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Articolo metodologico

Effetti terapeutici dell'estratto di Acorus calamus L. su lesioni cutanee indotte da radiazioni in un modello di ratto

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DOI:

10.3791/69705

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9 gennaio 2026

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1Department of Nuclear Medicine, General Hospital of Northern Theater Command, 2College of Medicine and Biological Information Engineering, Northeastern University, 3Shenzhen Institute for Advanced Study, University of Electronic Science and Technology of China

In questo articolo

Sommario

La lesione cutanea indotta da radiazioni è una complicanza comune e grave della radioterapia nei pazienti oncologici. Non esiste un trattamento clinico efficace. Questo protocollo valuta l'effetto terapeutico dell'estratto di Acorus calamus L. sulle lesioni cutanee indotte dalle radiazioni, con l'obiettivo di fornire nuovi candidati farmaci e strategie terapeutiche per la sua prevenzione clinica e il trattamento.

Abstract

La lesione cutanea indotta da radiazioni è una complicanza comune e debilitante nella terapia oncologica, spesso con conseguente ritardo nella guarigione delle ferite e un aumento del disagio del paziente. Ci sono alcuni farmaci terapeutici disponibili per la prevenzione o il trattamento. La Medicina Tradizionale Cinese, in particolare Acorus calamus L., ha mostrato potenziale nel trattamento di vari disturbi della pelle, ma la sua efficacia nelle lesioni cutanee indotte da radiazioni rimane poco esplorata.

Questo studio ha utilizzato un modello di ratto Sprague-Dawley esposto a radiazioni di 45 Gy per indurre lesioni cutanee. I ratti sono stati trattati con estratto di Acorus calamus L. al 10%, 20% e 40% per 45 giorni. La guarigione delle ferite, l'infiammazione, l'apoptosi e l'angiogenesi sono state valutate utilizzando i tassi di guarigione delle ferite, analisi istopatologica, misurazioni delle citochine, colorazione TUNEL e immunoistochimica. Il trattamento con Acorus calamus L. ha accelerato la guarigione delle ferite, con il gruppo a dosaggio medio che ha mostrato il tasso di guarigione più alto (88,97% a 45 giorni). L'analisi istopatologica ha rivelato una riduzione dell'infiammazione, un miglioramento dell'organizzazione del collagene e la formazione di nuovi vasi sanguigni. I livelli sierici di citochine infiammatorie (IL-1β, IL-6, TNF-α) sono stati significativamente ridotti e l'apoptosi è diminuita, con modulazione delle proteine apoptotiche chiave (P53, Bax, Bcl-2). L'espressione di VEGF e bFGF è stata aumentata, favorendo l'angiogenesi e la riparazione dei tessuti. Acorus calamus L. migliora la guarigione delle lesioni cutanee indotte dalle radiazioni riducendo l'infiammazione, inibendo l'apoptosi e favorendo l'angiogenesi. Questi risultati suggeriscono il suo potenziale come agente terapeutico per la gestione dei danni cutanei indotti dalle radiazioni, offrendo un'alternativa promettente per la gestione delle lesioni cutanee indotte dalle radiazioni in oncologia clinica. Sono necessari ulteriori studi per chiarirne i meccanismi molecolari.

Introduzione

La lesione cutanea indotta da radiazioni è una complicanza frequente e difficile sia di incidenti nucleari che di radioterapiatumorale 1. In radioterapia, circa il 95% dei pazienti sviluppa qualche grado di danno cutaneo, tra cui eritema, desquamazione, ulcere necrotiche ricorrenti, dolore persistente e un rischio aumentato di progressionemaligna 2. Queste lesioni sono spesso resistenti al trattamento, riducendo sostanzialmente la qualità della vita dei pazienti e talvolta rendendo necessaria l'interruzione della radioterapia, rappresentando così una grande sfida clinica nell'oncologiaradioterapica 3. I meccanismi sottostanti del danno cutaneo indotti dalle radiazioni sono complessi, coinvolgendo principalmente la produzione di radicali liberi nei tessuti cutaneo, che interrompono i processi cellulari e aggravano il processo diguarigione 4,5. Ciò comporta l'espressione prolungata di geni correlati all'apoptosi, risposte infiammatorie disregolate e vie di segnalazione alterate, tutti elementi che contribuiscono alla natura persistente delle ferite indotte daradiazioni 6.

Attualmente non esiste una terapia universalmente riconosciuta e standard d'oro per le lesioni cutanee indotte da radiazioni. La gestione clinica enfatizza gli approcci antinfiammatori oantiossidanti 7, in particolare corticosteroidi topici, che riducono le reazioni cutanee tramite effetti antinfiammatori, immunosoppressori e vasocostritivi, ma possono causare assottigliamento della pelle con un usoprolungato 8. L'amifostina, un agente radioprotettivo approvato dalla FDA, è limitata nell'uso clinico a causa degli effetti avversisignificativi 9. I fattori di crescita accelerano la guarigione della ferita promuovendo la proliferazione cellulare, l'angiogenesi e la formazione di tessuto di granulazione, ma le loro azioni sono ristrettamente focalizzate, offrono un controllo limitato sulle lesioni e infiammazioni dei tessuti profondi e comportano un rischio di iperplasiaeccessiva 7. Di conseguenza, la Medicina Tradizionale Cinese (MTC) ha attirato l'attenzione per la sua filosofia olistica, la presenza di molteplici componenti attivi con effetti terapeutici diversificati e un profilo di sicurezza favorevole. Studi precedenti hanno dimostrato che i prodotti naturali, come estratto di liquirizia, polisaccaridi di aloe e curcumina, alleviano l'infiammazione e i danni tissutali indotti dalle radiazioni eliminando radicali liberi, inibindo mediatori pro-infiammatori (TNF-α, IL-6) e favorendo la proliferazione deifibroblasti 10,11,12. Tuttavia, la maggior parte di queste indagini esamina composti attivi singoli o bersagli singoli, fornendo un'insufficiente comprensione dei meccanismi di azione sinergica multicomponente. Acorus calamus L., una pianta nota per le sue proprietà antinfiammatorie, antiossidanti, antibatteriche e cicatrizanti delle ferite, ha dimostrato potenziale in vari disturbi della pelle.

Acorus calamus L., un'erba perenne della famiglia degli Araneae, contiene diversi composti bioattivi, tra cui terpeni, fenilpropanoidi, flavonoidi, steroidi e alcaloidi. La sua composizione multicomponente consente un'azione simultanea su più bersagli, produendo effetti farmacologicisinergici 13. Gli studi dimostrano che inibisce le vie di segnalazione infiammatorie come NF-κB e MAPK e che regola alla bassa l'espressione dell'mRNA di fattori proinfiammatori, come TNF-α e IL-6, aumentando al contempo le attività degli enzimi antiossidanti come SOD e GSH-Px, esercitando così effetti antinfiammatori, antiossidanti eantibatterici14,15. Nonostante i suoi benefici documentati nel trattamento di condizioni cutanee causate da infezioni e allergie, il ruolo di Acorus calamus L. nelle lesioni cutanee indotte da radiazioni rimane poco esplorato. Studi recenti hanno dimostrato i suoi effetti protettivi contro i danni indotti dalle radiazioni, favorendo la guarigione delle ferite e riducendo l'infiammazione13. Tuttavia, i meccanismi terapeutici specifici di Acorus calamus L. nelle lesioni cutanee indotte da radiazioni non sono stati completamente chiariti.

L'obiettivo generale di questo studio è valutare gli effetti terapeutici dell'estratto di Acorus calamus L. in modelli animali di lesioni cutanee indotte da radiazioni. Valutiamo la guarigione delle ferite, le risposte infiammatorie e il comportamento cellulare per chiarire i meccanismi d'azione dell'estratto da molteplici prospettive. I risultati mirano a stabilire una base teorica per l'uso di Acorus calamus L. nella gestione clinica delle lesioni cutanee derivanti dalla radioterapia oncologica. Inoltre, lo studio presenterà le caratteristiche funzionali dell'estratto, scenari di intervento adatti e dati fondamentali sull'efficacia per aiutare i lettori a giudicare se questo approccio basato sul prodotto naturale completi le loro esigenze di ricerca o cliniche. In definitiva, questo lavoro cerca opzioni terapeutiche efficaci per migliorare la qualità della vita dei pazienti che ricevono radioterapia tumorale.

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Protocollo

Gli esperimenti sugli animali descritti in questo studio sono stati approvati dal Comitato Etico della Ricerca Medica Animale del Northern Theater Command General Hospital (Numero di Approvazione Etica: 2018-03). Per lo studio sono stati utilizzati maschi SD di grado SPF (6-8 settimane, peso 190-220 g). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Ospitare gli animali sperimentali

  1. Seleziona 108 ratti maschi SD con SPF, di età compresa tra 6 e 8 settimane e con un peso compreso tra 190 e 220 g.
  2. Mantieni la temperatura della stanza dell'animale a 22 ± 2 °C, l'umidità relativa al 50 ± 5% e un ciclo chiaro-buio di 12 ore. Permette ai ratti di avere accesso illimitato a cibo e acqua. Dopo un periodo di acclimatazione di una settimana, si procede agli esperimenti di follow-up.

2. Raggruppamento degli animali

  1. Assegnare casualmente i ratti in cinque gruppi distinti: gruppo normale (Normale, n = 18), gruppo modello (modello, n = 18), gruppi positivi (positivi, n = 18, crema di betametasone)16, gruppo sperimentale a bassa dose (Sperimentale-L, n = 18), gruppo sperimentale a dose media (Sperimentale-M, n = 18) e gruppo sperimentale ad alta dose (Sperimentale-H, n = 18). Ad eccezione del gruppo normale, tutti i gruppi sono stati esposti alle radiazioni.

3. Stabilire un modello animale di lesioni radioattive della pelle

  1. Somministrare l'anestesia con precisione e il minimo disagio tramite iniezione intraperitoneale (i.p.) di una soluzione pentobarbital di sodio all'1% (40 mg/kg). Conferma la profondità dell'anestesia osservando l'assenza del riflesso corneale e la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi. Applica una pomata sugli occhi dei ratti per prevenire la secchezza.
  2. Rimuovi i peli posteriori dei ratti con un rasoiatore. Poi disinfetta la zona posteriore con iodio e alcol al 75%.
  3. Metti ogni ratto in posizione prona. Fissare l'irradiatore a 32P-β (tasso di dosaggio superficiale: 0,9 Gy/min) sulla regione spinale bilaterale (2 cm × 2 cm di area) centrata lateralmente a 1 cm rispetto alla linea mediana, assicurando che la fonte entri in contatto con l'epidermide senza spazi interruti. Fissare l'applicatore con nastro medico sterile per evitare lo spostamento durante l'irradiazione. Irradiare l'area cutanea bersaglio per 50 minuti per ottenere una dose totale assorbita di 45 Gy17.
  4. Una volta che il ratto riprende conoscenza dopo l'irradiazione, si riporta nella sua gabbia individuale, assicurando l'accesso ad libitum ad ubrio ad itum ad acqua e cibo, mantenendo la temperatura a 22 ± 2 °C, l'umidità relativa al 50 ± 5% e un ciclo di 12 ore chiaro-buio.
    NOTA: Il processo sperimentale deve aderire rigorosamente ai principi stabiliti della protezione biologica e radioattiva del lavoro. Inoltre, tutte le procedure operative devono seguire le linee guida per lo smaltimento corretto e conforme dei rifiuti medici e radioattivi per garantire la sicurezza e la salute di tutto il personale coinvolto.

4. Preparazione dell'estratto di Acorus calamus L. e amministrazione dei farmaci

  1. Pesa i rizomi di Acorus calamus L., assicurati una pulizia accurata, lascia asciugare all'aria e macina fino a ottenere una polvere grossolana (40 mesh). Incorporare 10-20 volumi di etanolo al 50% e omogeneizzare a temperatura ambiente per 24 ore
  2. Dopo aver lasciato sedimentare l'estratto per 30 minuti, si decanta il soprantantante e si effettua la filtrazione preliminare attraverso 4-8 strati di garza per eliminare impurità grossolane. Successivamente, si filtra con carta filtrante ed evapora il filtrato a pressione ridotta in un evaporatore rotativo a 50-60 °C per recuperare il solvente, ottenendo un residuo solido privo di solvente (AE, con un contenuto di umidità < 5%).
  3. Preparazione dell'unguento AE18
    NOTA: Formulare pomate per estratto di Acorus calamus L. al 10% (Sperimentale-L, c/w), 20% (Sperimentale-M, c/w) e 40% (Sperimentale-H, a w/w) in conformità con l'Edizione 2020 della Farmacopea Cinese (Capitolo Generale 0109)19.
    1. Pesare accuratamente l'AE (ad esempio, 20 g per unguente al 20%) e il corrispondente petrolato di grado farmaceutico (ad esempio, 80 g per unguente al 20%).
    2. Aggiungere il 10% del petrolato totale all'AE, triturare vigorosamente per 5 minuti per formare una pasta omogenea (metodo di diluizione geometrica, assicurando che l'AE si disperda uniformemente nella base lipofila).
    3. Fondi il petrolatum rimanente a 60 °C, raffredda fino a 55 °C e aggiungi lentamente alla pasta di AE-petrolatum.
    4. Mescolare magneticamente a 250 giri/min per 30 minuti a 55 °C, poi mescolare continuamente raffreddandosi a temperatura ambiente per ottenere una pomata liscia e priva di particelle.
    5. Preparazione del controllo a vuoto: fondere petrolatum a 60 °C, mescolare a 250 giri/min per 30 minuti e raffreddare a temperatura ambiente (identico alla base dell'unguento AE).
    6. Conserva tutte le pomate e il petrolato bianco a 4 °C in contenitori sterili sigillati.
  4. Tutti i gruppi sono stati somministrati topicamente due volte al giorno alle 09:00 e alle 17:00 per 45 giorni consecutivi dopo l'irradiazione (il gruppo normale, non irradiato, ha ricevuto lo stesso schema di somministrazione in sincronia). La dose applicata è stata di 0,2 g/cm², distribuita uniformemente su un'area di pelle dorsale di 2 cm × 2 cm. Il gruppo normale riceveva veicolo (petrolato), mentre il gruppo modello riceveva veicolo (petrolato). Il gruppo di controllo positivo ha ricevuto una crema per betametasone. I gruppi sperimentali L, M e H hanno ricevuto creme contenenti AE rispettivamente al 10%, 20% e 40% (a settimana). Dopo ogni applicazione, l'area trattata veniva massaggiata delicatamente per 10 secondi per migliorare l'assorbimento, e i ratti venivano trattenuti per 5 minuti per evitare di essere leccati.

5. Raccolta di tessuto cutaneo e sangue di ratto

  1. Anestetizzare i ratti usando una soluzione di pentobarbital al sodio all'1% (40 mg/kg, i.p.). Disinfettare gli strumenti chirurgici e rimuovere la pelle lungo il sito della ferita.
  2. Fissare una porzione del tessuto con paraformaldeide al 4% (10 mL), un'altra porzione in glutaraldeide/terossido di osmio (5 mL, 2,5%) e conservare il resto in azoto liquido per ulteriori analisi (vedi Tabella dei Materiali).
  3. Raccogli campioni di sangue dall'aorta addominale del ratto. Centrifugare a 3.000 × g a 4 °C per 15 minuti; aspirare il sovrantato nei tubi EP; aliquota e conserva a -80 °C.

6. Valutazione della guarigione

  1. Osserva la ferita nei giorni 7, 15, 30 e 45 dopo l'irradiazione e scatta immagini della superficie della ferita con una telecamera ad alta definizione. Importare le immagini in ImageJ e disegnare l'area della ferita lungo il bordo della ferita. Calcola l'area nell'immagine. Assicurarsi che ogni operazione sia coerente per evitare errori di misurazione. Calcola il tempo di guarigione e la velocità di guarigione.
    NOTA: Tasso di guarigione della ferita (%) = (Area irradiata iniziale - Area della ferita non guarita) / Area irradiata iniziale. Criteri per la guarigione della ferita: La guarigione completa è definita come area crosta < il 5% dell'area della ferita o area guarita > il 95% dell'area della ferita. Area iniziale irradiata: l'area della ferita misurata al momento in cui gli animali irradiati presentavano una ferita stabile (una linea di base).

7. Esame di microscopia elettronica

  1. Campionamento rapido e fissazione dei tessuti
    1. Utilizzare una lama affilata per rimuovere un blocco di tessuto cutaneo di 1 mm³, che comprende lo strato epidermide-derma.
    2. Immergi immediatamente il campione in un tampone fosfato di glutaraldeide al 2,5% pre-raffreddato (0,1 M, pH 7,4) a 4 °C per 24 ore per fissarla.
  2. Lavaggio del tampone
    1. Effettuare tre lavaggi con 0,1 M fosfato tampone (pH 7,4), prevedendo 15 minuti per ogni lavaggio.
  3. Post-fissazione
    1. Trasferire il campione a una soluzione di tetrossido di osmio all'1% a 4 °C per una fissazione della durata di 1,5 ore.
  4. Disidratazione per gradiente
    1. Passa progressivamente attraverso concentrazioni di acetone del 50%, 70%, 80%, 90% e 100%, assegnando 15 minuti a ogni passaggio.
    2. Ripeti il trattamento con acetone al 100% tre volte, con ogni immersione della durata di 10 minuti.
  5. Incorporamento in resina epossidica
    1. Immergi il campione in una miscela 2:1 di acetone e resina epossidica per 2 ore, seguita da un'immersione notturna in resina epossidica pura.
    2. Polimerizzare il campione a 60 °C per 48 ore per formare un blocco solido.
  6. Sezionamento e colorazione
    1. Produrre sezioni ultrasottili da 70 nm usando un ultramicrotomo.
    2. Tingi con acetato di uranio per 15 minuti, poi con citrato di piombo per 5 minuti a 60 °C.

8. Colorazione con ematossilina-eosina (HE)

  1. Eseguire l'embedding della paraffina
    1. Esporre campioni cutaneo, disidratare usando un gradiente alcolico (ad esempio, 70%, 80% e 95% etanolo, ciascuno per 15 minuti, seguiti da due cambiamenti di etanolo al 100%, ciascuno per 15 minuti), e successivamente trasferiti allo xilene finché il tessuto non raggiunge uno stato traslucido.
    2. Immergi nella paraffina per assicurare l'immersione, poi permette la solidificazione.
  2. Esegui la dewaxing e la reidratazione
    1. Immergi le sezioni di paraffina nello xilene I/II per 10 minuti ciascuna.
    2. Risciacquo lo xilene con etanolo al 100%, poi immergi nel 95% di etanolo per 3 minuti, all'80% etanolo per 3 minuti, al 70% etanolo per 3 minuti, e infine risciacqua con acqua distillata.
  3. Condotta la colorazione nucleare dell'ematossilina
    1. Immergi nella soluzione di ematossilina di Harris per 7 minuti a temperatura ambiente.
    2. Sciacquare sotto acqua corrente per 10 minuti finché non appare la colorazione blu.
  4. Differenziazione e controcolorazione implementata
    1. Differenziare usando acido cloridrico all'1% in etanolo per 3 secondi (osservare la chiarezza nucleare al microscopio).
    2. Controtindi con una soluzione di ammoniaca allo 0,5% per 30 secondi.
  5. Eseguire la controcolorazione con eosina
    1. Colorare con una soluzione di eosina allo 0,5% (contenente acido acetico glaciale all'1%) per 90 secondi.
    2. Risciacquo rapidamente con acqua distillata per 5 secondi per rimuovere l'eccesso di macchia.
  6. Esegui disidratazione e pulizia
    1. Passa sequenzialmente attraverso 70%, 80%, 95%, 100% etanolo I/II (1 min ciascuno).
    2. Trasparentare con xilene I/II per 2 minuti ciascuno.
  7. Applicare sigillatura e osservazione
    1. Applica resina neutra a gocce, poi copri con una copertura.
    2. Asciugare in forno a 60 °C per 30 minuti prima dell'esame microscopico.

9. Colorazione tricroma di Masson

  1. Esegui la dewaxing di routine in modo simile alla colorazione pre-HE.
  2. Colorazione nucleare
    1. Lascia in ammollo nella soluzione di ematossilina per 10 minuti.
    2. Sciacquare con acqua corrente per 5 minuti finché la tinta blu non torna attivata.
  3. Colorazione delle fibre di collagene
    1. Immergi in una miscela di Alizarina Rossa e Fucisina Acida per 5 minuti.
  4. Differenziazione degli acidi fosfomolibidesi
    1. Trasferire in una soluzione acquosa acida fosfomolibdica all'1% per 1 minuto.
  5. Controcolorazione delle miofibre
    1. Trasferisci direttamente in una soluzione blu anilina al 2,5% per 5 minuti.
    2. Risciacquo rapidamente con una soluzione acquosa acido acetico glaciale allo 0,5% per 5 secondi.
  6. Disidratazione e montaggio
    1. Eseguire la disidratazione con etanolo gradiente: 95% etanolo I, 100% etanolo II (30 s ciascuno).
    2. Pulire con xilene.
    3. Montare con resina neutra, asciugare a 60 °C e successivamente esaminare al microscopio.

10. Rilevamento ELISA dei livelli di IL-1β, IL-6 e TNF-α

NOTA: IL-1β, IL-6 e TNF-α sono importanti citochine pro-infiammatorie comunemente utilizzate per valutare sia la presenza che l'intensità dell'infiammazione. Monitorare i loro livelli è fondamentale per ottenere una comprensione dei processi infiammatori e per determinare l'efficacia dei trattamenti antinfiammatori.

  1. Prepara i campioni di siero
    1. Segui il protocollo descritto nel Passo 5.3 per raccogliere campioni di siero.
  2. Standard e campioni diluiti
    1. Creare una diluizione gradiente degli standard utilizzando il diluente campione; diluire i campioni di siero in un rapporto di 1:4.
  3. Aggiungi campioni e incuba
    1. Introdurre 100 μL dello standard/campione in ogni pozzo; coprire i pozzi con una membrana; incubare a 37 °C per 90 minuti; Poi scarta il liquido e asciuga i pozzi.
  4. Rilevare la reazione anticorpo-enzima
    1. Erogare 100 μL di reagente marcato con enzimi specifico per IL-1β, IL-6 e TNF-α in ciascun pozzo; incubare a 37 °C per 60 minuti; rimuovere il liquido e asciugare con i tamponi; lavare la piastra quattro volte con 200 μL di tampone di lavaggio.
    2. Aggiungere 100 μL di soluzione lavorativa streptavidina-HRP (diluizione 1:100) a ciascun pozzo; incubare a 37 °C al buio per 30 minuti; lavare la piastra quattro volte con 200 μL di tampone di lavaggio.
  5. Sviluppare colore e terminare
    1. Introdurre 100 μL di soluzione substratale TMB in ciascun pozzo; incubare a temperatura ambiente al buio per 10 minuti; successivamente si aggiungono 50 μL di soluzione di stop a ciascun pozzo.
  6. Dati di lettura
    1. Misurare l'assorbanza a 450 nm (con una lunghezza d'onda di calibrazione di 630 nm) utilizzando un lettore di immunosorbente legato a enzimi entro 30 minuti; calcolare la concentrazione (pg/mL) utilizzando la curva standard.

11. Saggio TUNEL

  1. Pretrattamento della sezione
    1. Dewax e disidratano le sezioni di paraffina fino a raggiungere l'acqua distillata.
    2. Introdurre una soluzione operativa di proteinasi K a una concentrazione di 20 μg/mL e incubare a 37 °C per 20 minuti.
    3. Lava le sezioni tre volte con PBS, ogni lavaggio dura 2 minuti.
  2. Reazione di etichettatura
    1. Applicare la miscela di reazione TUNEL contenente l'enzima TdT e dUTP marcato con fluoresceina.
    2. Incubare in una camera umidificata a 37 °C al buio per 60 minuti.
  3. Conversione del segnale
    1. Lava tre volte con PBS, lasciando 5 minuti per ogni lavaggio.
    2. Introdurre un anticorpo anti-fluoresceina marcato con HRP a una diluizione di 1:500.
    3. Incubare a 37 °C per 30 minuti.
  4. Sviluppo cromogenico DAB
    1. Dopo il lavaggio con PBS, applicare la soluzione cromogenica DAB e monitorare lo sviluppo al microscopio per 1-3 minuti.
    2. Ferma la reazione usando acqua distillata.
  5. Controcolorazione e montaggio
    1. Controcolora i nuclei con ematossilina per 1 minuto.
    2. Disidratare con etanolo graduato, trasparentare con xilene e montare con resina neutra.
  6. Interpretazione del risultato
    1. Identificare i nuclei apoptotici come marrone-giallo, mentre i nuclei normali appaiono blu.
    2. Seleziona casualmente cinque campi ad alta potenza (400×) per ogni diapositiva per calcolare il tasso di apopttosi.

12. Colorazione immunoistochimica

  1. Dewaxing e prelievo di antigeni
    1. Immergi le sezioni di paraffina in Xylene I per 10 minuti, poi trasferisci su Xylene II per altri 10 minuti. Successivamente, disidratare usando una serie di etanolo gradiente, iniziando con 5 minuti in etanolo 100% I, seguiti da 5 minuti in etanolo II al 100%, 3 minuti ciascuno in etanolo 95%, 80% e 70%, e infine risciacquare con acqua distillata per 2 minuti.
    2. Eseguire la riparazione termica ad alta pressione con 0,01 M di citrato di sodio a pH 6,0, mantenendo una temperatura di 121 °C per 3 minuti.
  2. Bloccare l'interferenza endogena
    1. Introdurreuna soluzione al 3% diH2O2 a temperatura ambiente per 10 minuti per inattivare gli enzimi endogeni.
    2. Applicare una soluzione bloccante al 5% di BSA sul tessuto e incubare in una camera umidificata a 37 °C per 45 minuti; aspira eventuali soluzioni bloccanti in eccesso senza risciacquare.
  3. Incubazione degli anticorpi
    1. Somministrare una soluzione bloccante al 5% di BSA e incubare a 37 °C per 30 minuti.
    2. Aggiungere la soluzione primaria di lavoro degli anticorpi alla concentrazione ottimizzata (ad esempio, P53, Bax, Bcl-2, VEGF e bFGF) e incubare durante la notte in una camera umidificata a 4 °C; lavare tre volte con il tampone PBS-T contenente 0,1% Tween-20 per 5 minuti ciascuno.
    3. Introdurre un anticorpo secondario marcato con HRP diluito 1:200; incubare in una camera umidificata a 37 °C per 60 minuti; lavare tre volte con il tampone PBS-T per 5 minuti ciascuna. Poi, aggiungi la soluzione coniugata ABC e incuba a 37 °C per 30 minuti, seguita da tre lavaggi con PBS buffer per 5 minuti ciascuno.
  4. Sviluppo del colore DAB
    1. Aggiungi una soluzione di sviluppo DAB contenente 0,02% H₂O₂ e monitora lo sviluppo al microscopio a temperatura ambiente per 1-4 minuti.
    2. Interrompi immediatamente la reazione con acqua distillata.
  5. Controcolorazione e montaggio
    1. Immergi il campione nella soluzione di ematossilina di Harris per 1 minuto e risciacqualo con acqua corrente per 10 minuti per ottenere il recupero del blu.
    2. Immergi sequencialmente nelle seguenti soluzioni: 70% etanolo per 30 secondi, 80% etanolo per 30 secondi, 95% etanolo per 30 secondi, 100% etanolo I per 1 minuto e 100% etanolo II per 1 minuto.
    3. Per una pulizia completa e fissazione, immergi nello xilene I per 2 minuti, poi trasferisci allo xilene II per 2 minuti. Aggiungi la resina neutra da montare a goccia, copri con un copertino e asciuga in forno a 60 °C per 30 minuti.
  6. Quantificazione dei risultati
    1. Un colore marrone indica una reazione positiva; I segnali positivi (marrone-giallo) devono essere contrapposti al fondo negativo.
    2. Utilizza il software Image-Pro Plus per calcolare la percentuale di celle positive in almeno 5 campi visivi.

13. Rilevamento del Western blotting

  1. Preparazione della lisi tissutale
    1. Introdurre tessuto cutaneo liquido congelato dall'azoto in una malta in acciaio inox pre-raffreddato a -80 °C; aggiungere gradualmente azoto liquido in tre incrementi per mitigare la vaporizzazione; macinare in modo verticale finché tutte le particelle non sono più visibili; trasferire la polvere risultante in un tubo EP contenente il tampone di lisi.
    2. Incorporare inibitori della proteasi (1:100) e inibitori della fosfatasi (1:50); vortice sul ghiaccio per 30 secondi; condurre interruzioni ultrasoniche; incubare a 4 °C in un incubatore a scuotimento per 2 ore; centrifuga a 4 °C, 14.000 × g per 20 minuti; aspira con cura il surnadante.
  2. Quantificazione e lavorazione delle proteine
    1. Dispensare 5 μL del sovrantantante in una piastra a 96 pozzi; aggiungere 200 μL di soluzione di lavoro BCA; incubare a 37 °C al buio per 30 minuti; misurare l'assorbenza a 562 nm usando un lettore di microplacche; determina la concentrazione secondo la curva standard.
    2. Combinare 5× Ridotto Protein Loading Cushioner con la soluzione proteica in un rapporto 4:1; denatura mettendo in un bagno d'acqua bollente per 15 minuti; conserva a -20 °C per un uso futuro.
  3. Elettroforesi SDS-PAGE
    1. Prepara un gel risolvente al 12% di acrilammide; versare il gel finché non raggiunge 1 cm sotto i denti del pettine; coprire con isopropanolo per prevenire l'esposizione all'aria; dopo la solidificazione, rimuovere l'isopropanolo; versare un gel concentrante al 4%; inserire un pettine da 15 pozzi; lasciare la solidificazione a temperatura ambiente per 30 minuti; aggiungere 5 μL di marcatore proteico pre-colorato al pozzo di carico 1; aggiungere 20 μL di lisato vuoto al pozzo 2; aggiungere 10 μL di campione contenente 40 μg di proteine in ciascun pozzo da 3 a 14.
    2. Avviare l'elettroforesi a 80 V; passare a 120 V quando il blu di bromofenolo migra nel gel separante; mantenere una temperatura di 10-15 °C con circolazione di acqua ghiacciata; Scorre finché il blu di bromofenolo non raggiunge 0,5 cm dal fondo del gel.
  4. Procedura di lubrificazione umida
    1. Preparare un tampone di trasferimento contenente il 20% di metanolo; preraffreddamento a 4 °C. Attiva la membrana PVDF immergendola nel metanolo per 1 minuto; bilanciare la membrana NC in buffer. Assemblare la morsa di trasferimento in quest'ordine: "Piastra catodica - Tampone spugna - Carta filtrante - Gel - Membrana - Carta filtrante - Tampona spugna - Piastra anodica"; rimuovere accuratamente le bolle con un rullo; impostare parametri secondo il peso molecolare della proteina bersaglio: per proteine < 50 kDa, utilizzare un trasferimento costante di tensione a 100 V per 60 minuti; per proteine da 50 a 100 kDa, applicare un trasferimento a corrente costante a 250 mA per 90 minuti; per proteine > 100 kDa, implementare un trasferimento di corrente costante a 300 mA per 120 minuti; collegati a un bagno d'acqua circolante a 4 °C.
  5. Procedura di immunodeteczione
    1. Dopo il trasferimento, immergi la membrana PVDF nel metanolo per 1 minuto; lavare tre volte con TBST per 5 minuti ciascuno; coprire la superficie della membrana con il 3% di H₂O₂/TBST; incubare a temperatura ambiente al buio per 15 minuti; aspirare il liquido; aggiungere una soluzione bloccante al 5% di BSA/TBST; bloccare per 1 ora in un incubatore a 37 °C a scuotere; Lava la membrana tre volte con TBST per 5 minuti ciascuna.
    2. Aggiungere la soluzione primaria di lavoro degli anticorpi (come P53, Bax, Bcl-2, VEGF e bFGF); incubare durante la notte a 4 °C in un incubatore a tremare; lavare la membrana quattro volte con TBST per 10 minuti ciascuna; aggiungere anticorpi secondari marcati con HRP; incubare su un incubatore a temperatura ambiente per 90 minuti; lavare la membrana sei volte con TBST + SDS 0,5% per 8 minuti ciascuno.
  6. Imaging chemioluminescenza
    1. Mescolare volumi uguali di soluzioni ECL A e B; rivestono uniformemente la superficie della membrana; permettere che la reazione avvenga al buio per 60 secondi; aspirare qualsiasi liquido in eccesso; impostare un tempo di esposizione singolo tra 1 e 5 secondi per le proteine segnali forti; eseguire esposizione cumulativa in cinque segmenti (10/30/60/120/300 s) per proteine segnali deboli; cattura immagini utilizzando un imager a chemiluminescenza.
  7. Flusso di lavoro per l'analisi dei dati
    1. Quantificare le proteine utilizzando il software ImageJ; stabilire una soglia uniforme di sottrazione di fondo; calcolare il rapporto in scala di grigi della proteina target rispetto alla proteina di riferimento (β-actin o GAPDH)
    2. Importare i dati in GraphPad Prism per l'analisi.

14. Analisi statistica

  1. Presentare i dati tramite media ± errore standard di media. Utilizzare campioni indipendenti test t per confronti tra due gruppi e utilizzare ANOVA unidirezionale per confronti tra più gruppi.
  2. Analizza i dati utilizzando SPSS 26.0 e GraphPad Prism 8.0.2.
  3. Consideriamo P < 0,05 come indicativo di differenze statisticamente significative.

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Risultati

Effetto terapeutico di Acorus calamus L. sulle lesioni cutanee indotte da radiazioni
15 giorni dopo l'irradiazione, tutti i gruppi di ratti hanno mostrato squamazione secca, arrossamento localizzato, gonfiore, ulcerazioni e croste. A 30 giorni dall'irradiazione, il gruppo modello ha mostrato il danno cutaneo più grave, con croste e ulcerazioni nel sito irradiato che hanno raggiunto il loro picco. A 45 giorni, il gruppo modello mostrò una minima caduta di croste e la ferita presentò una certa contrazio...

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Discussione

La lesione cutanea indotta dalle radiazioni rimane una delle complicazioni più comuni e difficili nella radioterapia clinica del cancro. Essendo l'organo più grande e il primo bersaglio delle radiazioni, la pelle è suscettibile a danni causati da radicali liberi e specie reattive dell'ossigeno prodotte dalle radiazioni, che possono compromettere le funzioni cellulari, inclusa divisione cellulare, migrazione e differenziazione, portando infine a un ritardo nella guarigione delle ferite e ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal Piano Congiunto del Piano Scientifico e Tecnologico della Provincia di Liaoning (Progetto di Attaccamento Tecnico) (2024JH2/102600273) e dal Progetto di Ricerca Indipendente (ZZKY2024001, ZZKY2024002, ZZKY2024003) del Northern Theatre General Hospital.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione di fissazione al 4% di paraformaldeideBeyotime Biotech Inc (Beyotime), CinaP0099
Estratto di Acorus calamus L.Preparati internamenteN/A   Il protocollo di preparazione dettagliato è descritto nella Sezione 4 del Protocollo.
Anticorpi anti-Bax & nbsp;  Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Cina)GB11690
Anticorpo anti-Bcl-2Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Cina)GB113375
Anticorpi anti-bFGFProteintech Group, Inc. (Wuhan, Hubei, Cina)11234-1-AP
Anticorpi anti-P53  Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Cina)GB111740
Anticorpi anti-VEGF  Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Cina)GB111971
Kit per il Saggio Proteico BCA  Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Cina)G2026-200T
Crema di Betametasone  United Pharmaceutical Co., Ltd. (Cina)N/A Concentrazione: 0,1% a < br/> Approvazione Nazionale del Farmaco n.: H19994057
EtanoloShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.E111991Utilizzato come solvente per l'estrazione dell'estratto di Acorus calamus L.
Sistema di imaging a gel e blotBio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)ChemiDoc MP
Kit per colorazioni con ematossilina-eosinaBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., (Pechino, Cina) e nbsp;  G1120
HRP coniugata Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Cina)GB23303
Microscopio a fluorescenza invertitaOlympus Corporation (Tokyo, Giappone)IX83   
Masson' s Trichrome Stain KitBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., (Pechino, Cina) e nbsp;  G1340
Microplate Reader (per assorbimento, fluorescenza e rilevamento della luminescenza)Dispositivi Molecolari (San Jose, CA, USA)SpectraMax iD3
petrolatoSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, Cina)N/A   Petrolato bianco di qualità farmaceutica; Punto di fusione: 45-60 °C; C  Approvazione Nazionale dei Farmaci N.: H31022350
Rat IL-1 e beta; Kit ELISA & nbsp;  Beyotime Biotech Inc (Beyotime), CinaPI303
Rat IL-6 ELISA Kit    Beyotime Biotech Inc (Beyotime), CinaPI328
Ratto TNF-α Kit ELISA & nbsp;  Beyotime Biotech Inc (Beyotime), CinaPT516
Kit di rilevamento dell'apoptosi per cellule TUNEL (DAB)Beyotime Biotech Inc (Beyotime), CinaC1091

Riferimenti

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