Separazione HPLC automatizzata usando LC-mate: un autocampionatore ripetitivo integrato e un collettore di frazioni per la purificazione su scala microscala

Sommario

Fu sviluppato un autocampionatore integrato e un collettore di frazioni (LC-mate) per automatizzare separazioni ripetitive HPLC. Compatibile con i rivelatori HPLC che emettono segnali analogici, LC-mate migliora le prestazioni dei sistemi manuali e accelera i flussi di lavoro di ricerca che dipendono dalla cromatografia liquida ad alte prestazioni.

Abstract

La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) svolge un ruolo cruciale nella purificazione di composti di alto valore, soddisfacendo le crescenti esigenze delle discipline di chimica e biologia sia in ambito accademico che industriale. Tuttavia, l'iniezione manuale ripetuta e la raccolta delle frazioni durante la purificazione su scala microscopica limitano significativamente l'efficienza e la riproducibilità. Per superare questo collo di bottiglia, abbiamo sviluppato un sistema integrato di autocampionatore e collettore di frazione, temporaneamente chiamato LC-mate, che automatizza le separazioni ripetitive rispondendo direttamente ai segnali analogici provenienti dal rivelatore HPLC. Lo strumento è costruito attorno a una valvola switching ad alta pressione a sei porte per l'iniezione del campione e una valvola selettrice per la raccolta delle frazioni, con parametri operativi controllati tramite un'interfaccia intuitiva touchscreen. LC-mate è compatibile con rivelatori HPLC commerciali capaci di uscire analogicamente e può anche ottenere una separazione ripetitiva della modalità eluzione gradiente tramite l'innesco sincrono del segnale. Gli esperimenti dimostrativi hanno confermato un funzionamento stabile e separazioni riproducibili per la purificazione di prodotti naturali, mostrando una chiara riduzione dei tempi di gestione manuale. Il sistema offre una soluzione pratica e accessibile per migliorare l'automazione nei flussi di lavoro convenzionali HPLC, colmando il divario tra i sistemi di purificazione manuali e completamente automatizzati.

Introduzione

La cromatografia, introdotta da M.S. Tswett all'inizio del XX secolo, si è evoluta nella moderna cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) negli anni '60 con i progressi nella ^{strumentazione 1,2,3}.

Oggi, l'HPLC svolge un ruolo fondamentale nella purificazione di composti di alto valore, rispondendo alle crescenti esigenze delle discipline di biomedicina, chimica e biologia sia nel campo accademico che industriale. Nella ricerca accademica, la purificazione su scala microscopica dei prodotti naturali e la risoluzione delle molecole chirali dipendono in modo critico dalle tecniche semi-preparative^HPLC 4,5,6,7,8. Nella maggior parte dei casi pratici, i ricercatori iniettano una porzione della soluzione campionaria in una colonna HPLC alla volta invece che l'intera per evitare perdite imprevedibili del campione o a causa della limitazione della dimensione della colonna, che rende inevitabili l'iniezione ripetuta del campione e la raccolta delle frazioni. Nonostante la sua eccezionale capacità di separazione, l'uso dell'HPLC per la purificazione dei campioni rimane limitato da vincoli intrinseci nell'attuale strumentazione e nei flussi di lavoro. Un importante collo di bottiglia risiede nella forte dipendenza dall'intervento manuale, in particolare nell'iniezione di campioni e nella raccolta delle frazioni. Questi processi non sono solo dispendiosi in termini di tempo e laboriosi, ma anche suscettibili all'errore umano, compromettendo così la produzione, la riproducibilità e l'efficienza operativa^{complessiva 9,10}.

Autocampionatori commerciali e collettori di frazioni dei principali produttori HPLC, come Agilent, Shimadzu e Waters, forniscono un'automazione affidabile e precisa, ma sono tipicamente vincolati all'interno di ecosistemi hardware e software proprietari. Ad esempio, l'autocampionatore Agilent 1260 Infinity II e il collettore di frazioni G1364F sono integrati senza soluzione di continuità nei sistemi HPLC di Agilent, offrendo un'eccellente riproducibilità ma una compatibilità limitata tra piattaforme. Analogamente, gli autocampionatori SIL-20A/40C di Shimadzu e i collettori FRC-40/FRC-10A offrono alto throughput e un'eccellente precisione meccanica, ma dipendono dalle architetture di controllo LC-20 e Nexera di Shimadzu. I moduli autocampionatore HPLC e collettore III HPLC della Waters Alliance offrono anch'essi prestazioni robuste e formati di raccolta flessibili (fino a 300 mL/min), ma rimangono adattati agli ambienti proprietari UHPLC e LC-MS di Waters. Inoltre, gli autocampionatori tradizionali che si basano su aghi di iniezione possono ridurre il recupero del campione, e i collettori di frazioni a tubo possono essere scomodi per la gestione di grandi volumi eluenti. Per la maggior parte degli altri strumenti HPLC, la separazione semi-preparativa dipende ancora da un lavoro manuale ripetitivo e tedioso.

Queste sfide evidenziano la necessità di un approccio innovativo per automatizzare la purificazione dei campioni nei flussi di lavoro HPLC. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo sviluppato LC-mate, uno strumento compatto e versatile che integra moduli autocampionatori e di raccolta frazioni in un'unica piattaforma. Il nucleo fluidico di LC-mate è composto da due componenti chiave: una valvola di commutazione ad alta pressione a sei porte (SKVA-3130-S) costruita in acciaio inossidabile SUS 316 con un percorso di flusso di 0,4 mm e che supporta pressioni operative fino a 45 MPa, con una valutazione per un controllo preciso dell'iniezione del campione, e una valvola selettrice multi-posizione a 10 canali con un volume morto minimo (27,5 μL porta-porta, 5 μL) con un diametro del canale di flusso di 1,2 mm per una raccolta efficiente delle frazioni. Questa configurazione minimizza il volume morto e riduce il rischio di contaminazione incrociata. Per specifiche dettagliate degli strumenti, si prega di consultare la Tabella 1. LC-mate può ricevere l'uscita analogica dai rivelatori HPLC e attivare lo strumento HPLC tramite segnale sincrono, consentendo un controllo indipendente sia dell'iniezione del campione che della raccolta delle frazioni.

Tabella 1: Parametri dello strumento relativi al LC-mate. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Lo strumento è dotato di software di controllo intuitivo e di un'interfaccia touchscreen intuitiva che consente la visualizzazione in tempo reale dei segnali cromatografici analogici. LC-mate supporta sia modalità di separazione isocratica che di gradiente, permettendo agli utenti di configurare parametri chiave - tra cui il volume di iniezione, il numero di tempi di ripetizione, il tempo intervallare di ogni iniezione e la modalità di raccolta [basata su soglia, basata sul tempo o Collect All (raccogliere frazioni sia sopra che sotto la soglia)] e di avviare operazioni completamente automatizzate con un solo comando. Ciò elimina la necessità di interventi manuali ripetitivi e migliora significativamente l'efficienza della purificazione dell'HPLC.

La Figura 1 illustra l'aspetto generale, il principio di funzionamento e la configurazione del LC-mate integrato con un sistema HPLC.

Figura 1: Progettazione e configurazione del sistema LC-mate. (A) Disposizione schematica. (B) Diagramma strumentale. (C) Foto pratica di allestimento. (D) Collegamento della linea di trasmissione del segnale tra il rivelatore UV e il LC-mate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

1. Controllo della connessione

1. Verifica le connessioni idrauliche del solvente tra HPLC, LC-mate e colonna cromatografica per garantire i corretti percorsi di flusso (Figura 1A).
2. Controlla la connessione della linea di trasmissione del segnale tra il rivelatore UV e LC-mate, come mostrato nella Figura 1D.
   1. Collega il filo nero al terminale rosso e il filo bianco al terminale nero per far corrispondere la polarità del segnale analogico in uscita.
   2. Osserva il display LC-mate. Se appare la forma d'onda del segnale analogico, la connessione è corretta.
      NOTA: Se non è visibile alcuna forma d'onda, inverti le connessioni: collega il filo nero al terminale nero e il filo bianco al terminale rosso.
3. Controlla la connessione del trigger tra il rilevatore UV e LC-mate.
   1. Collega l'estremità singola del cavo dati alla porta di uscita del rilevatore UV.
   2. Collega i fili nero e bianco dall'altra estremità ai terminali di trigger blu e nero sull'LC-mate, rispettivamente.
   3. Stringi il terminale e il grilletto per garantire una connessione salda.

2. Avvio del sistema integrato di separazione

1. Assicurarsi un corretto avvio dell'HPLC.
2. Assicurati un avvio corretto del LC-mate.
   1. All'avvio del sistema LC-mate, clicca sull'icona LC-mate nell'interfaccia per eseguire automaticamente il programma di auto-test del sistema e inizializzare i moduli hardware chiave.
   2. Attendi il breve tono del prompt Di (circa 0,5 s) e la scomparsa del prompt "Auto-Test" sullo schermo dopo il completamento dell'auto-test, poiché indicano che l'inizializzazione è terminata.

3. Ottimizzazione delle condizioni

1. Configurare la condizione di separazione HPLC e avviare l'eluzione per raggiungere l'equilibrio della colonna.
2. Clicca sull'icona Test sul lato sinistro dello schermo di LC-mate e la seguente interfaccia verrà visualizzata sullo schermo (Figura 2A). Parametri di volume di iniezione di input, tempo di eluzione e tempi di ripetizione , e premi l'icona Start ; verrà avviata l'esecuzione di autocampionatore, collettore di frazioni e HPLC. In questo caso, l'eluente esce solo attraverso la porta 10 della valvola selettrice e può essere raccolto manualmente o scartato.
3. Identificare le condizioni di separazione possibili, inclusi risoluzione, tempo di ritenuta, tempo di ritenzione, volume di iniezione e lunghezza d'onda UV, ecc., per facilitare la successiva separazione e la raccolta delle frazioni in modalità appropriate.

4. Funzionamento automatico

NOTA: In base al cromatogramma delle condizioni di separazione fattibili, si potrebbe selezionare un modo adatto di raccolta delle frazioni dalle opzioni Soglia, Raccolta Temporizzata e Raccogli Tutte sul lato sinistro dell'interfaccia.

1. Raccolta delle frazioni basata sul valore soglia
   1. Seleziona il modulo funzione Threshold sul lato sinistro dell'interfaccia e il sistema mostrerà l'interfaccia di impostazione dei parametri come mostrato nella Figura 2B.
   2. Inserisci il volume di iniezione, i tempi di ripetizione, la soglia e il tempo di eluzione, e premi Start; l'HPLC e il LC-mate funzioneranno automaticamente. Le frazioni con picchi cromatografici superiori alla soglia saranno raccolte in diverse bottiglie di raccolta.
   3. Monitorare gli indicatori di stato disposti verticalmente sul display: Osservare l'iniezione in corso per confermare che l'introduzione del campione sia stata avviata. Controlla la separazione in corso per verificare che la separazione cromatografica sia in corso. Si noti "Svuotamento della siringa" per identificare quando la siringa sta purgando liquidi residui. Attenzione all'evidenziazione blu del testo corrispondente per confermare quale stato operativo sia attualmente attivo.
      NOTA: Durante il processo di separazione, premendo l'icona "Cromatogramma" verrà visualizzata la cromatogramma e la linea di soglia su una nuova interfaccia, e il cromatogramma è identico a quello mostrato sullo schermo del computer che controlla l'HPLC.
2. Raccolta delle frazioni basata sul periodo di tempo
   1. Seleziona il modulo Raccolta Temporizzazione dal lato sinistro dell'interfaccia per aprire il menu di impostazione parametri (Figura 2C).
   2. Inserisci i parametri richiesti: Volume di iniezione, Tempi di Ripetizione, Tempo di Eluzione e una serie di Tempo di Raccolta necessari.
   3. Premi il pulsante Start per avviare la sequenza automatica, poi il sistema HPLC e LC-mate verranno eseguiti ripetutamente secondo i parametri impostati.
3. Raccolta frazioni con la modalità "Colleziona Tutto"
   1. Seleziona il modulo funzione Raccogli Tutti sul lato sinistro dell'interfaccia, il sistema mostrerà l'interfaccia di impostazione dei parametri come mostrato nella Figura 2D.
   2. Imposta un valore di soglia di raccolta e i picchi cromatografici che sono sopra o sotto la soglia verranno raccolti separatamente, il che può garantire che nessun composto in una miscela si perda.
      NOTA: L'acetonitrile è un solvente infiammabile e tossico. Tutte le procedure che coinvolgono acetonitrile o altri solventi organici devono essere eseguite in uno spazio di laboratorio ben ventilato. Il personale deve indossare sempre l'attrezzatura di protezione individuale (DPI) appropriata, inclusi occhiali antischizzo chimici e guanti resistenti ai solventi. I rifiuti dell'acetonitrile e altri solventi organici devono essere raccolti in contenitori designati e correttamente etichettati per i rifiuti chimici pericolosi. Questi flussi di rifiuti sono stati gestiti secondo il protocollo di salute e sicurezza ambientale della nostra istituzione da un servizio di smaltimento autorizzato.

5. Pulizia delle condotte

NOTA: La pulizia della pipeline garantisce che non rimanga alcun campione nella pipeline quando l'autocampionatore verrà utilizzato la prossima volta.

1. Prepara una piccola bottiglia di solvente pulito e inserisci la pipeline di iniezione dell'autocampionatore nel solvente.
2. Seleziona il modulo Purificazione dall'interfaccia a sinistra per aprire il menu di impostazione dei parametri (Figura 2E).
3. Pulizia della pipeline degli iniettori
   1. Imposta il volume di iniezione tra 0 e 1000 e imposta i tempi di ripetizione (senza limiti).
   2. Clicca su Pulizia sotto "Pulizia completata" per iniziare la pulizia della pipeline dell'iniettore.
   3. Monitora il conteggio dei "Cicli" per tenere traccia del numero di cicli di lavaggio completati.
4. Pulizia della pipeline di raccolta
   1. Imposta il tempo di purificazione (senza limiti).
   2. Clicca su Purificazione sotto "Pipeline Attuale" per iniziare la pulizia della pipeline di raccolta.
   3. Monitorare il display della Pipeline Current per confermare quale pipeline viene pulita, mentre il sistema procede in modo sequenziale dalla pipeline 0 alla pipeline 10.

Figura 2: interfaccia touchscreen LC-mate per l'esecuzione del metodo. (A) Schermata di ottimizzazione. (B) Modalità soglia. (C) Modalità di temporizzazione. (D) Modalità raccolta tutto. (E) Pulizia della condotta. (F) Ambientazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Istruzioni per il salvataggio dei dati

1. Abilita il salvataggio automatico. Il sistema salva automaticamente il cromatogramma dopo ogni ciclo di eluzione.
2. Esegui il salvataggio manuale. Clicca sul pulsante Salva dopo che l'eluzione è completata. Inserisci i metadati richiesti nella finestra di dialogo per salvare il file.
3. Seleziona la posizione di stoccaggio. Scegli di salvare i file nella memoria locale del dispositivo, su una scheda SD o su una chiavetta USB esterna.
   NOTA: Utilizzare una chiavetta USB esterna per tutta la memoria dati per evitare limitazioni di capacità e garantire un facile accesso ai dati.

Risultati

Purificazione dell'iperosido 2"-O-galloyl
Il 2"-O-Galloyl-iperosido (2-GH) è un componente principale solubile in acqua di Euphorbia helioscopia L., una medicina tradizionale cinese con una lunga storia di utilizzo per la risoluzione di catarro e^{umidità 11}. La sua struttura chimica è mostrata nella Figura 3. Recentemente è stato riscontrato che il 2-GH po...

Discussione

Questi risultati dimostrano che il sistema LC-mate può eseguire autonomamente l'iniezione continua di campioni e la raccolta di frazioni seguendo i parametri stabiliti, minimizzando così significativamente l'intervento manuale e migliorando l'efficienza della separazione. Il sistema presenta un'interfaccia intuitiva, che richiede solo una configurazione hardware iniziale seguita da un funzionamento intuitivo dello schermo touch.

Per garantire il successo speri...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cromatografo liquido ad alte prestazioni-EasySep-1050	Shanghai Tongwei Analysis Technology Co., Ltd. Pagina web dello strumento EasySep®-1050 https://www.instrument.com.cn/netshow/sh100522/C140238.htm	1009992	Un sistema HPLC modulare e preparativo utilizzato nel protocollo. Include una pompa per l'erogazione dei solventi, un rivelatore UV/VIS e una valvola di iniezione manuale. Questo sistema costituisce l'unità di separazione del nucleo che il LC-mate automatizza.
(Colonna cromatografica liquida) Sharpsil-U C18 150 mm (L) e tempi; 30 mm (I.D.) S-10 & micro; m, 100A	Shanghai Xuanmei Industrial Development Co., Ltd.	U180110-300150	Colonna cromatografica invertita - fase C18 con una dimensione particellare di 10 e mu; m e una dimensione dei pori di 100 Å. È progettato per la separazione di piccole molecole (come farmaci, composti organici) e ha buona riproducibilità e stabilità. Le dimensioni della colonna (lunghezza 150 mm, diametro interno di 30 mm) la rendono adatta per cromatografia preparativa o semi-preparativa.
LC-mate	Shanghai Betterren Medical Technology Co., Ltd.. Per qualsiasi domanda su   lo strumento LC-mate, si prega di contattare l'autore corrispondente via e-mail: wmzhao@simm.ac.cn	GD202200337	Apparecchiature ausiliarie per sistemi di cromatografia liquida, probabilmente utilizzate per l'iniezione di campioni, la gestione della fase mobile o l'acquisizione dati. Può essere integrato con sistemi HPLC per migliorare l'automazione e l'efficienza dei processi sperimentali