Visualizzazione dell'elettrotassi dipendente dall'età di cellule staminali umane derivate dalle adipose sotto campi elettrici a corrente continua

Summary

In una piccola coorte di donatrici, l'invecchiamento ha ridotto la migrazione elettrotattica degli hADSC. Il DCEF ha alterato l'espressione genica (747 in upload, 624 in download), arricchendo i termini trasporto/canale GO e le vie PI3K-Akt KEGG, suggerendo un coinvolgimento nell'elettrotassia legata all'età, senza stabilire la causalità.

Abstract

Le cellule staminali umane derivate dalle adipi (hADSC) sono fondamentali per la rigenerazione dei tessuti e la guarigione delle ferite, e la loro migrazione diretta è un prerequisito per esercitare questi effetti terapeutici. I campi elettrici (EF) sono ben riconosciuti come segnali chiave che guidano la migrazione cellulare durante la riparazione delle ferite, tuttavia il comportamento elettrotattico degli hADSC — in particolare come le caratteristiche del donatore (ad esempio, l'età) regolano questo comportamento e i suoi meccanismi molecolari sottostanti — rimane poco compreso. Questa lacuna di conoscenza limita l'applicazione ottimizzata degli hADSC nella medicina rigenerativa. In questo studio, abbiamo prima validato l'esistenza di elettrotassi negli hADSC e ne abbiamo confermato la dipendenza dalla tensione: sotto campi elettrici a corrente continua (DCEF) di 100-200 mV/mm, gli hADSC migravano direzionalmente verso l'anodo, con intensità EF più forti che aumentavano sia la direzionalità che la velocità di migrazione (rispetto a un controllo di 0 mV/mm). Abbiamo poi confrontato gli hADSC di giovani donatrici femmine (27,00 ± 4,58 anni) e di donatrici anziane (62,33 ± 4,04 anni) utilizzando il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) dopo una stimolazione DCEF a 200 mV/mm. L'analisi trascritomica ha identificato 747 geni a aumento e 624 sottoregolati in vecchi hADSC, con geni differenzialmente espressi (DEG) arricchiti da processi/vie biologiche critiche per l'elettrotassi — incluso il trasporto transmembrana di ioni di sodio, l'attività dei canali di sodio dipendente dal voltaggio (termini GO) e la via di segnalazione PI3K-Akt (via KEGG). Dal punto di vista funzionale, gli hADSC anziani hanno mostrato una migrazione anodale significativamente ridotta (distanza accumulata, distanza euclidea e direttezza diminuite) rispetto ai giovani hADSC sotto stimolazione DCEF. Questo studio fornisce la prima evidenza di elettrotaxi dipendente dall'età negli hADSC, dimostrando che l'età del donatore è correlata a una capacità elettrotattica compromessa. Rivela inoltre che l'attività dei canali del sodio e la segnalazione PI3K-Akt disregolate potrebbero essere alla base di questo declino legato all'età. Questi risultati indicano i potenziali meccanismi regolatori dell'elettrotassi hADSC e offrono nuove intuizioni per adattare le terapie basate su hADSC (ad esempio, selezionando donatori ottimali o puntando alle vie del sodio/PI3K-Akt) per migliorare la rigenerazione tissutale e gli esiti di guarigione delle ferite.

Introduction

Le cellule staminali derivate dalle adipose (ADSC) possiedono una forte capacità di auto-rinnovamento e un significativo potenziale rigenerativo. In condizioni di induzione appropriate, possono differenziarsi in osteoblasti, condrociti e adipociti, tra gli^{altri 1}. Attraverso la segnalazione paracrina, l'ADSC può anche supportare la generazione di vasi sanguigni e vasi^{linfatici 2,3}, inibire la formazione della^{cicatrice 4} e mostrare effetti regolatori^{immunitari 5}. Pertanto, l'ADSC è considerata una cellula seme ideale per terapie cellulari nella medicina rigenerativa.

La funzione dell'ADSC è influenzata da varie caratteristiche del donatore, che possono influenzare la loro potenziale efficacia nelle terapie cellulari, tra cui età del donatore, indice di massa corporea, genere e^{altri 6}. L'ADSC derivata da donatori più anziani presenta caratteristiche di invecchiamento più pronunciate, con un potenziale di differenziazione adipogenica ridotto, potenziale di differenziazione osteogenica e capacità ^{migratoria 7,8,9}. Inoltre, la capacità di promuovere la proliferazione dei cheratinociti e stimolare i meccanismi di auto-riparazione dell'organismo è^diminuita.

La migrazione guidata dalle cellule è un meccanismo fisiologico chiave nella guarigione delle ferite e nella rigenerazione dei tessuti, con i campi elettrici (EF) che svolgono un ruolo importante nel guidare la migrazione cellulare e nel promuovere la riparazione delle^{ferite 11}. Ad esempio, quando la barriera epiteliale viene danneggiata, i campi elettrici endogeni si generano immediatamente e persistono fino a quando la ferita guarisce e la funzione della barriera epiteliale viene^ripristinata 12,13,14. Come uno dei segnali che guidano la migrazione cellulare diretta, è stato dimostrato che i segnali elettrici hanno una priorità superiore rispetto ad altri segnali coesistenti, come l'inibizione del contatto, le forze meccaniche e i fattori^{chemiotattici 15,16}. Sono stati sviluppati diversi metodi per promuovere la guarigione delle ferite e la rigenerazione dei tessuti, come attraverso farmaci e dispositivi esterni di stimolazione elettrica che potenziano o imitano i campi elettrici endogeni nel corpo^{umano 17,18}. La capacità delle cellule di migrare secondo un gradiente di campo elettrico è nota come elettrotassia. Gli studi in vitro hanno dimostrato che molti tipi diversi di cellule sono in grado di migrare direttamente nei campi elettrici. Alcune cellule migrano verso l'anodo, come le cellule della cresta neurale cranica dei mammiferi, gli astrociti umani e le cellule tumorali al seno^umano 19,20,21. Altre cellule migrano verso il catodo, come le cellule epiteliali tubolari renali umane, i fibroblasti dermici umani e i neutrofili^umani 22,23,24. L'ADSC può essere guidato a migrare verso l'anodo in campi elettrici a corrente continua (DC) e, in condizioni di coltivazione prolungate, è stato dimostrato che la corrente elettrica pulsata esogena favorisce efficacemente la migrazione direzionale dell'ADSC verso l'anodo mantenendo la vitalità della^{cella 25}. Ad oggi, gli studi sulle caratteristiche elettrotaxiche delle cellule staminali umane derivate dall'adiposo restano scarsi, e i meccanismi sottostanti che regolano il loro comportamento elettrotattico non sono ancora pienamente compresi.

Siamo i primi a indagare sistematicamente le differenze elettrotattiche dipendenti dall'età negli hADSC tra donatrici giovani e anziane sotto campi elettrici a corrente continua gradiente (DCEF), e a scoprire ulteriormente i meccanismi sottostanti (che coinvolgono l'attività dei canali di sodio e la segnalazione PI3K-Akt) tramite l'analisi trascritomica. In questo studio, abbiamo esaminato gli effetti del DCEF sugli hADSC. Utilizzando il sequenziamento dell'RNA e l'analisi differenziale di arricchimento genico, abbiamo confrontato i profili di espressione genica tra due gruppi hADSC - derivati da donatrici giovani e anziane - dopo stimolazione DCEF per identificare differenze trascrizionali legate all'età. Abbiamo ipotizzato che l'invecchiamento del donatore comprometta la reattività elettrotattica degli hADSC, e che questo declino legato all'età sia collegato a un'alterazione dell'attività dei canali di sodio e alla segnalazione PI3K-Akt.

Protocol

Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti prima della raccolta dei tessuti. Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico del Primo Ospedale Affiliato dell'Università Medica Cinese (Approvazione n.: [2018]2018-110-2). Il consenso informato scritto di tutti i partecipanti è stato ottenuto prima della raccolta dei tessuti

Isolamento e cultura hADSC
Raccolta di tessuti: Campioni di tessuto adiposo addominale umano sono stati prelevati durante procedure di liposuzione elettiva di routine eseguite presso il Dipartimento di Chirurgia Plastica del Primo Ospedale Affiliato dell'Università Medica Cinese. Tutte le donatrici erano volontarie donne sane sottoposte a liposuzione estetica addominale, e non sono stati eseguiti ulteriori interventi chirurgici a scopo di ricerca. I campioni di tessuto venivano raccolti dal chirurgo operatorio in condizioni sterili immediatamente dopo l'aspirazione e trasferiti in laboratorio in contenitori sterili su ghiaccio entro 30 minuti.

Dimensione del campione: In questo studio sono stati inclusi in totale 6 donatori, composti da 3 donatori più giovani (età: 27,00 ± 4,58 anni) e 3 donatori più anziani (età: 62,33 ± 4,04 anni).

Elaborazione dei tessuti: Trasferire frammenti di tessuto adiposo in un tubo conico da 50 mL, centrifugare a 1.800 x g per 3 minuti a 4 °C e aspirare con cura la fase oleosa superiore (per rimuovere i lipidi in eccesso). Aggiungi lo 0,2% di collagenasi di tipo IV (volume finale: 5-10 mL per 1 g di tessuto adiposo) al pellet, poi metti il tubo in un bagno d'acqua a 37 °C o in un incubatore per 45 minuti. Agita delicatamente il tubo ogni 10-15 minuti durante la digestione per garantire un contatto uniforme tra collagenasi e tessuto. Dopo la digestione, interrompere la reazione aggiungendo DMEM a basso contenuto di glucosio integrato con FBS al 10% e penicillina/streptomicina all'1% (rapporto volumetrico tra mezzo neutralizzante e soluzione di collagenasi = 1:1).

ATTENZIONE: Quando maneggi collagenase, indossa guanti usa e getta, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza per evitare il contatto con pelle e occhi, prepara e usa il reagente in un armadietto di sicurezza biologica (BSC) per prevenire la contaminazione da aerosol e, in caso di fuoriuscita di sparsa, pulisci immediatamente con etanolo al 75% e smalti i materiali contaminati come rifiuti biologici.

Isolamento cellulare: Centrifuga la miscela digeritiva neutralizzata a 1.200 x g per 10 minuti a 4 °C per pelletare le cellule. Scartare il soprantantante, poi risospendere il pellet in un tampone di lisi eritrocitaria (155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA; pH 7,4; volume: 2-3 mL per pellet) e incubare a temperatura ambiente (22-25 °C) per 5 minuti per lisare i globuli rossi residui. Filtrare la sospensione cellulare in modo sequenziale attraverso filtri da 200 μm per rimuovere i detriti tissulari non digeriti e ottenere una sospensione a singola cellula.

Conteggio delle cellule: Prima della semina, il numero cellulare veniva quantificato utilizzando un emocitometro. Per un breve periodo, gli hADSC sono stati staccati con lo 0,25% di tripsina-EDTA, risospesi nel mezzo di crescita e miscelati 1:1 con soluzione blu di tripano allo 0,4%. Le cellule vitali (non colorate) sono state contate manualmente utilizzando un emocitometro di Neubauer al microscopio ottico, e il numero totale di cellule vitali è stato calcolato come: numero cellulare/mL = (cellule contate medie x fattore di diluizione x 10⁴).

Coltura cellulare: Seminare le cellule filtrate a una densità di 5 x 10³ cellule/cm² in mezzo di crescita (DMEM a basso contenuto di glucosio + 10% FBS + 1% penicillina/streptomicina) e incubare a 37 °C con 5% di CO₂. Sostituire il substrato ogni 2-3 giorni per rimuovere le cellule non aderenti e mantenere condizioni ottimali di coltura. Tutti gli hADSC utilizzati per esperimenti successivi — inclusa la caratterizzazione cellulare (rilevamento dei marcatori superficiali, saggi di differenziazione trilineage), stimolazione DCEF, analisi di migrazione e morfologia, saggi di senescenza/proliferazione e sequenziamento dell'RNA — si trovavano dal passaggio 3 al passaggio 5.

Caratterizzazione hADSC
Espressione dei marcatori della superficie cellulare: Coltivare le cellule fino a una confluenza del 70%, poi dissociare le cellule aderenti con lo 0,25% di tripsina-EDTA (incubare a 37 °C per 3 minuti). Centrifuga la sospensione della cella a 300 x g per 5 minuti a 4 °C, elimina il surnatante e risospendi la pellet della cella in 1x PBS (volume: 1-2 mL). Aggiungere 1 x 10⁵ cellule per campione (risospesa in 100 μL di 1x PBS) e aggiungere anticorpi coniugati fluorescenti alle diluizioni specificate: anti-CD44 (1:50), anti-CD90 (1:100), anti-CD29 (1:50), anti-CD73 (1:50) e anti-CD105 (1:20)^1,4,7. Incubare la miscela anticorpi-cellula a 4 °C per 30 minuti al buio per evitare l'estinzione con fluorofori. Dopo l'incubazione, centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti a 4 °C e aspirare completamente il soprandante. Risospendere il pellet in 1-2 mL di 1x PBS, centrifugare di nuovo a 1.000 x g per 3 minuti a 4 °C, eliminare il surnadante e ripetere questo processo di lavaggio 2 volte per rimuovere gli anticorpi non legati. Infine, risospendere la pellet cellulare in 200 μL di PBS fresco 1x, acquisire dati di fluorescenza utilizzando un citometro di flusso ed eseguire analisi quantitativa con il software FlowJo (v10). Il flusso di lavoro di gating seguiva le procedure standard di fenotipizzazione MSC: porta FSC-SSC per escludere i detriti e selezionare la popolazione cellulare principale in base a dimensione e granularità, seguita da una doppia esclusione usando grafici FSC-A vs. FSC-H e SSC-A vs. SSC-H per garantire eventi a singola cella. Successivamente, è stato effettuato il gating delle cellule vive per escludere le cellule morte blue-positive o PI-positive a tripano. Il gating a fluorescenza è stato effettuato per i controlli con una singola colorazione, e i controlli non colorati sono stati utilizzati per fissare soglie per CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 (marcatori positivi) e CD34, CD45 (marcatori negativi). Sono stati esportati e analizzati appezzamenti rappresentativi per confermare l'identità degli hADSC.

Potenziale di differenziazione
Differenziazione adipogenica: Prelevare hADSC di generazione P3 all'85% di confluenza usando lo 0,25% di tripsina-EDTA, poi seminarli in piastre da 24 pozzi a una densità di 1 x 10⁵ cellule per pozzo (usando un mezzo DMEM completo) e incubare a 37 °C con il 5% di_CO-2 fino a raggiungere nuovamente l'85% di confluenza delle cellule. Per l'induzione, utilizzare il kit di differenziazione per adipogenesi, ricostituendo il componente A (induttore adipogenico) e il componente B (manutentore adipogenico) come indicato dal manuale, e utilizzare il componente A per i primi 3 giorni prima di passare al componente B per 1 giorno. Ripeti questo ciclo per 3 settimane. Per la colorazione, aspirare il mezzo di induzione, lavare delicatamente le cellule con 3 mL di 1x PBS (evitando disturbare gli strati cellulari), fissare le cellule con paraformaldeide (PFA) al 4% a temperatura ambiente per 20 minuti, poi incubare con soluzione di olio rosso O allo 0,3% (preparata in isopropanolo al 60%) a temperatura ambiente per 15 minuti. Lava le cellule 3 volte con 1 buco di specchio per rimuovere la macchia in eccesso, poi immagini le gocce lipidiche usando un microscopio a luce invertita (20 volte).

Differenziazione osteogenica: Seminare hADSC in piastre a 12 pozzi a una densità di 1 x 10⁵ cellule per pozzo, e quando le cellule raggiungono l'85% di confluenza, utilizzare il kit di differenziazione osteogenesi per l'induzione -- ricostituire il componente del kit A (induttore osteogenico) e il componente B (integratore osteogenico) in DMEM a basso contenuto di glucosio (concentrazioni finali: 10% FBS, 1% penicillina/streptomicina, 0,1 μM desametasone, 10 mM β-glicerofosfato, 0,05 mM di acido ascorbico-2-fosfato) e rinfrescare il substrato ogni 3 giorni per 3 settimane. Per la colorazione, fissare le cellule con il 4% di PFA a temperatura ambiente per 15 minuti, lavare 3 volte con 1 batteria di PBS, poi incubare con una soluzione di Alizarina Rossa S al 2% (pH 4,2, preparata in acqua deionizzata) a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavare le cellule 3 volte con 1x PBS per rimuovere la colorazione non legata, poi fotografare i noduli depositati nel calcio al microscopio a contrasto di fase (20x) e quantificare la mineralizzazione misurando l'area dei noduli S-positivi all'Alizarina Rossa usando il software ImageJ.

Differenziazione condrogenica: Centrifugare 250.000 hADSC a 500 x g per 5 minuti a 4 °C in un tubo conico da 15 mL per formare un pellet cellulare, aggiungere 500 μL di mezzo DMEM completo al tubo e incubare durante la notte a 37 °C con il 5% di_CO2 per stabilizzare il pellet. Il giorno successivo, utilizzare il kit di differenziazione della condrogenesi per l'induzione -- ricostituire il componente A del kit (induttore condrogenico) in un mezzo indipendente da_CO2 (concentrazioni finali: 1% di penicillina/streptomicina, 10 ng/mL TGF-β3, 50 μg/mL acido ascorbico-2-fosfato, 100 μg/mL piruvato di sodio) e rinfrescare delicatamente il mezzo ogni 3 giorni (evitare di disturbare la pellet). Dopo 3 settimane di induzione, fissare la pellet cellulare con il 4% di PFA a temperatura ambiente per 30 minuti, aspirare il fissativo, incubare con soluzione di Toluidina Blue O allo 0,1% (p/v) (preparata in tampone di acetato di sodio 0,1 M, pH 4,0) a temperatura ambiente per 15 minuti, aspirare la macchia, sciacquare la pellet 3 volte con acqua deionizzata per rimuovere il colorante in eccesso, poi immagini con un microscopio a campo chiaro (20x) e quantificare l'accumulo di proteoglicani solfadati misurando la densità ottica media (OD) della colorazione con Blu O con Toluidina utilizzando il software ImageJ.

ATTENZIONE: Quando si maneggia PFA al 4% (un reagente tossico e corrosivo), si lavora esclusivamente in una cappa fumaria indossando guanti usa e getta, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza per evitare l'inalazione di vapori o il contatto con pelle e occhi — se si verifica il contatto, risciacqua immediatamente con acqua corrente per 15 minuti e cerca assistenza medica. Per lo smaltimento dei rifiuti pericolosi, raccogli materiali usati contaminati da PFA e PFA (ad esempio, punte di pipetta, piatti) in un contenitore dedicato ai rifiuti chimici etichettato come PFA Waste e smalti utilizzando i protocolli istituzionali per i rifiuti pericolosi, assicurandoti di non mescolarli con rifiuti biologici.

Assemblaggio della camera elettrotaxica: Forare due fori (0,75 cm di diametro) alle estremità opposte della linea centrale su un coperchio a piastra di Petri da 10 cm, posizionato a 1 cm dal bordo della piastra (per accogliere ponti di agar-sale). Applicare uno strato sottile di grasso sottovuoto (≤ 2 cm di lunghezza, ≤ 1 cm di larghezza) sul fondo della piastra di Petri lungo la linea centrale, a 4 cm da ciascun bordo (Figura 1A). Usando pinze sterili a punta fine, posiziona una copertura di vetro sterile di 1 cm x 2 cm su ogni toppa di grasso e premi delicatamente per garantire una tenuta ermetica (evitare la rottura del coprislip; Figura 1B-C). Applica un altro sottile strato di grasso sottovuoto sopra ogni copertura attaccata, poi applica un secondo sottovoglio sterile di vetro da 1 cm x 2 cm direttamente sul grasso per formare una pila a doppio copertura. Premere delicatamente per garantire una tenuta ermetica tra le due coperture (evitare perdite medie; Figura 1D). Lungo la linea diagonale che collega l'angolo in alto a sinistra di uno stack di copertura al bordo piatto più vicino, e l'angolo in basso a destra dello stack opposto al bordo più vicino, applica grasso a vuoto per formare una parete barriera continua. La parete deve essere aderente saldamente al fondo della piattaforma (senza fessure) e misurare circa 2 cm di altezza e 0,5 cm di larghezza (Figura 1E). Sterilizza la camera assemblata sotto luce UV per 20 minuti (per eliminare la contaminazione mimicrobica), poi conserva a temperatura ambiente in condizioni sterili fino all'uso (Figura 1F).

Stimolazione DCEF: Posizionare vetrini sterili (per la semina cellulare) in una piastra di Petri da 10 cm e incubare durante la notte a 37 °C con il 5% di_CO2 per pre-condizionare le vetrine (favorire l'adesione cellulare). Preparare la soluzione di Steinberg diluendo 10 mL di soluzione stock 10x in 90 mL di_{ddH 2}O (sterile; concentrazioni finali: 58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca(NO₃)₂4H₂O, 0,83 mM MgSO₄7H₂O, 10 mM HEPES; pH 7,4). Aggiungi 0,3 g di agar a 20 mL della soluzione di Steinberg preparata, fai cuocere il microonde per 20 secondi finché l'agar non si scioglie completamente e la soluzione è trasparente, poi riempi immediatamente i ponti di sale su vetro con la miscela calda di agar-Steinberg e lascia solidificare a temperatura ambiente. Dopo la solidificazione, sterilizzare i ponti salini sotto luce UV per 15 minuti e sterilizzare due becher (ciascuno contenente 30 mL di soluzione di Steinberg) sotto luce UV per 15 minuti. Seminare hADSC di generazione P3 su vedi sterili precondizionati a una densità di 2 x 10⁴ cellule/cm², incubare a 37 °C con 5% di_CO2 per 24 ore per consentire l'adesione cellulare, poi trasferire le vetri a cellula sulla pista della camera elettrotassica assemblata e fissarle con vetrine laterali sterili (per prevenire il movimento). Sigilla la pista posizionando un antispolle di vetro di 3 cm x 2 cm sopra il grasso sottovuoto, premendo delicatamente per garantire una tenuta ermetica e applicando ulteriore grasso sottovuoto lungo i bordi del coperto superiore per formare una barriera (prevenire l'evaporazione del medio). Riempire i serbatoi della camera con un mezzo indipendente da_CO2 (integrato con 10% FBS e 1% penicillina/estreptomicina; volume: 5-8 mL per serbatoio), inserire i ponti sterilizzati di agar-sale attraverso i fori nel coperchio della piastra di Petri (con un'estremità immersa nel serbatoio del mezzo della camera e l'altra estremità immersa nei becher riempiti di soluzione di Steinberg), e collegare i becher a un alimentatore tramite elettrodi Ag/AgCl (per fornire una corrente continua stabile). Applicare un campo elettrico DC (DCEF) di 2 V/cm per 4 ore, monitorare la tensione ogni 15 minuti usando un multimetro digitale (regolare se necessario per mantenere un'intensità di campo costante) e catturare immagini in time-lapse della migrazione delle cellule ogni 5 minuti a 4 campi casuali utilizzando il software (modalità obiettivo 5x, campo chiaro).

NOTA: Quando si utilizzano apparecchiature elettriche, assicurarsi che l'alimentatore e gli elettrodi siano asciutti e posizionati su una superficie non conduttiva per evitare scosse elettriche. Indossa guanti isolati quando colleghi o disconnetti gli elettrodi, spegni l'alimentazione prima di regolare l'impianto e, in caso di perdita di materiale su componenti elettrici, spegni immediatamente la corrente e pulisci con carta assorbente imbevuta al 75% di etanolo. In questo studio, minimizzando lo spessore della camera di elettroforesi e mantenendola a circa 1 mm, oltre a condurre misurazioni multipunto della tensione a entrambe le estremità della camera, la variazione dell'intensità del campo è stata controllata entro il 10%. In queste condizioni, si considera che la distribuzione del campo elettrico all'interno dell'area di coltura sia essenzialmente uniforme²⁶.

Analisi di migrazione e morfologia
Imaging dal vivo: Per gli hADSC sotto stimolazione DCEF, importare le sequenze di immagini time-lapse (intervalli di 5 minuti) nel software ImageJ, tracciare manualmente 100 celle su 4 campi indipendenti dall'inizio (t=0) fino alla fine della stimolazione (t=4 h) usando il plugin di Tracciamento Manuale, e calcolare la velocità media di migrazione (μm/min) e la direzionalità (rapporto D/T, dove D = distanza retta dall'inizio alla fine, T = lunghezza totale del percorso) utilizzando il plugin Chemotaxis Tool (ImageJ).

Tracciamento: Calcola i seguenti parametri di migrazione per quantificare il comportamento elettrotattico: Direzione (Σcosθi/n, dove θi è l'angolo tra il vettore di spostamento della cella e la direzione del campo elettrico (EF), e n è il numero totale di celle tracciate, che variano da -1 a 1 con valori più vicini a 1 che indicano una migrazione più forte diretta verso l'anodo), Distanza Accumulata (lunghezza totale del percorso percorsa da ciascuna cella durante il periodo di stimolazione, in μm), Velocità di traccia (distanza accumulata divisa per il tempo di stimolazione, in μm/h) e Distanza euclidea (spostamento rettilineo dall'inizio all'estremità di ciascuna cella, in μm, riflettendo la migrazione netta).

Morphometria: Dopo la stimolazione DCEF, fissare le cellule con il 4% di PFA a temperatura ambiente per 20 minuti, lavare 3 volte con 1 PBS, colorare il citoscheletro con Phalloidin-TRITC (diluizione 1:500 in 1x PBS; volume: 200 μL per pozzo per piastre a 24 pozzi) a temperatura ambiente per 30 minuti (per contrassegnare la F-actina), e controcolorare i nuclei con DAPI (1 μg/mL in 1x PBS; volume: 100 μL per pozzo) per 5 minuti. Le cellule sono state fotografate utilizzando un microscopio a fluorescenza a un ingrandimento di 20x (con immagini rappresentative ad alta risoluzione catturate a 40x). Phalloidin-TRITC è stato visualizzato utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 540-555 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 565-580 nm, mentre DAPI è stato fotografato utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 358-405 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 420-480 nm. Successivamente si misurano i seguenti parametri morfologici in ImageJ: Asse lungo (diametro massimo dei Feret, la distanza più lunga tra due punti qualsiasi sul perimetro della cella), Lunghezza verticale (larghezza della cella perpendicolare all'asse lungo) e Verticalità (sinα, dove α è l'angolo tra l'asse lungo della cella e la direzione dell'EF, con valori più alti che indicano un maggiore allineamento con l'EF).

Saggio di senescenza e proliferazione
Colorazione SA-β-Gal: Utilizzare un kit di rilevamento della senescenza per identificare cellule senescenti (cellule colorate di blu) al microscopio a campo chiaro (obiettivo 20x). Seme hADSC di generazione P3 in piastre a 6 pozzi a una densità di 2 x 10⁵ cellule per pozzo, coltura fino all'80% di confluenza, aspira il mezzo, lava delicatamente le cellule 3 volte con 1x PBS, aggiungi 1 mL di Soluzione Fissativa (fornita nel kit) per pozzo e incuba a temperatura ambiente per 15 minuti, lava le cellule 3 volte con 1 PBS per rimuovere il fissativo residuo dopo la fissazione, aggiungere 0,5 mL di soluzione di lavoro per colorazione SA-β-gal (preparata mescolando 50 μL di substrato SA-β-gal con 450 μL di tampone di colorazione secondo il manuale del kit) per pozzo, sigillare la lastra con film trasparente (per evitare l'evaporazione), incubare durante la notte (16-18 h) a 37 °C (evitare l'esposizione al CO₂ , poiché altera il pH e inibisce l'attività enzimatica), cattura immagini in campo chiaro di ≥10 campi casuali per pozzo (obiettivo 10x) il giorno successivo, contare il numero di celle colorate di blu (SA-β-gal⁺) e il totale delle cellule, e calcolare la percentuale di celle senescenti come (Numero di celle SA-β-gal⁺ / Numero totale di celle) x 100.

Immunocolorazione Ki67
Dopo la colorazione SA-β-gal, aspirare la soluzione di colorazione, lavare le cellule 2 volte con 1 PBS, permeabilizzare le membrane cellulari con 0,1% di Triton X-100 (preparato in 1 PBS; 1 mL per pozzo) a temperatura ambiente per 10 minuti, e bloccare il legame degli anticorpi non specifici con il 5% di BSA (in 1 PBS; 1 mL per pozzo) a temperatura ambiente per 1 ora. Le cellule sono state poi incubate con anticorpo primario Anti-Ki67 (diluizione 1:200 in 1% di BSA/PBS; 500 μL per pozzo) a 4 °C durante la notte. Il giorno successivo, le cellule sono state lavate 3 volte con 1 PPS (5 min ciascuna) per rimuovere l'anticorpo primario non legato e incubate con anticorpo secondario coniugato Alexa Fluor 488 488 (diluizione 1:500 in BSA/PBS all'1%; 500 μL per pozzo) a temperatura ambiente per 1 ora al buio. Le cellule sono state lavate di nuovo 3 volte con 1 PBS e controcolorate con DAPI (1 μg/mL in 1x PBS; 200 μL per pozzo) per 5 minuti. Le immagini di fluorescenza sono state catturate utilizzando un microscopio a fluorescenza a ingrandimento di 20x (con immagini rappresentative ad alta risoluzione acquisite a 40x). Le celle Ki67⁺ marcate con Alexa Fluor 488 sono state visualizzate utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 485-495 nm e un'onda di emissione di 515-545 nm, mentre i nuclei colorati con DAPI sono stati fotografati utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 358-405 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 420-480 nm. La percentuale di cellule proliferative è stata calcolata come:(Numero di cellule Ki67⁺ / Numero di nuclei ^DAPI+ ) x 100.

NOTA: Quando si manipolano anticorpi primari e secondari, si lavora in un BSC per prevenire la contaminazione, si collocano gli anticorpi in volumi monouso per evitare cicli ripetuti di congelamento-disgelo e si raccoglie materiali contaminati da anticorpi (ad esempio, punte di pipetta, piastre) in una sacca dedicata autoclavabile per i rifiuti biologici per la sterilizzazione tramite autoclaving prima dello smaltimento.

Analisi elettrotassica dipendente dall'età degli hADSC: Utilizzare un alimentatore a impulsi DC per generare DCEF di tre intensità: 0 mV/mm (controllo), 100 mV/mm e 200 mV/mm, impiegare una workstation a celle vive per osservare e registrare la migrazione cellulare in tempo reale, e per ogni intensità EF, confrontare quantitativamente la capacità di migrazione anodale degli hADSC da donatrici giovani e anziane misurando la distanza accumulata, Distanza euclidea, velocità di traccia e direzione diretta, con tre repliche biologiche indipendenti per gruppo per garantire l'affidabilità dei risultati. I parametri di migrazione elettrotattica sono stati quantificati utilizzando i plugin Manual Tracking e Chemotaxis Tool in ImageJ (NIH). Le singole cellule sono state tracciate manualmente per l'intero periodo di stimolazione di 4 ore e sono stati calcolati i seguenti parametri secondo metodi standard: Distanza Accumulata: la lunghezza totale del percorso percorsa da ciascuna cellula durante il periodo di registrazione. Distanza euclidea: la distanza in linea retta tra le posizioni iniziale e finale della cella. Velocità del binario: distanza accumulata divisa per il tempo totale di tracciamento (μm/h). Direzione: calcolata come il coseno medio dell'angolo (θ) tra ciascun vettore di spostamento e il vettore campo elettrico (valori da -1 a 1; valori più vicini a 1 indicano una forte migrazione anodale).

Sequenziamento dell'RNA
Estrazione e preparazione dell'RNA: Sterilizza un contenitore pieno di ghiaccio sotto luce UV per 15 minuti (per mantenere la stabilità dell'RNA) e esegui tutti i passaggi successivi sul ghiaccio. Trasferire vetrini di vetro con semi hADSC (1 cm x 2 cm) dalla camera elettrotaxica a una piastra di Petri sterile, lavare le cellule 3 volte con 3 mL di PBS gelato (aggiungere PBS delicatamente, agitare leggermente e aspirare completamente per rimuovere il residuo), poi aggiungere 1 mL di reagente TRIzol a ogni vetrina e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per lisare completamente le cellule (assicurarsi che il lisato copra l'intero strato cellulare). Trasferire il lisato in un tubo centrifuga da 1,5 mL privo di RNasi, aggiungere 0,2 mL di cloroformio, far un vortice vigoroso per 15 secondi per indurre la separazione delle fasi, incubare il tubo sul ghiaccio per 15 minuti, poi centrifugare a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Questo separa il lisato in tre strati: la fase acquosa superiore contenente RNA, lo strato proteico medio e la fase organica inferiore. Trasferire con attenzione la fase acquosa superiore (≈ 0,5 mL) su un nuovo tubo privo di RNasi (evitare di toccare lo strato intermedio), aggiungere 0,5 mL di isopropanolo, vortice delicatamente per precipitare l'RNA, incubare sul ghiaccio per 10 minuti, poi centrifugare a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C; L'RNA formerà una pallina bianca sul fondo del tubo. Scartare il soprandante, ripetere una volta la precipitazione di isopropanolo per migliorare la purezza dell'RNA, aspirare completamente il sovrandante, asciugare all'aria il pellet di RNA in un BSC a temperatura ambiente per 5-10 minuti (non asciugare eccessivamente, poiché riduce la solubilità), risospendere il pellet di RNA in 30 μL di acqua trattata con DEPC, incubare a 55 °C per 10 minuti per facilitare la dissoluzione, quantificare la purezza dell'RNA misurando il rapporto A260/A280 (target: 1.8-2.0) usando uno spettrofotometro, valutare l'integrità dell'RNA usando un nanochip RNA; obiettivo: Numero di Integrità dell'RNA [RIN] > 8,0, e conservare campioni di RNA qualificati a -80 °C fino al sequenziamento.

ATTENZIONE: Il trizol e il cloroformio sono tossici, volatili e cancerogeni, quindi maneggiarli esclusivamente in una cappa con guanti in nitrile, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza — evita l'inalazione di vapori, pulisci con un tovagliolo di carta e risciacqua con sapone e acqua per 10 minuti se vengono rovesciati sulla pelle, e non mescolarli con candeggina o altri agenti ossidanti (poiché potrebbero produrre gas tossici). Per lo smaltimento di rifiuti pericolosi legati all'estrazione di RNA, raccogliere miscele, soprandananti isopropanoli e tubi contaminati in un contenitore sigillato e chimicamente resistente etichettato come Rifiuti di RNA (non mescolare con rifiuti acquosi o biologici) e smaltire i protocolli istituzionali sui rifiuti pericolosi, assicurandosi di non versare negli scarichi.

Preprocessing e controllo qualità dei dati: Preparare librerie di sequenziamento utilizzando il VAHTS mRNA-seq Library Prep Kit seguendo il protocollo del produttore: arricchire l'mRNA usando sfere magnetiche oligo(dT), frammentare l'mRNA in frammenti da 200-300 bp usando cationi divalenti, sintetizzare il cDNA del primo filamento usando esameri casuali seguiti da cDNA a seconda filamento, eseguire la riparazione delle estremità, aggiungere A-tail, legatare adattatori per sequenziamento, amplificare librerie tramite PCR e purificare usando perle. Sequenziare le librerie su una piattaforma di sequenziamento (letture accoppiate a 150 bp), generando circa 50 milioni di letture grezze per campione, poi utilizzare un software per tagliare le letture di bassa qualità (rimuovere le letture con >50% di basi con punteggio Phred Quality <20) e sequenze adattatori, mantenendo circa 48 milioni di letture pulite per campione (Q30 > 90%) per l'analisi a valle dopo il taglio.

Analisi bioinformatica: Allineare le letture pulite al genoma di riferimento umano (GRCh38/hg38) usando il software Hisat2 v2.2.1 e salvare i risultati dell'allineamento come file BAM, usare il software htseq-count v0.13.5 per contare il numero di letture mappate su ogni gene (basato sulle annotazioni geniche di Ensembl), normalizzare i dati del conteggio genico usando la funzione estimateSizeFactors dal pacchetto DESeq (2012) R per eliminare gli effetti dei lotti e le differenze nella profondità di sequenziamento, e eseguire analisi di espressione differenziale utilizzando la funzione nbinomTest (pacchetto DESeq), selezionando geni espressi differenzialmente (DEG) usando soglie di cambiamento di piegatura (FC) > 2 e valore p (padj) aggiustato < 0,05. Condurre analisi di arricchimento tramite Gene Ontology (GO) (processo biologico, funzione molecolare, componente cellulare) e analisi di arricchimento dei percorsi della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) sui DEG utilizzando il package clusterProfiler v4.0 R, concentrandosi su arricchimenti legati alla migrazione cellulare (ad esempio, adesione cellulare, migrazione cellulare), trasporto ionico (ad esempio, trasporto transmembrana degli ioni sodi) e vie di segnale (ad esempio, via di segnalazione PI3K-Akt). Esegui un clustering gerarchico non supervisionato sui DEG utilizzando il package pheatmap v1.0.12 R e visualizza i modelli di espressione genica tra i campioni con una heatmap (z-score scalati a righe).

Analisi statistica: Tutti i dati sperimentali sono presentati come Medio ± Errore Standard della Media (Medio ± SEM), con almeno 3 repliche biologiche indipendenti per gruppo (n ≥ 3). Utilizzare il test t di Student per confrontare le differenze tra due gruppi (ad esempio, donatori giovani vs. anziani) e l'Analisi unidirezionale della Varianza (ANOVA), seguita dal test post-hoc di Tukey per confrontare le differenze tra tre o più gruppi (ad esempio, diverse intensità di EF), eseguendo analisi statistiche utilizzando il software SPSS 23.0 e definendo la significatività statistica come segue: *p < 0,05, **p < 0,01, p < 0,001.

Results

L'applicazione dei campi elettrici guida la migrazione direzionale degli hADSC e ne aumenta la capacità migratoria
Gli hADSC estratti hanno mostrato tipici marcatori superficiali delle cellule staminali mesenchimali (ad esempio, CD29, CD44, CD90, CD73, CD105) e possiedono potenziale di differenziazione trilineage (adipogenico, osteogenico, condrogenico; Figura 2A), che soddisfa i criteri standard per l'identificazione di hADSC. Abbiamo applicato campi elettrici a corrente...

Discussion

All'inizio del processo di riparazione e rigenerazione delle lesioni tissutali, i campi elettrici emergono come uno dei primi segnali fisici stabiliti nel microambiente. Le loro proprietà direzionali sono correlate spaziotemporalmente con il reclutamento di cellule al sito^{di lesione 27}. I campi elettrici endogeni hanno origine dal potenziale transepiteliale generato dal trasporto di ioni polarizzati nei tessuti epiteliali. Quando la barriera epiteliale viene inter...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4° C/-20° C/-80° C Frigorifero	Haier, Cina	HYC-390/DW-25L262/DW-86L728J
Agar	HUSHI, Cina	10000561
Bioanalizzatore Agilent 2100	Agilent Technologies, Stati Uniti	G2939BA
Alizarin Red S	Sigma-Aldrich, Stati Uniti	A5533
Armadio di biosicurezza	Thermo Fisher Scientific, Stati Uniti	1300 A2 1,5 m
CaNO3· 4H2O	HUSHI, Cina	10013960
Centrifuga	Thermo Fisher Scientific, Stati Uniti	X4R Pro & nbsp;
Incubatore CO2	Thermo Fisher Scientific, Stati Uniti	Forma Steri-Cycle 3307
Collagenasi di tipo IV	Biosharp, Cina e nbsp;	BS076
Microscopio Confocale	ZEISS, Germania	LSM 900
Alimentazione a impulsi DC	Daedo Powertronics, Corea	DDP-500
Desametasone	Sigma-Aldrich, Stati Uniti	D4902
Multimetro digitale	Fluke, Stati Uniti	FLUKE-175
DMSO	Sigma-Aldrich, Stati Uniti	D2650
Bilanciamento elettronico	Sartorius, Germania & nbsp;	BSA224S-CW
FBS	Gibco, Stati Uniti	10270-106
Citometro di flusso	Thermo Fisher Scientific, Stati Uniti	A24858
IBMX (1-Metil-3-isobutilxantica)	Sigma-Aldrich, Stati Uniti	I7018
Indometacina	Sigma-Aldrich, Stati Uniti	I7378
Insulina	Sigma-Aldrich, Stati Uniti	I5500
Microscopio Rovesciato	ZEISS, Germania	Axio Observer 7 / ACR
ITS-G	Sigma-Aldrich, Stati Uniti	I3146
KCl	HUSHI, Cina	10019318
KH2PO4	HUSHI, Cina	10019320
Acido Linoleico	Sigma-Aldrich, Stati Uniti	L1376
Stazione Cellulare Viva	Live Cell Instrument, Corea	Chamlide TC
DMEM a basso livello di glucosio	Gibco, Stati Uniti	11885084
MgSO4· 7H2O	HUSHI, Cina	10019322
Na2HPO4· 12H2O	HUSHI, Cina	10019324
NaCl	HUSHI, Cina	10019318
NanoDrop 2000 Spettrofotometro	Thermo Fisher Scientific, Stati Uniti	ND-2000
Oil Red O	Sigma-Aldrich, Stati Uniti	O0625
Penicillina/Streptomicina	Gibco, Stati Uniti	15140122
Pipette	Eppendorf, Germania & nbsp;	4920000061
SYBR Premix EX Taq	Takara, Cina e nbsp;	RR420A
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich, Stati Uniti	T3260
Tris	HUSHI, Cina	10019326
TRIZOL	Beyotime, Cina	R0016
Tripsina-EDTA	Gibco, Stati Uniti	25200056
Microscopio verticale	ZEISS, Germania	415200-0000-000
Grasso a vuoto	DOW CORNING, Stati Uniti	1597418
Vitamina C e Vitamina;	Sigma-Aldrich, Stati Uniti	A4544
Sistema di Purificazione dell'Acqua	Thermo Fisher Scientific, Stati Uniti	GenPure xCAD Plus UF-TOC
β-Glicerofosfato	Sigma-Aldrich, Stati Uniti	G9422