Induzione di ferroptosi nel glioma da parte della calceolarioside A tramite modulazione della via PI3K/Akt/Nrf2

Sommario

Questo studio esplora il potenziale terapeutico della Calceolarioside A nel glioma, dimostrandone la capacità di inibire la segnalazione PI3K/Akt e promuovere la degradazione di Nrf2, inducendo così la ferroptosi e sopprimendo la progressione tumorale sia in vitro che in vivo.

Abstract

Questo protocollo dimostra il flusso di lavoro sperimentale utilizzato per indagare gli effetti della Calceolarioside A (CaA) sull'induzione e modulazione della ferroptosi della via Fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K)/Protein Kinase B (Akt)/Fattore Nucleare eritroide 2-correlato (Nrf2) nei modelli di glioma. Le procedure includono una serie di saghi cellulari nelle linee di glioma umano U251 e U87 per valutare la vitalità, la proliferazione e la chemiosensibilità cellulare dopo il trattamento con CaA. I cambiamenti associati alla ferroptosi vengono valutati misurando specie reattive dell'ossigeno (ROS), glutatione (GSH), malondialdeide (MDA) e livelli di ferro labile, insieme all'espressione di proteine correlate alla ferroptosi come la glutatione perossidasi 4 (GPX4), la sottounità antiporter cisteina/glutammato (xCT) e la ferritina tramite western blot. Per valutare il coinvolgimento delle vie di intervento, il protocollo dettaglia qRT-PCR, western blot e immunoprecipitazione per l'espressione e l'ubiquitinazione di Nrf2. Sono inclusi esperimenti di sovraespressione di Nrf2 per confermarne il ruolo nella regolazione della ferroptosi. Il protocollo dimostra inoltre l'uso di un modello xenoinnesto per topi, in cui cellule di U87 vengono impiantate sottocutaneamente, seguite dalla somministrazione intraperitoneale di CaA per valutare la crescita e la tossicità tumorale in vivo. L'analisi istologica degli organi principali viene eseguita per valutare la sicurezza sistemica. Inoltre, l'aggancio molecolare viene utilizzato per prevedere il legame diretto tra CaA e la subunità PI3K p110α (PIK3CA). Insieme, queste procedure forniscono un quadro riproducibile per esaminare i meccanismi della ferroptosi e l'efficacia terapeutica dei composti naturali nella ricerca sul glioma.

Introduzione

I gliomi, in particolare quelli di alto grado, rappresentano una delle forme più letali di tumori cerebrali, caratterizzati da rapida proliferazione, resistenza al trattamento e prognosi^{sfavorevole 1}. Negli ultimi anni sono stati esplorati vari agenti antigliomati, inclusi chemioterapici tradizionali come temozolomide e una serie di composti naturali come^{curcumina 2}, resveratrolo³ e epigallocatequina^{gallato 4}. Questi agenti esercitano i loro effetti attraverso molteplici meccanismi, tra cui l'induzione dell'apoptosi, l'inibizione dell'angiogenesi e la modulazione delle vie di stress ossidativo. Tuttavia, molti di questi composti affrontano limitazioni come scarsa biodisponibilità o caratterizzazione meccanicistica incompleta. Ciò evidenzia la necessità critica di metodologie complete che non solo confermino l'attività antitumorale, ma analizzino sistematicamente i meccanismi farmacologici sottostanti. Stabilire tali flussi di lavoro meccanicistici è particolarmente importante per accelerare lo sviluppo di nuovi composti anti-glioma dalla scoperta alla validazione preclinica.

Per supportare questo obiettivo, un numero crescente di studi ora integra strumenti computazionali e sperimentali avanzati per migliorare la risoluzione^{meccanicistica 5,6}. I modelli di progettazione di farmaci basati sulla struttura e di intelligenza artificiale (IA) — come AlphaFold3 e l'aggancio molecolare — stanno facilitando l'identificazione di promettenti interazioni farmaco-bersaglio con una velocità e una precisione senza^{precedenti 7,8}. Questi strumenti completano i metodi sperimentali prevedendo affinità di legame e identificando potenziali bersagli molecolari prima della validazione in laboratorio. Allo stesso tempo, l'emergere di saghi funzionali basati su percorsi, imaging di cellule vive e tecniche proteomiche ad alta risoluzione permettono ai ricercatori di valutare l'impatto cellulare di nuovi composti su molteplici assi regolatori, inclusi risposte allo stress ossidativo, cascate di trasduzione del segnale e modalità di morte cellulare come la ferroptosi ^9,10,11.

Tra le vie di segnalazione coinvolte nella biologia del glioma, le vie fosfatidilinositol 3-chinasi (PI3K)/Protein Kinase B (Akt) e le vie del fattore eritroide 2-correlato (Nrf2) sono di particolare interesse per il loro ruolo nella crescita tumorale, nell'omeostasi redox e nella resistenza alla terapia ^12,13. La segnalazione PI3K/Akt promuove la sopravvivenza, la proliferazione e l'adattamento metabolico nelle cellule glioma, mentre Nrf2 funge da regolatore principale della risposta antiossidante, sopprimendo la morte cellulare^{ferroptotica 14}. L'attivazione persistente di queste vie contribuisce all'evasione del trattamento, rendendole bersagli attraenti per l'intervento^{farmacologico 15}. I metodi convenzionali per l'interrogatorio delle vie includono il western blotting per proteine totali e fosforilate, nonché la qRT-PCR per l'analisi dell'espressione genica. Tuttavia, un'analisi approfondita della segnalazione Nrf2 richiede ulteriori saggi che valutano la stabilità delle proteine, la traslocazione nucleare e le modifiche post-traduzionali come l'ubiquitinazione. Queste strategie di rilevamento multifaccettate sono essenziali per comprendere come specifici composti interrompano o rafforzino la regolazione redox e il controllo ferroptotico.

La calceolarioside A (CaA), un derivato dell'acido idrossicinnamico, offre un doppio meccanismo inibendo contemporaneamente la segnalazione PI3K/Akt e promuovendo la degradazione proteasomologica di Nrf2, aumentando così la sensibilità ferroptotica. Questa strategia a doppio targeting può migliorare la riproducibilità e la profondità meccanicistica rispetto ad agenti esistenti come l'erastin o l'RSL3, che agiscono a valle delle difese antiossidanti. Questo protocollo presenta un approccio sperimentale integrato per indagare il meccanismo farmacologico del CaA, che include l'aggancio molecolare per identificare i siti di legame del PI3K, immunoblotting e immunoprecipitazione per rilevare l'espressione e l'ubiquitinazione di Nrf2, e marcatori di ferroptosi come specie reattive dell'ossigeno (ROS), glutatione (GSH) e malondialdeide (MDA). Inoltre, un modello di xenoinnesto murino viene utilizzato per valutare l'efficacia terapeutica e la sicurezza sistemica del CaA. Questo flusso di lavoro completo fornisce una piattaforma riproducibile e informativa per studiare il meccanismo d'azione degli agenti anticancro, con particolare attenzione all'integrazione della modulazione delle vie del segnale e della regolazione della morte cellulare.

Protocollo

Coltura cellulare e trattamento
Le cellule neuronali murine HT22 e le linee cellulari umane del glioma U87 e U251 sono state coltivate nel Modified Eagle Medium di Dulbecco, integrato con siero bovino fetale al 10% e 4 mM di L-glutamina, in condizioni umidificate a 37 °C con il 5% di CO₂. Per semplificare la coerenza sperimentale, tutti i trattamenti cellulari sono stati standardizzati e descritti qui. Questa sezione delinea le condizioni specifiche utilizzate in ciascun gruppo di trattamento e i relativi saggi a valle.

Trattamento CaA:
Le cellule HT22 sono state trattate con concentrazioni crescenti di CaA (0, 0,1, 0,5, 1, 10, 50, 100, 250 e 500 μM) per 72 ore. Le cellule gliomali U87 e U251 sono state trattate con CaA a concentrazioni di 5, 20 o 50 μM per 24 ore per la maggior parte degli esperimenti, oppure con 50 μM per 0, 6, 12 o 18 ore per studi temporali. Questi trattamenti sono stati utilizzati nelle seguenti analisi: western blotting per la subunità antiporter cisteina/glutammato (xCT), glutatione perossidasi 4 (GPX4), ferritina (FTH1), glutaminasi e PI3K/Akt/bersaglio mammifero della rapamicina (mTOR)/ fattore di iniziazione eucariotica 4B (EIF4B) (livelli totali e fosforilati); reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR) per Nrf2 e la proteina ECH-associata simile a Kelch 1 (Keap1); misurazione ROS utilizzando diacetato 2′,7′-diclorodiidrofluoresceina (DCFH-DA); quantificazione GSH e MDA; Rilevamento Fe²⁺ basato su FerroOrange; saggio di proliferazione di 5-etinil-2′-desossiuridina (EdU); Analisi di formazione della colonia; Analisi di vitalità cellulare 3-(4,5-dimetiltiazolo-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT).

Co-trattamento con liprosstatina-1 (Lip1):
Le cellule sono state pretrattate con 50 nM Lip1 per 2 ore prima dell'aggiunta di 50 μM CaA. Queste condizioni sono state utilizzate nel test MTT (0, 24, 48, 72 h); analisi di formazione della colonia; Analisi EdU; Saggio di apoptosi Annexin V/PI (con/senza cisplatino a 20 nM).

Co-trattamento MG132:
Le cellule sono state trattate con 10 μM MG132 da sola o combinate con 50 μM CaA per 24 ore. Questo è stato applicato al western blotting per la stabilizzazione della proteina Nrf2 (totale e nucleare); Saghi di immunoprecipitazione (IP) per Nrf2 e Keap1 ubiquitinati.

Co-trattamento con cisplatino:
Le cellule sono state trattate con 20 nM di cisplatino da solo o in combinazione con 20 μM CaA per 24 ore. Questi trattamenti sono stati utilizzati nell'analisi dell'apoptosi con annessa V/propidio ioduro (PI).

Sovraespressione Nrf2 :
Le cellule sono state trasfettate con plasmide di sovraespressione di Nrf2 a 2,5 μg o vettore vuoto utilizzando agente di trasfezione per 18 ore, poi trattate con 50 μM CaA per 24 ore. Questa condizione è stata utilizzata nel western blotting per xCT, GPX4, FTH1 e glutamasi; ROS, MDA, GSH saggi; Colorazione FerroOrange per ferro intracellulare.

Un diagramma del flusso di lavoro (Figura Supplementare S1) riassume le condizioni sperimentali sopra indicate e le relative analisi. Questa figura collega visivamente ogni protocollo di trattamento ai suoi specifici saghi a valle per migliorare chiarezza e riproducibilità.

Valutazione della vitalità cellulare
La vitalità cellulare è stata valutata utilizzando il metodo colorimetrico MTT convenzionale come^{descritto in precedenza 16}. Le cellule HT22, U251 e U87 sono state placcate in piastre di coltura da 96 pozzi e incubate durante la notte per consentire l'aderenza. Dopo il completamento del periodo di trattamento, sono stati introdotti 15 μL di soluzione MTT in ciascun pozzo e le piastre sono state incubate per 4 ore a 37 °C. Il mezzo veniva poi scartato e venivano aggiunti 150 μL di dimetilsolfosido (DMSO) per solubilizzare i cristalli formati di formazan. L'assorbanza veniva successivamente registrata a 490 nm utilizzando un lettore di microplacche. Valori di assorbanza più elevati indicano una maggiore vitalità cellulare, mentre una riduzione dell'assorbanza suggerisce effetti citotossici.

Saggio di incorporazione EdU
Per valutare la sintesi del DNA e la proliferazione cellulare, sono stati eseguiti saghi di incorporazione EdU utilizzando un Kit di Imaging EdU come descritto^{in precedenza 17}. Per un breve periodo, le cellule gliomali di U251 e U87 sono state seminate in piastre a 24 pozzi. Dopo il trattamento, le cellule sono state incubate con EdU (concentrazione finale di 10 μM) e coltivate per ulteriori 24 ore. Dopo la fase di incubazione, le cellule sono state fissate usando paraformaldeide al 4% e poi permeabilizzate con 0,5% di Triton X-100, e colorate secondo le istruzioni del kit. La percentuale di cellule EdU-positive (cellule proliferanti) è stata quantificata tramite microscopia a fluorescenza e normalizzata al totale dei nuclei colorati in 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).

Analisi della formazione della colonia
Per il test di formazione della colonia, le cellule gliomali di U251 e U87 sono state impiattate in piatti da 3,5 cm a bassa densità (500 cellule per piatto). Dopo il trattamento, il mezzo di coltura veniva sostituito da un mezzo fresco e privo di farmaci, e le cellule venivano mantenute per altri 14 giorni per permettere la formazione della colonia, con cambi di mezzo effettuati ogni tre giorni. Le colonie risultanti sono state successivamente fissate usando paraformaldeide al 4%, colorate con lo 0,1% di viola cristallino, e contate manualmente al microscopio. I gruppi di diametro superiori a 75 μm venivano segnati come colonie. Ogni esperimento è stato eseguito in triplicata e ripetuto tre volte. Questo saggio ha seguito i protocolli comunemente accettati per la valutazione della capacità proliferativa a lungo^{termine 18}. Le colonie dovrebbero apparire come gruppi densi e circolari; Meno colonie e più piccole suggeriscono una capacità proliferativa ridotta.

Valutazione dell'apoptosi cellulare
La morte delle cellule apoptotiche è stata valutata utilizzando il kit di rilevamento dell'apoptosi FITC-Annexin V come^{descritto in precedenza 16}. Le cellule gliomate U87 e U251 sono state trattate con 20 nM di cisplatino in presenza o assenza di 20 μM CaA per 24 ore prima della colorazione. Per esperimenti che coinvolgevano l'inibizione della ferroptosi, le cellule sono state pretrattate con 50 nM Lip1 per 2 ore, seguite da un co-trattamento con 20 μM CaA e 20 nM di cisplatino per ulteriori 24 ore. Dopo i trattamenti indicati, le cellule sono state prelevate (300 × g, 5 minuti) e colorate con Annexin V-FITC e PI secondo le istruzioni del produttore. Dopo l'etichettatura, i campioni venivano esaminati su un citometro a flusso. L'acquisizione dati è stata effettuata utilizzando canali FL1 (FITC) e FL2 (PI), con impostazioni di compensazione applicate per minimizzare la sovrapposizione spettrale. La proporzione di cellule V-positive per l'Annessina è stata successivamente calcolata per determinare il grado di apoptosi.

Analisi del western blot
Western blotting è stato condotto secondo procedure^{stabilite 19,20}. Brevemente, dopo i trattamenti indicati, le cellule sono state lisate in un tampone RIPA contenente inibitori di proteasi e fosfatasi, e i livelli proteici sono stati determinati tramite il saggio di Bradford. Per esperimenti che valutavano la distribuzione subcellulare di Nrf2, le proteine nucleari e citoplasmatiche venivano estratte utilizzando un kit di estrazione nucleare commerciale secondo le istruzioni del produttore.

Un totale di 40 μg di proteine da ciascun campione è stato risolto su un gel SDS-PAGE al 10% e successivamente trasferito sulle membrane PVDF. Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% preparato in PBST (PBS con 0,1% Tween-20) per 1 ora a temperatura ambiente, seguita da un'incubazione notturna con anticorpi primari a 4 °C. Dopo il lavaggio, sono stati applicati anticorpi secondari coniugati con HRP (1:5.000) per 1 ora a 37 °C, e i segnali sono stati rilevati tramite un sistema di chemiluminescenza (ECL) potenziata.

Sono stati misurati i livelli di espressione di xCT, glutaminasi, GPX4 e FTH1, utilizzando gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) come controllo del carico. Le proteine fosforilate (p-PI3K, p-Akt, p-mTOR e p-EIF4B) sono state quantificate rispetto ai rispettivi livelli proteici totali, mentre le proteine totali sono state normalizzate rispetto al GAPDH. Il Nrf2 nucleare è stato normalizzato a Lamin B. Gli esiti attesi includono una riduzione dipendente dalla dose e dal tempo di Nrf2 e p-PI3K/Akt/mTOR/EIF4B, e la riduzione della regolazione dei marcatori correlati alla ferroptosi nelle cellule trattate con CaA.

Per i saghi di ubiquitinazione, le cellule sono state trattate con MG132 (10 μM) con o senza CaA (50 μM) per 24 ore. Dopo la lisi, i complessi proteici sono stati immunoprecipitati utilizzando anticorpi anti-Nrf2 o anti-Keap1; IgG normale nel coniglio veniva usato come controllo negativo. Gli immunoprecipitati sono stati poi sondati con anticorpi anti-ubiquitina per rilevare forme ubiquitinate, mentre i lisati totali sono stati anche sondati per i livelli di Nrf2 e della proteina ECH-associata simile a Kelch 1 (Keap1) per confermare l'input.

Estrazione di RNA e PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)
L'estrazione di RNA e la qRT-PCR sono state eseguite seguendo i protocolli^{standard 21}. In breve, le cellule gliomate U87 e U251 sono state trattate con o senza 50 μM CaA per durate diverse (6 e 18 ore). L'RNA totale veniva isolato e convertito in cDNA tramite trascrizione inversa. La PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) veniva eseguita utilizzando un Master Mix SYBR Green qPCR su una piattaforma PCR in tempo reale. L'espressione genica relativa è stata determinata utilizzando il calcolo 2-ΔΔCt. Le sequenze di primer utilizzate per Nrf2, Keap1 e il gene di mantenimento GAPDH erano le seguenti:

Nrf2 in avanti, 5′-CACATCCAGTCAGAAACCAGTGG-3′;
Nrf2 retromarcia, 5′-GGAATGTCTGCCAAAAGCTG-3′

Keap1 in avanti, 5′-CAACTTCGCTGAGCAGATTGGC-3′;
Keap1 retromarcia, 5′-TGATGAGGGTCACCAGTTGGCA-3′

GAPDH avanti, 5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3′;
GAPDH inverso, 5′-AGCCTTCTACATGGTGGTGAAGAC-3′

Trasduzione Nrf2
Le cellule gliomali U251 e U87 sono state trasfettate transitoriamente con un plasmide di sovraespressione Nrf2 o con un corrispondente vettore di controllo vuoto utilizzando il reagente di trasfezione a base di lipidi; La procedura si basava sui metodi convenzionali di trasfezione^{transitoria 22}. Brevemente, le cellule venivano seminate in piastre a 6 pozzi a una densità di 3 × 10⁵ cellule per pozzo e coltivate durante la notte per raggiungere circa il 70-80% di confluenza al momento della trasfezione. Per ogni pozzo, 2,5 μg di DNA plasmidico venivano diluiti in 125 μL di mezzo siero ridotto e mescolati con 5 μL del reagente per la trasfezione. Separatamente, 3,75 μL del reagente di trasfezione sono stati diluiti in altri 125 μL del mezzo sirico ridotti. Le miscele di DNA diluito e reagenti per la trasfezione sono state poi combinate, delicatamente miscelate e incubate per 10-15 minuti a temperatura ambiente per permettere la formazione di complessi. I complessi di trasfezione risultanti (volume totale 250 μL) sono stati aggiunti goccia a goccia a ciascun pozzo contenente cellule in un mezzo fresco e completo.

Dopo 18 ore di incubazione a 37 °C in un incubatore a CO₂, il mezzo di trasfezione è stato sostituito con un mezzo di coltura fresco. Le cellule sono poi state successive analizzate, inclusi western blotting, analisi ROS, quantificazione MDA/GSH e studi sull'accumulo di ferro. Questo protocollo segue procedure di espressione genica transitorie ampiamente accettate e consente un'espressione robusta di Nrf2 entro 24-48 ore dopo la trasfezione.

Misurazione del ferro intracellulare
I livelli intracellulari di Fe²⁺ sono stati misurati utilizzando l'indicatore fluorescente FerroOrange. Cellule di glioma Brief, U251 e U87 sono state seminate in piastre a 24 pozzi e trattate con concentrazioni variabili di CaA (5, 20 e 50 μM). Per valutare l'effetto della sovraespressione di Nrf2 sulla ferroptosi, le cellule U87 e U251 sono state trasfettate con un plasmide di espressione di Nrf2 o un vettore vuoto. Dopo 18 ore, il mezzo veniva sostituito e le cellule venivano trattate con 50 μM CaA per 24 ore. Successivamente, le cellule sono state esposte a 1 μM di FerroOrange in un mezzo siero e incubate a 37 °C per 30 minuti prima dell'analisi. Dopo l'incubazione, le cellule sono state risciacquate e osservate al microscopio a fluorescenza, utilizzando un set di filtri TRITC (eccitazione ~543 nm, emissione 560-600 nm), dove l'aumento dell'intensità di fluorescenza arancione indica livelli più elevati di Fe²⁺ labile, tipicamente localizzato nel citoplasma. Questo metodo è stato adattato da saggi di ferro a base di sonda^{fluorescenti 23}.

Misurazione di GSH e MDA
I livelli intracellulari di GSH e MDA sono stati determinati seguendo protocolli di valutazione standardizzati per valutare lo stress^{ossidativo 24}. Cellule di glioma Brief, U251 e U87 sono state seminate in piastre a 24 pozzi e trattate con concentrazioni variabili di CaA (5, 20 e 50 μM). Per valutare l'effetto della sovraespressione di Nrf2 sulla ferroptosi, le cellule U87 e U251 sono state trasfettate con un plasmide di espressione di Nrf2 o un vettore vuoto. Dopo 18 ore, il mezzo veniva sostituito e le cellule venivano trattate con 50 μM CaA per 24 ore. Successivamente, le cellule sono state lisate nel tampone RIPA e le concentrazioni totali di proteine sono state misurate utilizzando un kit di quantificazione della proteina BCA. I contenuti di GSH e MDA sono stati successivamente analizzati utilizzando kit di rilevamento commerciali in conformità con i protocolli dei produttori.

Analisi ROS
La generazione intracellulare di ROS è stata valutata utilizzando la sonda fluorescente DCFH-DA in conformità con i protocolli^{stabiliti 25}. Cellule di glioma Brief, U251 e U87 sono state seminate in piastre a 24 pozzi e trattate con concentrazioni variabili di CaA (5, 20 e 50 μM). Per valutare l'effetto della sovraespressione di Nrf2 sulla ferroptosi, le cellule U87 e U251 sono state trasfettate con un plasmide di espressione di Nrf2 o un vettore vuoto. Dopo 18 ore, il mezzo veniva sostituito e le cellule venivano trattate con 50 μM CaA per 24 ore. Successivamente, le cellule sono state trattate con 5 μM DCFH-DA a 37 °C per 1 ora, seguite da lavaggi PBS per rimuovere l'eccesso di colorante. I segnali di fluorescenza venivano visualizzati utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita, dotato di un filtro FITC (eccitazione 488 nm, emissione 525 nm), e venivano catturate immagini per l'analisi. L'aumento dell'intensità della fluorescenza verde corrisponde a livelli elevati di ROS intracellulari.

Esperimenti con animali
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio dei National Institutes of Health. Il protocollo è stato approvato dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali del Weifang Peoples Hospital con il numero di approvazione [2025SDL579]. Per generare il modello xenograft del glioma, 2 × 10^{cellule 6} U87 sono state risospese in 0,2 mL di PBS e inoculate sottocutaneamente nel fianco sinistro di topi NUDI BALB/c maschi di 4 settimane. Dopo aver lasciato sviluppare i tumori per 7 giorni, i topi sono stati assegnati casualmente a tre gruppi (n = 8 per gruppo): controllo non trattato, trattamento con CaA (2,5 mg/kg) e CaA (2,5 mg/kg) combinato con Lip1 (10 mg/kg). I trattamenti sono stati somministrati tramite iniezione intraperitoneale giornaliera per 14 giorni consecutivi. Le dimensioni tumorali sono state misurate ogni 3 giorni con calibri e i volumi sono stati calcolati con la formula: volume = (lunghezza × larghezza²) / 2. Al giorno 21, tutti i topi sono stati soppressi e i tumori sono stati espulsi e fotografati per ulteriori analisi.

Sequenziamento dell'RNA e analisi delle vie KEGG
Il sequenziamento dell'RNA è stato eseguito per profilare i cambiamenti trascrizionali dopo l'esposizione al CaA. L'integrità dell'RNA è stata confermata utilizzando uno spettrofotometro UV-VIS a microvolume e un sistema di elettroforesi basato su capillari prima del sequenziamento sulla piattaforma Illumina. Le letture pulite sono state mappate al genoma di riferimento umano (GRCh38) con HISAT2, e l'espressione genica è stata quantificata come FPKM. I geni espressi differenzialmente sono stati identificati utilizzando DESeq2 (FDR < 0,05, |log₂FC| ≥ 1), e l'arricchimento funzionale è stato valutato tramite analisi delle vie KEGG (P < 0,05 aggiustata).

Analisi dell'agganciamento molecolare
L'aggancio molecolare è stato impiegato per prevedere l'interazione tra CaA e la via PI3K/Akt. La struttura cristallina della subunità catalitica PI3K umana p110α (PIK3CA) è stata ottenuta dal Protein Data Bank (PDB ID: 8BFU). La struttura di CaA è stata recuperata da PubChem e minimizzata l'energia utilizzando software di modellazione molecolare. Utilizzando software di preparazione per l'aggancio molecolare, tutte le molecole d'acqua e i liganti non essenziali sono stati rimossi dalla struttura PIK3CA e sono stati aggiunti atomi di idrogeno. Fu definita una griglia di attracco attorno al sito attivo di PIK3CA (basata sulle coordinate note del sito di collegamento) e fu utilizzato un algoritmo di attracco per eseguire l'attracco. Le posizioni di legame con il punteggio più alto di CaA sono state selezionate in base all'affinità di legame (kcal/mol) e esaminate per interazioni chiave. Le interazioni proteina-ligando, come i legami idrogeno e i contatti idrofobi, sono state visualizzate con software di visualizzazione molecolare e uno strumento di mappatura delle interazioni 2D.

Sicurezza e smaltimento dei rifiuti
Tutti gli esperimenti che coinvolgevano reagenti chimici come DMSO, coloranti fluorescenti (DCFH-DA, FerroOrange) e fissativi venivano condotti in una cappa con dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati, inclusi guanti e occhiali di sicurezza. Il DMSO e le sonde fluorescenti sono stati maneggiati con cautela a causa della loro capacità di penetrare la pelle e della potenziale citotossicità. I materiali contaminati, inclusi punte di pipetta, piastre di coltura e guanti, venivano smaltiti in contenitori designati per rifiuti pericolosi. I tessuti e le carcasse animali venivano trattati come rifiuti biopericolosi e venivano inceneriti o autoclavati secondo le normative istituzionali sulla biosicurezza e le linee guida ambientali locali.

Analisi statistica
Tutti i risultati sono presentati come media ± deviazione standard (SD). Le differenze tra i due gruppi sono state valutate utilizzando un test t di Studente a due code. Per le analisi che coinvolgono più gruppi, è stata applicata ANOVA unidirezionale seguita da confronti post hoc adeguati (come il test di Tukey). Un valore p inferiore a 0,05 è stato considerato indicativo della significanza statistica.

Risultati

Soppressione della proliferazione e aumento della chemiosensibilità delle cellule U251 e U87 in vitro tramite CaA
La Figura 1A illustra la struttura di CaA. Abbiamo innanzitutto valutato gli effetti citotossici del CaA utilizzando un test MTT su cellule neuronali normali di HT22 murine e cellule umane glioma U251 e U87. Rispetto alle cellule non trattate (0 μM CaA), CaA ha avuto un impatto minimo sulla vitalità delle cellule HT2...

Discussione

CaA mostra un effetto antitumorale convincente nel glioblastoma modulando in modo unico due assi critici di sopravvivenza: la via PI3K/Akt/mTOR e il meccanismo di difesa Nrf2-ferroptosi. La via PI3K/Akt è frequentemente iperattivata nel glioblastoma multiforme (GBM, alterato fino all'~88-90% dei casi) a causa della perdita di PTEN o attivazione RTK, che favorisce proliferazione e resistenza^{alla terapia 26}. Tuttavia, mirare da solo a questa via ha prodotto una limi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agilent 2100 Bioanalyzer			sistema di elettroforesi capillare
Annexin V-FITC Apoptosis Kit	Roche Diagnostics	11858777001	N/A
AutoDock Tools 1.5.7 (AutoDock Vina)			software di preparazione per il docking molecolare (algoritmo di docking)
Calceolarioside A (CaA)	Sigma-Aldrich	SMB00246	N/A
Chem3D			software di modellazione molecolare
cDNA Synthesis Kit	Vazyme Biotech	R223	N/A
DCFH-DA	Sigma-Aldrich	D6883	N/A
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11965092	N/A
DMSO	Merck	D8418	N/A
FerroOrange probe	Dojindo	F374	N/A
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F2442	N/A
Flow cytometer	BD Biosciences	FACSAriaIII Flow Cytometry	Strumento per l'analisi delle cellule colorate con Annexin V
Fluorescence microscope	Olympus	IX73	Strumento per l'osservazione della fluorescenza di FerroOrange e DCFH-DA
FTH1 antibody	Abcam	ab75973	AB_1310150
GAPDH antibody	Abcam	ab8245	AB_2107448
GLS antibody	Abcam	ab93434	AB_10563527
GPX4 antibody	Abcam	ab125066	AB_10972289
HT22 murine neuronal cell line	AddexBio	C0011008	CVCL_0321
jetPRIME transfection reagent	Polyplus-transfection	114-07	reagente di trasfezione a base di polimero
Keap1 antibody	Abcam	ab139729	AB_2732852
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	N/A
LigPlot+			strumento di mappatura delle interazioni 2D
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific		reagente di trasfezione basato su lipidi
Liproxstatin-1	Selleck	S7699	N/A
MG132	Selleck	S2619	N/A
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific	H1M	Strumento per la misura dell'assorbanza nell'assay MTT (a 490 nm)
MTT	Sigma-Aldrich	M5655	N/A
NanoDrop			spettrofotometro UV-Vis a microvolume
Nrf2 antibody	Abcam	ab62352	AB_945626
Nude BALB/c mice	Vital River, China	N/A	IMSR_CRL:028
OptiMeM reduced serum medium
PyMOL			software di visualizzazione molecolare
QuantStudio 5 Real-Time PCR System
SYBR Green Master Mix	Vazyme Biotech	Q711	N/A
TRIzol Reagent	Thermo Fisher	15596026	N/A
U251 human glioma cell line	CLS Cell Lines Service	300385	CVCL_0021
U87 human glioma cell line	ATCC	HTB-14	CVCL_0022
Ubiquitin antibody	Abcam	ab7780	AB_306981
xCT/SLC7A11 antibody	Abcam	ab175186	AB_2715513