Validazione del sistema di pressione iperbarica con anestesia allo xeno per Drosophila melanogaster

Summary

Gas che sembrano innocui a pressione atmosferica possono indurre comportamenti come la narcosi in condizioni iperbariche. Le camere a pressione iperbariche convenzionali sono costose e richiedono molta manodopera. Questo studio presenta un metodo semplice e a basso costo per esaminare gli effetti dello xeno su Drosophila melanogaster a pressioni moderate inferiori a 4 atm.

Abstract

In condizioni iperbariche, le concentrazioni elevate dei gas ambientali possono provocare una gamma di risposte comportamentali in vari animali. Una parte consistente di questi comportamenti rappresenta cambiamenti negli stati cognitivi ancora poco compresi. Un esempio notevole è l'anestesia generale. L'effetto comportamentale di diversi gas in condizioni iperbariche nell'anestesia generale, o narcosi, è stato un'indagine scientifica di lunga data, nonostante l'uso estremamente frequente di questi farmaci in medicina. Lo Xenone, classificato come gas nobile e agente anestetico, è considerato una delle opzioni più sicure per l'anestesia generale negli esseri umani. Tuttavia, non anestetizza le mosche in condizioni normobarie. Qui abbiamo stabilito un semplice allestimento sperimentale che aumenta la pressione ambientale fino a ~3 atm e permette lo studio dell'anestesia allo xeno in uno degli organismi modello più popolari, Drosophila melanogaster. Questa configurazione sperimentale facilita ulteriormente lo studio di altri gas e del loro effetto in condizioni iperbariche.

Introduction

I due estremi estremi degli effetti comportamentali osservati negli animali in condizioni iperbariche sono la convulsione causata dall'ossigeno e la narcosi causata^{dall'azoto 1,2}. Curiosamente, sono stati segnalati deficit cognitivi come allucinazioni e disturbi della memoria con azoto e idrogeno a valori di pressione precedenti al livello di^{incoscienza 3,4}. L'anestesia indotta da xeno, kripton e protossido di azoto in condizioni iperbariche è stata segnalata prima^{del 5,6}.

L'anestesia generale è sia un pilastro della medicina sia un fenomeno di notevole interesse scientifico. Nonostante il suo uso lungo e diffuso, la nostra comprensione rimane limitata su come alcune sostanze chimiche inducano l'assenza temporanea di movimento, memoria, dolore^{e coscienza 7}. Lo Xenon, essendo un gas nobile, poteva essere nominato il membro più peculiare tra gli agenti anestetici. È considerato un'opzione sicura per l'anestesia, offrendo induzione e recupero rapidi, minime disturbi fisiologici e solo lievi effetti collaterali come nausea^{postoperatoria 8,9}.

Data l'importanza medica dell'anestesia e le insolite proprietà chimiche dello xeno, questo studio mira a indagare l'anestesia indotta dallo xenone utilizzando il semplice modello animale Drosophila melanogaster. Sono stati condotti diversi studi di ricerca utilizzando moscerini della frutta per studiare l'anestesia generale, con molte soluzioni proposte e l'uso di vari anestetici^volatili 10,11,12,13. Tuttavia, non sono stati segnalati anestesie allo xeno in Drosophila. In condizioni normobariche, lo xeno non induce anestesia in Drosophila melanogaster, comunemente nota come moscerini della frutta. Per affrontare questa limitazione, questo studio offre un sistema iperbarico che consente la manipolazione controllata della pressione ambientale tra 1 atm e circa 4 atm. Sono stati condotti diversi studi che utilizzano camere iperbariche per rispondere a curiosità simili^14,15. Tuttavia, la maggior parte delle camere iperbariche commerciali beneficia di materiali robusti e a prova di perdite, ma hanno un alto volume (~3 L) e sono sistematicamente complicate da gestire e costose. Al contrario, il metodo descritto in questo articolo è semplice ed economico, permettendo di esplorare gli effetti dei vari gas e delle loro combinazioni. Fornisce un allestimento adatto a modelli animali di piccola dimensione come D. melanogaster e C. elegans.

Protocol

1. Preparazione di Drosophila melanogaster

1. Raccogliere 20 femmine e 20 maschi di età da 1 a 3 giorni per ogni esperimento utilizzando CO₂.
2. Riposare le mosche selezionate in una fiala con cibo per almeno 24 ore prima dell'esperimento a una temperatura di ~22 °C.

2. Somministrazione anestetica

1. Trasferire i gas dai contenitori dei loro contenitori ai sacchetti di gas impermeabili per l'uso sperimentale. Per il trasferimento diretto del gas dal contenitore ai sacchi, usa tubi in silicone.
2. Fissare un tubo in silicone di 25 mm (3,4 mm di diametro) alla siringa di polipropilene. Poi collega la siringa di polipropilene ai sacchi di gas e al rubinetto a tre vie. Per chiarezza, la siringa al polipropilene sarà indicata come siringa #1 nel resto del testo.

3. Assemblaggio della configurazione iperbarica (Figura 1)

1. Posiziona il tavolo luminoso LED in orientamento orizzontale sul tavolo (bordo lungo orizzontale rispetto alla superficie del tavolo).
2. Posiziona la pompa di iniezione accanto a uno dei lati corti del tavolo luminoso LED, assicurandosi che l'orientamento della pompa permetta alla siringa sperimentale di estendersi sopra la retroilluminazione.
3. Posiziona la telecamera sopra l'impianto per coprire la zona in cui si trova la siringa sperimentale.
4. Taglia un tubo di silicio lungo 75 mm (diametro 3,4 mm). Collega il rubinetto a tre vie al manometro usando il tubo in silicone dall'ugello centrale.
5. Usa morsetti a molla per tubo sul lato del manometro e il rubinetto a tre vie per assicurarti che il tubo sia ben stretto.
6. Utilizzando il pulsante segnato da una doppia freccia nell'unità di controllo della pompa di iniezione, imposta la velocità a 80 mm/m e la durata a 38 s per la compressione o decompressione automatica dello sturalavandini.

4. Procedura per l'anestesia allo xeno

1. Limita la luce ambientale nella stanza sperimenti, accendi il tavolo delle luci LED e imposta la luminosità al livello 3. Questo aiuta ad aumentare il contrasto nel video.
2. Rimuovi lo sturalavandini della siringa in policarbonato. Inserisci una piccola quantità di cotone nel capezzolo della siringa per impedire alle mosche di scappare. Per chiarezza, la siringa in policarbonato sarà indicata come siringa #2 nel resto del testo.
3. Per trasferire 40 mosche dalla fiala alla siringa #2, prima togli il coperchio della fiala e posiziona il barile della siringa verticalmente sopra la fiala. La flangia della canna dovrebbe fondersi con la parte superiore della fiala per permettere alle mosche di entrare nella canna della siringa. Gira la struttura di 180° e batti il colpo. Questo posizionerà le mosche sul fondo della canna della siringa. Rimetti lo sturalavandini. Posiziona la siringa con le mosche all'interno della pompa di iniezione.
4. Orienta i segni della canna della siringa sul lato per una migliore visuale delle mosche dal punto di vista della telecamera.
5. Fissa la siringa dalla canna e dalla testa dello stantuffo alla pompa di iniezione usando le viti regolabili.
6. Rimuovi il cotone dalla punta della siringa #2 e collegalo con il rubinetto a tre vie.
7. Avvia la registrazione video. Accendi il manometro. Gira il rubinetto per collegare il manometro alla siringa #2 e conferma la pressione di 0 kPa nella siringa usando il manometro.
8. Gira il rubinetto a tre vie in posizione laterale per permettere lo scambio d'aria con la siringa prima dell'esperimento.
9. Sposta lo sturalavandini dalla fascia 20 a quella di 2 mL tramite l'opzione di controllo manuale della pompa di iniezione, progettata per facilitare l'opzione più rapida.
10. Aspira 18 mL del gas anestetico dalla busta del gas alla siringa #1. Collega la siringa #1 con il tap a tre vie dalla porta laterale di blocco del luer. Per valutare il volume corretto, 18 mL di gas anestetico in una miscela totale di 20 mL fornirebbero il 90% della percentuale di gas. Questo può essere modificato in base alla percentuale finale di gas desiderata.
11. Sposta lo sturalavandini di nuovo sulla linea da 20 mL tramite l'opzione manuale della pompa di iniezione.
12. Gira il rubinetto per collegare il manometro alla siringa #2. Di solito, il manometro mostra una pressione di ~-3 kPa dopo il riempimento dell'anestetico.
13. Sposta automaticamente lo sturalavandini, con velocità e tempo impostati a 80 mm/s e 38 s. Si prevede che la pompa raggiunga i 5 mL bar del barile in 38 secondi. Quando lo sturalavandini si ferma, la pressione massima deve essere di ~200 kPa.
14. Lascia lo sturalavandini in posizione 5 mL per 20 secondi. Nota la pressione di picco.
15. Tocca la siringa per spostare eventuali mosche attaccate allo stantuffo, facendole sedere immobili sul fondo.
16. Inizia la decompressione automatica alla fine di 20 secondi. Termina l'esperimento quando lo sturalavandini è tornato alla barra da 20 mL. Nota la pressione finale per il controllo delle perdite.

5. Analisi dei dati

NOTA: In questo esperimento, l'emergenza anestetica è stata utilizzata come punto finale. I movimenti delle mosche venivano quantificati dal momento di inizio della decompressione dello stantuffo. Furono sviluppati due diversi metodi di analisi: analisi dei pixel e tracciamento delle mosche. Ogni metodo di analisi aveva i suoi svantaggi, che vengono comunicati nella discussione.

1. Analisi dei pixel
   1. Usa ScreenFlow per montare i video. Ritaglia ogni video alla regione di interesse (ROI), cioè i primi 5 mL della canna della siringa.
   2. Taglia il video ai primi 20 secondi dopo la decompressione con la siringa. Esporta i video modificati come GIF. Duplica la GIF.
   3. Usando Fiji, rimuovere il primo fotogramma da un duplicato e rimuovere l'ultimo fotogramma dall'altro duplicato. Per raggiungere questo risultato, seleziona Editing Immagine > Video > Elimina Fotogrammi.
   4. Fai in modo che ogni GIF binario nelle Fiji appaiano bianche su uno sfondo nero. Per ottenere ciò, seleziona Processo > Binario > Diventa binario.
   5. Apri entrambi i GIF nelle Fiji. Calcola la differenza di pixel tra le GIF. Per ottenere ciò, seleziona Calcolatore di Processo > Immagine. Questa operazione creerà un GIF con differenza di pixel.
   6. Salva la GIF della differenza di pixel. Analizza la particella nelle diverse GIF. Per farlo, seleziona Analizza > Analizza particelle nelle Fiji. Regola le soglie di dimensione dei pixel per aumentare il rapporto segnale-rumore.
   7. Dopo aver analizzato le particelle, Fiji genera un CSV con differenze di pixel per fotogramma. Risparmia il CSV. I dati CSV possono essere utilizzati per tracciare il movimento per fotogramma. Usa il movimento cumulativo attraverso i frame per assegnare differenze statistiche tra gli esperimenti.
2. Tracciamento delle mosche
   NOTA: Per il metodo di tracciamento delle mosche, è stata utilizzata la tecnologia AI per rilevare e tracciare il centro di massa di ogni mosca nei video degli esperimenti. Due modelli sono stati combinati per questo: YOLO (You Only Look Once) per la rilevazione e MASA (Matching Anything by Segmenting Anything) per il tracciamento. I modelli sono stati eseguiti su Google Colab utilizzando una GPU Tesla T4.
   1. Installa la libreria YOLO di Ultralytics in Colab, poi carica il modello yolo11n.pt. Usa CVAT (Computer Vision Annotation Tool) per annotare le mosche nei frame estratti dai video, poi esporta il dataset in formato YOLO per l'addestramento. Le procedure dettagliate di installazione e formazione sono descritte nel repository online.
   2. Installa il repository MASA in Google Colab e incorpora un filtro di Kalman per eseguire il tracciamento degli oggetti attraverso frame consecutivi. Integrare il modello addestrato di rilevamento YOLO con il framework di tracciamento MASA.
   3. Usa FixTrack per rivedere manualmente i tracklet generati dalla pipeline combinata MASA+YOLO. Identificare e unire tracce frammentate in modo errato o correggere disallineamenti d'identità per ottenere traiettorie continue per singole mosche. Le procedure dettagliate di installazione e formazione sono descritte nel repository FixTrack.

Results

Il metodo descritto in questo articolo consente di monitorare sia il tempismo sia l'entità dell'attività locomotoria nelle mosche in condizioni iperbariche. Questa configurazione permette a gas come lo xeno e l'ossido d'azoto, che non hanno proprietà anestetiche in condizioni normali, di produrre anestesia in Drosophila melanogaster. Per dimostrarlo, abbiamo sperimentato con diverse concentrazioni di xeno e aria. Abbiamo iniziato a stabilire il processo con 90% xeno e 10% aria. ...

Discussion

Questa configurazione semplice e a basso costo rende ampiamente accessibili i saghi comportamentali iperbarici in Drosophila, consentendo esperimenti rapidi e riproducibili senza recipienti a pressione specializzati. Tuttavia, presenta alcune limitazioni. Uno dei suoi compromessi importanti è la pressione massima più bassa rispetto alle installazioni esistenti. La pressione massima che possiamo indurre con questa configurazione è ~4 atm, mentre i vasi a pressione usati per D...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sacchetti ermetiche per il gas (0,5 L)	Techinstro	7440440
Fotocamera	Mela	iPhone 15
Fasce per tubi a molla a doppio filo	Mappa delle fonti	a24120200ux2109
Miscela alimentare per Drosophila	Allevamento Avanzato	DM900
Drosophila melanogaster	Darwin Biological	LZ-210
Tubo di iniezione	Aitoserlea	B09M8G5BQ8
Tavolo luminoso a LED	Lairi	M1-3878368
Manometro	Dwyeromega	477AV-8
Rubinetto di fermamento a tre vie in metallo a tre vie e a capo;	Sigma Aldrich & nbsp;	Z182184
Siringa in policarbonato (20 mL)	DMC Medical	FD-1031NS
Siringa di polipropilene (20 mL)	BD	301031
Tubo in silicone
Gas Xeno	Gas industriali di Chengdu Taiyu