Trasformazione efficiente basata sulla rigenerazione mediata da agrobatterio di una specie anfibia asessuata di Brassicaceae, Rorippa aquatica

Sommario

Presentiamo un protocollo efficiente e ottimizzato per la trasformazione mediata da Agrobacterium di una specie anfibia asessuata di Brassicaceae, Rorippa aquatica, senza procedure di coltura tissulare sterile ad alto volume di risorse. Utilizzando un marcatore di trasformazione visiva e una pipeline di rigenerazione dei germogli, si generavano con successo trasformanti quasi clonali, avanzando così gli studi futuri sull'adattamento delle piante all'ambiente subacqueo.

Abstract

La trasformazione genetica stabile delle piante mediata da Agrobacterium tumefaciens è stata uno strumento potente per la ricerca fondamentale in biologia vegetale così come per le biotecnologie vegetali che influenzano direttamente il miglioramento delle colture. Pipeline di trasformazione semplici ed efficaci, come il metodo di immersione floreale per Arabidopsis, hanno fatto avanzare drasticamente le analisi su larga scala della funzione genica. Tuttavia, tale condotta non può essere applicata a specie vegetali che non si riproducono sessualmente. Rorippa aquatica è una specie modello anfibia emergente di Brassicaceae che presenta eterofilia e drastici cambiamenti della forma delle foglie e delle piante in ambienti terrestri o sottomarini. R. aquatica si propaga esclusivamente in modo vegetativo. La pipeline ottimizzata presentata qui fornisce una trasformazione efficiente e affidabile di R. aquatica mediata da Agrobacterium, senza richiedere colture tissutali sterili. Le talee fogliari sono brevemente immerse in Agrobacterium sospese in un buffer di trasformazione contenente un vettore binario che esprime un marcatore visivo, RUBY, sotto il promotore costitutivo. Successivamente, gli inoculanti vengono coltivati su carta filtrante imbevuta d'acqua in una camera di crescita. Successivamente, le piante rigeneranti con pigmentazione rosso RUBINO vengono separate e messe in vaso nel terreno. Quei rigeneranti T1 iniziali (R1-T1) esprimono settori rossi. Eliminando il settore rosso e ripetendo i passaggi di rigenerazione, nella generazione successiva R2-T1 viene prodotto un gran numero di fratelli transgenici, alcuni dei quali sono quasi uniformemente rossi; indicativo dell'espressione RUBINO. Questa semplice pipeline di trasformazione può essere adottata per R. aquatica e possibilmente altre specie vegetali a propagazione vegetativa per introdurre geni di interesse e indagare le loro funzioni nell'adattamento a terrestri vs. ambienti acquatici.

Introduzione

La trasformazione genetica stabile, cioè l'introduzione e l'espressione di geni di interesse per una determinata specie vegetale, è centrale per la scienza vegetale di base e la biotecnologia vegetale. La trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens è di gran lunga il mezzo più utilizzato di ingegneria genetica vegetale per la sua generazione affidabile di trasformanti^{stabili 1}. Lo sviluppo di un sistema vettoriale binario, in cui il vettore clonazione del T-DNA e il plasmide auxiliare del vir disarmato sono separati in due entità, ha rivoluzionato la trasformazione mediata da Agrobacterium ^1,2. Per la pianta modello Arabidopsis thaliana, una semplice procedura di trasformazione floreale a immersione economica ha permesso la generazione ad alto rendimento di trasformanti clonali (emisigoti) per la genetica funzionale e la genomica ^3,4. Tuttavia, tale approccio non è fattibile per specie vegetali che si propagano prevalentemente o esclusivamente vegetativamente.

Le piante anfibie mostrano una capacità unica di prosperare sia in ambienti terrestri che acquatici (subacquei^{) 5}. Rorippa aquatica è una specie anfibia di Brassicaceae che presenta eterofiliali. In un ambiente terrestre, R. aquatica sviluppa foglie rotonde con epidermide composta da cellule del pavimento e stomi. Al contrario, le loro foglie acquatiche mostrano morfologie ben adattate all'ambiente subacqueo: foglie altamente dissezionate a forma di aghi con epidermide priva di cellule cuticolate del pavimento o^{stomi 6,7}. Filogeneticamente, R. aquatica è strettamente imparentata con Arabidopsis thaliana; entrambi appartengono alla stessa famiglia,^{Brassicaceae 6}. Insieme alla disponibilità di dati di sequenza del genoma completo e all'elevata conservazione delle sequenze dei geni codificanti tra R. aquatica e A. thaliana, R. aquatica funge da pianta modello anfibia emergente per studiare la base molecolare dell'adattamento alla terra e^{all'acqua 8}. Infatti, recenti studi fisiologici ed espressivi genici suggeriscono che il riconnesso delle vie di segnalazione luminosa e ormonale sia fondamentale per l'eterofilia di R. aquatica ^7,8.

Per testare le funzioni molecolari dei geni e delle vie candidate, la trasformazione genetica è assolutamente essenziale. R. aquatica si propaga vegetativamente^{in natura 8,9}. Pertanto, a differenza di A. thaliana, la trasformazione del dip floreale di Agrobacterium non può essere applicata a R. aquatica. In modo sorprendente, R. aquatica rigenera facilmente intere piante da foglie staccate senza integrazione esogena di fitormoni¹⁰. Per un breve periodo, entro pochi giorni dal distacco del segmento della foglia, la proliferazione cellulare diventa attiva nel tessuto vascolare all'estremità prossimale della superficie tagliata. Nel giro di una settimana, sia radici che germogli si rigenerano, produendo infine giovani piante (piante a rosetta). Le singole piante possono essere separate e cresciute fino a^{maturità 10}. Questo processo spontaneo di rigenerazione completa delle piante può essere facilmente utilizzato per una trasformazione genetica di R. aquatica.

La pipeline ottimizzata qui riportata consente una trasformazione efficiente e affidabile di R. aquatica mediata da Agrobacterium, sfruttandone la capacità di rigenerazione spontanea dopo il distacco delle foglie. Per una selezione semplice dei trasformanti senza la necessità di costosi processi di coltura sterile, è stato adottato un marcatore di selezione visiva non invasivo, RUBY, un vettore sintetico con tre geni che portano alla biosintesi della^{betalain 11}. Ottimizzando le condizioni della coltura batterica, le fasi di inoculazione e i processi di incubazione delle talee fogliari per la rigenerazione, sono state prodotte piante di R. aquatica in modo affidabile e transgenica fino alla maturità. Quasi tutti i trasformanti iniziali della generazione R1-T1 mostrano settori rossi, indicando che sono mosaici genetici eterogenei. Eliminando i settori delle foglie rosse RUBY+ e ripetendo i processi di rigenerazione, è possibile la generazione di piante interamente rosette rosse, quindi quasi clonali, trasformanti di R. aquatica alla successiva generazione R2-T1. Questa pipeline di trasformazione può essere facilmente applicata per introdurre/esprimere geni estranei di interesse in R. aquatica, accelerando così gli studi genetici molecolari sull'eterofilia e sull'adattamento delle piante ad ambienti estremi.

Protocollo

I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione dei materiali vegetali

1. Tagliare e tagliare foglie mature, completamente lobate, sane in pezzi di 1-2 cm da piante madri mature di due mesi (Figura 1A).
2. Fodere un vassoio di propagazione delle piante (vassoi per nido permanente da 20 x 30 cm) con due strati di carta asciugatutto piegati in autoclavi. Inzuppa i tovaglioli di carta con acqua sterile, così da avere uno strato sottile sopra.
3. Posizionare le talee con il lato adassiale verso l'alto, con spazio attorno a ogni espiante per evitare sovrapposizioni (Figura 1A).
4. Spruzza leggermente le talee e copri bene il vassoio con pellicola trasparente.
5. Posizionare i vassoi nella camera di crescita a 25 °C-28 °C con 16 ore di luce e 8 ore di buio in condizioni umide e un'intensità luminosa di 50 μmol/^{m 2}/s.
6. Ispeziona e mantieni vassoi di propagazione puliti e umidi 2-3 volte a settimana.
   1. Aggiungi acqua sterile per mantenere uno strato sottile sopra gli asciugamani di carta insatura.
   2. Sostituisci la pellicola trasparente che ha perso adesione e/o mostra segni di contaminazione (ad esempio, torbidità visibile dell'acqua).
7. Utilizzando micro-forbici o bisturi, si elimina con cura singole piante a rosetta sane rigenerate che portano sia un germoglio che una radice tra 14 e 21 giorni dopo la nascita (Figura 1B).
   NOTA: È necessaria un'attenta escissione per ottenere una singola pianta a rosetta con germogli e radici intatti. Le piante della rosetta Rorippa proliferano densamente lungo l'intersezione tra l'expianta fogliare e la nervatura centrale, complicando l'identificazione delle singole piante a rosetta. Il germoglio di una pianta a rosetta cresce in modo adessiale, mentre le radici crescono sotto la superficie della foglia, complicando la visibilità dell'intera pianta a rosetta (Figura 1B).
8. Trapianta singole piante a rosetta in vasi contenenti un terreno umido (rapporto 2:1:1 di terriccio: Vermilculite: Perlite) integrato con un fertilizzante a rilascio lento (Figura 1B).
9. Acqua con acqua del rubinetto modificata con 0,25 g/L di fertilizzante NPK granulato e coprita con una cupola di umidità o pellicola trasparente per mantenere condizioni umide.
10. Posizionare i vassoi nella camera di crescita in condizioni preesistenti (25 °C-28 °C con 16 ore di luce e 8 ore di buio in condizioni umide e un'intensità luminosa di 50 μmol/^{m 2}/s)
    NOTA: È fondamentale preservare le condizioni del suolo umido. Mantieni uno strato sottile d'acqua sotto i trapianti in vaso.

2. Colture agrobatteriche per la trasformazione

1. Ceppo di Streak A. tumefaciens GV3101 che ospita il plasmide Ti-plasmide pMP90 (pTiC58DT-DNA) che contiene il vettore RUBY su una piastra da 30 mL LB contenente rifampicina (0,03 mg/mL), gentamicina (0,025 mg/mL) e spectinomicina (0,05 mg/mL) e cresce a 28° C per 48-72 ore fino a quando non si evidenziano colonie singole.
2. Seleziona una singola colonia e inocula 5 mL di brodo MG/L modificato con biotina e antibiotici selettivi precedenti (Tabella 1) e incuba in uno shaker rotativo a 28 °C a 200 giri/min per 16 ore.
3. Trasferire l'inoculo in una fiaschetta conica con brodo da 250 MG/L e incubare in uno shaker rotativo a 28 °C a 200 giri/min per 16 ore.
4. Assicurarsi che la coltura liquida abbia un diametro esterno_{minimo di 600} pari a 1,2 utilizzando uno spettrofotometro. Granula i batteri tramite centrifugazione a 3396 x g per 10 minuti a temperatura ambiente (circa 22 °C). Modificare il brodo dell'inoculo con 200 μM di Acetosiringone (AS).
   NOTA: Le aliquote di AS filtrante sterile vengono preparate in DMSO a una concentrazione operativa di 100 mM e conservate a -20 °C. Il brodo per inoculi dovrebbe essere preparato fresco. L'AS viene aggiunto direttamente prima della fase di centrifugazione per minimizzare il degrado. Le descrizioni dei media e i componenti sono elencati nella Tabella 1.
5. Evitando il disturbo diretto del pellet batterico, scartare il surnatante e risospendere il pellet nel brodo di inoculo.
6. Fai roteare manualmente la fiaschetta in modo che la soluzione abbia un OD₆₀₀ di circa 0,8.
7. Incubare l'inoculo su uno shaker a 90 giri/min per 2,5 ore a temperatura ambiente (circa 22 °C).
8. Registrare le condizioni pertinenti (Coltura e Inoculo OD₆₀₀, concentrazione di AS e quantità di tensioattivo, periodo di inoculazione e numero di unità sperimentali necessarie per l'efficienza della trasformazione.
   NOTA: Concentrazioni ottimali di colture batteriche e di risospensione sono essenziali per massimizzare l'efficienza della trasformazione minimizzando al contempo una crescita batterica eccessiva. Prima della centrifugazione, assicurarsi che la coltura batterica abbia un OD600 minimo di 1,2; risospendere a un inoculo OD600 di 0,8. Le modifiche al brodo di induzione sono ottimizzate per migliorare la trasformazione senza compromettere la vitalità del rigenerante. Le concentrazioni raccomandate sono 150-225 μM per l'AS e 0,005% per il tensioattivo.
   ATTENZIONE: Smaltire tutti i batteri transgenici e le piante in contenitori designati per rifiuti biopericolosi.

3. Trasformazione delle talee di foglie di R. aquatica

1. Durante l'incubazione della coltura di risospensione dell'inoculo, seleziona diverse piante di 2 mesi che presentino foglie sane con margini interi.
2. Prepara un vassoio per la propagazione delle piante (vassoi per nido permanente da 20 x 30 cm) con 2 strati di carta assorbente autoclavata. Piega gli asciugamani di carta. Inzuppa i tovaglioli di carta con acqua sterile, così da avere uno strato sottile sopra.
   NOTA: Stabilire una vaschetta di controllo negativa in cui gli espiantili non inoculati subiscono condizioni ambientali identiche.
3. Assicurati che il banco di laboratorio sia dotato di contenitori sterili da 100-500 mL ddH₂O, adatti al volume previsto di inoculo sospeso, una micropipetta e punte.
4. Prima della fine della fase di incubazione, si tagliano rapidamente dieci foglie alla base del piccolo dalle piante di stocco selezionate. Metti gli espiantili in una piastra di Petri con acqua sterile.
   NOTA: È fondamentale utilizzare tessuto appena espulso per l'inoculazione fogliare per evitare la disidratazione delle foglie.
5. Dopo 2,5 ore, pipettare 50 μL di tensioattivo in una soluzione di risospensione da 1 L (concentrazione di tensioattivo dello 0,005%) e far roteare delicatamente la fiaschetta per mescolare (Figura 2A). Garantire l'accessibilità di un vassoio di propagazione per posizionare gli espianti dopo l'inoculazione (Figura 2B).
6. Posizionare il lato abassiale della foglia verso l'alto e tagliare perpendicolarmente lungo la nervatura centrale in pezzi lunghi 1 cm con un bisturi (Figura 2C).
7. Inserisci immediatamente foglie appena tagliate in un tubo da 50 mL, adatto al miscelatore rotante a tubo, per fungere da essiccazione per l'inoculazione.
8. Versare l'inoculo nel tubo di esimpianto a un volume per saturare tutto il materiale, poi agitare in un miscelatore rotativo per 10 minuti a temperatura ambiente per l'inoculazione (Figura 2D,E).
9. Rimuovere tutte le foglie inoculate dalla soluzione con la pinza e posizionarle direttamente nel vassoio di propagazione preparato.
10. Separare e distribuire gli expianti bagnati in modo che siano parzialmente, ma non completamente, immersi nello sottile strato d'acqua sopra gli asciugamani di carta saturi (Figura 2F).
    ATTENZIONE: Mantieni condizioni asettiche ed evita qualsiasi contatto con superfici o strumenti utilizzati durante le procedure di Agrobacterium prima della loro disinfezione.
11. Sigilla ogni vassoio con pellicola trasparente e incuba al buio a temperatura ambiente (22° C) per tre giorni.
12. Al termine del periodo buio, assicurati che i vassoi siano sigillati con pellicola trasparente e correggi i vassoi con ddH_2Oper mantenere il livello di umidità.
13. Sposta le teglie di inoculazione in una camera di crescita in condizioni di propagazione vegetativa.
    ATTENZIONE: Consolidare i rifiuti degli inoculi in un contenitore di rifiuti, trattarli con una soluzione di candeggina al 10% e smaltirli secondo le linee guida di biosicurezza.

4. Rigenerazione delle piante a rosetta e istituzione della generazione R1-T1

1. Ispeziona le mascherie di inoculazione 2-3 volte a settimana per assicurarti condizioni pulite e umide.
   1. Aggiungi_{ddH 2O}usando una bottiglia da spremere. Se disponibile, nebulizza l'espiante con uno spruzzino prima di richiudere le vaschette.
   2. Mantieni un'umidità elevata sostituendo pellicola trasparente che ha perso aderenza o mostra segni di contaminazione (ad esempio, torbidità visibile dell'acqua).
2. Ispezionare visivamente le piante di rosetta rigenerate per le caratteristiche di idoneità al trapianto. I rigeneranti ideali mostreranno un germoglio intatto con più foglie e radici lunghe almeno 2-3 mm (Figura 2G).
   NOTA: Le piante a rosetta transgeniche si rigenerano tipicamente più lentamente, raggiungendo solitamente l'idoneità al trapianto 21-28 giorni dopo essere state inserite nella camera di crescita.
3. Esporre e trapiantare intatte piante di rosetta transgeniche nelle stesse condizioni dei rigeneranti clonali WT.
4. (Opzionale) Registra il numero di trasformanti rigenerati e correla con le loro condizioni di trasformazione per valutare l'efficienza.
   NOTA: Esercitare particolare attenzione durante la selezione. I rigeneranti transgenici sono spesso piccoli e facilmente trascurati. Ispezionare attentamente sia le superfici fogliari adassyli che abassiali usando pinze per massimizzare la resa e minimizzare i danni.
5. Elimina la pianta a rosetta di accisa, evitando però di toccare foglie transgeniche. Taglia eventuali foglie in eccesso immediatamente intorno alla foglia transgenica. Trapianta una pianta per vaso.
6. Concima, annaffia e nebulizza rapidamente ogni pianta e posizionala sotto una cupola di plastica per trattenere l'umidità (Figura 2G,H).
7. Etichetta e registra ogni piantina transgenica.
8. Restituire gli expiantili che contengono trasformanti privi di germogli, radici o che sembrano troppo piccoli per essere trapiantati nel vassoio di propagazione per continuare lo screening. Trapianta ulteriori trasformanti quando la crescita è sufficiente.
9. Trapianti di nebbia e acqua quotidianamente per la prima settimana. Assicurati che ci sia sempre acqua nel vassoio.
10. Rimuovere e smaltire eventuali trapianti che hanno scenso o non mostrano più espressione di pigmento RUBINO.
    ATTENZIONE: Smaltire tutti i materiali transgenici secondo le normative istituzionali sulla biosicurezza.

5. Rigenerazione successiva e stabilimento della generazione quasi clonale R2-T1

1. Quando le piante a rosetta si sviluppano in grandi piante sane (2 mesi), si esprimono le foglie espanse che esprimono RUBINO da una singola piantina (Figura 2H).
   NOTA: Sebbene le foglie che esprimono il rubini possano apparire uniformemente rosse, sono più comunemente chimere. Entrambi i fenotipi sono adatti alla propagazione. Procedi con i metodi standard di propagazione vegetativa nei passaggi successivi.
2. Dividi i pezzi di foglie trasformati e mettili in un vassoio di propagazione. Etichetta chiaramente ogni vassoio di propagazione con il corrispondente ID donatore della piantina.
   ATTENZIONE: Non mescolare foglie di più piantine nello stesso vassoio. Ogni piantina rappresenta un evento transgenico unico e deve essere tracciata come generazione separata.
3. Piante R2-T1 rigenerate in trapianto (14-28 giorni dopo la propagazione). Assegnare a ogni impianto un nuovo identificatore che rifletta il suo secondo stato. Continuare la cura standard dopo il trapianto come descritto in precedenza (Figura 2I,J).

Risultati

I parametri della trasformazione di A. tumefaciens sono stati ottimizzati per produrre con successo piante transgeniche di R. aquatica che esprimono RUBY, bypassando le limitazioni basate sulla sterilità e sfruttando il rapido tasso di rigenerazione asessuale (Figura 1 e Figura 2). Dopo che gli espiantifoli di foglie sono stati inoculati ed esposti a un successivo trattamento scuro di 72 ore, le piante rigenerate hanno iniziato a crescere entro 2 settimane nelle condizioni descritte. Le piante rigenerate che mostravano settori chimerici di RUBINO abbastanza grandi per il trapianto sono state trovate tra 3 e 5 settimane dopo l'inoculazione (Figura 3) e risultavano leggermente più piccole rispetto a quelle piante a rosetta non espressive. Non sono state trovate piante rigenerate da RUBINO sui vassoi di controllo di tipo selvatico, confermando che questo fenomeno era diverso dalla fisiologia di R. aquatica. Il tipo di brodo in coltura batterica, il tipo di brodo di inoculo per risollevazione, il metodo di infiltrazione e il periodo di inoculazione non differivano significativamente nella capacità o nella velocità di generazione di trasformanti (Tabella 2 e Tabella 3). I fattori di trattamento che hanno influenzato positivamente l'efficienza della trasformazione includevano l'aumento della concentrazione di AS e il trattamento da esposizione all'auxina prima dell'inoculazione con expiante fogliare. Un aumento della concentrazione di tensioattivo influì negativamente sulla resa ed è stato ritenuto inadatto.

La versione R 4.4.2 12,13,14,15 è stata utilizzata per eseguire l'analisi del Poisson General Linear Mixed Model (Poisson GLMM) dei dati sul conteggio delle piante a rosetta. Tuttavia, nell'Esperimento D (Tabella 2D), dove i rigeneranti espressi da RUBI sono stati esaminati per un'inoculazione di 15 minuti modificata con 150 μM AS o 225 μM AS, il modello ha violato le ipotesi dovute a sottodispersione, e invece è stato applicato un GLMM Binomiale Negativo.

Gli effetti delle diverse condizioni di brodo batterico e coltura sull'efficienza della trasformazione sono stati esaminati con attenzione. Tra i cinque replicati sperimentali, l'uso del brodo LB di Miller o del brodo MG/L specifico per la trasformazione ha portato a trasformanti che esprimevano RUBY sotto parametri quasi identici e non differivano significativamente nei loro effetti (Tabella 2A). I mezzi di RUBY espressi in piante a rosetta rigenerate da singoli pezzi di foglie, composti da 15 a 60 espianti per trattamento, variavano da 1,61 ± 0,71 rigeneranti prodotti da esperimenti che utilizzavano brodo di risospensione in coltura basato su LB e non MS (Control Induction Broth, Tabella 1) e 3,23 ± 1,13 rigeneranti da quegli esperimenti con MG/L e il Optimized Induction Broth. Nonostante la mancanza di una differenza significativa, a causa di osservazioni soggettive, la coltura MG/L e il Brodo di Induzione Ottimizzato (Tabella 1) sono stati selezionati per futuri esperimenti di ottimizzazione.

Successivamente, abbiamo testato i fattori che influenzano il carico batterico e la capacità di accedere al tessuto meristematico delle piante. Tra otto repliche (Tabella 2B), gli espiantili inoculati con una concentrazione di tensioattivi aumentata dello 0,01% hanno mostrato uno stress estremo un mese dopo, risultando in piccoli rigeneranti in gran parte non vitali. Non sembrava esserci alcun trasformante rigenerato tra queste repliche, anche se il fenotipo del rigenerante stressato degli expiante era la pigmentazione bordeaux, marrone e gialla, quindi potrebbero esserci stati potenziali trasformanti. In ogni caso, la non vitalità dei rigeneranti ha confermato il mantenimento di una concentrazione di tensioattivi dello 0,005%.

Due tecniche meccanicistiche, agitazione o infiltrazione a vuoto, sono state confrontate nel loro effetto per introdurre il DNA desiderato nella pianta ospite. Il metodo di infiltrazione di controllo, in cui gli espiantili venivano immersi in 50 mL di inoculo risospeso e ruotati in un miscelatore a tubo, ha avuto successo nel produrre rigeneranti espressi da RRUBINO tra i trattamenti elencati. L'infiltrazione applicata nel vuoto ha prodotto anche rigeneranti espressi in RUBY, ma non differiva nell'efficienza di trasformazione rispetto al metodo di controllo (p = 0,478, Tabella 2D). Sono stati osservati circa 2-5 rigeneranti espressi da RBY per vassoio di propagazione, sia inoculati tramite infiltrazione nel vuoto sia tramite agitazione fisica.

La concentrazione modificata di Acetosyringone (AS) nell'inoculo batterico differiva chiaramente nel suo effetto sull'efficienza della trasformazione. L'aumento della concentrazione di AS da 150 μM a 225 μM migliorò significativamente la produzione di esprimi espressioni di RUBY (p = 0,000309, 0,000458; Tabella 3C,D). Tra i quattro esperimenti, ogni trattamento consisteva in un vassoio con 40 espiantili inoculati trattati allo stesso modo. Coloro che sono stati inoculati a concentrazioni più elevate hanno registrato in media quasi 5 rigeneranti espressi da RUBINO rispetto a 1 trasformante per vassoio di AS di controllo (Tabella 3C). Inoltre, l'effetto AS sembrava essere separato dai periodi di durata dell'inoculazione.

Tra i tre esperimenti con durate di inoculazione di 15 minuti, con eximpianti modificati con 225 μM AS, è stata trovata una media di 7,28 ± 4,13 rigeneranti espressi con RUBY, chiaramente superiore ai trattamenti da 150 μM, dove 2,03 ± 1,32 tasso di rigenerazione (Tabella 3D). Non è apparso alcun effetto chiaro sull'intervallo di tempo tra i trattamenti di controllo con AS a 150 μM (p = 0,676), per i quali il tasso medio di inoculazione a 10 minuti era di 1,48 ± 0,954 rispetto a 1,84 ± 1,230 rigeneranti tra le inoculazioni di 15 minuti (Tabella 3B). Analogamente, inoculanti trattati a 10 minuti e 225 μM hanno rigenerato circa 5 piante a rosetta espresse da RUBINO per trattamento, cosa non chiaramente diversa dai trattamenti inoculanti di 15 minuti, dove sono stati indicati 6-7 rigeneranti per il vassoio di trattamento (Tabella 3A).

Inoltre, è stato testato l'ormone vegetale auxina, che favorisce la rigenerazione delle piante in generale. L'esposizione di frammenti di foglie appena estizzate a un trattamento con auxina a impulsi prima dell'inoculazione ha avuto un effetto positivo chiaro sull'aumento della rigenerazione del RUBINO rispetto a quelli in ddH_2O(p = 0,00969, Tabella 2C). Quando inseriti in_{ddH 2}0 modificato con 285 μM di acido indolo-3-acetico (IAA), gli espianti hanno mostrato un tasso medio di trasformante di 6,67 ± 1,490 per trattamento rispetto al trattamento senza auxina, che ha registrato una media di 2,00 ± 0,816.

La linea transgenica immediatamente rigenerata fu designata come generazione R1-T1 (Figura 2), con singoli rigeneranti come linee. Tutte le piante a rosetta R1-T1 iniziali mostravano espressione di RUBINO sotto forma di foglie chimeriche, con una varietà di motivi chimerici. Più comunemente, 1-3 foglie di pianta esprimevano chimere distinte dove il tessuto espresso e non espresso in RBY divergeva alla nervatura centrale. La maggior parte delle piantine R1-T1 di un mese ha mantenuto espressione chimerica (Figura 3A), ma è stato trovato un piccolo numero di piantine completamente espressive di RUBY.

I settori chimerici pigmentati con RUBY propagati asessualmente da frammenti di foglie di piantine R1-T1 (Figura 3B) si sono rigenerati completamente in RUBY o in piante chimeriche di rosetta R1-T1 entro 2-4 settimane dall'escissione (Figura 3C). Dopo un mese, la maggior parte delle piantine R2-T1 mostrava prevalentemente foglie di RUBINO, con alcune che mostravano piccole regioni chimeriche non espresse (Figura 3D,E).

Figura 1: Protocollo e tempistica di propagazione vegetativa. Immagini rappresentative illustrano la pipeline produttiva utilizzata per rigenerare piante rosette asessuate. (A) Tagliare le foglie mature, sane e intere lobate dalle piante madri già stabilite e tagliarle in 2-3 pezzi. (B) Posizionare gli espiantili in un vassoio di propagazione e mantenerli in condizioni specificate. Dopo 3 settimane, le piante a rosetta sono state rimosse dagli espianti e trapiantate nel substrato del suolo. Qui sotto c'è una foto reale delle rosette rigenerate ancora attaccate (frecce rosa) alla ferita madre. Queste piantille sono nella fase ottimale per il trapianto. Barra in scala: 10 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Trasformazione delle talee di foglie di R. aquatica e rigenerazione di trasformanti che esprimono trascrizioni di RUBINO . Panoramica grafica della procedura di trasformazione e della produzione dei rigeneranti trasformati. (A) Ottenere l'inoculo batterico. (B) Preparare un vassoio di propagazione con carta filtrante sterile e acqua. (C) Tagliare le foglie in pezzi di expianta. (D) Immersione degli espiantili nell'inocolo. (E) Agitazione in un mixer rotativo per 20r/1 min per 10 min. (F) Distribuzione degli expianti saturi nel vassoio, copertura con una cupola di plastica e incubazione in condizioni di buio per 72 ore. (G,H) Dopo 1 mese, espellendo i rigeneranti trasformati intatti dagli espianti esposti ad Agrobacterium e trapiantanandoli per stabilire piante mature. (I,J) Ripetendo il passaggio di propagazione (G,H) per produrre una generazione quasi clonale di R2-T1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Generazioni asessualmente propagate di una linea transgenica RUBY . (A) Piantina matura di R1-T1 che mostra foglie chimeriche con espressione RUBINO . Barra della scala: 1 cm. (B) Due dei venti espiantimenti appena posizionati in un vassoio di propagazione della piantina di 3 mesi mostrata in (A). Gli espianti mostrano un motivo chimerico di RUBINO separato alla costa centrale. Barra di scala: 1 cm. (C) Piante di rosetta R2-T1 rigenerate con diversi gradi di espressione chimerica di RUBINO , un mese dopo l'escissione, prima del trapianto. Radici RUBY positive rigenerate (freccia marrone). Barra di scala: 2 cm (D) piantina R2-T1 mostrata 1 mese dopo il trapianto, con espressione di RUBY . Barra di scaglia: 2 cm. (E) Piantina matura di R2-T1 3 mesi dopo il trapianto che mostra piccoli settori (frecce verdi). Barra in scala: 2 cm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Diagramma di flusso della pipeline ottimizzata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Formulazioni dei Media Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Effetto di quattro parametri di ottimizzazione sull'efficienza di trasformazione di R. aquatica. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Effetto della concentrazione di acetosirone nell'inoculo sull'efficienza di trasformazione diR. aquatica. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

In questo studio, abbiamo stabilito una semplice trasformazione stabile mediata da Agrobacterium basata sulla rigenerazione diretta di R. aquatica, una pianta anfibia di Brassicaceae che si propaga esclusivamente^{asessualmente 10,16}. Non è stata stabilita una pipeline di trasformazione approfondita delle piante anfibie propagate vegetativamente, né è stata utilizzata la trasformabilità pratica di R. aquatica con un marcatore visivo. È importante notare che questa pipeline non richiede un laborioso e sterile processo di coltura dei tessuti vegetali né incubatori specializzati per la crescita delle piante. Pertanto, questo protocollo può essere ampiamente adottato in contesti sperimentali diversi, dai laboratori di ricerca scientifica fino all'aula.

Tra le diverse condizioni di inoculazione e incubazione testate, alcuni fattori hanno apportato un miglioramento significativo nell'efficienza della trasformazione. In particolare, una concentrazione leggermente più alta di acetosiringone (AS) così come quella di indolo-3-acetico (IAA) hanno influenzato positivamente l'efficienza della trasformazione (Tabella 1 e Tabella 2). L'AS è un composto fenolico che attrae Agrobacterium, ed è stato dimostrato che migliora l'efficienza della trasformazione delle piante in^{Arabidopsis 17}. L'auxina fitormonale è centrale per la riprogrammazione delle cellule vegetali. Un rapido aumento dell'espressione genica correlata all'auxina è stato osservato durante la rigenerazione indotta dalla^{ferita 10}. Per questo motivo, si potrebbe presumere che l'auxina (IAA) applicata esogenamente durante l'inoculazione in espiante aumenti l'efficienza della rigenerazione. Tuttavia, non sono state osservate differenze nel numero osservato di piante rigenerate in tre studi (57 7,55 vs. 59,67 5,51 per controllo vs. trattamento). Pertanto, il trattamento con auxina potrebbe probabilmente aiutare il processo di trasformazione piuttosto che la rigenerazione stessa.

Un tensioattivo non ionico, il trisilano alcalilato (noto come Silwet L-77), aumenta notevolmente l'efficienza di trasformazione di Arabidopsis tramite il metodo^{floral-dip 3}, e per questo è ampiamente utilizzato nella comunità della biologia vegetale. È stato osservato un minimo stress vegetale tra gli espianti modificati con Silwet L-77 allo 0,005% (concentrazione raccomandata per il tuffo floreale). Quando questa dose è stata raddoppiata (0,01%), le talee di foglie di R. aquatica sono state gravemente danneggiate, con il risultato di quasi nessun recupero di trasformanti (Tabella 2B). Durante il bagno floreale di Arabidopsis, l'uso di tensioattivi riduce la tensione superficiale degli inoculanti e migliora l'accesso ai boccioli floreali. Al contrario, come specie anfibia, R. aquatica sviluppa foglie lisce prive di tricomi o cuticole^{spesse 5}. L'aumento del tensioattivo ha causato danni ai tessuti fogliari, indicando che fattori diversi dal tensioattivo dovrebbero essere prioritari per l'efficienza della trasformazione nei tessuti fogliari non pubescenti. Il tensioattivo è più rilevante per il fenotipo pubescente, dove facilita la penetrazione dei tessuti. Dopo aver integrato tutti i parametri testati, viene fornita una pipeline con le condizioni più ottimali come diagramma di flusso (Figura 4).

L'utilizzo di un marcatore visivo, RUBY, è fondamentale per questa pipeline di trasformazione. RUBY è un reporter sintetico che codifica tre geni codificanti (CYP76AD1, DODA e Glucosyltransferasi) che sintetizzano un pigmento rosso brillante, la betalaina¹¹. Quando l'espressione RUBY è stata osservata nei rigeneranti R1-T1, si è manifestata come settori rossi, indicando che sono molto probabilmente chimerici (Figura 2 e Figura 3). Uno studio precedente ha rivelato che la rigenerazione di R. aquatica ha origine da un cambium vascolare di^{una sezione} 10 di foglia tagliata. Sorprendentemente, i rigeneranti R1-T1 mostrano occasionalmente un bordo chimerico lungo la vena centrale, con metà della lama della foglia rossa e l'altra metà verde (Figura 3A,B). La rigenerazione da settori RUBY occasionalmente ha prodotto piante completamente rosse con radici rosse (Figura 3C, freccia bordeaux), che sono poi cresciute fino a diventare piante R2-T1 uniformemente rosse (Figura 3D). Non sono stati osservati effetti avversi della sovraespressione di RUBY sulla crescita e lo sviluppo di R. aquatica (Figura 3). A supporto, non sono state osservate differenze riconoscibili nella dimensione e nella forma delle foglie a rosetta R1-T1 con settori RUBINO (ad esempio, Figura 3B). È possibile che un transgene forte e costitutivo guidato dal promotore possa interferire con la crescita normale delle piante e la risposta fisiologica.

In alcune occasioni, queste piante RUBY 'quasi clonali' svilupparono settori verdi (Figura 3E, frecce verdi), suggerenti di riversione o silenziamento del transgene. Ciò indica che avere un marcatore visibile come RUBY è indispensabile per l'espressione ectopica o per il silenziamento (ad esempio, RNAi) di un gene di interesse per futuri studi molecolari e meccanicistici. Si può introdurre un transgene di interesse nella cassetta RUBY e osservare i fenotipi nei settori rosso, RUBY . In conclusione, sfruttando la riprogrammazione diretta indotta dal taglio delle foglie e un marcatore visibile non invasivo, una pipeline di trasformazione semplice ed efficiente è ottimizzata per R. aquatica, una Brassicaceae che si propaga vegetativamente. Sebbene sia fuori dall'ambito di questo protocollo, una futura comprensione dell'origine esatta della rigenerazione di R. aquatica trasformata potrebbe fornire informazioni sulla riprogrammazione cellulare nelle piante.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1000 & micro; L Punte per pippo LTS a bassa ritenzione	Rainin	30389213
Acetosirone	Sigma-Aldrich	D134406-1G
Estratto di lievito di bacto, tecnico	Fisher Scientific	DF0886-17-0
BD Bacto Agar	Fisher Scientific	214030
BD Difco LB Broth, Miller	Midland Scientific	DIFCO 244610
BD Bacto Triptone Disidratato	Fisher Scientific	DF0123-17-3
Polvere liofilizzata a biotina	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
Dome trasparenti per i vassoi PermaNest	Soluzione per il coltivatore	GD221
Film trasparente trasparente	Thomas Scientific	22-305654
Vermiculite grossolana	Bectine
Di-potassio fosfato di idrogeno anidro	Sigma-Aldrich	105109
Piastre di Petri usa e getta 100 x 15 mm	VWR International	25384-342
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M9546-250G
Etanolo, 200 proof	Fisher Scientific	04-355-720
Falcon 50 mL tubi centrifughe conici	Fisher Scientific	14-432-22
Asciugamani di carta piegati 9,3" x 10,5"	Kimberly-Clark	2920
Spettrofotometro visibile GENESYS 30	Thermo Scientific	840-277000
Soluzione di gentamicina	Sigma-Aldrich	G1272-100ML
L-Glutamico acido monosodio sale idrato	Sigma-Aldrich	G1626-100G
Cloruro di magnesio	Sigma-Aldrich	M8266-100G
Solfato di magnesio, eptaidrato	Sigma-Aldrich	M9546-250G
MaxQ 6000 Incubatore Shaker	Thermo Scientific	SHKE6000
Idrato MES	Sigma-Aldrich	M8250-100G
Miscela di sale basale (MS) Murashige e Skoog in polvere	Sigma-Aldrich	M5524-50L
MX-RL-pro: Rotatore a tubo giratorio	Scilogex	824222019999
mio-inositolo	Sigma-Aldrich	I7508-100G
Camera di crescita Percival	Percival	AR36L3
Additivo per il terreno per la piantagione di perlite	Industrie PVP	PVP105408
Vassoi per piante Perma-Nest 8''x12''	VWR International	470150-476
Misuratore di pH Sette Compatto 5220	Mettler Toledo	30019028
Bisturi protetto	Fisher Scientific	02-688-79
Rifampicina	Sigma-Aldrich	R3501-5G
Fertilizzante a Rilascio Intelligente Fertilizzante per Plante	Osmocote	B0071CZTBA
Cloruro di sodio	Fisher Scientific	S271-3
Spectinomicina diidrocloruro pentaidrato	Sigma-Aldrich	S4014-5G
Bottiglie spray con vaporizzatore a pompa	Thomas Scientific	1141V43
Vasi quadrati da 3,5" GAGE	Growers Nursery Supply Inc.	03GA-0350S
Sucrosio	Sigma-Aldrich	S0389-5KG
Sunshine #4 Terriccio Professionale per la Coltivazione	Orticoltura Sun GRO	1341CFL0028P S
Tensioattivo - Silwet L-77	Fisher Scientific	NC1791615
Dissecatore a vuoto	Il Laboratorio	55207
Nutrimento vegetale universale solubile in acqua	Miracle-Gro	160101