In questo video vi mostriamo una procedura per una consegna precisa biolistic dei reagenti nel tessuto vivo con una pistola romanzo gene in miniatura. Stiamo abbattendo l'espressione della molecola netrina guida degli assoni negli embrioni sanguisuga fornendo molecole di dsRNA nella parete ventrale del corpo e dei gangli di singoli segmenti.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Localizzato RNAi e di espressione genica ectopica nel Leech medicinali
In questo articolo
Sommario
Abstract
In questo video, che mostrano l'uso di una pistola pneumatica capillare per la consegna accurata biolistic dei reagenti nel tessuto vivo. Usiamo la procedura per i modelli di espressione genica turbare in segmenti selezionati di embrioni sanguisuga, lasciando i segmenti non trattati come controlli interni.
La pistola pneumatica capillare può essere utilizzato per raggiungere gli strati interni di cellule nelle fasi precoci dello sviluppo senza aprire il campione. Come metodo per l'introduzione di sostanze localizzato nei tessuti viventi, la consegna biolistic con la pistola ha diversi vantaggi: è veloce, senza contatto e non distruttiva. Inoltre, una pistola singolo capillare può essere utilizzato per la consegna indipendente di sostanze diverse. La regione di consegna può avere dimensioni laterali di circa 50-150 micron e si estende su circa 15 micron intorno alla profondità di penetrazione media, che è regolabile tra 0 e 50 micron. Questa consegna è il vantaggio di essere in grado di indirizzare un numero limitato di celle in una posizione intermedia tra selezionato singola cella abbattere da microiniezione e knockdown sistemico attraverso iniezioni extracellulare o mediante approcci genetici.
Per abbattere o bussare nell'espressione del netrina molecola guida degli assoni, che è naturalmente espresso da alcuni neuroni centrali e nella parete ventrale del corpo, ma non il dominio dorsale, forniamo le molecole di dsRNA o plasmide-DNA nella parete del corpo e gangli centrali. Questa procedura prevede le seguenti fasi: (i) la preparazione del setup sperimentale per un test specifico (la regolazione della pressione di accelerazione), (ii) il rivestimento di particelle con le molecole di dsRNA o DNA, (iii) le particelle di carico rivestito nella pistola, fino a due reagenti in un saggio, (iv) preparare gli animali per la consegna delle particelle, (v) la consegna di particelle rivestite in tessuto bersaglio (parete del corpo o gangli), e (vi) il trattamento degli embrioni (immunostaining, immunoistochimica e neuronali etichettatura) per visualizzare i risultati, di solito 2 o 3 giorni dopo il parto.
Quando le particelle sono stati rivestiti con netrina dsRNA, hanno causato ben visibili knock-down di espressione netrina che si è verificato solo nelle cellule contenenti particelle (in genere, 1-2 particelle per cella). Particelle rivestite con un plasmide fluorescenza EGFP codifica indotta in cellule neuronali quando si fermarono nel loro nucleo.
Protocollo
Particelle possono essere rivestiti con diversi reagenti, come le molecole dsRNA, plasmidi DNA o coloranti. Il tipo e il diametro delle particelle sono scelti in base al reagente e la profondità delle cellule bersaglio nei tessuti: le particelle più grandi penetrare ulteriormente, ma può causare qualche danno al tessuto.
1. Preparazione di particelle rivestito dsRNA
- Posto al 100% isopropanolo sul ghiaccio.
- Risospendere 5 mg di particelle d'oro (S1600ri, Seashell Technology, LLC; diametro medio di 1,6 micron) in 100 ml di tampone vincolanti. Quando la soluzione è pronta, passare alla fase successiva.
- Dilui....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
In questa dimostrazione, abbiamo usato la pistola pneumatica capillare per fornire particelle d'oro all'interno delle cellule localizzate in piccoli volumi di un embrione vivo sanguisuga per knock-in e knock-down geni. La regione del bersaglio in genere aveva un diametro di circa 150 micron e le particelle sono stati trovati circa 15 micron intorno alla profondità di penetrazione media, che è stato regolabile tra 0 e 50 micron. Quando le particelle sono stati rivestiti con molecole di dsRNA del netrina fattore guida degli assoni, ha.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Dott. Michael Baker per il suo aiuto nella generazione di costrutti per gene knock-in e per la prestazione del time-lapse film di crescere proiezioni sensoriali. Vorremmo anche ringraziare Virginia Vandelinder di assistenza tecnica con gli esperimenti della pistola pneumatica.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| particelle d'oro | Altro | Seashell Technology, LLC | S1600ri | |
| tampone di legame | Reagente | Seashell Technology, LLC | ||
| gomma siliconica | Reagente | Dow Corning | Sylgard 184 |
Riferimenti
- Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
- Baker, M. W., Macagno, E. R.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
