È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo di ricerca

Regolazione della via AKT/Wnt/β-catenina e induzione della cuproptosi da parte della curcumina nel glioblastoma

651 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/69663

⸱

27 gennaio 2026

 , 
1Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Yangtze University

In questo articolo

Sommario

La curcumina (CUM) inibisce la progressione del glioblastoma (GBM) inducendo la cuproptosi tramite la soppressione dell'asse AKT/Wnt/β-catenina. Questo protocollo indaga il meccanismo molecolare con cui il CUM impedisce la progressione maligna nel GBM e descrive metodi per valutare come il CUM induca la cuproptosi modulando questa via.

Abstract

La curcumina (CUM) può regolare il comportamento maligno del glioblastoma (GBM). Questo studio indaga se il CUM sopprimi la progressione del GBM inducendo la cuproptosi tramite la via di segnalazione AKT/Wnt/β-catenina. Le concentrazioni ottimali di curcumina sono state determinate utilizzando il test MTT. Le cellule A172 e U251 sono state trattate con CUM, inibitore AKT MK-2206, inibitore Wnt LGK974 ed Elsm-Cu (Elesclomol +CuCl 2). La proliferazione, migrazione, invasione e apoptosi cellulari sono state valutate utilizzando colorazione con carboxifluoresceina succinimidilammineste, saghi scratch, saghi di Transwell e citometria a flusso, rispettivamente. Sono stati utilizzati MitoSOX fluorescenza, analisi metabolica del cavalluccio marino, immunofluorescenza, rilevamento del Cu2+ e Western blotting per valutare lo stress ossidativo mitocondriale e la cuproptosi. L'asse AKT/Wnt/β-catenina è stato analizzato utilizzando un kit di segnalazione TCF/LEF1 e western blotting. È stato stabilito un modello xenoinnesto GBM e il CUM è stato somministrato tramite gavage per cinque settimane. Sono stati valutati gli effetti del CUM sulla crescita tumorale, sulla cuproptosi e sull'espressione delle proteine della via AKT/Wnt/β-catenina. Le cellule sono state trattate con 10 μM e 20 μM di CUM in vitro. Il trattamento con CUM riduceva proliferazione, migrazione e invasione, promuovendo allo stress ossidativo e la cuproptosi. CUM soppresse anche l'attività di segnalazione Wnt/β-catenina. L'inibizione delle vie ha aumentato i livelli di specie reattive di ossigeno (3,7 volte) e di Cu2+ (3,1 volte), e ha ridotto l'espressione di acetiltransferasi di diidrolipoammide, limitando così il comportamento maligno. Nei topi nudi, il CUM riduceva significativamente la crescita tumorale, promosse la cuproptosi e inibiva l'attivazione dell'asse AKT/Wnt/β-catenina. I nostri risultati indicano che il CUM sopprime la segnalazione AKT/Wnt/β-catenina, promuove la cuproptosi e interferisce con la progressione del GBM.

Introduzione

Il glioma è il tumore maligno intracranico primario più diffuso nel sistema nervoso centrale (SNC)1. Il glioma di grado 4 di solito si riferisce a glioblastoma (GBM), con prognosi2 scadente. La GBM è un tumore cerebrale altamente invasivo, che rappresenta quasi il 50% delle neoplasie del sistema nervoso centrale, con una sopravvivenza mediana inferiore a 1anno e 3. È noto per la sua elevata malignità e l'elevato tasso direcidiva 4,5. Attualmente, le strategie di trattamento della GBM si basano principalmente sulla chirurgia, integrata da radioterapia, chemioterapia e altri metodi di trattamentocompleti. Sebbene strategie terapeutiche emergenti come immunoterapia, bioterapia e nanomedicina abbiano ottenuto risultati notevoli in studipreclinici 7,8, il tasso complessivo di sopravvivenza a 5 anni rimane solo del 4,3%. Il regime chemioterapico più comunemente utilizzato è il noto regime Stupp; tuttavia, per i pazienti con GBM e MGMT non metilata, il tasso complessivo di sopravvivenza non è significativamenteprolungato 10. Pertanto, esplorare nuove strategie di trattamento è di fondamentale importanza per prolungare il periodo di sopravvivenza dei pazienti. Questa ricerca ipotizza che il meccanismo anticancro della curcumina (CUM) sulla GBM coinvolga la cuproptosi.

Metabolismo anomalo del rame o danni cellulari indotti dal rame possono portare a una serie di malattie11. In condizioni redox convenzionali, il Cu+ ridotto può essere ossidato a Cu2+. Tsvetkov et al. hanno scoperto un meccanismo precedentemente sconosciuto di morte cellulare indotta dal rame, chiamato cuproptosi. Gli ioni Cu2+ si legano a composti acilati, e poi l'espressione delle proteine cluster Fe-S viene sottoregolata, causando la mortecellulare 12,13. Ricerche approfondite hanno confermato che la cuproptosi è strettamente associata al processo fisiopatologico deitumori 14,15. Gli inncRNA e i geni correlati alla cuproptosi rappresentano potenziali biomarcatori per la prognosi e il trattamento delGBM 16. La BCMD può rilasciareCu-2+, indurre la cuproptosi e scatenare la morte immunogena delle cellule per trattare ilGBM 17. Pertanto, crediamo che la cuproptosi possa essere utilizzata come nuovo bersaglio per la terapia con GBM. Tuttavia, la maggior parte degli schemi esistenti si basa su portatori sintetici come Elesclomol-Cu o su induzione diretta di ioni rame ad alta concentrazione. Sebbene questo intervento esogeno e drastico possa dimostrare il concetto di cuproptosi, le sue prospettive di trasformazione clinica sono limitate a causa della mancanza di correlazione fisiologica e di miratura. Pertanto, la ricerca di composti naturali o a piccole molecole che possano regolare endogenamente e con precisione la cuproptosi del GBM e chiarire il suo meccanismo di segnalazione a monte è diventata un ponte chiave tra questo nuovo meccanismo e il trattamento clinico.

La medicina cinese è stata ampiamente considerata una risorsa preziosa per la ricerca sui farmaci antitumorali. Il CUM è una sostanza polifenolica estratta dalla curcuma della medicina tradizionale cinese. La farmacologia moderna ha confermato che possiede funzioni antiossidanti, antinfiammatorie e antitumorali. CUM ha molte attività antitumorali. Può ridurre l'attività delle cellule GBM promuovendo l'apoptosi, la rottura delle vie multimolecolari e altrimeccanismi 18. Esperimenti in vitro hanno dimostrato che il CUM a bassa dose combinato con irradiazione può potenziare sinergicamente la proliferazione dell'antiGBM19. Inoltre, CUM può regolare i percorsi core relativi al GBM, incluso MAPK20. Rispetto alla tradizionale chemioterapia con temozolomide (TMZ), la CUM mostra vantaggi terapeutici unici. L'efficacia del temozolomide è spesso limitata dai potenti meccanismi di riparazione del DNA nella GBM, che portano a resistenza ai farmaci; il meccanismo con cui il CUM induce la cuproptosi mirando al metabolismo mitocondriale21,22 è indipendente dalla TMZ. La CUM può non solo regolare i processi metabolici legati alla cuproptosi, ma anche interferire contemporaneamente con molteplici vie chiave di segnalazione legate alla progressione della GBM, offrendo potenziali vie per superare i limiti delle singole terapie e sviluppare strategie di trattamento combinate. L'intervallo di concentrazione di CUM utilizzato in questo studio (10-20 μM) è coerente con le concentrazioni efficaci riportate negli studi di trattamentopreclinico 23. Sebbene la bassa biodisponibilità orale intrinseca del CUM e la sua efficienza di somministrazione attraverso la barriera emato-encefalica siano sfide chiave nelle applicazioni pratiche, i sistemi emergenti di nano-somministrazione e le strategie di modifica mirata hanno fornito soluzioni promettenti per superare questo collo di bottiglia24.

Sebbene gli effetti proapoptotici, antiproliferativi e inibitori della migrazione del CUM nel GBM siano stati riportati da molti studi, la maggior parte delle ricerche esistenti si è concentrata sui suoi effetti sulle vie tradizionali di apoptosi o autofagia. Questo studio mira a chiarire se il CUM inibisca la progressione maligna del GBM regolando la cuproptosi. Abbiamo indagato se il CUM possa indurre la cuproptosi in parte sopprimendo l'asse AKT/Wnt/β-catenina, sopprimendo così la GBM. Sulla base di ciò, questo studio fornisce basi sperimentali per il CUM per migliorare il trattamento della GBM e per sviluppare nuovi bersagli nella terapia con GBM.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con gli standard istituzionali stabiliti per la cura e l'uso umano degli animali da laboratorio e sono state formalmente approvate dal Comitato Etico Animale dell'istituzione. Sono state adottate misure per ridurre il disagio e il disagio degli animali ogni volta che fosse possibile.

Il lavoro che coinvolgeva composti chimici, coloranti e campioni biologici seguiva pratiche di biosicurezza consolidate per mitigare i potenziali rischi. Le sostanze potenzialmente pericolose - inclusi paraformaldeide, reagenti a base di rame e DHE - sono state gestite con dispositivi di protezione individuale appropriati, inclusi guanti, maschere e occhiali di sicurezza. Tutti i materiali di scarto, come reagenti esauriti e oggetti usa e getta contaminati, sono stati separati in contenitori designati per i rischi biologici e successivamente trattati da servizi autorizzati di gestione dei rifiuti pericolosi in conformità con le normative istituzionali e ambientali sulla sicurezza. Il disegno sperimentale complessivo è delineato nella Figura 1.

Figura 1
Figura 1: Il flusso di lavoro di questo studio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Coltura cellulare e raggruppamento
Gli astrociti cerebrali umani normali (NHA) e le linee cellulari di glioblastoma A172, U251, LN229 e SHG-44 (vedi Tabella dei Materiali) sono stati coltivati in un mezzo DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e mantenuti in incubatore a 3 °C con il 5% di CO₂. Il mezzo veniva cambiato a giorni alterni e le cellule venivano spostate quando raggiungevano circa l'80% di confluenza. La dose appropriata e il tempo di esposizione per CUM sono stati determinati utilizzando il test MTT. Le cellule NHA, A172, U251, LN229 e SHG-44 sono state trattate con diverse concentrazioni (0, 2,5, 5, 10, 20 e 4 μM) di CUM per 24, 48 e 7 ore, rispettivamente23. Successivamente, sono stati aggiunti 2 μL di soluzione MTT. Dopo l'h, sono stati aggiunti 15 μL di dimetilsolfosido a ciascun pozzo e miscelati delicatamente. La densità ottica (OD) a 45 nm veniva misurata utilizzando un lettore di microplacche. Le cellule non trattate (gruppo di controllo) sono state utilizzate come controlli negativi in tutti gli esperimenti.

Le cellule A172 e U251 sono state seminate e suddivise in gruppi: Controllo, CUM a bassa dose (1 μM), CUM ad alta dose (2 μM), inibitore AKT (MK-2206), inibitore AKT + inibitore Wnt (MK-2206 + LGK974) ed Elsm-Cu (Elesclomol + CuCl₂), in base alle condizioni terapeutiche. Le cellule nei gruppi CUM sono state trattate con 10 o 2 μM di CUM per 4 ore. Le cellule del gruppo MK-2206 ricevettero 1 μM di MK-2206 per 2 ore. Le cellule del gruppo MK-2206 + LGK974 sono state trattate con μM LGK974 per l'h dopo l'esposizione a MK-2206. Le cellule del gruppo Elsm-Cu sono state trattate con 100 nM Elesclomol e μM CuCl₂ per 4ore e 14.

Citometria a flusso
Le cellule A172 e U251 coltivate in ciascun gruppo sono state incubate con PBS contenente 1 μg/mL di soluzione di colorazione PI per 1 minuto. Le cellule sono state poi trattate con lo 0,25% di tripsina e raccolte tramite centrifugazione (20 × g, minimo, temperatura ambiente). Le cellule PI-positive sono state rilevate utilizzando un citometro a flusso con canale PE (eccitazione a 488 nm), e il tasso di mortalità cellulare è statocalcolato a 27.

Saggio sul carbossidfluoresceina succinimidile amminoestere (CFSE)
Le cellule A172 e U251 sono state incubate con il colorante CFSE μmol/L CellTrace a 3 °C per 1 minuto al buio. Il mezzo veniva quindi neutralizzato e le celle centrifugate a 20 × g per un minimo a temperatura ambiente. Dopo la raccolta, le cellule venivano coltivate e trattate secondo i loro raggruppamenti. L'intensità della fluorescenza CFSE è stata analizzata utilizzando la citometria di flusso (eccitazione a 488 nm)27.

Saggio di formazione dei cloni cellulari
Le cellule coltivate di A172 e U251 sono state digerite, risospese e contate. Furono aggiunti due millilitri della sospensione a celle preparate. Dopo una miscelazione delicata, le cellule sono state incubate per circa 14 giorni. Le cellule sono state poi fissate con paraformaldeide al 4% per 3 minuti, e il fissativo è stato scartato. Dopo aver tingito con viola cristallina allo 0,1%. Furono catturate immagini della colonia e il tasso di formazione dei cloni calcolatoa 14.

Test di graffio cellulare
Le cellule A172 e U251 (1 × 106 cellule/pozzo) sono state coltivate fino a raggiungere il 90% di confluenza. Il monostrato cellulare è stato graffiato una volta usando una punta sterile da 2 μL per creare una ferita e poi trattato con diverse concentrazioni di sperma per h e 48 ore. Le immagini sono state catturate con un microscopio. Il tasso di guarigione dei graffi è stato valutato utilizzando il software ImageJ. Le immagini venivano convertite in formato a 8 bit, veniva impostata una soglia unificata per distinguere l'area di scarto dall'area della cella, e le aree di scarto a 0 h e 48 ore venivano calcolate usando la funzione Analizza Particelle . Tasso di guarigione da grattacino (%) = (distanza 0 h − distanza 48 h) / distanza 0 h × 100%23.

Esperimento Transwell
Le cellule A172 e U251 sono state esposte ai trattamenti specificati, poi sono state staccate enzimaticamente e centrifugate a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Le cellule sono state risospese in un mezzo privo di siero. Il Matrigel è stato diluito in un rapporto 1:8 in un mezzo senza siero, miscelato accuratamente, e 5 μL sono stati applicati nella camera superiore di un inserto Transwell, seguiti da un'incubazione di 4 ore. Sono stati aggiunti in totale 5 × 104 celle per pozzo nella camera superiore, mentre 60 μL di mezzo integrato con il 20% di FBS sono stati inseriti nella camera inferiore. Dopo 48 ore di incubazione, le cellule venivano fissate usando paraformaldeide e colorate con viola cristallina. Sono stati selezionati cinque campi visivi dal centro e dalla periferia di ciascun pozzo. Le cellule sono state osservate e fotografate al microscopio. Le cellule invasive sono state calcolate utilizzando ImageJ. Le immagini sono state convertite in formato a 8 bit, sono state applicate soglie per distinguere le cellule colorate dallo sfondo, e la funzione Analizza le Particelle ha contato le celle che erano migrate attraverso lamembrana 23.

Rilevamento del potenziale della membrana mitocondriale (MMP)
Le cellule coltivate di A172 e U251 in ciascun gruppo sono state incubate con mL di soluzione lavorativa di JC-1 per 30 minuti al buio. Le cellule venivano lavate delicatamente con il buffer JC-1 preraffreddato, osservate e fotografate con un microscopio a fluorescenza. Utilizzando l'eccitazione a 488 nm, i segnali polimerici e monomeri del JC-1 sono stati raccolti utilizzando rispettivamente filtri a emissione da 590 nm e 530 nm. Il rapporto di fluorescenza rosso/verde (aggregati JC-1 a monomeri) è stato analizzato utilizzando il software ImageJ per valutare le variazioniMMP 28. Le immagini dei canali rossi e verdi sono state estratte separatamente e l'intensità media di fluorescenza nella stessa regione è stata quantificata.

Rilevamento del tasso di consumo di ossigeno (OCR)
Sono state seminate cellule A172 e U251 coltivate. La piastra veniva posta in un analizzatore preriscaldato a 3 °C per l'adattamento. Una volta adattato, veniva aggiunto il mezzo di determinazione. Dopo la calibrazione automatica, la piastra è stata bilanciata per 15-2 minuti a 3 °C senzaCO2. È stata misurata la OCR di base e il programma di analisi è stato impostato per registrare la OCR mitocondriale a intervalli definiti. I dati sono stati esportati per analisisuccessive 28.

Rilevamento con sonda fluorescente MitoSOX delle specie reattive dell'ossigeno (ROS)
Le cellule A172 e U251 sono state regolate a una densità di 1 × 104 cellule/mL, e 1 mL per pozzo è stato seminato in un piatto confocale, e successivamente è stato eseguito l'intervento farmacologico. Il soprannatante della cella fu scartato e fu aggiunto 1 mL di sonda MitoSOX diluita (1:1.000). Le cellule sono state incubate al buio a 3 °C per 1 minuto. Il segnale di fluorescenza è stato catturato utilizzando un microscopio a fluorescenza (eccitazione/emissione: 510/580 nm) per valutare i livelli di ROSmitocondriali 29.

Immunofluorescenza
Le coperture sono state lavate una volta con un mezzo di coltura DMEM. Sono poi stati inseriti in piastre a sei pozzi per la semina cellulare e l'intervento farmacologico. Dopo 24 ore, le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% e successivamente bloccate con albumina sieroica bovina al 5% (BSA) per 30 minuti. La soluzione bloccante è stata rimossa e sono stati applicati anticorpi primari diluiti che mirano alla diidrolipoammide acetiltransferasi (DLAT) e β-catenina, seguiti da un'incubazione notturna a °C 30. Gli anticorpi secondari marcati fluorescentmente sono stati quindi introdotti e incubati a 3 °C per 30 minuti. I nuclei cellulari venivano controcolorati con DAPI e le vetrine venivano montate utilizzando un reagente antifade. Le immagini di fluorescenza sono state catturate con un microscopio a fluorescenza e l'intensità del segnale è stata quantificata con il software ImageJ. Le immagini venivano convertite in formato a 8 bit e veniva applicata una soglia costante per distinguere i segnali target dal rumore di fondo. Lo strumento Rectangle è stato utilizzato per selezionare le regioni cellulari desiderate, e l'intensità media di fluorescenza è statamisurata 27. Per visualizzare i mitocondri, le cellule sono state trattate con MitoTracker Red CMXRos a 20 nM per 30 minuti e poi fissate con paraformaldeide30.

Kit per segnalazione luciferasi TCF/LEF1
L'attivazione Wnt/β-catenina nelle cellule A172 e U251 è stata valutata utilizzando un kit di segnalazione di luciferasi TCF/LEF1. Il vettore reporter TCF/LEF contiene una scatola TATA e elementi di risposta del fattore delle cellule T/fattore potenziatore linfoide (TCF/LEF), consentendo la rilevazione indiretta dell'attività trascrizionale della β-catenina tramite l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP). Le cellule A172 e U251 coltivate sono state trasfettate inversamente con vettore reporter TCF/LEF da 5 ng. Sedici ore dopo la trasfezione, l'intensità della fluorescenza è stata registrata utilizzando un lettore di microplacche con impostazioni di eccitazione ed emissione rispettivamente di 488 e 51 nm.

Topi con tumore
Dieci maschi di topi nudi BALB/c (7 settimane, 2 ± 2 g) sono stati mantenuti in condizioni specifiche prive di patogeni (2 °C, 65% di umidità) con accesso illimitato a cibo e acqua standard. Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato di Revisione Etica del Primo Ospedale Affiliato dell'Università dello Yangtze (No 2023092; data di approvazione: 18.10.2023).

Per stabilire un modello di xenoinnesto GBM, le cellule A172 (4 × 106 cellule/mL) sono state sospese in un mezzo siero e 0,1 mL sono state iniettate sottocutaneamente nel fianco destro di ciascun topo. Gli animali sono stati assegnati casualmente a un gruppo di controllo o a un gruppo di trattamento CUM (n = 5 per gruppo). Il gruppo CUM ha ricevuto 60 mg/kg di curcumina al giorno tramite gavage orale, mentre il gruppo di controllo ha ricevuto un volume uguale di soluzione salina. I diametri tumorali venivano registrati ogni 7 giorni usando un calibro vernier, e il volume tumorale calcolato usando la formula 1/2 × lunghezza ×larghezza 2 (mm3). Dopo 5 settimane, i topi sono stati soppressi per lussazione cervicale e i tumori sono stati prelevati in condizioni sterili per la misuradel peso 32.

Saggio TUNEL
I tessuti tumorali sono stati fissati al 4% di paraformaldeide per 24 ore, disidratati in etanolo, incorporati in paraffina e sezionati a uno spessore μm. Le sezioni sono state decerate e reidratate, sciacquate con PBS, trattate con proteinasi K per 50 minuti per il recupero dell'antigene e incubate con perossido di idrogeno al 3%. È stata applicata una miscela di reazione TUNEL per 1 ora, seguita da un montaggio con un reagente antifade. Le immagini di fluorescenza sono state acquisite tramite microscopia e le cellule TUNEL-positive per campo sono state quantificate utilizzando il software ImageJ.

Immunoistochimica
Le sezioni tumorali immerse in paraffina sono state cotte a 6 °C, decerate nello xilene e reidratate tramite una serie di etanolo graduato. Il prelievo dell'antigene è stato eseguito utilizzando un tampone EDTA riscaldato, seguito da una tempramento dell'attività della perossidasi endogena. Le vetrine sono state incubate con anticorpo primario anti-Ki-67 durante la notte a °C. Dopo l'incubazione con un anticorpo secondario per 20 minuti, le sezioni sono state colorate con diaminobenzidina (DAB) per 5 minuti e controcolorate con ematossilina. Dopo la disidratazione e il montaggio con resina neutra, le vetrine venivano fotografate al microscopio. La colorazione positiva è stata identificata tramite precipitato marrone-giallastro, e le cellule Ki-67 positive sono state quantificate utilizzando ImageJ27.

Colorazione a fluorescenza con diidroetidio (DHE)
I livelli ROS sono stati valutati utilizzando la colorazione a fluorescenza DHE. Le sezioni di tessuto tumorale congelato sono state risciacquate con PBS. La fluorescenza di fondo è stata spenta e μM DHE è stato aggiunto a ciascuna sezione per 3 minuti. Dopo il lavaggio PBS, le sezioni sono state sigillate al buio. La fluorescenza è stata osservata al microscopio (eccitazione/emissione: 518/605 nm) e sono state raccolte cinque immagini casuali per gruppo. ImageJ è stato utilizzato per quantificare i livelli ROS.

Rilevamento del contenuto con2+
La concentrazione di Cu2+ nelle cellule GBM e nei tessuti tumorali è stata valutata utilizzando un kit di rilevamento colorimetrico. Le cellule A172 e U251, post-trattamento, sono state prelevate e centrifugate a 1.500 × g per 10 minuti a °C. I pellet cellulari sono stati risospesi in 0. mL di acqua distillata, sonicata su ghiaccio e centrifugata nuovamente. I tessuti tumorali sono stati omogeneizzati in acqua distillata e centrifugati in modo simile a 4 °C per 10 minuti. I soprannatanti (1 μL) sono stati trasferiti su una piastra a 96 pozzi, mescolati con 23 μL di reagente cromogenico, sigillati e incubati per 5 minuti. La densità ottica (OD) è stata misurata a 58 nm utilizzando un lettore di microplacche, e i livelli di Cu2+ sono staticalcolati a 14.

Tazza Occidentale (WB)
Le proteine sono state isolate da cellule coltivate e tessuti tumorali. I supernatanti sono stati ottenuti tramite centrifugazione a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C, e le concentrazioni proteiche sono state quantificate tramite un saggio BCA. Dopo la denaturazione, i campioni sono stati separati con SDS-PAGE, trasferiti nelle membrane PVDF e bloccati con il 5% di latte scremato per 1 ora. Le membrane sono state lavate in TBST e incubate durante la notte a °C con anticorpi primari contro FDX1, LIAS, DLAT, DLD, AKT, p-AKT, Wnt3a, GSK-3β, p-GSK-3β, β-catenina, p-β-catenina e β-actina (vedi la Tabella dei Materiali)14,33. Dopo ulteriori lavaggi TBST, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari coniugati con HRP per 1 ora, sviluppate utilizzando reagente ECL e visualizzate tramite chemiluminescenza. Il software ImageJ veniva utilizzato per quantificare l'intensità del segnale utilizzando lo strumento di selezione Rettangolo e la funzione di analisi dei Gel. L'espressione relativa delle proteine è stata calcolata come il rapporto tra il valore grigio della banda target e il controllo interno (GAPDH). Gli estratti nucleari da cellule A172 e U251 sono stati preparati utilizzando un kit di estrazione di proteine nucleari. È stata valutata l'espressione di β-catenina e Lamin B1, con Lamin B1 che fungeva da sistema di controllo del cariconucleare 34.

Analisi statistica
I risultati quantitativi riflettono la media di tre repliche indipendenti. Tutti i dati sono stati valutati per la distribuzione normale e l'omogeneità della varianza. L'ANOVA unidirezionale seguita dal test post hoc di Tukey è stata utilizzata per confronti tra più gruppi. I dati sono presentati come media ± deviazione standard (SD). Un valore P inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Queste procedure sono state utilizzate per garantire la robustezza dei dati e supportare l'affidabilità delle conclusioni.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Inibizione della vitalità delle cellule GBM e morte cellulare indotta
Innanzitutto, non è stato rilevato alcun cambiamento significativo nella vitalità delle cellule NHA dopo 2 ore, 48 ore e 72 ore di intervento con CUM (Figura 2A), indicando che le concentrazioni di CUM utilizzate non hanno avuto effetti tossici sulle cellule normali. Al contrario, la vitalità delle linee cellulari GBM (A172, U251, LN229 e SHG-44) è stata significativamente ridotta a concentrazioni di CU...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Il tasso di recidiva del GBM è associato alle sue caratteristiche biologichemaligne 36. Il CUM esercita effetti anti-GBM regolando lo stress ossidativo, l'apoptosi, l'autofagia, la metastasi, l'invasione e i principali bersaglimolecolari 37. In questo studio, esperimenti a livello cellulare hanno dimostrato che il CUM ha aumentato significativamente la mortalità delle cellule GBM e ha inibito la proliferazione, la formazione di colonie, la ...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione di colorazione al 0,1% di viola cristallinoServicebioG1014Celle di marcatura
4% di paraformaldeideBeyotimeP0099Riparare cellule o tessuti
Inibitore AKT (MK-2206)Selleck.cn, Shanghai, CinaS1078Inibitore specifico dell'AKT
Anticorpi (anticorpi primari e secondari)ABclonal Technology, Wuhan, Cina / abcam, Cambridge, Regno Unito / Servicebio, Wuhan, Cina / Beyotime, Shanghai, Cina / Cell Signaling, Danvers, MA, USAA8814, ab32572, GB25303, ab15580, ab108257, ab246917, A8814, AF6708, AA326, 4060, ab219412, 280376, 9322, ab97051, ab229025Rilevamento dei livelli di espressione proteica
Kit di rilevamento dell'apoptosi cellulareServicebio, Wuhan, CinaG1021Rilevamento dell'apoptosi
Colorante Cell Trace CFSEInvitrogen, Carlsbad, CA, USAC34570Rilevamento della proliferazione cellulare
Sistema di imaging a chemiluminescenzaBio-Rad, Hercules, CA, USAChemi Doc XRS+Rilevamento a ultra-alta sensibilità delle proteine
Kit di analisi colorimetrica Cu2+Elabscience, Wuhan, CinaE-BC-K300-MRilevamento del contenuto di Cu2+ nei tessuti tumorali e nelle cellule GBM
CuCl2Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania751944Induttore di cuproptosi
Curcumina (CUM)Foglia sorgente di Shanghai, Shanghai, CinaS19245Composto polifenolico
Kit di rilevamento DHEBeyotime, Shanghai, CinaS0063Rilevamento dei livelli ROS
Dimetilsolossido (DMSO)ServicebioG4101-2Solvente per il saggio MTT
Sviluppatore ECLServicebioG2161Usato per il western blot
ElesclomolSelleck.cnS1052Induttore di cuproptosi
Citometria a flussoBD in Bioscienze, New Jersey, USABD FACSAria IIIUtilizzato per i test di morte cellulare e CFSE
Microscopio a fluorescenzaOLYMPUS, Tokyo, GiapponeIX73Utilizzato per i saggi di immunofluorescenza, ROS, TUNEL, DHE e MMP
Le linee cellulari di glioblastoma A172 (RRID: CVCL_0131), U251 (RRID: CVCL_0021), LN229 (RRID: CVCL_0393) e SHG-44 (RRID: CVCL_6902)Punosai Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, CinaCL-0012, CL-0237, CL-0578, CL-0207Linee cellulari umane di glioblastoma
Software GraphPad Prism 9.0GraphPad Software, LLCVersione 9.0Analisi statistica
Software ImageJ 1.53kIstituto Nazionale di Salute MentaleVersione 1.53kCalcolo statistico
Soluzione funzionante JC-1Solarbio, Pechino, CinaM8650Rilevamento della MMP
Maschi BALB/c topi nudiSlack Kingda Laboratory Animal Co., Ltd., Hunan, CinaEsperimento con il topo
Lettore di microplaccheBio-Tek, Vermont, USAELX-800Per la misurazione del valore OD450 nm
MicroscopioOLYMPUSBX53Utilizzato per il test di graffiamento cellulare, l'esperimento Transwell e i saghi di immunoistochimica
Sonda MitoSOXThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAM36008Utilizzato per il rilevamento ROS
Mitotracker Red CMXRosThermo Fisher ScientificM7512Marcatura specifica dei mitocondri nelle cellule viventi
Kit di rilevamento MTTServicebioG4101-1Rilevamento della vitalità cellulare
Cellule NHA normali degli astrociti cerebrali umani (RRID:CVCL_B0DK)Huatuo Biotechnology Co., Ltd., Shenzhen, CinaHTX2408Linea cellulare per esperimenti di controllo
Kit di estrazione di proteine nucleariBeyotimeP0027Estrazione di proteine nucleari
Analizzatore del metabolismo energetico delle cellule di cavalluccio marinoAgilent,   Pechino, CinaCavalluccio Marino XFUtilizzato per il rilevamento OCR
Kit per segnalazione luciferasi TCF/LEF1Biolab Technology Co., Ltd, Pechino, CinaRilevamento dell'attività della via di segnalazione Wnt/β-catenina
Kit di rilevamento TUNELBeyotimeC1088Rilevamento dell'apoptosi nei tessuti tumorali
Inibitore Wnt (LGK974)Selleck.cnS7143Inibitore specifico della Wnt

Riferimenti

  1. Weller, M., et al. Glioma. Nat Rev Dis Primers. 10 (1), 33(2024).
  2. Liang, R., Xiang, Y., Hu, C., Tang, X. Expression and clinical significance of RBBP4 gene in lower-grade glioma: an integrative analysis. Biochem Biophys Rep. 35, 101533(2023).
  3. Sahoo, O. S., Mitra, R., Nagaiah, N. K. H. The hidden architects of glioblastoma multiforme: glioma stem cells. 3 (1), 66(2024).
  4. Schaff, L. R., Mellinghoff, I. K. Glioblastoma and other primary brain malignancies in adults: a review. JAMA. 329 (7), 574-587 (2023).
  5. Singh, D. Nanocage-tethered polymeric hybridome for pDNA delivery: a revolutionary approach for treatment of glioblastoma. J Can Biomol Therap. 2 (1), 133-144 (2025).
  6. van den Bent, M. J., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 402 (10412), 1564-1579 (2023).
  7. Zhou, Y., Shi, F., Zhu, J., Yuan, Y. An update on the clinical trial research of immunotherapy for glioblastoma. Front Immunol. 16, 1582296(2025).
  8. Ravuluri, J. A. V., et al. Brain-targeted nano-architectures for efficient drug delivery and sensitization in glioblastoma. Curr Pharm Des. 29 (22), 1775-1790 (2023).
  9. LeBlanc, V. G., et al. Single-cell landscapes of primary glioblastomas and matched explants and cell lines show variable retention of inter- and intratumor heterogeneity. Cancer Cell. 40 (4), 379-392.e9 (2022).
  10. Zhang, Y., et al. Single-cell RNA sequencing identifies critical transcription factors of tumor cell invasion induced by hypoxia microenvironment in glioblastoma. Theranostics. 13 (11), 3744-3760 (2023).
  11. Jiang, Y., Huo, Z., Qi, X., Zuo, T., Wu, Z. Copper-induced tumor cell death mechanisms and antitumor theragnostic applications of copper complexes. Nanomedicine (Lond). 17 (5), 303-324 (2022).
  12. Tsvetkov, P., et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science. 375 (6586), 1254-1261 (2022).
  13. Meena, R., Sahoo, S. S., Sunil, A., Manna, D. Cuproptosis: a copper-mediated programmed cell death. Chem Asian J. 20 (4), e202400934(2025).
  14. Jin, Y., et al. Baicalein enhances cisplatin sensitivity in cervical cancer cells by promoting cuproptosis through the Akt pathway. Biomed Pharmacother. 179, 117415(2024).
  15. Ning, S., et al. Type-I AIE photosensitizer loaded biomimetic system boosting cuproptosis to inhibit breast cancer metastasis and rechallenge. ACS Nano. 17 (11), 10206-10217 (2023).
  16. Chen, Y., Zhang, J., Zheng, W., Xu, H. Cuproptosis-related lncRNAs and genes: potential markers for glioblastoma prognosis and treatment. PLoS One. 20 (2), e0315927(2025).
  17. Huang, Q. -X., et al. Metal-organic framework nanoagent induces cuproptosis for effective immunotherapy of malignant glioblastoma. Nano Today. 51, 10911(2023).
  18. Mohamadian, M., Ahmadi, S. S., Bahrami, A., Ferns, G. A. Review on the therapeutic potential of curcumin and its derivatives on glioma biology. Neurochem Res. 47 (10), 2936-2953 (2022).
  19. Zoi, V., et al. Curcumin and radiotherapy exert synergistic anti-glioma effect in vitro. Biomedicines. 9 (11), 1562(2021).
  20. Wong, S. C., Kamarudin, M. N. A., Naidu, R. Anticancer mechanism of curcumin on human glioblastoma. Nutrients. 13 (3), 950(2021).
  21. Sun, X., et al. Protective effect of curcumin on hepatolenticular degeneration through copper excretion and inhibition of ferroptosis. Phytomedicine. 113, 154539(2023).
  22. Xiang, B., et al. Curcumin ameliorates copper-induced neurotoxicity through inhibiting oxidative stress and mitochondrial apoptosis in SH-SY5Y cells. Neurochem Res. 46 (2), 367-378 (2021).
  23. Wang, Z., et al. Curcumin suppresses glioblastoma cell proliferation by p-AKT/mTOR pathway and increases the PTEN expression. Arch Biochem Biophys. 689, 108412(2020).
  24. Jia, F., et al. Matrix metallopeptidase 2-responsive curcumin-loaded nanoparticles-induced signal transducer and activator of transcription 3 inhibition suppresses glioblastoma multiforme growth via enhancing nuclear factor erythroid 2-related factor 2 activity. Int J Biol Macromol. 307 (Pt 2), 141998(2025).
  25. Su, X., Chen, S., Lu, H., Li, H., Qin, C. Study on the inhibitory effect of curcumin on GBM and its potential mechanism. Drug Des Devel Ther. 15, 2769-2781 (2021).
  26. Bhagat, N., et al. Self-assembled systems for nose-to-brain delivery of temozolomide in brain tumor therapy. Int J Pharm. 675, 125540(2025).
  27. Mohajerani, F., et al. CLEC19A overexpression inhibits tumor cell proliferation and migration and promotes apoptosis concomitant suppression of PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway in glioblastoma multiforme. BMC Cancer. 24 (1), 19(2024).
  28. Li, Z., et al. MELK promotes HCC carcinogenesis through modulating cuproptosis-related gene DLAT-mediated mitochondrial function. Cell Death Dis. 14 (11), 733(2023).
  29. Lin, S., Wu, B., Hu, X., Lu, H. Sirtuin 4 downregulation contributes to chondrocyte senescence and osteoarthritis via mediating mitochondrial dysfunction. Int J Biol Sci. 20 (4), 1256-1278 (2024).
  30. Wang, W., et al. Ferroptosis inducers enhanced cuproptosis induced by copper ionophores in primary liver cancer. J Exp Clin Cancer Res. 42 (1), 142(2023).
  31. Wagstaff, M., et al. β-Catenin interacts with canonical RBPs including MSI2 to associate with a Wnt signalling mRNA network in myeloid leukaemia cells. Oncogene. 44 (29), 2490-2503 (2025).
  32. Liao, C. L., et al. Tetrandrine suppresses human brain glioblastoma GBM 8401/luc2 cell-xenografted subcutaneous tumors in nude mice in vivo. Molecules. 26 (23), 7105(2021).
  33. Huo, S., et al. ATF3/SPI1/SLC31A1 signaling promotes cuproptosis induced by advanced glycosylation end products in diabetic myocardial injury. Int J Mol Sci. 24 (2), 1667(2023).
  34. Zhang, Z., et al. Maresin1 suppresses high-glucose-induced ferroptosis in osteoblasts via NRF2 activation in type 2 diabetic osteoporosis. Cells. 11 (16), 2560(2022).
  35. Wang, H., et al. Targeting Wnt/β-catenin signaling exacerbates ferroptosis and increases the efficacy of melanoma immunotherapy via the regulation of MITF. Cells. 11 (22), 3580(2022).
  36. Liu, Y., et al. DNA aptamer S11e recognizes fibrosarcoma and acts as a tumor suppressor. Bioact Mater. 12, 278-291 (2022).
  37. Walker, B. C., Mittal, S. Antitumor activity of curcumin in glioblastoma. Int J Mol Sci. 21 (24), 9435(2020).
  38. Zhang, B., Xie, L., Liu, J., Liu, A., He, M. Construction and validation of a cuproptosis-related prognostic model for glioblastoma. Front Immunol. 14, 1082974(2023).
  39. Liu, Z., Ma, H., Lai, Z. The role of ferroptosis and cuproptosis in curcumin against hepatocellular carcinoma. Molecules. 28 (4), 1623(2023).
  40. Tian, Z., Jiang, S., Zhou, J., Zhang, W. Copper homeostasis and cuproptosis in mitochondria. Life Sci. 334, 122223(2023).
  41. Prasad Panda, S., Kesharwani, A. Micronutrients/miRs/ATP networking in mitochondria: clinical intervention with ferroptosis, cuproptosis, and calcium burden. Mitochondrion. 71, 1-16 (2023).
  42. Peng, Y., Wang, Y., Zhou, C., Mei, W., Zeng, C. PI3K/Akt/mTOR pathway and its role in cancer therapeutics: are we making headway. Front Oncol. 12, 819128(2022).
  43. Precilla, D. S., et al. Wnt/β-catenin antagonists: exploring new avenues to trigger old drugs in alleviating glioblastoma multiforme. Curr Mol Pharmacol. 15 (2), 338-360 (2022).
  44. Li, C., Yang, J., Wang, W., Li, R. LHPP exerts a tumor-inhibiting role in glioblastoma via the downregulation of Akt and Wnt/β-catenin signaling. J Bioenerg Biomembr. 53 (1), 61-71 (2021).
  45. Liu, Y. T., et al. Dysregulated Wnt/β-catenin signaling confers resistance to cuproptosis in cancer cells. Cell Death Differ. 31 (11), 1452-1466 (2024).
  46. Yu, W., et al. Investigation of cuproptosis regulator-mediated modification patterns and SLC30A7 function in GBM. Aging (Albany NY). 16 (4), 3554-3582 (2024).
  47. Afshari, A. R., et al. Anti-tumor effects of curcuminoids in glioblastoma multiforme: an updated literature review. Curr Med Chem. 28 (39), 8116-8138 (2021).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Curcumina GlioblastomaVia AKTWnt Beta CateninaInduzione della CuproptosiProliferazione CellulareMigrazione CellulareStress Ossidativo MitocondrialeCitometria a FlussoWestern BlotModello di Xenotrapianto
Video in arrivo
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.