Articolo metodologico

Mappatura a livello genomico delle modifiche degli istoni e dei siti di legame dei fattori di trascrizione nelle linee cellulari neuroendocrine di cancro polmonare a piccole cellule utilizzando CUT&RUN

DOI:

10.3791/69656

⸱

3 aprile 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology and Oncology, Department of Medicine, Cancer Center, Medical College of Wisconsin, 2Linda T. and John A. Mellows Center for Genomic Sciences and Precision Medicine Center Medicine, Medical College of Wisconsin, 3Data Science Institute, Medical College of Wisconsin

In questo articolo

Sommario

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È descritto un protocollo ottimizzato Cliavage Under Target and Release Using Nuclease followed by next generation sequencing (CUT&RUN-seq) per le linee cellulari neuroendocrine di cancro polmonare a piccole cellule. Consente la mappatura genomica a livello genomico di varie modifiche degli istoni e dei siti di legame del fattore di trascrizione (ad esempio E2F7) per indagare la deregolazione epigenetica e trascrizionale nella patobiologia degli SCLC.

Abstract

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Le proteine rimodellanti della cromatina e i fattori di trascrizione (TF) svolgono ruoli fondamentali nella biologia tumorale del cancro polmonare a piccole cellule (SCLC). La caratterizzazione a livello genomico delle modifiche post-traduzionali degli istoni (PTM) e dei siti di legame delle TF è essenziale per identificare elementi regolatori del DNA e vie geniche che porteranno a una comprensione meccanicistica più profonda della SCLC e a indicare bersagli per l'intervento terapeutico. Clivagge Under Target and Release Using Nuclease seguito da sequenziamento di nuova generazione (CUT&RUN-seq) è un metodo potente per mappare specifiche modifiche agli istoni e determinare i profili di legame al DNA di un'ampia gamma di proteine in situ nel genoma cellulare. In CUT&RUN, la nucleasi micrococcica (MNasi) fusa alla proteina A/G viene reclutata tramite anticorpi verso le posizioni genomiche delle proteine associate alla cromatina, dove i frammenti di DNA sottostanti vengono rilasciati dalla cromatina in massa all'attivazione e alla scissione della MNasi. Questa digestione localizzata genera piccoli frammenti di DNA specifici per il locus, adatti al sequenziamento.

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per la profilazione delle modifiche degli istoni H3K4me3 (associata a promotori attivi o aperti) e H3K4me1 (associata a potenziatori attivi), nonché del fattore di trascrizione E2F7, nello SCLC. Questo protocollo è stato ottimizzato per modelli di linee cellulari SCLC neuroendocrine (NE), tipicamente caratterizzate da nuclei grandi, pochi citoplasmati e crescita come aggregati non aderenti in sospensione.

Introduzione

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Le modifiche post-traduzionali degli istone (PTM) e i fattori di trascrizione (TF) sono regolatori centrali dell'espressione genica. I PTM degli istone, come acetilazione, metilazione, fosforilazione e ubiquitinazione, principalmente sulle code N-terminali, influenzano la strutturadella cromatina 1,2. Nel cancro, le PTM degli istoni sono spesso disregolate, portando all'attivazione aberrante degli oncogeni o al silenziamento dei geni soppressoritumorali 3. I TF legano sequenze specifiche di DNA presso promotori o potenziatori per attivare o reprimere i geni bersaglio, spesso reclutando enzimi modificatori delle istone che coordinano il rimodellamento dellacromatina 4. Gli enzimi che scrivono, cancellano o leggono i segni degli istoni, come le acetiltransferasi degli istoni (HAT), le deacetilasi degli istoni (HDAC) e le metiltransferasi (HMT), sono frequentemente mutati o disregolati nel cancro, rendendoli bersagli terapeuticiattraenti 5.

Nella SCLC, i cambiamenti epigenetici e i fattori di trascrizione che definiscono la linea di discendenza (LDTF) sono fattori chiave della biologiatumorale 6. A differenza delle mutazioni genetiche, le alterazioni epigenetiche, inclusa la metilazione del DNA e le modifiche agli istoni, regolano l'espressione genica senza modificare la sequenza di DNA sottostante. Queste modifiche possono mettere a tacere i geni soppressori tumorali o attivare oncogeni, alimentando il comportamento aggressivo dello SCLC. Ad esempio, la metiltransferasi dell'istone KMT2D è frequentemente mutata con una frequenza di alterazione del 12,9% in una grande coorte di pazienti SCLCreali 7 ed è responsabile della mono-metilazione della lisina 4 dell'istona H3 (H3K4me1), un segno associato alle regioni potenziatrici attive nel genoma. La SCLC è una malattia molecolare eterogenea. Gli SCLC sono classificati in sottotipi molecolari basati sull'espressione differenziale di quattro LDTF: omologo dell'achaete-scute 1 (ASCL1), fattore di differenziazione neurogenica 1 (NEUROD1), proteina associata sì 1 (YAP1) e homeobox di classe 2 POU (POU2F3). I sottotipi neuroendocrini (NE), inclusi ASCL1 e NEUROD1, rappresentano circa il 70-80% dei casiSCLC 8. Pertanto, indagare la distribuzione e i profili dei diversi PTM degli istoni e dei siti di legame TF nei vari sottotipi SCLC può chiarire programmi genici specifici per sottotipo vulnerabili a interventi terapeutici.

Il metodo tradizionale per identificare le PTM degli istoni e i siti di legame delle proteine regolatorie specifiche per la sequenza a livello genomico è il sequenziamento da immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-seq)9. Tuttavia, ChIP-seq richiede un gran numero di cellule di ingresso e spesso produce un alto background in tutto il genoma. Di conseguenza, ChIP-seq richiede un alto livello di arricchimento della proteina bersaglio per distinguere il vero segnale dal rumore e necessita di un sequenziamento profondo per un'analisi efficace dei dati. Inoltre, il reticolamento con formaldeide utilizzato nel ChIP-seq può mascherare epitopi e generare siti di legame falsipositivi 10. Clivagge Under Target and Release Using Nuclease seguito da sequenziamento di nuova generazione (CUT&RUN-seq) è un'alternativa ad alta risoluzione per mappare i PTM degli istoni e i siti di legame TF in situ all'interno delle cellule intate. In questo metodo, le cellule permeabilizzate vengono incubate con un anticorpo che mira la proteina associata alla cromatina di interesse, seguita dal legame di una proteina di fusione della proteina A(G)-nucleasi micrococcica (MNasi). La digestione mirata del DNA che aggira la proteina di interesse viene quindi indotta in condizioni ad alto contenuto di calcio e basso contenuto di sale, rilasciando frammenti specifici di DNA per la purificazione. I frammenti di DNA purificati vengono utilizzati per costruire librerie di sequenziamento con codice a barre, che possono essere aggregate per il sequenziamento ad alta velocità 11,12,13,14. Rispetto a ChIP-seq, CUT&RUN richiede significativamente meno cellule in ingresso, produce meno rumore di fondo, evita artefatti di reticolazione e richiede meno letture di sequenziamento - rendendolo particolarmente adatto per studiare gli stati dinamici della cromatina nel cancro in modo economico.

La tecnologia CUT&RUN è stata sviluppata per indagare le posizioni genomiche delle proteine interagenti con la cromatina, incluse modifiche agli istoni, siti di legame TF e complessi associati alla cromatina, rivelando così paesaggi regolatoriepigenetici 11,12. Questa tecnica ha permesso analisi dettagliate dell'architettura potenziatore-promotore, della regolazione della rete trascrizionale e della dinamica dello stato della cromatina durante lo sviluppo e la progressione dellamalattia 15. Nella ricerca sul cancro, CUT&RUN consente una mappatura precisa dei segni diistone 16,17 e dell'occupazione dei fattori di trascrizione oncogenica, aiutando a identificare programmi regolatori specifici per linea di linea e potenziali target terapeutici15,16. Inoltre, CUT&RUN può essere eseguito in situ in cellule, inclusa la cellula TCD8+ 17, così come su campioni tissutali18,19.

Per rilevare la localizzazione genomica dei PTM e dei siti di legame del fattore di trascrizione E2F7 nei sottotipi SCLC, abbiamo applicato CUT&RUN-seq a quattro modelli di linea cellulare SCLC NE: H146 e DMS79 (sottotipo ASCL1), oltre a H446 e H82 (sottotipo NEUROD1), con o senza mutazioni KMT2D. Abbiamo profilato il marchio degli istoni H3K4me1, una modifica associata all'enhancer principalmente catalizzata da KMT2D, ed E2F7, che si è dimostrato essere un cofattore diASCL1 20. Il marchio degli istoni H3K4me3, associato ai promotori attivi, fungeva da controllo positivo, mentre IgG fungeva da controllo negativo.

Qui presentiamo un protocollo dettagliato CUT&RUN-seq per le linee cellulari SCLC NE, basato sui seguenti punti: un kit CUT&RUN disponibile in commercio (vedi Tabella dei Materiali), il lavoro originale di Skene e Henikoff 11,12,13 e le nostre ottimizzazioni di laboratorio.

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Protocollo

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NOTA: Questo protocollo (Figura 1) fornisce istruzioni passo dopo passo per eseguire CUT&RUN-seq nelle linee cellulari SCLC NE, che tipicamente crescono come aggregati non aderenti o cluster fluttuanti.

1. Coltura cellulare

  1. Mantenere le linee cellulari DMS79 (sottotipo ASCL1), H146 (sottotipo ASCL1), H82 (sottotipo NEUROD1) e H446 (sottotipo NEUROD1) in 13 mL di substrato RPMI-1640 integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina (vedi Tabella dei Materiali) in fiaschette da 75 mL. Coltivare le cellule in un incubatore a 37 °C con il 5% diCO2.
    NOTA: Tutte le celle utilizzate in questo studio sono state acquistate dall'ATCC e sono state autenticate con brevi ripetizioni in tandem.

2. Permeabilizzazione cellulare

NOTA: Una corretta permeabilizzazione cellulare è essenziale per permettere agli anticorpi, alla pAG-MNasi e ai frammenti di proteina-DNA digeriti di diffondersi liberamente dentro e fuori dalle cellule. Prima di iniziare il protocollo CUT&RUN su una nuova linea cellulare, dovrebbero essere effettuate ottimizzazioni per determinare la concentrazione ideale di digitonina per un'efficace permeabilizzazione. La concentrazione più bassa per raggiungere una permeabilizzazione superiore al 95% (95% delle cellule "morte") dovrebbe essere utilizzata per il protocollo CUT&RUN.

  1. Mettere il stock di digitonina al 5%, l'inibitore della proteasi e la spermidina sul ghiaccio e lasciarli scongelare completamente.
  2. Prepara il tampone di lavaggio secondo la Tabella 1 e tieni il tampone sul ghiaccio.
  3. Prepara una soluzione lavorativa di digitonina allo 0,05% mescolando 10 μL del materiale al 5% con 990 μL di tampone di lavaggio. Mescola bene con vortice e tieni sul ghiaccio.
  4. Generare una serie di diluizione di digitonine (0,05%, 0,01%, 0,001% e 0,0001%)" diluendo sequenzialmente la soluzione precedente in un volume finale di 1 mL di ogni provetta. Vortice ogni diluizione prima di procedere alla successiva. Contemporaneamente, preparare un controllo allo 0,05% di Dimetil Solfossido (DMSO) in Wash Buffer (100 μL totali; vedi Tabella 2).
    NOTA: Digitonina e DMSO sono sostanze chimiche pericolose. Maneggiare con cautela e gettare tutti i rifiuti in un contenitore per rifiuti pericolosi correttamente etichettato con coperchi sicuri.
  5. Tieni tutte le soluzioni di diluizione della digitonina e il controllo DMSO sul ghiaccio fino a quando non vengono utilizzate.
  6. Determina il numero di cellule necessarie moltiplicando il numero di condizioni di permeabilizzazione per il numero di celle richieste per test. Includere un ulteriore 20% per compensare la variazione della pipettura (ad esempio, per cinque condizioni a 5×105 celle ciascuna, preparare circa 1,2 x 5 x 5 x 105 cellule).
  7. Raccogliere il numero richiesto di cellule coltivate tramite centrifugazione a 600 × g per 3 minuti a temperatura ambiente (RT). Risospendere il pellet a 600 μL di 1× PBS (100 μL per condizione più il 20% in più).
  8. Aliquota 100 μL delle celle risospese con PBS in cinque tubi microcentrifughe da 1,5 mL - uno per ogni concentrazione di digitonina e uno per il controllo DMSO.
  9. Centrifuga i tubi a 600 × g per 3 minuti a RT.
  10. Rimuovere con attenzione il sovrantante e risospendere ogni pellet a 50 μL del correspondente buffer di controllo digitonina o DMSO.
  11. Incubare i campioni a RT per 10 minuti.
  12. Mescolare 10 μL delle cellule trattate con 10 μL di blu di tripano e caricare 10 μL della miscela su un vetrino per il conteggio cellulare.
  13. Usa un contatore cellulare per quantificare cellule vitali (non colorate) e non vitali, permeabilizzate positive (colorate di blu).
  14. Identificare la concentrazione più bassa di digitonina che produce la più alta proporzione di cellule positives al blu di tripano. Usa questa concentrazione per l'esperimento a valle CUT&RUN. Conferma che il controllo DMSO mantenga la vitalità tipica di una coltura cellulare sana normale.

3. SEQ DI TAGLIO E CORSA

NOTA: I reagenti in questo protocollo sono scalati per 5 reazioni, con aggiunte aggiuntive per compensare la perdita di pipetta. Per un elenco di materiali e attrezzature, consulta la Tabella dei Materiali. Sono raccomandate almeno due repliche biologiche indipendenti per ogni esperimento CUT&RUN.

  1. Giorno 1
    1. PREPARAZIONE DEL BUFFER TAGLIA E RUN
      1. Preprepara il tampone di lavaggio combinando il tampone pre-lavaggio, 25x inibitore della proteasi e 1 M di spermidina come indicato nella Tabella 3.
      2. Prepara il tampone di permeabilizzazione cellulare aggiungendo il 5% di Digitonina al tampone di lavaggio secondo la Tabella 3.
      3. Preparare il tampone di anticorpi aggiungendo 0,4 μL di EDTA a 100 μL di tampone di permeabilizzazione cellulare con la giusta concentrazione di digitonina, come descritto nella Tabella 3. Metti il tampone preparato sul ghiaccio.
      4. Conservare il restante Cell Permeabilization Buffer a 4 °C per l'uso al secondo giorno.
    2. Attivazione delle perle della concanavalina A (ConA)
      1. Sospezione delicata della sospensione delle perline ConA per garantirne una distribuzione uniforme.
      2. Trasferire 55 μL della sospensione delle sfere (11 μL per campione) in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
      3. Posiziona il tubo su un rack magnetico da 1,5 mL finché le sfere non si sono completamente separate, poi pipetta per rimuovere il surnadante.
      4. Lavare immediatamente le sfere due volte con 500 μL di tampone di attivazione delle perle gelato (100 μL per campione). Sospezione le perline con una pipetta delicata ad ogni lavaggio e usa il rack magnetico per eliminare il surnatant tra un lavaggio e l'altro.
      5. Dopo il lavaggio finale, rimuovere il sovrantantante e sospendere delicatamente le sfere attivate in 55 μL (11 μL per campione) di tampone di attivazione a sfera gelate.
      6. Aliquota 10 μL delle perline sospendono in ogni tubo di un set a 8 strisce e mantengono i tubi sul ghiaccio.
    3. Prelevare cellule e legare le cellule a perle attivate
      NOTA: La vitalità cellulare è importante per il rapporto segnale/background. Tuttavia, la vitalità delle linee cellulari NE della SCLC può variare (70%-90%) a causa dell'elevato tasso intrinsecamente elevato di ricambio cellulare e della preferenza per la crescita come aggregati di medie-grandi dimensioni in sospensione.
      1. Rimuovi le cellule dall'incubatore a 37 °C ed esaminale al microscopio per garantirne la qualità.
      2. Trasferire la sospensione della cella su un tubo conico da 50 mL e centrifugare a 1.000-1.200 × g per 5 minuti a RT.
      3. Aspirare il mezzo dal tubo conico e risciacquare il pellet cellulare con 20 mL di 1× PBS.
      4. Centrifuga di nuovo, aspira il PBS e digerisce il pellet con Accutase per 3-5 minuti a 37°C, in base alla dimensione del pellet.
      5. Interrompi la digestione aggiungendo 5 mL di PBS + 10% di FBS. Ottieni la sospensione monocellulare pipettando delicatamente su e giù con una pipetta sierologica.
      6. Centrifugare le celle a 1.000-1.200 × g per 5 minuti, scartare il sovrantantante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di PBS.
      7. Contare le cellule di partenza, confermare la vitalità e l'integrità cellulare.
      8. Calcola il numero totale di cellule necessarie moltiplicando il numero di reazioni per il numero di cellule per reazione (5×105). Aggiungere un eccesso del 20% per compensare gli errori di pipetting (ad esempio, 1,2 × 6 × 5 × 105 per 6 reazioni). Trasferire le sospensioni a celle calcolate su tubi da 1,5 mL. Centrifuga a 600 x g, 3 min a RT.
        NOTA: Prepara almeno una reazione aggiuntiva come riserva.
      9. Risospendere le celle nel RT Wash Buffer a una densità di 5×105 celle per reazione (sei reazioni in totale), utilizzando 100 μL per reazione, con un pipetto delicato ma accurato per garantire una sospensione uniforme. Centrifugare a 600 x g per 3 minuti a RT. Pipette per rimuovere il surnadante.
      10. Ripeti ancora una volta il passaggio di lavaggio (Passo 9).
      11. Aliquota 100 μL di cellule lavate per ogni tubo del set a 8 strisce contenente 10 μL di sfere di CoA attivate. Pipetta delicatamente per mescolare e gira rapidamente in una mini centrifuga per raccogliere la pasta (le perline non dovrebbero depositarsi).
      12. Incubare la pasta delle cellule a perla per 10 minuti a RT per permettere alle cellule di legarsi alle perle.
      13. Posiziona i tubi su un rack magnete da 0,2 mL, lascia che la pasta si liberi e pipetta per rimuovere il surnadante. Risparmia 10 μL di sovrantantante per confermare che le cellule sono legate alle perle. Scartate il supernatant rimasto e passate rapidamente al passo successivo.
      14. Rimuovi i tubi dal magnete. Aggiungi immediatamente 50 μL di buffer anticorpale gelato a ogni reazione e fai una pipetta delicata per risospendere le sfere.
      15. Miscela 10 μL sia del sovrandante che 10 μL della sospensione cellula/perla (risospesa in Antibody Buffer) con 10 μL di blu tripano e carica la miscela sul vetrino cellulare contro.
      16. Analizza con un contatore cellulare. Conferma che il sovrantantante contiene quasi nessuna perla o cellula, e che la miscela di sfera/cellula contiene cellule permeabilizzate circondate da perline.
        NOTA: È importante verificare la compatibilità del legame delle perle di CoA delle Celle.
    4. Permeabilizzazione e legame degli anticorpi
      NOTA: Il successo di CUT&RUN dipende in modo critico dall'affinità dell'anticorpo per il suo bersaglio e dalla sua specificità in specifiche condizioni sperimentali. Raccomandiamo quanto segue: 1. Utilizzare anticorpi commerciali validati per CUT & RUN quando disponibili. 2. Per bersagli senza anticorpi validati CUT&RUN, si considerino quelli validati per immunofluorescenza (IF), poiché gli anticorpi IF riconoscono epitopi nel loro contesto cellulare nativo, simile al legame in situ dell'anticorpo al bersaglio all'interno delle cellule permeabilizzate in CUT&RUN. 3. Testare 3-5 anticorpi in parallelo per identificare quello più efficace per la tua applicazione specifica.
      1. Gira rapidamente il pannello K-MetStat e la pipetta per sospendere. Aggiungere 2 μL di pannello K-MetStat alle reazioni designate per gli anticorpi di controllo H3K4me3 positivo e IgG negativo. Pipetta per mescolare e tubi a centrifuga rapida (opzionale).
      2. Aggiungere 0,5 μg ciascuno di anticorpi H3K4me3, H3K4me1 e IgG, e 0,6 μg di anticorpi policlonali E2F7 da fonti diverse per ciascuna reazione (Tabella 4). Etichetta i tubi a 8 strisce.
      3. Pipetta delicatamente per mescolare correttamente ogni tubo di reazione. Incubare durante la notte a 4 °C su un nutator con i tappi dei tubi sollevati. Non ruotare o invertire i tubi.
  2. Giorno 2
    1. Legame della pAG-MNasi all'anticorpo
      NOTA: Le perline che si depositano durante la notte è normale e non influisce sui risultati. Se le perline diventano grumosse o appiccicose dopo l'incubazione notturna, sospendere le perline con una pipettatura delicata. Per migliorare la coerenza e la capacità di produzione, si raccomanda il pipetting multicanale. Quando si usano tubi a 8 strisce, rimuovere e sostituire i buffer una striscia alla volta per evitare che le perline ConA si secchino.
      1. Metti il supporto magnetico sul ghiaccio.
      2. Rimuovi i tubi a 8 strisce dall'incubazione a 4 °C e dai rapidi centrifughi per raccogliere il liquido.
      3. Metti i tubi sul supporto magnetico finché la pasta non si libera. Pipetta con attenzione e rimuovi il soprantantante.
      4. Tieni i tubi sul supporto magnetico. Lavare i tubi due volte con 200 μL di tampone di permeabilizzazione cellulare fredda. Pipetta per rimuovere il soprantantante.
      5. Rimuovere i tubi dal supporto magnetico e aggiungere immediatamente 50 μL di Cold Cell Permeabilization Buffer a ogni reazione. Pipetare delicatamente per risospendere cellule/perline.
      6. Aggiungi 2,5 μL di pAG-MNasi a ogni reazione e mescola bene pipettando delicatamente.
      7. Incuba le reazioni per 10 minuti in tempo di terapia respiratoria.
      8. Fai girare velocemente i tubi, rimettili sul supporto magnetico, finché la pasta non si libera. Pipetta per rimuovere il soprantantante.
      9. Tenendo i tubi sul supporto magnetico, lavare i tubi due volte con 200 μL di tampone di permeabilizzazione cellulare fredda. Pipetta per rimuovere il soprantantante.
      10. Rimuovere i tubi dal supporto magnetico, risospendere delicatamente in 50 μL di tampone di permeabilizzazione cellulare fredda. Metti i tubi sul ghiaccio.
    2. Digestione e rilascio mirati della cromatina
      NOTA: Eseguire una digestione dipendente da Ca2+ a 0 °C per minimizzare la cissione non intenzionale della MNasi del DNA12 accessibile. Includere il DNA spike-in, come Escherichia coli (E. coli), in modo che rappresenti circa lo 0,5-5% (idealmente ~1%) del totale del sequenziamento13. Il DNA spike-in viene utilizzato per normalizzare la profondità di sequenziamento ed è particolarmente importante quando si confrontano campioni in una serie, ad esempio nella valutazione dei cambiamenti globali nella modifica degli istoni dopo l'inibizione o la delezione genetica degli enzimi modificanti degli istoni.
      1. Aggiungi 1 μL di 100 mM di cloruro di calcio a ciascuna reazione nella striscia a 8 tubi (dal passo 3.2.1.10) mentre si è sul ghiaccio. Pipetta delicatamente per risospendere completamente le perline e garantire una digestione efficiente.
      2. Incubare i tubi su un nutator a 4 °C per 2 ore, con le estremità tappate sollevate.
      3. In un nuovo tubo da 1,5 mL, prepara il Stop Buffer Mix. Per ogni reazione, si combinano 33 μL di Stop Buffer con 1 μL di DNA spike-in di E. coli (0,5 ng). Vortice delicato per mescolare.
      4. Aggiungere 33 μL di buffer di stop a ciascuna reazione al termine delle 2 ore di incubazione. Mescola con pipettura delicata.
      5. Incubare le reazioni in un termociclatore a 37 °C per 10 minuti.
      6. Fai girare rapidamente i tubi per raccogliere il contenuto sul fondo, poi posizionarli su un portacalamite finché la soluzione non diventa trasparente.
      7. Trasferire con attenzione circa 84 μL di soprantantante che contiene il DNA rilasciato da CUT & RUN in tubi freschi da 1,5 mL.
    3. Purificazione del DNA utilizzando il DNA Purification Kit (vedi Tabella dei Materiali)
      NOTA: Prima del primo utilizzo, aggiungere 6,9 mL di isopropanolo al DNA Binding Buffer e aggiungere 20 mL ≥ etanolo al 95% al DNA Wash Buffer.
      1. Aggiungi 420 μL di DNA Binding Buffer a ciascun supernatant raccolto. Vortice per un breve periodo per mescolare a fondo.
      2. Metti una colonna di pulizia del DNA nei suoi tubi di raccolta.
      3. Carica ogni campione sulla colonna corrispondente.
      4. Centrifugare a 16.000 × g per 30 secondi a RT. Scartare il flusso e riportare la colonna nel tubo di raccolta.
      5. Aggiungi 200 μL di buffer di lavaggio del DNA a ciascuna colonna e centrifuga a 16.000 x g per 30 secondi a RT. Scartare il flusso e rimettere la colonna nel tubo di raccolta.
      6. Ripeti il passaggio del lavaggio una volta.
      7. Centrifugare di nuovo a 16.000 x g per 30 secondi a RT per rimuovere completamente il residuo di tampone di lavaggio.
      8. Trasferire le colonne su tubi etichettati da 1,5 mL.
      9. Applicare 12 μL di Elution Buffer direttamente sulla membrana al centro della colonna.
      10. Incubare per 5 minuti a RT e poi centrifugare a 16.000 × g per 1 minuto a RT per eluire il DNA.
        NOTA: Questo è un punto di sosta sicuro. Conservare il DNA eluzionato a -20 °C per una futura elaborazione.
    4. Quantificazione del DNA CUT&RUN e analisi della distribuzione delle dimensioni dei frammenti
      NOTA: Quantificare il DNA utilizzando un fluorometro con il kit di analisi ad alta sensibilità dsDNA, che fornisce misurazioni più accurate del DNA a doppio filamento rispetto ai metodi basati su assorbenza.
      1. Utilizzare 1 μL di ciascun campione per determinare la concentrazione di DNA CUT&RUN utilizzando il kit di analisi ad alta sensibilità dsDNA (vedi Tabella dei Materiali).
      2. Utilizzare un ulteriore 1 μL di DNA per valutare la presenza e la distribuzione delle dimensioni dei frammenti tagliati. Eseguire l'analisi dei frammenti utilizzando il kit di DNA ad alta sensibilità (vedi Tabella dei Materiali) seguendo le linee guida del produttore (opzionale).
        NOTA: Proteine di legame altamente abbondanti, come le modifiche post-traduzionali degli istoni (PTM), possono essere facilmente rilevate in questa fase. Tuttavia, i fattori di trascrizione a bassa abbondanza possono essere più difficili da rilevare.
    5. Costruzione della libreria, analisi dei frammenti e sequenziamento
      NOTA: ≤5 ng di DNA totale CUT&RUN, come determinato dalla quantificazione del dsDNA High Sensitivity Assay Kit, è stato utilizzato per la costruzione delle librerie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) di CUT&RUN. Per minimizzare i dimer degli adattatori, riduci l'adattatore da Illumina a 1 μL per la legazione dell'adattamento. Il numero di cicli PCR durante la costruzione della biblioteca può essere regolato in base alla quantità di input, alla resa della libreria e al tasso di duplicazione. Diverse strategie di selezione della dimensione delle Sfere magnetiche (vedi Tabella dei Materiali) possono essere utilizzate a seconda dei PTM o fattori di trascrizione bersaglio-istone.
      1. La costruzione della biblioteca è stata realizzata utilizzando il kit di preparazione CUT&RUN (vedi Tabella dei Materiali) secondo le istruzioni del produttore del kit, con piccole modifiche. In breve, 5 ng di CUT&RUN DNA venivano utilizzati come input raccomandato per la preparazione della biblioteca. Per DNA inferiore a 5 ng, usa il più possibile per la preparazione della biblioteca. Per ogni campione venivano utilizzati due primer indice i5 e i7 per garantire un sequenziamento multiplexato efficace.
        NOTA: Questo è un punto di sosta sicuro. Il DNA può essere conservato a -20°C per ulteriori elaborazioni.
      2. Misura la concentrazione della libreria CUT&RUN con un fluorometro e il kit di test ad alta sensibilità dsDNA. La distribuzione delle dimensioni delle librerie NGS CUT&RUN è stata determinata utilizzando il Kit di DNA ad Alta Sensibilità (vedi Tabella dei Materiali) basato sulla Guida del Kit di Alta Sensibilità o su uno strumento analogo di elettroforesi capillare, TapeStation (vedi Tabella dei Materiali).
        NOTA: Diluire la libreria CUT&RUN per portare la concentrazione all'interno del raggio di rilevamento del dsDNA High Sensitivity Assay Kit e del High Sensitivity DNA Kit.
      3. Librerie pool (40-46) basate su indici molecolari e unici uguali. Dopo la purificazione del DNA per la selezione delle dimensioni delle Magnetic Beads, il sequenziamento a estremità accoppiata (lunghezza di lettura di 100 bp) per le librerie aggregate è stato eseguito su un sistema Illumina NovaSeq 6000 per metà S-Prime (SP) a una profondità di lettura stimata di 10 milioni di letture per libreria.
    6. Analisi dei dati CUT&RUN
      1. Analizza i dati CUT&RUN utilizzando una pipeline personalizzata (Figura 5A). Valuta la qualità della lettura con FastQC. Rimuovi le sequenze degli adattatori dall'inizio delle letture usando Cutadapt. Allineare le letture a estremità accoppiate al genoma umano (hg38) e il genoma di riferimento di E. coli con Bowtie2. Usa Samtools per rimuovere le letture non mappate. Rimuovi le letture duplicate con Picard e genera file bedGraph usando Bedtools. Crea file bigWig (bw) con DeepTools. Visualizza i dati usando IGV e DeepTools. Normalizzare il totale delle letture al conteggio di letture spike-in di E. coli. Eseguire chiamate di picco utilizzando SEACR (Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN)19.

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Risultati

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Le linee cellulari tipiche o "classiche" della SCLC NE sono caratterizzate da nuclei grandi, citoplasma scarso e crescita come aggregati non aderenti o sferoidi compatti in sospensione. Le linee cellulari ad alto contenuto di ASCL1, come NCI-H146 e DMS79, e le linee cellulari ad alto NEUROD1 livello di ASCL1, come NCI-H82 e H446, mostrano questo classico fenotipo SCLC: cellule di piccole e medie dimensioni con scarso citoplasma, cromatina finemente granulare e una tendenza a crescere pre...

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Discussione

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La disregolazione epigenetica e le LDTF sono i principali fattori che determinano la biologia tumoraledegli SCLC 6. Determinare la distribuzione genomica di specifiche modifiche agli istoni e proteine di legame al DNA nello SCLC può rivelare potenziali meccanismi di resistenza terapeutica acquisita e plasticità fenotipica. CUT&RUN-seq è un metodo potente per mappare le interazioni proteina-DNA tra istoni e non istoneni ad altarisoluzione 14...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata supportata dal K08CA241309 NCI (PI: Hui-Zi Chen), dall'ACS IRG Award (PI: Hui-Zi Chen) e dall'American Lung Association Lung Association Lung Cancer Discovery Award (PI: Hui-Zi Chen). Il sequenziamento è stato eseguito presso il Linda T. and John A. Mellowes Center for Genomic Sciences and Precision Medicine. Ringraziamo inoltre tutti i membri del laboratorio per i loro punti di vista e il supporto a questo lavoro.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
reagente
RPMI-1640 media Gibco ThermoFisher Scientific11875093Mezzo di coltura cellulare
Siero Fetale Bovino (FBS)NevrologiaFBS002-HIComponente del mezzo di coltura cellulare
1% Penicillina-Sstreptomicina  Gibco ThermoFisher Scientific15140122Antibiotici, per prevenire la contaminazione batterica delle colture cellulari
Soluzione Trippan Blue, 0,4%Gibco ThermoFisher Scientific15250061La colorazione blu di tripano è stata utilizzata per valutare la permeabilità con un contatore cellulare automatizzato.
Roche cOmplete, cocktail inibitore Proease senza EDTARoche11873580001Inibitore della proteasi. Componenti del wash buffer
5% Digitonin EpiCypher21-1004Componenti buffer  e la ricetta del tampone si trova nel foglio del tampone
Buffer di attivazione delle perleEpiCypher21-1001Componenti buffer  e la ricetta del tampone si trova nel foglio del tampone
Perle Concanavalin A (ConA)EpiCypher21-1401Le microsfere paramagnetiche coniugate con ConA sono perle magnetiche rivestite di lectine che permettono il legame delle membrane lipidiche
CUT& RUN Kit CUTANA ChIC EpiCypher14-1048Reagenti per CUT & Generazione di DNA RUN
Kit di purificazione del DNACUTANA  EpiCypher14-0050Estrarre il DNA dai frammenti di DNA bersaglio rilasciati nel supernante nella reazione
CUT& Kit di preparazione della biblioteca RUNCUTANA EpiCypher14-001Genera il CUT& RUNA le librerie di sequenziamento di nuova generazione (NGS)
  Purificazione del DNA Sfere magneticheAgencourt AMPure XP Beckman CoulterA63880Pulizia del prodotto PCR e selezione della dimensione (cioè rimozione dimer e primer adattatori)
DNA spik-in di E. coliEpiCypher18-1401Utilizzato come spike-in esogeno per calibrare le letture di sequenziamento su una serie di campioni & mdash; ad esempio, condizioni trattate contro non trattate
pAG-MNasiEpiCypher  15-1016Un'adesione all'anticorpo primario, l'enzima taglia il frammento di DNA bersaglio su entrambi i lati della proteina legata quando viene attivato dal calcio
PBS PH7.4 1xGibco (Thermo Fisher Scientific)10010-049Lavaggio delle celle
Tampone pre-lavaggioEpiCypher21-1002Componenti buffer  e la ricetta del tampone si trova nel foglio del tampone
dsDNA Alta Sensibilità   Kit per il testQubitTM Thermo Fisher ScientificQ32854CUT& Quantificazione del DNA RUN
Buffer di fermamentoEpiCypher21-1003Componenti buffer  e la ricetta del tampone si trova nel foglio del tampone
Kit di DNA ad alta sensibilità  Tecnologie Agilent5067-4626CUT& Analisi della quantificazione delle biblioteche del DNA e NGS di RUN e distribuzione delle dimensioni dei frammenti
Materiale
Tubi PCR a 8 strisce da 0,2 mLEpiCypher10-0009kTubi per CUT & RUN Reaction compatibili con i tubi da 0,2 ml Magnetic Separation Rack
Diapositive LUNA a 8 canaliLogos BioSystems INCL72001Diapositive per il conteggio delle celle,   Controllo della vitalità e dell'integrità delle celle
Serbatoio multicanale di reagentiFisher Scientific14-387-072Contenitore tampone per lavaggio
DynaMagTM-2 (Rack di separazione magnetica), tubi da 1,5 mLThermo Fisher Scientific12321DLe sfere ConA venivano isolate dal loro buffer di stoccaggio tramite rack di separazione magnetica e successivamente attivate tramite risospensione in buffer di attivazione in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
Rack di separazione magnetica, tubi da 0,2 mLEpiCypher10-0008Stai in piedi per separare  cellule che legano le sfere, anticorpi, pAG/MNasi da reazioni e tamponi di lavaggio
Eppendor Research più 8-Channel Pipette, 0,5-10 uL Eppendorf3125000010Campioni dei tubi a 8 strisce a aspirazione   Per accelerare il flusso di lavoro, un pipettor multi-canale comparabile
Pipetta Eppendorf Refrence 2 a 8 canali, 30-300 uLEppendorf4926000050Fasi di aspirazione e lavaggio per accelerare il flusso di lavoro, pipettor multi-canale comparabile
Equipaggiamento
Miscelatore Vortex-Genie 2 Scientific Industries, velocità variabile, 120VFisher Scientific50-728-002Min-centrifuga e spin
LUNA FX7 Contatore automatico di celleLogos BioSystems INCL70001Contatore Celle
Mixer di nutazioneVWR82007-202Fasi di incubazione delle sfere (incubazione notturna degli anticorpi, reazione di digestione pAG-MNasi).
Eppendorf 6331 Nexus Gradient MasterCycler Thermal CyclerEppendorf6331CUT& Costruzione di biblioteche di nuova generazione RUN
Fluorometro Qubit 4Thermo Fisher ScientificD33226Quantificazione del DNA.
Bioanalizzatore Agilent 2100Tecnologie AgilentG2939ADimensione del frammento, analisi della concentrazione per CUT & RUNA DNA e CUT& RUN libraries,   strumento di elettroforesi capillare comparabile (ad esempio Agilent TapeStation)
Agilent TapeStationTecnologie AgilentG2992AADimensione del frammento, analisi della concentrazione per CUT & RUNA DNA e CUT& RUN: Librerie
Sistema Illumina NovaSeq 6000  Illumina, San Diego, CA, USASequenziamento del CUT & Pool RUN librerie  

Riferimenti

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