tubo della microcentrifuga su un rotatore per circa 30 minuti a RT per una corretta lisi delle cellule. Durante questo tempo, pre-raffredda la centrifuga a 4 °C.
  6. Centrifuga il lisato cellulare a 16.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Scartate la pallina perché conterrà detriti cellulari.
  7. Raccogli il soprandanante per la quantificazione delle proteine usando il saggio BCA (o qualsiasi altro metodo preferito). Procedere immediatamente oppure conservare i lisati dopo aver rimosso tutto il substrato per il saggio a -20 °C (per conservazione a breve termine) o -80 °C (per conservazione a lungo termine).
  8. Quando si riavvia dopo aver conservato i campioni a -20 °C o -80 °C, si scongelano sul ghiaccio per circa 20–30 minuti, si fa brevemente un vortice/rotazione e si continua con il protocollo BCA standard.
  9. In alternativa, contare le cellule per pozzo utilizzando un emocitometro o tramite un citometro a flusso e integrarsi nelle strategie di normalizzazione. In tal caso, aggiungere circa 100–200 μL di tripsina (preriscaldata a 37 °C) immediatamente dopo la fine del test e la rimozione del mezzo di test, e incubare a 37 °C per 5 minuti. Raccogliere le cellule aggiungendo 100–200 μL di FBS al 10% per neutralizzare gli effetti della tripsina.
    1. Centrifuga le cellule a 300 x g per 5 minuti, rimuovi il surnatante e risospendi il pellet in circa 1 mL di FBS al 10% prima di contare con un emocitometro. In alternativa, le cellule possono essere fissate con PFA al 4% per 15 minuti prima di procedere con il conteggio cellulare basato su citometria di flusso.
      NOTA: Se si procede subito con il conteggio cellulare, non è necessaria fissazione basata su PFA.
  10. Normalizzare i valori ECAR con la concentrazione di proteine dello Passo 7.8 o i conteggi cellulari del Passo 7.9.1 in ciascun pozzo utilizzando il software Wave come nello Passo 6.10.5.1. I valori risultanti sono i valori normalizzati per il test di sforzo di glicolisi.
  11. Genera i risultati e il grafico utilizzando l'opzione "Esporta" seguita dall'opzione "Primagem del Graph Pad" e "Foglio Excel" per ogni valore di punto dati per la quantificazione.
    NOTA: Nella piastra di coltura cellulare, la scelta di quattro pozzi vuoti designati è flessibile e può essere impostata dallo sperimentatore. La disposizione degli spazi vuoti predefinita è mostrata nella Figura 3C.

8. Misurazioni di lattato da coltivazioni di soprantativi

  1. Scongelare gradualmente le aliquote sovrantanti sul ghiaccio raccolte al giorno 12 e conservate a −80 °C dal Passo 6.5.
  2. Determinare le concentrazioni di L-lattato utilizzando il kit di analisi L-Lattato in modalità fluorometrica seguendo il protocollo del produttore.
    Nota: La modalità fluorometrica è molto più sensibile rispetto al test colorimetrico.
  3. Preparare gli standard tramite diluizione seriale dello standard di lattato fornito per generare una curva di calibrazione da 0 a 0,1 nmol/pozzo.
  4. Aggiungi campioni e standard in una micropiastra trasparente da 96 pozzi in duplicato, poi aggiungi la miscela di reazione contenente la miscela di enzimi lattato e la sonda fluorescente in ogni pozzo.
  5. Incubare a RT per 30 minuti protetto dalla luce. Misurare l'intensità della fluorescenza utilizzando un lettore di micropiastre di fluorescenza con lunghezze d'onda di eccitazione/emissione impostate a 535/587 nm.
  6. Calcola le concentrazioni di lattato nei campioni dalla curva standard ed esprimele come pM. I livelli di lattato provenienti da supernatanti di microglia primaria non trattata (controllo) e trattata con LPS sono presentati nella Tabella 2.

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Risultati

Il test di stress extracellulare basato su flusso di glicolisi misura con successo il profilo glicolitico delle microglie primarie. Il saggio misura la glicolisi basale, cioè la glicolisi dopo l'iniezione di glucosio, la capacità glicolitica dopo l'iniezione di oligomicina e l'inibizione della glicolisi dopo l'iniezione di 2DG. Per il nostro esperimento, abbiamo confrontato microglie primarie di controllo (non trattate) e trattate con LPS. Abbiamo osservato lievi cambiamenti morfologici ...

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Discussione

La risposta microgliale durante la neuroinfiammazione è accompagnata da un profondo riprogrammazione metabolica che permette a queste cellule di soddisfare le esigenze energetiche e biosintetiche del loro stato funzionale. Il test di stress della glicolisi basato su flusso extracellulare offre un metodo sensibile e in tempo reale per misurare il flusso glicolitico, permettendoci di analizzare come la microglia primaria adatta il proprio metabolismo in condizioni pro-infiammatorie. In que...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interessi da dichiarare.

Ringraziamenti

Il lavoro è finanziato tramite una sovvenzione CIHR a DKK. L'RTI al Dr. Craig Moore per l'analizzatore XFe24 del saggio Seahorse è molto riconosciuta.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione 1M HEPESSigma AldrichH0887
1X HBSSGibco & nbsp;  14175-079
2,5% di tripsinaGibco & nbsp;  15090-046
2DGMillipore sigma D6134
Antibiotico/Antimicotici  Gibco15240-062
D & ndash; (+)Glucosio, anidro  Termoscientifica   A16828.36
DMEMGibco  11965-092
DNasi IMillipore sigma 11284932001- Roche
FBSFisherbrandFB12999102
GlutamaxGibco & nbsp;  35050-061
Kit L-LattatoAbcamAB65330
LPS Sigma Aldrich  L4391
MEM, NEAA Gibco & nbsp;  11140-050
Oligomicina AMillipore sigma 495455
Penicillina/StreptomicinaGibco & nbsp;  15240-062
Strisce indicative di pHFisherbrand13-640-516
Cavalluccio Marino XFe24Tecnologie AgilentN/ANome generico: Analizzatore di flusso extracellulare
Micropiastre di coltura cellulare Seahorse 24 V7 PSCavalluccio Marino Agilent100777-004Nome generico: Micropiastre di coltura cellulare a flusso extracellulare
Saggio sul cavalluccio marino XF Buffer calibrante (pH 7,4)Agilent Seahorse & nbsp;  100840-000Nome generico: Buffer calibrante di flusso extracellulare
Medium DMEM XF per test di cavalluccio marino (pH 7,4)Agilent Seahorse & nbsp;    103575-100Nome generico: Mezzi extracellulari per il saggio del flusso
Seahorse Kit per il test di flusso extracellulareAgilent Seahorse & nbsp;102342-100Nome generico: Targhetta di calibrazione del flusso extracellulare  
Piruvato di sodio  Gibco & nbsp;  11360-070

Riferimenti

  1. Prinz, M., Jung, S., Priller, J. Microglia biology: One century of evolving concepts. Cell. 179, 292-311 (2019).
  2. Tay, T. L., et al. Unique microglia recovery population revealed by single-cell RNAseq following neurodegeneration. Acta Neuropathol. Commun. 6, 87(2018).
  3. Wang, Z., et al. Glycolysis and oxidative phosphorylation play critical roles in natural killer cell receptor-mediated natural killer cell functions. Front. Immunol. 11, 202(2020).
  4. Soto-Heredero, G., Gómezde Las Heras, M. M., Gabandé-Rodríguez, E., Oller, J., Mittelbrunn, M. Glycolysis-a key player in the inflammatory response. FEBS J. 287, 3350-3369 (2020).
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