Articolo metodologico

Propagazione in vivo basata sul coltivatore di nematodi entomopatogeni

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DOI:

10.3791/69678

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9 gennaio 2026

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1US Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Vegetable Crops Research Unit, 2Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 3US Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Southeast Fruit and Tree Nut Research Unit

In questo articolo

Sommario

Presentiamo due metodi per gli agricoltori per propagare in massa nematodi entomopatogeni come bio-insetticidi. Il primo metodo utilizza gel di poliacrilammide come substrato per la coltura del nematode, mentre il secondo utilizza il filone rivestito di polimero come substrato di coltura. Entrambi i metodi si basano sulla propagazione in vivo dei nematodi all'interno di cadaveri di insetti.

Abstract

I nematodi entomopatogeni (EPN) prodotti con metodi in vitro o in vivo sono agenti di biocontrollo altamente efficaci per la gestione dei parassiti. I sistemi di propagazione di massa in vivo portano a nematodi di alta qualità, ma spesso sono più laboriosi e/o meno convenienti rispetto ai metodi commerciali in vitro . I sistemi di propagazione dei nematodi orientati al coltivatore descritti finora sono generalmente inaffidabili perché si affidano a fonti esterne (industria o laboratori accademici) per calibrare l'inocolo. Abbiamo progettato sistemi innovativi basati sui coltivatori in cui gli agricoltori possono produrre continuamente i propri nematodi dopo aver acquisito inoculi da laboratori/aziende EPN affermate.

Qui presentiamo due metodi per gli agricoltori per propagare in massa le EPN come bio-insetticidi. Nel primo metodo, abbiamo confrontato la produzione in vivo di nematodi utilizzando il metodo standard della trappola bianca a un approccio orientato al coltivatore che prevede il gel di poliacrilammide come substrato del nematode. Il metodo orientato al coltivatore produsse più nematodi rispetto al metodo standard durante la coltivazione di due specie EPN comunemente disponibili (Steinernema carpocapsae e Heterorhabditis bacteriophora).

Nel secondo metodo, due specie di nematodi autoctone (Oscheius onirici e Heterorhabditis georgiana) sono state propagate in massa all'interno di larve di coleottero vivi (Tenebrio molitor) che sono state incastonate tra due strati di cotone rivestito di polimero. La raccolta dei nematodi emersi dal bistrato di lana utilizzava un'irrigazione sistematica di un vassoio, creando una suspense di nematodi pronta per applicazioni sul campo. Questi sistemi orientati ai coltivatori promettono un'ampia adozione da parte degli stakeholder agricoli perché gli approcci sono tecnicamente semplici e scalabili per chi cerca metodi accessibili e affidabili per produrre nematodi. Fornendo ai coltivatori un mezzo per creare i propri strumenti di gestione dei parassiti, questi metodi dovrebbero facilitare una maggiore indipendenza e redditività nelle aziende agricole statunitensi.

Introduzione

I nematodi entomopatogeni (EPN), comunemente rappresentati dalle specie di Steinernema e Heterorhabditis, sono stati utilizzati come efficaci agenti di biocontrollo dei parassiti insetti del suoloper molti anni 1. Gli EPN cercano nel terreno ospiti insetti e, quando un nematode trova un ospite adatto, entra nel corpo dell'insetto e impiega batteri simbiotici per ucciderel'insetto 2. Questi batteri simbiotici consumano l'ospite, si moltiplicano all'interno del cadavere e diventano la principale fonte di cibo per inematodi 3. Infine, dopo più generazioni di nematodi all'interno del cadavere ospite, emergono i nematodi giovanili infettivi (IJ) per cercare nuovi ospiti insetti. È in questa fase che i nematodi possono essere raccolti e utilizzati come bio-insetticida per la protezione delle colture. Gli agricoltori (e altri stakeholder agricoli) possono acquistare formulazioni di questi nematodi benefici, ma raramente possono coltivare i propri nematodi da utilizzare come parte dei programmi di gestione dei parassiti.

La coltivazione e la raccolta dei nematodi con metodi di produzione tipici può essere piuttosto difficile. La produzione su piccola scala di EPN si basa spesso su metodi in vivo , mentre su scala più ampia si utilizza la produzione in vitro 4. La maggior parte dei metodi in vitro utilizza omogeneati di sottoprodotti animali come dieta per i nematodi, evitando così la manipolazione degli insetti. Non sorprende che la produzione in vivo possa essere impegnativa e costosa perché comporta l'inoculazione di insetti ospiti vivi, spesso utilizzando il metodo della trappolabianca 5 con Galleria mellonella L. ('vermi di cera') o Tenebrio molitor L. ('vermi della farina'). La coltivazione di nematodi all'interno degli insetti ospiti aggiunge non solo l'alto costo degli insetti vivi, ma anche il lavoro associato alla loro manipolazione.

Man mano che gli EPN si sviluppano all'interno dei loro ospiti insetti, i cadaveri mostrano segni caratteristici di infezione corrispondenti al genere EPN che liinfetta 6. I cadaveri possono quindi essere posti su una superficie umidita all'interno di una tavola di contenimento che è stata posta all'interno di una ciotola più grande pienad'acqua 7. Quando i nematodi hanno completato il loro ciclo vitale all'interno del cadavere ospite, gli IJ escono dal cadavere e vengono raccolti, tipicamente tramite irrigazione delicata con acqua, e poi conservati in una varietà di mezzi, inclusi substrati inerti come gel (Figura 1), segatura o vermiculite8. La produzione in vivo riflette generalmente una bassa economia di scala dovuta ai costi del lavoro e degliinsetti 7,9.

La produzione in vitro si basa sull'allevamento di EPN su mezzi artificiali contenenti colture monosoniche di EPN e dei loro batteri simbiotici, Photorhabdus (per Heterorhabditis) e Xenorhabdus (per Steinernema)4,10. Questo metodo richiede competenze avanzate e un investimento significativo per i materiali e gli strumenti associati alla fermentazione ad altaproduttività 11. Di conseguenza, una produzione affidabile di EPN in vitro è probabilmente proibitiva per molte attività agricole.

Per gli agricoltori e altri stakeholder agricoli, le sfide tecniche associate alle tecniche in vitro possono essere aggirate migliorando le metodologie in vivo, in particolare l'allevamento potenziatodegli insetti combinato con l'inoculazione automatica dei nematodi e la raccolta 7,13. Tali metodi in vivo possono diventare sostanzialmente più efficienti, poiché ottimizzano le procedure di inoculazione, produzione e conservazione conEPN 7,14,15,16. Inoltre, la produzione in vivo può essere adattata alle esigenze degli utenti finali facilitando la produzione di EPN da parte degli stessiagricoltori 17. Uno svantaggio fondamentale di questo metodo è che l'inoculo del nematode deve essere rifornito ai coltivatori da una fonte commerciale o finanziata pubblicamente per ogni ciclodi produzione, rendendo il coltivatore perpetuamente dipendente dalla fonte di inoculo fornita esternamente. Pertanto, era necessario per i coltivatori un metodo di produzione EPN sostenibile e a lungo termine. I metodi sostenibili risultanti sono presentati in questo articolo.

Per esplorare questi approcci, abbiamo impostato due diversi metodi di produzione in vivo . Nel primo metodo, abbiamo confrontato la produzione in vivo dall'approccio standard White trap al metodo innovativo orientato al coltivatore. Il risultato è un approccio relativamente semplice e a basso costo per la produzione di EPN, sostenibile e facilmente adattabile a varie specie diEPN 9. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è che una piccola parte delle EPN prodotte in qualsiasi 'lotto' può essere utilizzata per vaccinare gli ospiti di insetti per i lotti successivi. Pertanto, una volta che al coltivatore è stato fornito l'inoculo EPN iniziale, il materiale di sorgente esterno non è più necessario. Questo processo risponde all'uso continuo da parte del coltivatore.

Un approccio altrettanto a basso costo e basso input alla propagazione dei nematodi è stato sviluppato in parallelo, focalizzato principalmente sul biocontrollo dei parassiti del mirtillo rosso in Wisconsin, USA. Recentemente, due ceppi di nematodi della specie, Oscheius onirici (Nematoda: Rhabditidae) e Heterorhabditis georgiana (Nematoda: Rhabditidae), sono stati scoperti nelle torbiere acide del centrodel Wisconsin 18 e testati ripetutamente in studisul campo 18,19. Queste specie sono autoctone e si sono dimostrate altamente virulente contro insetti parassiti storicamenteproblematici 18,19,20. Per questo motivo, molti agricoltori sono stati interessati a utilizzare questi nematodi come agenti di biocontrollo per parassiti delle colture (verme della frutta di sparganothis e pulce dai capelli rossi). I nematodi possono essere propagati in massa in vivo utilizzando larve di coleottero (Tenebrio molitor) che sono state incorporate in strati umidi e ben aerati di un cotone rivestito di polimero (cioè 'garza di cavallo'). È importante sottolineare che le fibre sono bagnabili ma abbastanza rigide da mantenere lo spessore della garza dopo l'aggiunta dell'acqua. Di conseguenza, i due strati di garza non si comprimono quando sono bagnati, facilitando una migliore circolazione dell'aria e la sopravvivenza dei nematodi. Il sistema di garze a due strati simula meglio gli spazi porosi all'interno del suolo umido ed è adatto allo stoccaggio dei nematodi una volta che gli IJ sono emersi. La raccolta degli IJ dal bistrato di garze è facilmente effettuata tramite irrigazione sistematica della garza e raccolta della miscela ricca di nematodi.

Protocollo

1. Ottenimento dell'inoculazione iniziale e delle procedure di base

NOTA: La produzione di massa dei metodi basati sul coltivatore si basa su insetti ospiti infetti. Nel primo metodo, una volta prodotto l'inoculo iniziale, non sono più necessarie sospensioni acquose di nematodi per infettare nuovi ospiti.

  1. Per iniziare l'inoculo iniziale, ottieni la specie EPN desiderata. Utilizzare lo stadio giovanile infettivo (IJ) di Steinernema carpocapsae (ceppo Whole) e Heterorhabditis bacteriophora (ceppo VS).
  2. Utilizzando le IA, infettare le larve di G . mellonella all'ultimo stadio usando il metodo della trappolabianca 7.
  3. Inoculare vive 50 larve di G. mellonella con IJ (100 IJs/insetto) di S. carpocapsae o H. bacteriophora in placche di Petri (90 mm) foderate con carta filtrante. Mantenere gli insetti inoculati a 25 °C fino all'emergere degli IJ (5-7 giorni per S. carpocapsae, 7-10 giorni per H. bacteriophora).
  4. Procedere con il processo di produzione basato su coltivazione continua9.
    1. Per l'inoculazione di massa, si mette un cadavere infetto (ad esempio, infetto da S. carpocapsae o H. bacteriophora) con 50 larve vive di G. mellonella in un contenitore di plastica (5,7-14,2 L) foderato con un tovagliolo di carta umido e lasciato a 25 °C.
    2. Dopo 72 ore, rimuovere dal contenitore cadaveri che non mostrano cambiamenti di colore appropriati (beige/marrone per Steinernema; rosso/arancione per Heterorhabditis) per evitare contaminazioni.
    3. Sposta i cadaveri in contenitori con polvere di gel di poliacrilammide in contenitori di plastica trasparente e inumiditi con acqua (20 mL/grammo secco di gel). Posiziona i cadaveri sopra una rete a rete in nylon (2 mm × 2 mm di poro) per separarli dalgel 7.
    4. Preleva gli IJ dagli ospiti infetti (che rimangono sullo schermo sopra il gel). Continuare il raccolto nel gel fino a ~5-7 giorni dopo l'inizio dell'emergenza delle IJ; rimuovere e scartare i cadaveri esauriti (il prelievo degli IJ dovrebbe essere lasciato continuare finché i IJ non diminuiscono sostanzialmente, di solito circa 5-7 giorni).
      NOTA: Gli IJ prelevati nel gel possono essere utilizzati per iniziare l'inoculo per un successivo ciclo di produzione di EPN, usati direttamente per l'applicazione o conservati in refrigerazione per un uso successivo per diverse settimane o mesi senza perdita di vitalità o addirittura 3-6 mesi per la riinoculazione.
  5. Per sviluppare l'inoculo per i successivi cicli di produzione, esporre larve sane di G. mellonella agli IJ presenti nel gel nelle piastre di Petri (90 mm). Poi, utilizzare questi ospiti appena infetti per inoculare il gruppo successivo di larve di G. mellonella (come menzionato sopra nei passaggi 1.2 e 1.3).
  6. Per applicazioni EPN, risciacquare le IJ che sono entrate nel gel usando acqua del rubinetto o schermi (dimensione dei pori < 0,3 cm). In alternativa, applica le EPN direttamente nel gel su piccole aree senza risciacquare.
    NOTA: Gli EPN possono essere utilizzati in sospensioni acquose e applicati con la pratica standard dei coltivatori (spruzzatori, irrigazione, ecc.)7. Il gel può essere conservato per diverse settimane in refrigerazione con lievi riduzioni della vitalità dell'EPN, mentre a temperatura ambiente può essere conservato per non più di 2 settimane. In refrigerazione, il gel può essere conservato per mesi (i tempi esatti variano a seconda della specie EPN).

2. Esperimento di Steinernema carpocapsae

NOTA: L'obiettivo di questo studio era validare la produzione di IJ in un approccio basato sul coltivatore rispetto all'approccio standard della trappola bianca, variando la dimensione dell'arena.

  1. Ha impostato l'esperimento per comprendere cinque trattamenti con diverse densità di cadaveri che variano da 5 a 50 ospiti per arena.
    1. T1: Controllo: Posizionare 5 cadaveri in trappole bianche usando piastre di Petri (10,0 cm × 1,5 cm; diametro [D] × altezza [H]) oppure 0,06 cadaveri/cm 2.
    2. T2: Posizionare 30 cadaveri in trappole bianche più grandi (15,0 cm × 1,5 cm; D × H) in contenitori in plastica trasparente da 14,2 L (43,2 cm × 28,3 cm × 16,5 cm; L × W × H) o 0,025 cadaveri/cm 2.
    3. T3: Mettere 25 cadaveri in gel di poliacrilammide (15 g di polvere gel + 300 mL di acqua del rubinetto) in contenitori di plastica trasparente da 5,7 L (36,2 cm × 21 cm × 12,4 cm; L × W × H) o 0,033 cadaveri/cm 2.
    4. T4: Mettere 30 cadaveri in gel di poliacrilamide (35 g di gel secco + 700 mL di acqua del rubinetto) in contenitori in plastica trasparente da 14,2 L o 0,025 cadaveri/cm 2.
    5. T5: Mettere 50 cadaveri in gel di poliacrilamide (35 g di polvere in gel secco + 700 mL di acqua del rubinetto) in contenitori in plastica trasparente da 14,2 L o 0,041 cadaveri/cm 2.
  2. Usa il metodo standard della trappola bianca (T1) come controllo (vedi passo 2.1).
  3. Assicurati che ogni trattamento abbia quattro repliche e ripeti l'intero esperimento due volte.
  4. Posiziona i cadaveri con trattamenti al gel sopra la rete a rete in nylon da 2 mm × 2 mm.
  5. Copri tutti i contenitori con coperchi forati stretti leggermente e lascia a 25 °C.
  6. Osserva le trappole bianche quotidianamente per l'emergenza dell'IJ e termina 7 giorni dopo la prima emergenza dell'IJ.
  7. Alla fine, si valuta la produzione totale di IJ per insetto basandosi sulle procedure standard didiluizione 6.
  8. Nel gel, contare gli IJ dopo aver miscelato accuratamente il gel, registrando il volume totale del gel, diluendo 10 mL in acqua (rapporto 1:100) e mescolare per quasi 20 minuti.

3. Esperimento del batteriopora con Heterorhabditis

NOTA: Questo esperimento è stato progettato per testare una procedura di produzione basata su coltivatori per H. bacteriophora (le procedure si basavano sui risultati dell'esperimento con S. carpocapsae ).

  1. Prepara i trattamenti: Mettere 5 cadaveri in trappole bianche in piastre di Petri (100 mm D x 15 mm) e 50 cadaveri in gel di poliacrilammide (35 g di polvere in gel secco + 700 mL di acqua del rubinetto) in contenitori trasparenti da 14,2 L.
  2. Utilizzare il metodo della trappola bianca (vedi passo 3.1) come controllo.
  3. Ripeti l'intero esperimento due volte con cinque repliche di ogni trattamento.
  4. Eseguire l'esperimento e valutare la resa dell'IJ nello stesso modo dell'esperimento precedente (vedi sezione 2).

4. Propagazione di Oscheius onirici e Heterorhabditis georgiana

NOTA: L'obiettivo di questo studio era convalidare la produzione di IJ utilizzando un secondo approccio basato sul coltivatore che si basava su un cotone rivestito di polimero (garza da cavallo) disponibile commercialmente come substrato di coltura. In questa procedura, la garza di cavallo funge da substrato per le IJ emergenti perché le sue proprietà fisiche permettono sia l'aerazione che una raccolta efficiente degli IJ. L'approccio con garza per cavalli è stato confrontato con un substrato standard a nematode (semplice cotone).

  1. Esaminare i due fattori in un disegno fattoriale bidirezionale completamente incrociato: Identità del Nematode (O. onirici o H. georgiana) × Substrato di Coltivazione (garza di cavallo o cotone). Questo disegno sperimentale (2 × 2) creerà quattro combinazioni di trattamenti uniche, ciascuna replicata 7 volte e disposta in un disegno completamente randomizzato.
  2. Per ogni replica, si posiziona una garza di cavallo o un foglio di cotone in un vassoio di plastica poco profondo (35,6 cm × 25,4 cm × 2 cm) per fungere da substrato per gli insetti ospiti. Distribuire 200 larve di T. molitor (congelate) uniformemente sul foglio. Posizionare un altro foglio delle stesse dimensioni sopra le larve, creando tre strati (uno strato inferiore di lana, uno strato di vermi della farina e uno strato superiore di lana). Per entrambe le specie di nematodi, prepara sette vassoi con garza di cavallo e sette vassoi con cotone.
  3. Derivare l'inocula IJ sia per O. onirici che per H. georgiana da colture di nematodi in vivo con T. molitor (vermi della farina) come ospite su cotone inumidito rotondo.
    1. Metti due piccoli tondini di cotone all'interno di una piastra di Petri e inumiditeli con un bagno (10-15 mL) di acqua del rubinetto.
    2. Posizionare 4-6 larve di T. molitor (vive o congelate) in un motivo non sovrapposto tra i due tondi di cotone.
    3. Aggiungi 10 mL di una suspensa di nematode (400-500 IJs/mL) al round di cotone superiore, permettendo agli IJ di cercare e infettare i vermi della farina.
      NOTA: A 21-22 °C, le IJ iniziano a emergere 2-4 settimane dopo l'inoculazione.
    4. Raccogli gli IJ dalle piastre di Petri versando (due volte) 20-25 mL d'acqua sopra il rotondo di cotone e raccogliendo la pasta che si è percolata attraverso il cotone.
  4. Infettare gli ospiti insetti all'interno delle grandi vaschette poco profonde tramite un'accurata immersione dei fogli di lana con circa 400 mL di una sospensione a nematodo (80.000-90.000 nematodi/L). Lasciare che i nematodi infettino le larve degli insetti e incubare per 4 settimane a 21-22 °C.
  5. Dopo 4 settimane, raccoglie i nematodi irrigando ogni vassoio due volte con irrigazioni (500 mL ciascuna) di acqua del rubinetto, raccogliendo un totale di 1 L di sospensione di nematodi.
  6. Contare la densità del nematode per mL al microscopio dissezionale e contare i conteggi per ogni vassoio replicato.

Risultati

Esperimento di S. carpocapsae
Gli effetti del trattamento sono stati significativi basandosi sulla media dei numeri di IJs/cadavere (ANOVA unidirezionale: F4,39 = 2,95, P = 0,0362). Solo T2 e T4 erano significativamente diverse tra loro, poiché T4 produceva più IJ per cadavere (244.029 ± 16.241) rispetto a T2 (159.114 ± 9.669) (Figura 2).

Esperimento su H. bacteriophora
Un effetto significativo del trattamento è stato osservato sul numero medio di IJ per cadavere in questo esperimento (ANOVA unidirezionale: F1,19 = 5,0, P = 0,040). Il trattamento basato sul metodo orientato al coltivatore presentava significativamente più IJs/cadavere (186.389 ± 28.645) rispetto al trattamento con trappola bianca (124.470 ± 19.129) (Figura 3).

Propagazione di Oscheius onirici e Heterorhabditis georgiana
Il bistrato di garza di cavallo è stato altrettanto efficace come il cotone nel fornire un substrato di coltura per i nematodi O. onirici e H. georgiana (ANOVA a due vie: effetto principale del nematode Identità: F1,23 = 0,146; P = 0,706; effetto principale del tipo di substrato: F1,23 = 0,104; P = 0,751; interazione tra identità del nematode e tipo di substrato: F1,23 = 0,346; P = 0,563). La media di O. onirici per L da vassoi con cotone e garza da cavallo era, rispettivamente (in milioni), 101,11 ± 13,73 e 95,93 ± 20,19. La media di H. georgiana per L da vassoi con cotone e garza da cavallo era, rispettivamente (in milioni), 82,23 ± 18,69 e 99,93 ± 18,40.

Figura 1
Figura 1: Diagramma del metodo basato sul coltivatore. Passo 1: inoculazione; Passo 2: incubazione di massa; Passo 3: trasferire in gel di poliacrilammide con schermo. Abbreviazione: IJs = nematodi giovanili infettivi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2: Produzione media di Steinernema carpocapsae (Tutti) in giovani infettivi (IJ) per cadavere di Galleria mellonella in cinque trattamenti. Abbreviazione: IJs = nematodi giovanili infettivi. Questa cifra è stata presa con il permesso di Oliveira-Hofman et al.9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Produzione media di giovani infettivi da Heterorhabditis bacteriophora (ceppo VS) per cadavere di Galleria mellonella da un trattamento con trappola bianca e gel di poliacrilammide. Questa cifra è stata presa con il permesso di Oliveira-Hofman et al.9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questa ricerca ha rivelato che i metodi orientati al coltivatore (con gel di poliacrilamide e/o un doppio strato di garza rivestito di polimero) possono produrre in modo affidabile un elevato numero di nematodi per i programmi di controllo dei parassiti. È importante sottolineare che i parametri di base dei processi sopra menzionati possono essere migliorati per soddisfare le esigenze dei coltivatori (ad esempio, densità di ospiti, dimensioni delle arene e substrati utilizzati). I due approcci possono essere adatti a diversi sistemi di coltura; Un confronto e un'ulteriore ottimizzazione dei metodi saranno un argomento centrale di ricerche future.

Confrontando il gel di poliacrilammide con il metodo basato sulla trappola bianca, il substrato in gel produce un numero maggiore di IJ. Un elemento fondamentale di questi risultati è che gli IJ possono muoversi direttamente nel gel, mentre nelle trappole bianche devono spostarsi dall'interno della ciotola di contenimento al piatto di raccolta e, di conseguenza, alcuni IJ potrebbero non raggiungere il piatto di raccolta. Ci sono vantaggi nel prelevare gli IJ direttamente dal gel, dato che gli IJ tendono a disperdersi nell'ambiente circostante, concentrandosi efficacemente nel gel, facilitando l'immagazzinaggio e/o la raccoltadi 15.

Allo stesso modo, gli IJ coltivati in vermi della farina incastonati nel bistrato di garza possono anche lasciare i cadaveri e, seguendo la gravità, spostarsi verso il basso e raccogliersi sulle fibre bagnate della garza. La struttura del bistrato rivestito di polimero crea un'ampia superficie su cui possono concentrarsi i nematodi. La facilità di coltivazione e raccolta degli IJ rende questo approccio adatto ai coltivatori che desiderano produrre nematodi internamente. La scoperta che la garza per cavalli fosse produttiva quanto il cotone è piuttosto importante perché indica che i benefici della garza per cavalli (cioè un miglioramento dell'efficienza della raccolta dei nematodi) possono essere sostenuti senza riduzioni della produttività. È probabile che la garza di cavallo offra una maggiore aerazione rispetto al cotone, perché le fibre di garza non collassano in un tappeto denso e impregnato d'acqua. È importante sottolineare che i nematodi che emergono direttamente da un ospite infetto (secondo i nostri metodi in vivo ) avranno dimostrato — come popolazione — la loro capacità di trovare, soggiogare e uccidere gli ospiti insetto, indicando così un alto grado di contagiosità (capacità di invasione), migliore capacità di dispersione, maggiore virulenza e tolleranza ambientale (abiotica), rispetto ai nematodi prodotti tramite metodi in vitro 21. 22.

Il sistema di produzione orientato al coltivatore qui proposto può essere facilmente adattato ad altre specie di EPN, poiché l'insetto ospite, Galleria mellonella, è molto suscettibile alla maggior parte delle specie di Steinernema e Heterorhabditis 6. Possono essere utilizzati altri ospiti insetti, come T. molitor 6,7,18,19. Il valore della formulazione del gel è stato dimostrato da Leite et al. (2018)23; Se conservati alla temperatura corretta nel sistema gel, possono essere conservati per diversi mesi prima dell'utilizzo. La formulazione a base di gel è molto adatta alla maggior parte dei sistemi applicabili; i gel con poliacrilamidi sono stati utilizzati con successo come formulazioni standard di EPN perdecenni 6, 7, 24. Inoltre, i gel hanno una grande capacità di conservazione e la raccolta dal gel tramite screening e risciacquo è moltofacile 24, può richiedere meno di 5 minuti (osservazione personale di Shapiro-Ilan) e si osservano rese più elevate nell'approccio del sistema gel rispetto alle trappole bianche. Le formulazioni in gel mantengono gli IJ all'interno delle formulazioni (mentre altre formulazioni (basate su torba, vermiculite, substrato per la diatomea, compost di funghi e funghi) avevano una percentuale più alta di IJ che sfuggivano almezzo 23). Ulteriori prove su substrati di stoccaggio dei nematodi che possono dissolversi completamente nell'acqua di un serbatoio di spruzzo (ad esempio, spugna fenolica come utilizzata da Leite et al. (2023)25 sarebbero utili per i coltivatori.

Il nostro approccio orientato al coltivatore ha un potenziale svantaggio: la sotto-coltivazione ripetuta può causare il deterioramento della virulenza dei nematodi, un problema potenziale per tutti i sistemi produttivi. Questo problema può essere evitato se i coltivatori utilizzano un inoculo iniziale da lineeinconsanguine 26 e poi limitano le densità di nematodi durante gli episodi di infezione, limitando così l'incidenza dei "cheater" (nematodi non virulenti che dipendono da altri nematodi per uccidere l'ospite) all'interno delle colturedi nematodi 27.

I nostri innovativi metodi di produzione basati sui coltivatori rappresentano approcci sostenibili, accessibili, ad alto rendimento, ad alta longevità e a basso costo (ma ad alta intensità di manodopera) alla produzione di EPN. La chiave per una produzione continua è l'uso di un inoculo iniziale affidabile, basato su ospiti infetti o su gel immagazzinato. Il processo risponde quindi all'uso continuo da parte dei coltivatori, che rappresenta un'alternativa ad altri metodi in cui il coltivatore dipende continuamente da una fonte di inoculo fornita esternamente. Disporre di molteplici metodi per sistemi di propagazione dei nematodi orientati ai coltivatori permetterà ai coltivatori di adattare il sistema alle proprie pratiche agricole.

L'impulso per i coltivatori a produrre i propri nematodi sarà vario quanto quello dei coltivatori stessi, ma considerando che i nematodi prodotti con metodi in vivo spesso mostrano maggiore capacità di ricerca, fitness e virulenza21,22, vi è un valore intrinseco nell'allevamento in vivo di nematodi. Al contrario, le EPN prodotte tramite approcci in vitro non incontrano insetti vivi durante il loro sviluppo, il che di fatto nega ai nematodi l'opportunità di mantenere un'elevata letalità pro capite (una metrica importante del loro valore come agente di biocontrollo)7,21,22. La costo-efficacia dei nostri metodi dovrebbe essere considerata rispetto ad altre tecniche in vivo, così come la costo-efficacia delle EPN commerciali. L'efficacia sul campo e i costi sono fattori importanti per qualsiasi programma di biocontrollo.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Stacy Byrd per l'assistenza tecnica. La menzione di nomi commerciali o prodotti commerciali in questa pubblicazione serve esclusivamente a fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Clear plastic ContainersSterile Crop, Townsend MAhttps://www.sterilite.com/
Clear plastic ContainersIris USA, Inc, Pleasant Prairie, WIhttps://www.irisusainc.com/
Cotton woolMedLine Cotton Rolls, 1 × 8,5 ft rollshttps://athome.medline.com/en/medline-sterile-cotton-roll-1in-x-8-5ft-1lb-10ct-non6028
Heterorhabditis georgianaUSDA ARS Vegetable Crops Research Unit, Madison, WIN/A
Ocheius onirici USDA ARS Vegetable Crops Research Unit, Madison, WIN/A
Polyacrylamide gel powderSoil Moist, JRM Chemical, Cleveland OHhttps://www.soilmoist.com/
Polymer-coated cotton wool (horse gauze)Leggett & PlattBB Satin Star 12'S, 30 × 36 inch roll
Steinernema carpocapsae (All strain)  Heterorhabditis bacteriophora (VS strain)USDA ARS Southeastern Fruit and Tree Nut Research Laboratory, Byron, GA.N/A

Riferimenti

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