Valutazione della funzionalità multimodale delle cellule T recettori antigenici chimerici a risoluzione di singola cellula attraverso l'analisi optofluidica

Summary

La terapia adottiva con cellule T utilizzando le cellule CAR-T mostra potenziali risultati nel trattamento dei tumori del sangue, anche se le risposte durature sono incoerenti. Le cellule T polifunzionali sono correlate con la durata della remissione, ma gli saghi standard oscurano le sottopopolazioni chiave. Presentiamo un flusso di lavoro a singola cellula utilizzando una piattaforma optofluidica per identificare e isolare cellule CAR-T altamente funzionali per ulteriori studi.

Abstract

La terapia adottiva con cellule T è un nuovo paradigma terapeutico in cui le cellule T autologhe vengono modificate geneticamente per esprimere un recettore antigenico chimerico (CAR) che prende di mira il tumore prima dell'espansione ex vivo e della re-infusione nel paziente. Nonostante notevoli dimostrazioni di potenza antitumorale nei pazienti con neoplasie ematologiche avanzate, le risposte durature non si manifestano in una frazione sostanziale dei casi. Sebbene diversi fattori idiosincratici possano contribuire alla variabilità degli esiti clinici, ci sono sempre più evidenze che la percentuale di cellule T polifunzionali nel prodotto CAR-T pre-infusione sia fortemente correlata con la durata della remissione del cancro. Purtroppo, le valutazioni standard dei prodotti a cellule CAR-T attualmente si basano su misurazioni di popolazione di massa o saggi terminali, limitando la capacità di isolare e studiare sottopopolazioni con proprietà funzionali elevate. Qui dimostriamo un flusso di lavoro che sfrutta una piattaforma optofluidica per valutare sia il profilo di secrezione delle citochine sia l'attivazione tramite l'espressione CD137 delle singole cellule CAR-T, che può essere opzionalmente combinata con la valutazione dell'attività citotossica. Le cellule che mostrano il maggiore grado di funzionalità multimodale possono essere isolate per ulteriori analisi che possano informare la progettazione di terapie con cellule CAR-T di nuova generazione.

Introduction

Le cellule T espresse dal recettore antigenico chimerico (CAR) hanno dimostrato una notevole potenza antitumorale nei pazienti con neoplasie ematologiche^{avanzate 1,2}. Tuttavia, una parte sostanziale dei pazienti trattati alla fine ricade, evidenziando la necessità di sviluppare prodotti a cellule CAR-T con maggiore persistenza^{funzionale 3,4,5,6}. Sebbene molti fattori idiosincratici possano contribuire alla variabilità degli esiti clinici, ci sono sempre più evidenze che la percentuale di cellule T polifunzionali nel prodotto CAR-T pre-infusione sia fortemente correlata con la durata della remissione del cancro. Pertanto, strategie per arricchire o ingegnerizzare le cellule CAR-T con maggiore polifunzionalità potrebbero produrre prodotti terapeutici con potenziale aumentato di mediazione di risposte cliniche ^{durature 6,7,8}. Purtroppo, i metodi attuali per caratterizzare le funzioni delle cellule CAR-T si basano in gran parte su misurazioni di popolazione di massa o su saghi terminali. Questi limitano la capacità di isolare e studiare sottopopolazioni specifiche con proprietà multifunzionali potenziate. Ad esempio, la secrezione di citochine viene tipicamente valutata tramite sovrantativi di massa o tramite colorazione intracellulare. Quest'ultimo richiede la fissazione delle cellule in cambio di informazioni^{al livello 9} della singola cellula. Analogamente, il potenziale citotossico viene valutato più comunemente per popolazioni di cellule CAR-T di massa quantificando la perdita di vitalità cellula-bersaglio dopo la co-coltura T-linfo/^{bersaglio-cellula 10}. La capacità di valutare la secrezione, l'attivazione e l'attività citolitica delle citochine delle cellule CAR-T vitali a risoluzione monocellulare potrebbe stimolare lo sviluppo di prodotti terapeutici con un'efficacia antitumorale più duratura.

Qui presentiamo un metodo per profilare simultaneamente singole cellule CAR-T per funzionalità multimodali tramite una piattaforma optofluidica a singola cellula (Figura 1). Il sistema utilizza il posizionamento opto-elettrico (OEP) per spostare le perle di cattura delle citochine e le singole cellule in recinti spazialmente separati, permettendo valutazioni funzionali di singoli cellule CAR-T (Figura 2A). In questo protocollo, dimostriamo un flusso di lavoro per generare le cellule CAR-T tramite trasferimento genico non virale e valutiamo la secrezione e l'attivazione delle citochine tramite CD137 delle singole cellule CAR-T durante la co-coltura con cellule target espressori e antigeni negative (Figura 3 e Figura 4)¹¹. Il potenziale di differenziare i profili di citochine e attivazione tra prodotti cellulari modificati è esemplificato confrontando le cellule CAR-T standard con quelle c-Jun che^{sovraesprimono 6}. L'attività citotossica contro le cellule a singolo bersaglio può essere valutata anche utilizzando letture basate su caspasi o fluorescenza sulla piattaforma optofluidica (Figura 2B). Tuttavia, è necessaria un'analisi time-lapse per determinare la cinetica delle interazioni, che può variare significativamente per ogni costruzione e esperimento CAR. Allo stesso modo, i saggi di uccisione ripetuta che imitano la stimolazione cronica richiedono un flusso di lavoro alternativo. Pertanto, in questo articolo descriviamo la procedura di base per la valutazione della citotossicità, ma non ne discutiamo le applicazioni dettagliate.

In base alla valutazione scelta e alle caratteristiche del bersaglio, le cellule CAR-T vive che mostrano il maggiore grado di funzionalità multimodale possono essere scaricate dallo strumento e trasferite a singoli pozzi in piastre da 96 pozzi per ulteriori studi (Figura 2C).

Protocol

NOTA: Il buffer e la preparazione dei media sono forniti nella Tabella 1.

1. Isolamento delle cellule T CD8 da coni del sistema di riduzione dei leucociti

NOTA: Eseguire tutti i passaggi con una tecnica sterile e asettica in un armadietto di biosicurezza in coltura tissutale. Tutti i mezzi per diluizioni, lavaggi e risospense devono essere mantenuti a 4 °C per tutta la procedura.

1. Aggiungere 15 mL di mezzo di separazione cellulare (densità 1,077 g/mL) a ciascuno dei due tubi conici da 50 mL (tubo di separazione).
2. Tenere un cono del sistema di riduzione dei leucociti (LRS) (lato conico verso il basso) sopra un tubo conico non tappato da 50 mL. Usando forbici sterilizzate, taglia il tubo di plastica che si estende sotto il cono LRS. Appoggia il cono LRS sopra il tubo conico aperto da 50 mL e taglia il tubo di plastica sopra. Raccogliere circa 8-10 mL di sangue nel tubo conico da 50 mL.
3. Riempire il tubo conico da 50 mL fino a 50 mL con PBS + EDTA (preparato come indicato nell'elenco di substrati e tamponi) e fare una pipetta per mescolare il sangue diluito. Dividere equamente il sangue diluito tra i due tubi di separazione.
4. Centrifuga i tubi di separazione con sangue diluito a 750 x g per 15 minuti a temperatura ambiente (RT), con 9 come accelerazione e 2 come decelerazione.
5. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, raccogli e trasferisci con cura il rivestimento buffy da ogni tubo di separazione in un nuovo tubo conico da 50 mL.
6. Riempire ogni tubo conico da 50 mL a 40 mL con PBS + EDTA e risospendere per ottenere sospensioni a singola cella. Centrifugare le sospensioni monocella a 300 x g per 10 minuti a 4 °C. Aspira il soprandante.
7. Risospendere e combinare i pellet cellulari in 40 mL di PBS + EDTA. Centrifuga la sospensione a cella singola a 300 x g per 10 minuti a 4 °C. Aspira il soprandante.
8. Risospendere il pellet cellulare in PBS + EDTA e determinare la densità cellulare vitale della sospensione delle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) tramite colorazione con Trippan Blue.
   NOTA: Il Trippan Blue è un colorante impermeabile a cellule vive che tinge il DNA. Quindi, sia i PBMC vivi che le cellule non nucleate (cioè i globuli rossi) rimarranno non colorati. È importante escludere le piccole cellule (ad esempio, globuli rossi) quando si determina la densità vitale di PBMC.
9. Trasferire il numero desiderato di PBMC in un nuovo tubo conico da 50 mL per l'arricchimento magnetico delle cellule T CD8⁺ . Stimare 10 volte il numero desiderato di cellule T CD8⁺ come quantità iniziale di PBMC necessaria per l'arricchimento magnetico. Tieni i reagenti freddi durante la procedura.
10. Centrifuga la sospensione della cella PBMC a 300 x g per 10 minuti a 4 °C. Aspira il soprandante. Risospendere il pellet cellulare in 40 μL di MACS Buffer (preparato come indicato nell'elenco di mezzi e buffer) per 1 x 10⁷ celle.
11. Aggiungi 10 μL di cocktail Biotina-Ab a cellule T CD8⁺ ogni 1 x^{10 7} cellule. Mescola pipettando e incuba per 5 minuti a 4 °C.
12. Aggiungi 30 μL di buffer MACS per 1 x 10⁷ celle. Aggiungi 20 μL di microsfere CD8⁺ per 1 x 10⁷ cellule. Mescola pipettando e incuba per 10 minuti a 4 °C.
13. Posiziona colonna/e LS pre-raffreddata su un magnete. Posiziona un tubo conico da 15 mL sotto per raccogliere il flusso di liquido. Bilanciare ogni colonna LS con 3 mL di MACS Buffer.
14. Utilizzando lo stesso tubo conico da 15 mL del tubo di raccolta, applicare la sospensione della cella alla colonna LS equilibrata. Lava la colonna 3 volte con 1 mL di MACS Buffer. Lascia passare ogni lavaggio da 1 mL completamente attraverso la colonna LS prima di applicare il lavaggio successivo.
15. Sospendere attentamente le cellule raccolte e determinare la densità cellulare vitale della sospensione arricchita CD8⁺ tramite colorazione con Trippan Blue.

2. Attivazione a perla delle cellule T CD8⁺ basata su perle

1. Calcola il numero di sfere umane CD3/CD28 necessarie per un rapporto 1:1 di cellule T:perle. Il calcio di sfera di attivazione contiene 1 x 10⁶ perle per 25 μL.
2. Fai un vortice delicato sulle sfere di attivazione per almeno 30 secondi prima di trasferire il volume calcolato della sospensione delle perne su un tubo conico da 15 mL. Aggiungi un volume uguale di substrato per lavare le perline e il vortice per almeno 5 secondi.
3. Posiziona il tubo conico da 15 mL nel rispettivo magnete per 1 minuto per raccogliere le sfere ai lati del tubo. Aspira e scarta il soprantantante.
4. Calcola il volume di mezzo necessario per una concentrazione finale di cellule T di 1 x 10⁶ cellule T/mL. Rimuovere il tubo conico da 15 mL dal magnete e risospendere nel volume calcolato del mezzo di coltura. Aggiungi IL-2 umano ricombinante a una concentrazione finale di 50 U/mL.
5. Trasferire il mezzo completamente integrato al tubo contenente le cellule T e risospendere. Seminare la sospensione cellulare in un formato di coltura cellulare appropriato (ad esempio, 1 mL in piastre da 48 pozzetti, 2 mL in piastre da 24 pozzetti) e incubare per 40 ore.

3. Generazione di cellule CAR-T tramite trasferimento genico non virale tramite nucleofezione

NOTA: Il preriscaldamento del mezzo (37 °C), dei reagenti (RT) e della centrifuga (RT) è fondamentale per garantire un'elevata efficienza di trasferimento genico.

1. Prepara e etichetta una piastra da 48 pozzetti con 1 mL di mezzo di coltura cellulare per ogni condizione di nucleofezione. Incubare la piastra per almeno 30 minuti per fornire un mezzo caldo e regolato con_CO2 e pH fisiologico.
2. Accendi il Nucleofettore e seleziona le posizioni da nucleofettare all'interno della striscia a 16 pozzi. Seleziona il programma appropriato (ad esempio, FI-115 per favorire alta efficienza o EO-115 per una maggiore vitalità).
3. Estrai la piastra di coltura cellulare con le cellule T dall'incubatore e usa un microscopio per controllare l'aspetto visivo delle cellule, così da farti un'idea iniziale se l'attivazione sia stata un successo. Le cellule T attivate con successo dovrebbero mostrare un raggruppamento uniforme e una forma cellulare ingrandita. Un colore medio che differisce da un substrato fresco in una tonalità leggermente arancione indica che l'attivazione ha portato a uno stato metabolico più attivo ed è considerato un buon segno. A questo punto, un'analisi citometrica a flusso dei marcatori di attivazione precoce CD25 e CD69 può convalidare l'attivazione.
4. Sospendere, prelevare e contare le cellule T attivate. Calcola il numero di cellule T necessarie considerando da 1,2 a 2 x^{10 cellule T da 6} per condizione. Trasferire il volume calcolato in una nuova valvoletta conica da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 10 minuti a RT.
5. Aspirare e scartare il supernatant e lavare le cellule T con 10 mL di PBS caldo. Centrifugare a 200 x g per 10 minuti a RT. Utilizzare il tempo di centrifugazione per scongelare i plasmidi codificanti CAR, tipicamente costituiti da una concentrazione di 1 μg/μL di DNA. Assemblare plasmide di codifica trasposasi (SB100x) (1,0 μg) o minicerchio (0,5 μg) insieme a plasmide a codifica CAR (1,0 μg) o minicerchio (0,6 μg) in un singolo tubo di microcentrifugazione da 1,5 mL privo di DNAsi per condizione di nucleofezione.
6. Prepara una quantità sufficiente di Soluzione Nucleofecttore P3 con supplemento aggiunto (per condizione: 16,4 μL di Soluzione Nucleofecttore + 3,6 μL di Integratore).
7. Estrai il tubo conico da 15 mL contenente le cellule T dalla centrifuga, aspira il soprandanante e centrifuga per 1 minuto a 200 x g per raccogliere il liquido residuo sul fondo. Prendi una pipetta da 200 μL per rimuovere con cura quanta più protezione possibile senza toccare il pellet cellulare.
8. Procedere immediatamente con la risospensione del pellet delle cellule T in 20 μL di tampone P3 (come indicato nell'elenco dei materiali) per condizione. Trasferire 20 μL di sospensione cellulare in tampone P3 al tubo di microcentrifugazione da 1,5 mL contenente le rispettive costruzioni, mescolare delicatamente senza introdurre aria e trasferire la sospensione cellulare sulla striscia nucleofecttiva a 16 pozzi. Tocca delicatamente per rimuovere qualsiasi aria dal fondo del pozzo.
9. Posizionare la striscia a 16 pozzi nel Sistema Nucleofector 4D e avviare la procedura di nucleofezione. Dopo una nucleofezione riuscita, una croce verde dovrebbe essere visibile sullo schermo per ogni pozzo scelto.
10. Aggiungere immediatamente 100 μL di mezzo preriscaldato dal piatto preparato da 48 pozzi prima di incubare la striscia da 16 pozzi per 10 minuti nell'incubatrice.
11. Sospendere con cura 2 o 3 volte, trasferire la sospensione cellulare nella piastra preparata a 48 pozzi e rimetterla nell'incubatrice.
12. Dopo 4-5 ore, rimuovere con attenzione 500 μL da ogni pozzo e aggiungere con cura 500 μL di mezzo di coltura fresco e preriscaldato, integrato con 50 U/mL di IL-2 umano ricombinante.
13. Effettuare cambi regolari del substrato a giorni alterni per espandere le cellule, mantenendo una densità cellulare tra 0,5 e 2 x 10⁶ T/mL.
14. Al giorno 6, rimuovere le sfere di attivazione CD3/CD28. Prelevare le cellule T risospendendole delicatamente 10 volte e trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL. Posiziona il tubo conico da 15 mL nel rispettivo magnete per 1 minuto.
15. Aspirare la sospensione cellulare, trasferire su una piastra di coltura fresca e nutrire le cellule con un mezzo di coltura fresco integrato con IL-2 fino a una concentrazione finale di 50 U/mL. Le sfere dovrebbero rimanere visibili nelle pareti laterali del tubo conico da 15 mL rimasto nel magnete.
16. Analizzare l'efficienza del trasferimento genico al giorno 7 tramite un'analisi flow-cytometrica dell'espressione dei rispettivi CAR o marcatori surrogati prima di procedere con la selezione magnetica delle cellule T CAR positive per transgene al giorno 8 (Strategia di Gating nella Figura Supplementare 1).

4. Arricchimento magnetico delle cellule T positive al transgene

NOTA: Eseguire tutti i passaggi con una tecnica sterile e asettica in un armadietto di biosicurezza in coltura tissutale. Tutti i mezzi per diluizioni, lavaggi e risospense devono essere mantenuti a 4 °C per tutta la procedura.

1. Preleva le cellule T risospendendole delicatamente e trasferendole a tubi conici da 15 mL. Contare le cellule T, prendere il numero di cellule da arricchire magneticamente e centrifugare per 10 minuti a 300 x g.
2. Aspirare e scartare il surnatante e lavare risospendendo 10 mL di buffer MACS. Centrifuga per 10 minuti a 300 x g. Aspira e scarta il soprandatante.
3. Calcola la quantità di anticorpo biotinilato diretto contro il marcatore surrogato (ad esempio, tEGFR) necessario. Tipicamente, l'anticorpo dovrebbe essere titolato a 1 μL ogni 1 x 10⁶ cellule.
4. Risospendere le cellule T a una densità di 1 x 10⁷ cellule per mL e aggiungere la quantità calcolata di anticorpo biotinilato. Incubare per 20 minuti a 4 °C.
5. Lavare aggiungendo 10 mL di buffer MACS e centrifugare 10 minuti a 300 x g. Aspira e scarta il soprandatante.
6. Risospendere le cellule T a 1 x 10⁷ celle per 80 μL di buffer MACS. Aggiungere microsfere di antibiotina a un volume di 20 μL per 1 x 10⁷ cellule. Mescola bene e incuba per 15 minuti a 4 °C.
7. Lavare aggiungendo 10 mL di buffer MACS e centrifugare 10 minuti a 300 x g. Aspira e scarta il soprandatante. Sospendere le celle in 500 μL di buffer MACS.
8. Posiziona colonna/e LS pre-raffreddata su un magnete. Posiziona un tubo conico da 15 mL sotto per raccogliere il flusso di liquido.
9. Bilanciare ogni colonna LS con 3 mL di MACS Buffer. Utilizzando lo stesso tubo conico da 15 mL del tubo di raccolta, applicare la sospensione della cella alla colonna LS equilibrata.
10. Lava la colonna 3 volte con 1 mL di MACS Buffer. Lascia passare ogni lavaggio da 1 mL completamente attraverso la colonna LS prima di applicare il lavaggio successivo.
11. Per raccogliere cellule positive al transgene, si prende la colonna LS dal magnete e la inserisci in un tubo conico fresco da 15 mL. Aggiungi 5 mL di buffer MACS e spingi delicatamente il liquido fuori dalla colonna.
12. Conta le celle isolate e centrifuga per 10 minuti a 300 x g. Sospendere le cellule positive-transgene in un volume appropriato di mezzo integrato con IL-2 e incubare fino a eseguire valutazioni funzionali e/o fenotipiche. Esegui un controllo di purezza prima di iniziare i flussi di lavoro colorando per il CAR o il marcatore di trasduzione surrogato (Figura Supplementare 2).

5. Preparazione del sistema

1. Accendi lo strumento e apri il software Cell Analysis Suite (CAS). Assicurati che il contenitore di raccolta rifiuti sia vuoto. Verifica che ci sia acqua nella colonna dell'umidificatore.
2. Naviga al pannello dei flussi di lavoro. Apri il flusso di lavoro Full Clean (pre-caricato durante l'installazione del sistema).
   NOTA: Si consiglia di eseguire il flusso di lavoro Full Clean entro 72 ore dall'inizio di un esperimento sullo strumento.
3. Esegui tutti i controlli e procedi cliccando su Start. Quando richiesto, sostituisci i tubetti conici e le bottiglie di reagente in ciascuna delle slot del vano reagente con contenitori nuovi con soluzione pulitiva BLI. Clicca sull'icona Run per procedere.
4. Quando richiesto, sostituisci i tubetti conici e le bottiglie di reagente in ciascuna delle slot del vano reagente con contenitori freschi con acqua sterile. Clicca sull'icona Run per procedere.
5. Apri il flusso di lavoro Pre-flight Check (pre-caricato durante l'installazione del sistema). Esegui tutti i controlli e procedi cliccando su Start.
6. Prepara un tubo conico da 50 mL con 2 mL di soluzione bagnante. Prepara un tubo conico separato da 50 mL con 39,6 mL di 1x DPBS e 400 μL di Additivo Bagnante.
7. Quando richiesto, sostituisci il chip Flush con un chip optofluidics. Clicca sull'icona Run per procedere. Pulisci con cura la superficie del chip di optofluidica e delle ghine del nido con etanolo al 70% prima di chiudere i nidi.
8. Quando richiesto, sostituire i tubetti conici e le bottiglie di reagente in ciascuna delle slot della baia dei reagenti con contenitori nuovi con le soluzioni appropriate.

6. Creazione di flussi di lavoro per sami

1. Naviga al pannello dei flussi di lavoro. Seleziona Crea nuovo flusso di lavoro (+), seleziona Opto T cell Profiling, poi seleziona MCA e Cytotoxicity Assay dal menu a tendina.
2. Premi doppiamente su Multiplex Cytochine Bead Load per espandere la lista dei bead load. Se si testano meno di 3 bersagli di citochine, clicca su X per eliminare la sfera o le sfere di citochine dalla lista di carico delle perle.
3. Aggiorna ogni campo con il tipo di perla appropriato, il bersaglio della citochina e la posizione di importazione.
   NOTA: Il software CAS caricherà automaticamente ogni perla di cattura delle citochine in ordine decrescente della luminosità Cy5, indipendentemente da come siano disposte le voci di caricamento delle perle.
4. Clicca doppiamente su Carico APC Priorizzato con Controllo per espandere la lista di carichi della cella bersaglio. Se si testano più di 1 cella target di controllo e 1 campione di linea cellulare target, aggiungono ulteriori passaggi di caricamento delle celle.
5. Aggiornare ogni campo con il nome desiderato della linea cellulare target, il campo di vista desiderato (FOV) sulla penna e i criteri di selezione APC (specificando il file template di selezione della penna target (TPS)).
6. Seleziona Configurazione di carico delle T Cell e seleziona Più linee di Celle. Premi doppiamente su Carico Prioritario delle Cellule T per espandere la lista di carichi delle cellule T.
7. Aggiorna ogni campo con il nome desiderato della linea delle cellule T, i FOV desiderati per la penna e i criteri di selezione delle cellule T (specificando il file modello TPS).
8. Premi doppiamente Cytotoxicity Assay per ampliare le impostazioni del test di citotossicità. Aggiorna i campi di Impostazioni di Imaging specifici per il workflow con la Durata del Saggio desiderata (h).
9. Fai doppio clic su Phenotype and Cytochine Assays per ampliare il protocollo di colorazione per il saggio di secrezione di citochine.
10. Aggiorna i campi On Chip Staining con la posizione di importazione appropriata per le colorazioni primarie e secondarie.
11. Premi doppiamente su T Cell Scarico per espandere la lista di scarico. Aggiorna il campo # di Esportazioni per Chip (inclusi i vuoti) al numero desiderato di esportazioni. Salva e apri il nuovo flusso di lavoro creato.

7. Carico della perla di cattura delle citochine

1. Sonica e/o vortice ogni fiala delle perle per sospendere completamente le perle di cattura. Determina la concentrazione delle sfere tramite un contatore cellulare.
2. Regola la densità delle perle a 4,5 x 10⁶ perle/mL (perle di tipo A) o 4 x 10^{perle da 6} perle/mL (perle di tipo B) in 30 μL di tampone diluizione delle sfere.
3. Conservare le sospensioni a 4 °C fino a quando non viene richiesto di caricare nel deposito del campione. Esegui tutti i controlli e procedi cliccando su Start.
4. Quando richiesto, miscela la sospensione della sfera citochina con una pipetta da 20 μL e carica la sospensione nella posizione di importazione appropriata. Clicca sull'icona Run per procedere.
5. Quando richiesto, ispezionare visivamente diversi FOV per verificare che le perle di cattura siano state caricate con una distribuzione uniforme tra i canali fluidici a una densità appropriata. Se la distribuzione e/o la densità di carico fossero subottimali, si seleziona Flush e Import per ritentare il caricamento con perle. Se la distribuzione e la densità del carico fossero adeguate, seleziona Procedi per iniziare a infilare le perline.
6. Ripeti il passo 7.3 per ogni sfera di cattura di citochine.

8. Carico della cella target

1. Determinare la densità di cellule vive di ciascuna linea cellulare bersaglio tramite colorazione con Trypan Blue.
   NOTA: Questo flusso di lavoro presuppone che le cellule target provengano da colture attive. Se invece si devono utilizzare cellule criopriservate, assicurarsi che le cellule siano state coltivate per almeno un passaggio dopo lo scongelamento e siano almeno al 90% vitali.
2. Preleva 1 x 10⁶ cellule bersaglio in un tubo microfuge da 1,7 mL. Centrifuga a 300 x g per 5 minuti a RT. Aspira il soprantantante.
3. Risospendere ogni pellet della cella bersaglio in 100 μL di Soluzione di Colorazione Annessina V. Incubare per 30 minuti in tempo di ritiro, protetto dalla luce.
4. Aggiungi 400 μL di 1x Annexin V Binding Buffer e risospendi tramite pipetta. Centrifuga a 300 x g per 5 minuti a RT. Aspira il soprantantante.
5. Risospendere ogni pellet della cella bersaglio in 250 μL di mezzo di carico +_{CaCl 2}. Conservare le sospensioni della cella bersaglio a 4 °C fino a quando non viene richiesto di caricare nel vano di carico campioni.
6. Quando richiesto, risospendere le celle target con una pipetta da 200 μL e caricare la sospensione della cella target nella posizione di importazione appropriata. Clicca sull'icona Run per procedere.
7. Quando richiesto, ispezionare visivamente diversi FOV per verificare che le celle target siano state caricate con una distribuzione uniforme tra i canali fluidici a una densità appropriata. Se la distribuzione e/o la densità di carico fossero subottimali, selezionare Flush e Import per ritentare il caricamento target cell. Se la distribuzione e la densità di carico erano adeguate, seleziona Procedi per iniziare il gate TPS.
8. Quando richiesto, naviga su Operazioni Manuali, poi clicca su TPS e carica il template TPS richiesto.
9. Specifica il filtro/i ottico e i FOV da visualizzare per definire le porte TPS, poi clicca su Captura Only per avviare l'acquisizione dell'immagine.
10. Apri l'Editor di Configurazione Gate, seleziona la casella per Annexin e seleziona il canale appropriato per la colorazione Annexin V per il parametro X. Dal menu a tendina, seleziona Log (Delta Median Brightness). Seleziona OEP per il parametro Y. Dal menu a tendina, seleziona Vicino più prossimo.
11. Trascina gli angoli del gate risultante per escludere^{le celle} basse di Annexin V^e Nearest Neighbor, poi salva il template TPS senza cambiare il nome del file.
12. Torna a Flussi di lavoro e clicca su Continua per procedere con la scrittura. Ripeti i passaggi 8.7-8.11 per ogni linea cellulare bersaglio.

9. Carico delle cellule T

1. Determinare la densità di cellule vive di ciascuna linea di cellule T tramite colorazione con Trippan Blue.
   NOTA: Questo flusso di lavoro presuppone che le cellule T provengano da colture attive. Se invece si devono utilizzare cellule criopriservate, assicurarsi che siano state coltivate durante la notte dopo lo scongelamento e siano almeno al 90% vitali.
2. Preleva 1 x 10⁶ cellule T in un tubo microfuge da 1,7 mL. Centrifuga a 300 x g per 5 minuti a RT. Aspira il soprantantante.
3. Risospendere ogni pellet della cella bersaglio in 100 μL di Soluzione di Colorazione Annessina V. Incubare per 30 minuti in tempo di ritiro, protetto dalla luce.
4. Aggiungi 400 μL di 1x Annexin V Binding Buffer e risospendi tramite pipetta. Centrifuga a 300 x g per 5 minuti a RT. Aspira il soprantantante.
5. Risospendere ogni pellet di cellula T in 250 μL di mezzo di carico + CaCl₂. Conservare le sospensioni a T-cell a 4 °C fino a quando non viene richiesto di caricare nel deposito di campioni.
6. Quando richiesto, sospendere le celle target con una pipetta da 200 μL e caricare la sospensione delle cellule T nella posizione di importazione appropriata. Clicca sull'icona Run per procedere.
7. Quando richiesto, ispezionare visivamente diversi FOV per verificare che le cellule T siano state caricate con una distribuzione uniforme attraverso i canali fluidici a una densità appropriata. Se la distribuzione del carico e/o la densità fossero subottimali, selezionare Flush e Import per ritentare il caricamento delle cellule T. Se la distribuzione e la densità di carico erano adeguate, seleziona Procedi per iniziare il gate TPS.
8. Quando richiesto, naviga su Operazioni Manuali, poi clicca su TPS e carica il template TPS richiesto.
9. Specifica il filtro/i ottico e i FOV da visualizzare per definire le porte TPS, poi clicca su Captura Only per avviare l'acquisizione dell'immagine.
10. Apri l'Editor di Configurazione Gate, seleziona la casella per Annexin e seleziona il canale appropriato per la colorazione Annexin V per il parametro X. Dal menu a tendina, seleziona Log (Delta Median Brightness). Seleziona OEP per il parametro Y. Dal menu a tendina, seleziona Vicino più prossimo.
11. Trascina gli angoli del gate risultante per escludere^{le celle} basse di Annexin V^e Nearest Neighbor, poi salva il template TPS senza cambiare il nome del file.
12. Torna a Flussi di lavoro e clicca su Continua per procedere con la scrittura. Ripeti i passaggi 9.7-9.11 per ciascuna linea di cellule T.

10. Saggio sulla citotossicità

1. Preparare un mezzo perfusionale in un tubo conico da 50 mL aggiungendo 100 μL di reagente NucView 530 Caspase-3 pre-scongelato a 20 mL di mezzo a cellule T (concentrazione stock 1 mM, concentrazione finale 5 μM).
2. Quando richiesto, sostituire il tubo conico appropriato nelle slot della baia reagente con il tubo conico preparato contenente il Mezzo di Perfusione. Clicca sull'icona Run per procedere.
   NOTA: 20 mL di mezzo perfusionale sono sufficienti per perfondere un singolo chip optofluidico per 24 ore. Prepara ulteriori mezzi di perfusione se il test di citotossicità deve durare più di 24 ore.
3. Se desiderato, interrompere eventuali passaggi rimanenti del test di imaging citotossico dopo 14 ore cliccando su Salta il resto dell'imaging TPS e procedere con il flusso di lavoro.

11. Test fenotipico e di citochine

1. Prepara la soluzione primaria di colorazione in un tubo microfuge da 1,7 mL mescolando 76 μL di anticorpi multiplex Human CD8/NK Panel Detection e 4 μL di anti-CD137_BV421.
2. Mescola pipettando e conserva a 4 °C finché non viene chiesto di caricare. Quando richiesto, miscela la soluzione primaria di colorazione con una pipetta da 20 μL e carica nella posizione di importazione appropriata. Clicca sull'icona Run per procedere.
3. Prepara la soluzione secondaria di colorazione in un tubo microfuge separato da 1,7 mL mescolando 72 μL di 1x DPBS con 8 μL del multiplex kit SA-PE.
   NOTA: La soluzione secondaria di colorazione deve essere preparata in anticipo, in modo che sia pronta a caricarsi non appena la colorazione primaria è completata.
4. Mescola pipettando e conserva a 4 °C finché non viene chiesto di caricare. Quando richiesto, miscela la soluzione secondaria di colorazione con una pipetta da 20 μL e carica nella posizione di importazione appropriata. Clicca sull'icona Run per procedere.

12. Analisi del saggio

1. Naviga sul Desktop e apri il software Assay Analyzer . Seleziona Analizzatore di Saggi, seleziona Flussi di lavoro, poi seleziona il tipo di workflow da analizzare.
2. Usa qualsiasi criterio desiderato per definire penne di interesse da scaricare. Genera la lista di scarico secondo i criteri desiderati, poi torna al software CAS e seleziona Continua il flusso di lavoro selezionato.
3. Verifica che la casella di spunta per la lista Crea esportazione con Assay Analyzer per: [Optofluidics Chip ID] sia selezionata.

13. Scarica

1. Preparare una piastra a fondo arrotondato da 96 pozzi con 50 μL di mezzo per cellule T per pozzo. Clicca su Continua per procedere con lo scarico della cella.
2. Quando richiesto, apri la baia di carico dei chip, apri il coperchio del nido e rimuovi il chip optofluidico. Posizionare il chip in una piastra di Petri sterile, con il bordo superiore del chip optofluidico sollevato >1° per evitare che le cellule si rotolino fuori dalle penne. Conservare in un incubatore sterile per colture tissutali durante il successivo lavaggio.
3. Metti un chip Flush sterile nel nido vuoto, chiudi il coperchio del nido, poi chiudi il vano per chip. Clicca su Finito e poi su Continua.
4. Quando richiesto, apri la baia di carico dei chip, apri il coperchio del nido e rimuovi il chip Flush. Rimetti il chip optofluidico nel nido vuoto, chiudi il coperchio del nido e poi chiudi il vano del chip. Clicca sull'icona di corsa per procedere.
5. Quando richiesto, seleziona Aperta per visualizzare il menu Carica/Scarica Piastra del Pozzo . Clicca su Scarica per rimuovere la targa precedente. Aggiorna l'ID della piastra del pozzo e il tipo di piastra del pozzo, seleziona Carico, poi seleziona Fatto.
6. Clicca su Continua per procedere con lo scarico della cella. Una volta scaricate tutte le penne desiderate, naviga su Operazioni Manuali e apri il vano dei chip per recuperare la piastra contenente le celle di interesse.

Results

Utilizzando il protocollo descritto, abbiamo sfidato singoli leccini CAR T simulati nucleofetti, CAR e c-Jun sovraespressi con cellule tumorali K562 della Figura 3 antigene-negative o antigene-positive, o lasciandole non stimolate (solo cellule T). Le cellule target sono state valutate per la loro espressione omogenea dell'antigene come prerequisito per risultati riproducibili (Figura supplementare 3). Grazie al loro isolamento in nanopens singoli, siamo riusciti a caratterizzare i profili di espressione delle citochine di queste cellule come produttori singoli, doppi o tripli, a seconda della condizione testata (Figura 3). Questi risultati sono stati verificati utilizzando ELISA come metodo consolidato per la rilevazione delle citochine (Figura Supplementare 4).

Come previsto, la maggior parte delle cellule T mock-nucleofettate è rimasta negativa per tutte e tre le citochine misurate (TNF-α, IFN-γ e IL-2). Tra le cellule CAR T standard, i produttori di citochine IFN-γ doppie, triple e singole positive, così come piccole frazioni di cellule secretore di TNF-α e IL-2, sono stati rilevati al momento della sfida antigenica, mentre l'esposizione a cellule tumorali antigeni-negative non ha indotto la secrezione multicellulare di citochine. Curiosamente, la sovraespressione di c-Jun ha aumentato la proporzione di produttori di doppia e tripla citochine, così come di cellule secernenti singole citochine, al contatto con il bersaglio, riducendo così la frazione complessiva di cellule cytochine-negative rispetto alle cellule T CAR standard. Questi risultati sono coerenti con rapporti precedenti che descrivevano la modulazione fenotipica delle cellule T CAR tramite l'espressione forzata di questo fattore di trascrizione⁶. In particolare, abbiamo osservato una proporzione maggiore di cellule IFN-γ-positive nel gruppo solo di cellule T rispetto al gruppo delle cellule tumorali antigene-negative, il che potrebbe essere dovuto al minor numero di cellule analizzate in quella condizione.

Per approfondire l'attivazione delle cellule T, abbiamo valutato l'espressione di CD137 nelle singole cellule CAR CAR sovraespresse con nucleofettaggio simulato, CAR e c-Jun trattate come descritto sopra (Figura 4 e Tabella Supplementare 1). La sfida delle cellule CAR T con cellule bersaglio K562 che esprimono antigeni ha portato a un aumento dell'espressione di CD137 rispetto alle cellule mock-nucleofettate. Inoltre, abbiamo osservato una tendenza verso una frazione leggermente più alta di cellule CD137 positive tra le cellule CAR sovraespressive rispetto al prodotto CAR standard.

In conclusione, il protocollo descritto ha permesso la valutazione della secrezione e dell'attivazione delle citochine e dell'attivazione delle cellule CAR T a livello di singola cellula, consentendo l'identificazione dei produttori di citochine singole e multicellulari e la ripresa delle tendenze fenotipiche precedentemente descritte al livello^{di massa 6}.

Figura 1: Flusso di lavoro schematico per la profilazione multimodale tramite una piattaforma optofluidica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini rappresentative delle diverse caratteristiche della piattaforma optofluidica. (A) Importare la sequenza di singole particelle in singole penne tramite OEP. Le penne nella parte sinistra delle immagini sono state caricate nella sequenza precedente. (B) Eventi di morte in tre singoli pennini nel tempo, mostrando cellule tumorali che esprimono antigeni con GFP. (C) Esportazione di una singola cella da una penna tramite OEP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi rappresentativa dei profili di secrezione delle citochine a livello di singola cellula. Singole cellule T mock-nucleofettate o CAR-T sono state coltivate in presenza o in assenza di cellule tumorali K562 antigene-negative o antigene-positive all'interno di nanopen contenenti sfere di cattura di citochine per TNF-α, IL-2 e IFN-γ. I grafici a torta mostrano le proporzioni di cellule CAR-T pennate singolarmente analizzate con il profilo di secrezione di citochine indicato dopo 24 ore di co-coltura (analisi degli endpoint). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi rappresentativa dell'espressione di CD137 a livello di singola cellula. Singoli mock-nucleofettati o CAR-T sono stati colorati per l'espressione superficiale CD137 sul chip optofluidico, 24 ore dopo la coltura in presenza o assenza di cellule tumorali K562 antigene-negative o antigene-positive. I grafici violino mostrano l'intensità di fluorescenza dell'espressione di CD137 su cellule T mock-nucleofettate e cellule CAR-T dopo 24 ore di coltura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Componenti del mezzo a cellule T (Filtrati sterili utilizzando unità di filtro a vuoto 0,22μM)	Volume (concentrazione finale)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX, 25mM HEPES)	500 mL
Penicillina/Streptomicina (10.000 U/mL)	5 mL (90 U/mL)
β-Mercaptoetanolo (50mM)	0,5 mL (45μM)
Siero umano (inattivato dal calore)	50 mL (9%)
Integratore GlutaMAX (100 volte)	5mL (0,9x)
Componenti del mezzo cellulare tumorale	Volume (concentrazione finale)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX, 25mM HEPES)	500 mL
Penicillina/Streptomicina (10.000 U/mL)	5 mL (90 U/mL)
Siero per vitelli fetali (inattivazione al calore)	50 mL (9%)
Componenti buffer MACS	Volume (concentrazione finale)
DPBS (Mg2+-libero, Ca2+-libero)	500 mL
Siero per vitelli fetali (inattivazione al calore)	2,5 mL (0,5 %)
EDTA (0,5 M)	2 mL (2 mM)
Componenti buffer PBS/EDTA	Volume (concentrazione finale)
DPBS	500 mL
EDTA (0,5 M)	2 mL (2 mM)
Componenti del mezzo di carico	Volume (concentrazione finale)
Mezzo per cellule T	18 mL
Reagente di carico	2 mL
Componenti di caricamento Support+CaCl2	Volume (concentrazione finale)
Caricamento dei mezzi	499 μL
CaCl2	1,25 μL
Substrato di perfusione + substrato di caspasi	Volume (concentrazione finale)
Mezzo per cellule T	20 mL
Substrato NucView 530 Caspase-3 (1 mM in DMSO)	100 μL
Componenti del buffer a diluizione a sferone	Volume (concentrazione finale)
DPBS	800 μL
BSA (2% fronte a favore)	100 μL (0,2% w/v)
Preadolescente-20 (10% w/v)	10 μL (0,1% p/v)

Tabella 1: Preparazione dei media e dei cuscinettini.

Figura supplementare 1. Strategia esemplare di gating per valutare l'efficienza del trasferimento genico prima dell'arricchimento magnetico. Diagrammi esemplari di contorno e istogramma mostrano la strategia di gating per identificare le cellule CAR CAR (tEGFR-positive) dopo il trasferimento genico. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2. Controllo della purezza dopo lo smistamento. Diagrammi di contorno esemplari rappresentano una frazione delle cellule CAR CAR espresse (tEGFR-positive) dopo l'esecuzione di un ordinamento magnetico. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3. Espressione di antigene sulle cellule tumorali bersaglio. Grafici istografici rappresentativi mostrano cellule tumorali WT K562 o ingegnerizzati per esprimere ROR1 colorati con anticorpi isotipo o miranti ROR1 tramite citometria di flusso. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4. Rilevamento delle citochine tramite ELISA standard. Concentrazioni di IL-2 e IFN-γ nel sovrantante dopo 24 ore di co-coltura con cellule tumorali^{K562 ROR1} a E:T di 4:1 misurate tramite ELISA per cellule CAR vs CAR+cJ T. Significatività statistica determinata dal test t non accoppiato con *P≤ 0,05, **P≤ 0,01, ***P≤ 0,001, ****P≤ 0,0001. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 1: Cellule analizzate. La tabella indica il numero di singole cellule analizzate per condizione. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Il flusso di lavoro dimostrato consente la valutazione del profilo di secrezione e attivazione delle citochine delle singole cellule CAR-T durante la co-coltura con cellule bersaglio antigeni-positive e antigeni-negative, che possono essere opzionalmente combinate con la valutazione dell'attività citolitica. Sebbene la capacità di catturare dati funzionali multimodali a risoluzione di singola cellula offra un modo per analizzare le prestazioni delle cellule T CAR con precisione senza precedenti, la quantificabilità delle misurazioni dipende fortemente dalla precisione della tecnologia OEP nel caricare lo stesso numero di sfere di cattura citochine, cellule target e cellule CAR-T in ciascuna penna. Pertanto, è fondamentale assicurarsi che la densità di carico e i criteri TPS di ogni reagente o campione di cella siano ottimizzati per consentire il carico a singola sfera e/o singola in ogni penna. Sebbene adattare la concentrazione della sospensione della perla o della cella nei canali fluidici possa consentire un adeguato carico della penna, le opzioni Flush e Import della piattaforma rappresentano una strategia aggiuntiva per ripetere il processo di caricamento.

Una caratteristica vantaggiosa del design dei chip optofluidici è la separazione della disposizione della penna in 22 FOV distinti. Caricando cellule T ingegnerizzate con diversi costrutti CAR in diversi FOV all'interno del chip optofluidico, siamo stati anche in grado di valutare se un costrutto alternativo che imponesse l'iperespressione di c-Jun potesse migliorare la generazione di cellule CAR-T con funzionalità multimodale, rispetto a un prototipo standard CAR (Figura 3 e Figura 4). In questo modo, una piattaforma optofluidica fornisce mezzi per identificare rapidamente i prototipi candidati CAR che potrebbero avere il potenziale per aumentare la durata della remissione del cancro indotto dalle cellule CAR-T. Da notare che l'analisi dell'interazione tra cellule target ed effettrici a livello di singola cellula richiede un controllo cruciale di parametri chiave, ad esempio l'eterogeneità dell'espressione dell'antigene target sulle cellule tumorali e la purezza della popolazione di cellule CAR-T (Figura supplementare 2 e Figura supplementare 3).

Sebbene ci siamo concentrati sulla valutazione della secrezione di IL-2, TNF-α e IFN-γ, l'ampia gamma di analiti solubili rilevabili con pannelli di cattura multiplex di citochine disponibili in commercio consente una notevole personalizzazione del flusso di lavoro. Gli sviluppi recenti evidenziano che il campo sta anche progrediendo nella direzione della citometria a flusso ad alta dimensione, aprendo nuove possibilità di sinergie con il profiling funzionale dei diversi tipi di cellule^{immunitarie 12,13}. Ad esempio, applicazioni future potrebbero coinvolgere campagne di screening per identificare le cellule T regolatorie (Treg) che esprimono CAR polifunzionali. Questi secernono molteplici citochine antinfiammatorie come TGF-β e^IL-10-14. Pertanto, l'adattabilità di un sistema optofluidico potrebbe aprire la strada a intuizioni fondamentali man mano che le immunoterapie cellulari si espandono verso nuovi confini nel trattamento delle malattie non maligne.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nucleofectore 4-D	Lonza
Microsfere anti-biotina	Miltenyi Biotec	130-090-485
Dinabead CD3/CD28	Thermo Fisher	11131D
Kit di isolamento CD8+ T cell	Miltenyi Biotec	130-096-495
Tubi conici CELLSTAR da 15 ml (PP)	Greiner Bio-One	188271-N
Tubi conici CELLSTAR da 50 ml (PP)	Greiner Bio-One	227261
Corning 75cm e circa 2; Fiaschetta di coltura cellulare a forma di U con tappo di sigillatura	Corning	430720U
Piastre Costar trasparenti a 24 pozzi trattate con TC multiple, avvolte singolarmente, sterili	Corning	3526
Piastre a pozzetti multipli trattate con TC trasparenti a 48 pozzi, avvolte singolarmente, sterili	Corning	3548
DPBS, niente calcio, niente magnesio	Thermo Fisher	14190169
Magnete DynaMag-15	Thermo Fisher	12301D
EGFR (Erbitux, Cetuximab)	Eli Lilly	NDC 66733-948-23	per la coniugazione interna (biotin)
Anticorpo EGFR (C225 (Cetuximab)) [Alexa Fluor 647]	Novus Biologicals	NBP2-75903AF647
Siero bovino fetale, valore	Thermo Fisher	A5256801
Integratore GlutaMAX (100 volte)	Thermo Fisher	35050038
IL-2 IS umano, di qualità premium	Miltenyi Biotec	130-097-748
Siero Umano	Deutsches Rotes Kreuz (DRK)/ Croce Rossa Tedesca (GRC)	N/A
Colonna di separazione delle celle MACS, LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Kit 4D-Nucleofector X per cellula primaria P3	Lonza	V4XP-3032
Pancoll umano, densità: 1,077 g/ml	PanBiotech	P04-60500
Kit di rilevamento dell'apoptosi PE Annex V	BD in Biologia	559763
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml)	Thermo Fisher	15140122
Kit di biotinilazione e isolamento della superficie cellulare Pierce	Thermo Fisher	A44390
Kit di partenza QuadroMACS (LS)	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI 1640 Medium, Integratore Glutamasi, HEPES	Thermo Fisher	72400054
Pipette sierologiche 2, 5, 10, 25 e 50 ml	Greiner Bio-One	710180, 606180, 607180, 760180, 768180
Macchia blu di tripano (0,4%)	Thermo Fisher	15250-061
UltraPure 0,5  M EDTA, pH 8,0	Thermo Fisher	15575020
β-Mercaptoetanolo (50mM)	Thermo Fisher	31350010
Reagenti beacon
Lamiera a 96 pozzi con fondo rotondo	Corning	3799
Chip Beacon Plastic Flush		500-00030
Soluzione detergente BLI, ipocloite di sodio, 0,825%	Bruker	520-08000
Albumina Sirica Bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A4161
Anticorpo anti-umano Brilliant Violet 421 CD137 (4-1BB)	Biolegend	309820
Cloruro di calcio (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670
LEGENDplex Umano IFN-& gamma; Capture Beads B3, 13X	Biolegend	740545
LEGENDplex Human IL-2 Capture Bead A5, 13X	Biolegend	740934
Anticorpi di rilevamento del pannello Th LEGENDplex V02	Biolegend	741041
LEGENDplex Umano TNF-α Capture Bead B7, 13X	Biolegend	740711
LEGENDplex SA-PE	Biolegend	740452
Substrato Caspasi-3 NucView 530, 1 mM in DMSO	Hö Izel	B-10406
Chip OptoSelect 3500	Bruker	500-12001
Azida di sodio	Sigma-Aldrich	S2002
PREADOLESCENTI 20	Sigma-Aldrich	P1379
Cuscinetti per l'Esportazione Vegana	Bruker	520-00040
Bottiglie per media VWR, quadrata, PETG, 125ml	VWR	216-2265
Bottiglie VWR Media, Square, PETG, 500ml	VWR	216-2267
Additivo bagnante	Bruker	520-08016
Soluzione bagnante	Bruker	520-00009