Analisi del DNA microbico sul campo utilizzando un kit di estrazione biologica sul campo e un'unità qPCR sul campo

Summary

Forme affidabili e accurate di analisi del DNA dispiegabile sul campo sono fondamentali per molti settori. Questo articolo offre due metodi per l'analisi microbica ambientale sul campo: 1) l'isolamento del DNA microbico da campioni ambientali utilizzando un kit di estrazione biologica sul campo, e 2) l'analisi del DNA tramite l'unità qPCR di campo.

Abstract

Con l'adozione più ampia della PCR quantitativa (qPCR) in diversi settori, la capacità di estrarre e analizzare il DNA in contesti remoti senza ostacoli logistici sta diventando essenziale. Un esempio chiaro è la necessità di strumenti semplici per quantificare i batteri degradanti contaminanti in siti remoti colpiti da deragliamenti di treni o rilasci di petrolio, consentendo una valutazione tempestiva del rischio e dell'impatto ambientale. Per raggiungere questo obiettivo in modo affidabile, i processi devono essere portatili e leggeri, facili d'uso per i non scienziati, resistenti alla contaminazione e in grado di fornire risultati rapidi mantenendo comunque un rigoroso controllo di qualità. Sebbene esistano da anni opzioni sia per l'estrazione degli acidi nucleici sia per l'analisi qPCR al di fuori del laboratorio, solo recentemente i progressi tecnologici hanno permesso lo sviluppo di sistemi dispiegabili sul campo capaci di prestazioni affidabili e accurate. In questo studio, dimostriamo l'uso di un kit di estrazione del DNA da campo abbinato a strumenti qPCR portatili in condizioni ambientali realistiche. Le prove sul campo condotte a temperature esterne ambientali di circa 30 °C hanno dimostrato rese di DNA ed efficienze di amplificazione paragonabili a quelle ottenute in ambienti di laboratorio controllati. È importante sottolineare che i risultati ottenuti sul campo hanno dimostrato una sensibilità e una riproducibilità equivalenti, confermando che i flussi di lavoro portatili possono fornire dati di alta qualità senza la necessità di infrastrutture di laboratorio convenzionali. Questi risultati evidenziano il potenziale di analisi molecolari decentralizzate che ampliano la portata della qPCR in contesti remoti e con risorse limitate, mantenendo al contempo l'accuratezza e l'affidabilità richieste per il processo decisionale.

Introduction

Quando si considerano analisi di biologia molecolare, come la qPCR, ci sono diverse limitazioni nella gestione del campione. Un esempio chiaro è la domanda di strumenti semplici e affidabili per quantificare i batteri degradanti contaminanti in siti remoti colpiti da deragliamenti di treni o rilasci di petrolio, supportando una valutazione tempestiva del rischio e dell'impatto^ambientale 1,2,3,4,5. La limitazione principale è che, indipendentemente da quanto freddo si mantenga il campione, le comunità microbiche possono (e lo faranno) cambiare nel^{tempo 6,7}. Per garantire che i dati riflettano accuratamente l'ambiente originale da cui sono stati raccolti i campioni, si raccomanda che il DNA venga estratto da tali campioni entro 24 ore^{e 8}. Per un ingegnere che raccoglie campioni microbici su una piattaforma petrolifera offshore, o per uno scienziato nel profondo di una foresta pluviale, questa linea temporale non è fattibile. Portare un campione d'acqua o suolo da uno di questi luoghi remoti a una compagnia di spedizioni nello stesso giorno e poi inviarlo con una notte in laboratorio (mantenendo il refrigero), dove il DNA può essere estratto prima dell'analisi, è semplicemente impossibile.

Una volta estratto il DNA, l'orologio si ferma e l'intera informazione genetica del campione viene preservata indefinitamente con tecniche di conservazione^{adeguate 9}. Questo rende il DNA estratto incredibilmente unico rispetto alla stragrande maggioranza dei campioni chimici, metallurgici e biologici - la maggior parte dei quali ha una durata limitata. Il DNA archiviato può essere recuperato anni o decenni dopo e analizzato per nuovi obiettivi su nuove piattaforme. Per questo motivo, è fondamentale che il DNA estratto rappresenti davvero la comunità microbica originale, e non quella modificata a causa del transito ritardato.

Inoltre, la necessità di un laboratorio di estrarre e analizzare i campioni limita notevolmente sia la flessibilità che la coerenza nei programmi di campionamento. Il costo della logistica da solo può essere proibitivo per alcuni^{progetti 10}. La capacità di analizzare campioni, quantificando con precisione i bersagli genetici di interesse entro ore o addirittura minuti dopo il campionamento, apre molte porte a progetti ambientali in tutto il mondo.

Protocol

NOTA: Il seguente protocollo è stato eseguito utilizzando un Bio-Extract Kit (kit di estrazione biologica sul campo) e il FieldQuant qPCR (qPCR basato sul campo).

1. Campionamento di biomassa dalle acque sotterranee e un protocollo di isolamento del DNA utilizzando un filtro incapsulato e un kit di estrazione biologica

1. Indossa guanti e occhiali di sicurezza per tutti i passaggi del primo passo.
2. Preparare la pompa peristaltica e il tubo e purgare il pozzo utilizzando una purga a volume standard, seguendo la guida¹¹ per il campionamento delle acque sotterranee dell'Agenzia per la Protezione Ambientale (EPA).
3. Rimuovere il filtro incapsulato, l'adattatore, la pinza e i tappi dal tubo centrifuga fornito (Figura 1).
4. Fai passare il tubo (1/4-5/16 in diametro interno [I.D.]) attraverso la pinza fornita e stringi la morsa per fissare il tubo all'adattatore di bloccaggio (Figura 2).
5. Collega l'ingresso del filtro all'adattatore Luer-Lock installato nel passaggio precedente.
6. Posiziona il filtro all'interno di un contenitore ricevente in modo che la quantità d'acqua filtrata possa essere misurata con precisione.
7. Filtra fino a 1 L d'acqua utilizzando bassi flussi (<0,5 L/min). La quantità d'acqua filtrata varia a seconda della torbidità dell'acqua.
   1. Se il filtro si intasa prima che 1 L venga filtrato, fermati e prosegue con il passaggio successivo.
      NOTA: L'analisi del DNA è sensibile e può essere eseguita con solo 10 mL, a seconda della biomassa del sistema.
8. Registra manualmente il volume che è passato attraverso il filtro in millilitri (mL). Getta via l'acqua filtrata.
9. Tappa il filtro su entrambe le estremità. Assicurati che l'estremità più sottile sia chiusa con il tappo rosso e quella più spessa con il tappo bianco Luer-Lock.
10. Rimetti il filtro nel tubo di plastica fornito.
11. Attacca l'etichetta al tubo della centrifuga e annota la quantità d'acqua che è passata attraverso il filtro, la posizione, la data di campionamento e le analisi richieste. Conserva a 1-4 °C fino all'estrazione.
    NOTA: I filtri devono essere estratti entro 24 ore dal campionamento.
12. Utilizzando le salviette per preparazione alcolica incluse, pulisci una superficie piana che può essere usata per l'estrazione (ad esempio, una tavola di legno, portellone del camion, ecc.)
13. Per estrarre il DNA, disponi tutti i componenti del campo di estrazione biologica Kit sulla superficie piatta e pulita (Figura 3).
    1. Sblocca entrambe le estremità del filtro e metti da parte i tappi per usarli più tardi. Trova e apri una delle siringhe da 3 mL incluse nel kit. Prendi aria nella siringa da 3 mL e collegala al filtro tramite la connessione di blocco Luer.
    2. Spingi l'aria fuori dalla siringa per spingere fuori l'acqua residua dal filtro. Scollega la siringa e tira più aria prima di ripetere.
    3. Ripeti più volte, assicurandoti che venga spinta fuori dal filtro quanta più acqua possibile. Ricappucchia il tappo rosso della presa.
14. Inverti più volte la siringa chiusa Soluzione A per assicurarti che sia ben miscelata. Rimuovi il tappo della siringa che blocca i luer.
15. Collega la siringa della Soluzione A all'ingresso del filtro incapsulato da 0,2 μm tramite la punta di bloccaggio del luer e aggiungi lentamente tutta la Soluzione A premendo lo stantuffo. Spingere troppo velocemente può causare la formazione di contropressione, quindi assicurati di abbassare lentamente lo sturalavandini. Se l'ostruzione del filtro impedisce l'aggiunta della Soluzione A, rimuovi il tappo rosso dell'uscita del filtro e riprova. Ricappucchio il filtro.
16. Agita vigorosamente il filtro chiuso per 5 minuti.
    NOTA: Per prevenire la fatica, si possono preparare più campioni fino a questo passaggio e tutti possono essere stretti a mano contemporaneamente. Se disponibile, può essere utilizzato un miscelatore a vortice ricaricabile per eseguire questo passaggio invece di stringere la mano.
17. Inverti la siringa chiusa della Soluzione B più volte per assicurarti che sia ben miscelata. Rimuovi il tappo di bloccaggio dei luer dalla siringa.
18. Rimuovi il tappo di ingresso del filtro incapsulato. Collega la siringa della Soluzione B all'ingresso del filtro incapsulato tramite la punta di bloccaggio del luer e aggiungi lentamente tutta la Soluzione B premendo lo stantuffo. Spingere troppo velocemente può causare la formazione di contropressione, quindi assicurati di abbassare lentamente lo sturalavandini. Ricappucchia il tappo dell'ingresso del filtro.
19. Agita vigorosamente il filtro chiuso per 5 minuti.
    NOTA: Per prevenire la stanchezza, si possono preparare più campioni fino a questo passaggio e tutti stringere a mano contemporaneamente. Se disponibile, può essere utilizzato un miscelatore a vortice ricaricabile per eseguire questo passaggio invece di stringere la mano.
20. Rimuovi il tappo dell'ingresso.
21. Con il filtro invertito, si spinge 1 mL d'aria dentro il filtro usando una siringa da 3 mL collegata all'unità di filtro incapsulata e poi tira indietro lo sturalavandini per rimuovere quanta più possibile la lisato (liquido).
    NOTA: Se il lisato è particolarmente viscoso, potrebbe essere necessario spingere e tirare lo sturalavandini più volte per rimuovere la soluzione dal filtro.
22. Aggiungi il lisato a un tubo a perle da 5 mL. Copri il tubo e sigillalo con parafilm sopra.
23. Stringi vigorosamente il tubo con la mano per 5 minuti. Metti il tubo in posizione verticale mentre continui con i passi.
    NOTA: Per prevenire la fatica, si possono preparare più campioni fino a questo passaggio e tutti possono essere stretti a mano contemporaneamente. Se disponibile, può essere utilizzato un miscelatore a vortice ricaricabile per eseguire questo passaggio invece di stringere la mano.
24. Per evitare la contaminazione della parte superiore della lamina, posiziona la cartuccia di preparazione del campione su una superficie piana.
25. Rimuovi la siringa da 1 mL dal suo imballaggio e avvita la colonna con blocco a luer all'estremità della siringa. Usa la punta appuntita della colonna per fare due fori nella prima sezione della cartuccia di preparazione del campione.
    ATTENZIONE: Alcune sezioni della cartuccia contengono sali caotropici e/o etanolo. Indossa guanti e occhiali di sicurezza.
26. Utilizzando una pipetta volumetrica in plastica, trasferisci 1 mL di lisato (solo liquido, evitando il più possibile di trasferire le sfere) dal tubo delle perline al foro appena perforato della sezione della prima cartuccia di preparazione del campione. Per ottenere i migliori risultati, aggiungi lentamente il lisato con un leggero angolo quando si pipetta nel foro della lamina.
27. Inserisci la colonna della siringa nella sezione rossa della cartuccia. Tira completamente il liquido nella siringa e poi spingilo fuori. Esegui questa pompa 10 volte.
28. Spingi tutto il liquido fuori dalla siringa e lo riporta nella sezione rossa della cartuccia prima di passare al passo successivo. Nessun liquido dovrebbe essere trasferito da una sezione all'altra - questo vale per ogni passaggio rimanente del protocollo di isolamento del DNA del campione.
29. Posiziona la punta appuntita della colonna della siringa sopra la sezione rosso-arancione e perfora due fori attraverso la barriera di alluminio. Usa lo stantuffo per tirare tutto il volume della siringa, il liquido su per tutta la siringa e pompa di nuovo fuori. Ripeti questo passaggio una volta per un totale di 2 pompe, spingendo tutto il liquido fuori. Non trasferire alcun liquido al passaggio successivo.
30. Posiziona la punta appuntita della colonna di siringa sopra la sezione arancione e perfora due fori attraverso la barriera di alluminio. Usa lo sturalavandini per tirare tutto il volume di fluido della siringa nella siringa e pompa tutto fuori. Non trasferire alcun liquido al passaggio successivo.
31. Posiziona la punta appuntita della colonna della siringa sopra la sezione gialla e perfora due volte attraverso la barriera della carta. Usa lo sturalavandini per tirare tutto il volume di fluido della siringa nella siringa e pompa tutto fuori. Non trasferire alcun liquido al passaggio successivo.
32. Posiziona la punta appuntita della colonna della siringa sopra la sezione blu ad asciugare all'aria e perfora la barriera di alluminio solo una volta. Usa lo sturalavandini per tirare tutto il volume d'aria della siringa nella siringa e pompa rapidamente fuori. Ripeti rapidamente questa azione di pompaggio almeno 20 volte finché la colonna non sembra asciutta.
33. Posiziona la punta appuntita della colonna di siringa sopra l'ultima sezione verde e perfora due volte la barriera di alluminio. Usa lo sturalavandini per tirare tutto il volume di fluido della siringa nella siringa e pompa tutto fuori. Ripeti questo passaggio per un totale di 5 pompe.
34. Utilizzando la siringa da 1 mL e la colonna di preparazione del campione, trasferire tutta la soluzione dalla sezione verde in un microtubo da 1 mL ben etichettato - questo è il campione di DNA estratto sul campo. Conserva a 1-10 °C (ad esempio, in un frigorifero con ghiaccio/impacchi di ghiaccio, o in frigorifero, ecc.) per un massimo di una settimana, o fino all'uso.
    NOTA: Per la conservazione a lungo termine, i campioni di DNA possono essere conservati a -20 °C indefinitamente.

2. Protocollo di analisi qPCR basato sul campo utilizzando un'unità qPCR di campo

NOTA: Lo strumento qPCR basato sul campo e il telefono che lo controlla si affidano a batterie ricaricabili. Assicurati che entrambi siano completamente carichi prima di recarsi sul campo.

1. Inserire fino a tre campioni di DNA estratti sul campo nelle fessure pure del vassoio. Assicurati che ci sia un campione per sezione: uno negli slot 1, 2 o 3, un campione negli slot 4, 5 o 6 e un campione negli slot 7, 8 o 9.
2. Posizionare le strisce di analisi per ogni campione nelle corrispondenti scanalature A, B o C sul vassoio. Allinea il primo pozzo sulla striscia con il primo slot sulla vassoia.
3. Sblocca il telefono e apri l'applicazione intitolata allo strumento qPCR registrato. Il telefono e l'unità qPCR da campo si collegano tramite wireless integrato a corto raggio. Quando l'app si apre, tocca il pulsante Start Run .
   NOTA: L'applicazione è precaricata sul telefono incluso e non può essere scaricata altrove.
4. Nella schermata successiva, tocca il pulsante Genera ID .
5. Questa schermata successiva è dove vengono inserite le informazioni sul campione per ciascun campione; tocca sotto Sample ID e digita il nome del campione.
   1. Toccare le unità campione e selezionare l'unità di volume appropriata per il tipo di campione utilizzato nell'estrazione (grammi [g], millilitri [mL] o tampone).
   2. Poi tocca sotto la quantità di campione e tipifica il volume del campione utilizzato nell'estrazione sul campo sopra (ad esempio, millilitri d'acqua filtrata). Ripeti questo processo per i restanti due campioni.
   3. Quando l'inserimento delle informazioni di campione per tutti i campioni è completato, tocca il pulsante continua .
      NOTA: Se si usano meno di 3 campioni, lasciare l'ID del campione come predefinito, selezionare un'unità qualsiasi e digitare un 1 nella riga della quantità di campione affinché i campioni non utilizzati procedano.
6. Nella schermata successiva, tocca la cartella. Sposta alla schermata successiva e tocca salva nella cartella corrente.
7. Nella schermata successiva, digita il nome di una run e tocca conferma.
8. Accendi lo strumento premendo e tenendo premuto il pulsante di accensione , situato in alto a sinistra dello strumento, finché tutte le luci frontali dello strumento non si accendono (~5 s). Poi, tocca conferma nell'app per continuare.
9. Sullo schermo successivo, tocca connetti tramite wireless integrato a corto raggio. Premi il pulsante wireless integrato a corto raggio (un simbolo familiare e registrato) sulla parte superiore dello strumento finché la luce blu non inizia a lampeggiare. Tocca conferma e aspetta che app e strumento si sincronizzino insieme. Una volta sincronizzate, tocca il nome dello strumento nell'app per selezionarlo, poi tocca il pulsante di connessione per procedere al caricamento delle strisce di analisi.
   NOTA: Se lo strumento e l'app non si sincronizzano la prima volta, assicurati che la spia wireless a corto raggio integrata sullo strumento sia ancora lampeggiante e tocca di nuovo la scansione.
10. Prima di rimuovere i tappi delle strisce di analisi, controlla che i pellet liofilizzati non siano in cima a nessuno dei pozzi delle strisce di analisi. Se lo sono, muovi delicatamente il fondo del pozzo per far cadere il pellet più in basso nel pozzo.
11. Rimuovi i tappi dai tubi delle striscie di uso per il primo campione. Aggiungi 18 μL di acqua sterile nel primo pozzo della striscia per il saggio e pipetta delicatamente su e giù per sciogliere la pellet. Ripeti per i 2 pozzi rimanenti.
12. Aggiungi 2 μL del campione in ogni pozzo e sigilla i tubetti inserendo un set di tappi di gomma per saggio nei tubi con le tacche tra i tappi rivolte verso il retro della vaschetta. Ripeti i passaggi 2.10-2.12 per i campioni rimanenti se necessario. Una volta che tutte le strisce di analisi sono state riempite e sigillate con tappi per strisce, tocca conferma nell'app.
13. Rimuovi ogni striscia di analisi una alla volta e controlla la presenza di bolle sul fondo dei pozzi. Se ci sono bolle sul fondo di uno dei pozzi, muovi delicatamente la striscia avanti e indietro finché le bolle non si spostano verso la parte superiore del pozzo. Una volta controllati tutti i pozzi, clicca conferma nell'app e procedi a caricare le strisce nello strumento.
14. Apri il coperchio dello strumento e posiziona le strisce di analisi nello strumento qPCR di campo nello stesso ordine e orientamento in cui sono sulla vassoia, in modo che le cerniere del pozzo e le tacche tra i tappi siano rivolte verso il retro dello strumento. Dopo aver aggiunto tutte le strisce a strisce, spingi delicatamente il coperchio finché non si blocca in posizione e tocca conferma.
15. Tocca il pulsante start run nell'app.
    NOTA: La corsa inizierà e richiederà ~45 minuti per completarsi utilizzando condizioni preimpostate della corsa. Queste condizioni non sono modificabili.
16. Quando la corsa termina, tocca i risultati via email. Una volta che il telefono è in Wifi, i risultati verranno inviati per analisi e report; fino ad allora, i risultati vengono memorizzati sullo strumento.
    1. Una volta connesso al WiFi, l'utente dovrà premere nuovamente il pulsante invio per inviare i risultati.
17. Pulisci il vassoio tra una prova e l'altra per evitare contaminazioni tra i campioni.
    NOTA: L'output è un file Excel contenente i valori della soglia di ciclo (Ct) per ogni pozzo. Questi risultati vengono inviati al laboratorio, che verifica la qualità dell'amplificazione e converte i valori di Ct in abbondanze utilizzando curve standard validate specifiche per ciascun target qPCR e basate sul volume e sulla matrice del campione originale. Questi risultati vengono inviati all'utente sia come consegnabile elettronico che in PDF.

Results

L'estrazione del DNA da campioni ambientali rappresentativi è stata effettuata utilizzando sia il kit di estrazione biologica sul campo sia un metodo altamente validato in laboratorio precedentemente^{descritto 4}. Come mostrato nella Figura 4, il completamento riuscito dell'isolamento del DNA utilizzando il kit di campo è stato confermato confrontando i risultati della qPCR con un metodo di estrazione altamente validato in laboratorio. Questa coerenza conferma che il metodo ha preservato l'integrità del DNA dei campioni ambientali sul campo.

I componenti del kit qPCR di campo sono mostrati nella Figura 5. L'analisi di una diluizione standard di coltura di Dehalococcoidi (DHC) utilizzando l'unità qPCR di campo è stata eseguita sia a temperature interne (21 °C) che esterne (30 °C) per illustrare la robustezza dello strumento in condizioni reali di campo. I risultati, visti nella Figura 6, evidenziano la bassa deviazione per 10 diverse ripetizioni di ciascuna. Per contestualizzarlo completo, il DHC è un organismo capace di degradare solventi clorati ed è comunemente quantificato tramite qPCR nell'industria della bonifica^{ambientale 4}.

Per convalidare la precisione degli strumenti, il DHC è stato analizzato a tre diverse concentrazioni utilizzando dieci strumenti qPCR di campo eseguiti in duplicato (Figura 7). Anche a basse abbondanze, la deviazione standard relativa è rimasta bassa (sotto il 5%) su tutte le ricorrenze. Si noti che, rispetto alla deviazione standard, la deviazione standard relativa è importante per i dati logaritmici poiché normalizza i risultati attraverso la seguente equazione:

Dove RSD è la deviazione standard relativa, σ è la deviazione standard del dataset, e μ è la media del dataset.

Insieme, entrambi i metodi in questo articolo forniscono risultati riproducibili attraverso estrazioni di campo replicate e saghi qPCR. L'accordo tra estrazioni sul campo e laboratorio e analisi qPCR dimostra che si possono ottenere dati affidabili e di alta qualità senza dipendere dall'infrastruttura di laboratorio, consentendo di effettuare analisi microbiche in ambienti remoti o con risorse limitate.

Figura 1: Componenti del kit filtro incapsulato. Il filtro incapsulato viene utilizzato per filtrare la biomassa dal campione d'acqua. Collegandosi a una pompa peristaltica tramite un tubo, l'acqua viene spinta attraverso il filtro. Dopo aver annotato il volume totale d'acqua, l'acqua viene scartata e la biomassa raccolta sul filtro è pronta per l'estrazione del DNA. Componenti: a. tubo sterile che contiene il filtro e i componenti prima e dopo l'uso, b. tappo di ingresso, c. fascetta per tubi, d. adattatore di connessione per tubi di bloccaggio di Luer, e. filtro incapsulato, f. tappo di uscita in gomma. Immagine utilizzata con il permesso di Microbial Insights, ^Inc.12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Collegamento filtro e tubo. Il tubo viene spinto sopra l'adattatore di collegamento del tubo a bloccaggio Luer e mantenuto in posizione tramite la fascetta. L'altra estremità del tubo è collegata a una pompa peristaltica (questa connessione e il funzionamento della pompa sono fuori dall'ambito di questo protocollo). Immagine utilizzata con il permesso di Microbial Insights, ^Inc.12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: componenti del kit di isolamento del DNA. Tutti i componenti sono sterili prima dell'uso. I componenti includono: (1) kit di filtro incapsulato (vedi Figura 1 per maggiori dettagli), (2) siringa da 3 mL, (3) siringa da 1 mL precaricata con Soluzione A, tappata, (4) 1 mL di siringa precaricata con Soluzione B, tappata, (5) siringa da 3 mL, (6) tubo a sfera in silicone, (7) siringa da 1 mL dotata di colonna di isolamento, (8) pipetta di trasferimento usa e getta da 1 mL, (9) cartuccia per preparazione del campione di isolamento del DNA, (10) tubo microcentrifuga da 1,5 mL. Non mostrati: quadrati di parafilm per sigillare durante l'agitazione e salviette per preparazione all'alcol usate per pulire la superficie usate per l'estrazione. Immagine utilizzata con il permesso di Microbial Insights, ^Inc.12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Confronto dell'estrazione sul campo utilizzando campioni reali. Risultati comparativi qPCR di DNA isolato da due campioni rappresentativi utilizzando un metodo di laboratorio (barre rosse) rispetto al kit di estrazione biologica (barre blu). Questi non sono stati analizzati in replicazione, come ci si aspetterebbe in un'analisi qPCR standard. I bersagli genici (asse x) mostrano abbondanza (asse y) entro un ordine di grandezza per entrambi i metodi. Le informazioni su ciascun gene target specifico non sono incluse poiché sono al di fuori dell'ambito di questo articolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Strumento qPCR basato sul campo e i suoi componenti. I componenti includono: A. Lo strumento qPCR basato sul campo, B. vassoio per preparazione campioni, C. striscia di saggio contenente reagenti liofilizzati, D. telefono precaricato con applicazione utilizzata per eseguire lo strumento. Immagine utilizzata con il permesso di Microbial Insights, ^Inc.12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Dimostrazione della robustezza della qPCR in campo. Standard Dehalococcoides (DHC) analizzato in dieci repliche in condizioni esterne (30 °C, barre rosse) e interne (21 °C, barre blu), evidenziando l'affidabilità dello strumento per il campo. Il numero di replica è indicato lungo l'asse x e l'abbondanza calcolata del DHC è indicata lungo l'asse y. La media interna (20 °C) è stata calcolata come 4,92 × 10² cella/mL, DS = 1,14 × 10² celle/mL (n = 10), e la media esterna (30 °C) è stata calcolata come 5,89 × 10² celle/mL, SD = 1,80 × 10² cella/mL (n = 10). Le misurazioni ottenute a 20 °C e 30 °C non differivano significativamente (test t di Welch, p = 0,17). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Dimostrazione della precisione della qPCR di campo. Performance di precisione tra 10 strumenti diversi, eseguiti in duplicata a tre diverse concentrazioni standard. Il valore vero e il numero di replica (n = 2 per 10 strumenti a ciascuna concentrazione standard) sono elencati lungo l'asse x, con barre colorate specifiche per l'unità di campo. L'asse y mostra l'abbondanza calcolata per ogni corsa. La deviazione standard percentuale relativa per ciascuna concentrazione standard è mostrata nelle linee tratteggiate sopra le barre. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Una caratteristica fondamentale di questo protocollo è che consente l'estrazione del DNA microbico e l'analisi qPCR in condizioni di campo senza la necessità di infrastrutture di laboratorio o^{elettricità 12}. Il metodo è stato ottimizzato per bilanciare portabilità e affidabilità, fornendo risultati riproducibili coerenti con i flussi di lavoro in laboratorio anche quando eseguiti all'aperto sotto un intervallo di temperature^{ambientali 12}. L'intervallo d'uso suggerito è da 4 °C a 95 °C (39 °F a 104 °F), e il confronto affiancato a temperature esterne standard (30 °C, 86 °F) per una squadra sul campo dimostra una costanza affidabile (Figura 6). Questa coerenza è essenziale per garantire che i risultati sul campo siano interpretabili insieme ai dataset di laboratorio.

Diversi passaggi sono fondamentali per il successo del protocollo. Durante il processo di estrazione, la completa rimozione del liquido dai filtri e la miscelazione accurata dei reagenti sono importanti per garantire una lisi efficiente e un recupero del DNA. Allo stesso modo, un trasferimento attento del lisato nella cartuccia di preparazione del campione, minimizzando il trasferimento delle perle, è fondamentale per prevenire intasamenti o guasti della colonna. Le strategie di risoluzione dei problemi includono rallentare la depressione dello sturalavandini per ridurre la contropressione e il ripetere il pompaggio con la siringa se i lisati viscosi ostacolano il movimento del fluido. Per la qPCR, evitare bolle nei pozzi di analisi e garantire una risospensione completa dei pellet sono fondamentali per un'amplificazione accurata.

Nonostante i suoi vantaggi, il metodo presenta delle limitazioni. Le rese di DNA possono essere inferiori rispetto a quelle ottenute con i kit da centrifugazione da banco da banco e campioni altamente torbidi o ricchi di organico possono compromettere le prestazioni delle colonne. Sebbene i kit di isolamento siano semplici e facili da usare per chiunque - inclusi utenti senza esperienza di laboratorio precedente - esiste un rischio aggiuntivo di errore nel confrontare una persona inesperta sul campo. Inoltre, sebbene l'unità qPCR sul campo fornisca risultati rapidi, è limitata a un numero limitato di reazioni simultanee (attualmente limitate a 9 bersagli genici per esecuzione) rispetto ai termociclatori standard. Queste limitazioni sono però compensate dalla velocità dell'analisi e dalla capacità di catturare profili delle comunità microbiche sul campo. Non vi sono limiti intrinseci su quali target qPCR possano essere analizzati oltre al catalogo del laboratorio che offre l'unità.

L'importanza di questo metodo risiede nella sua capacità di mobilitare analisi molecolari, consentendo il monitoraggio in tempo reale delle popolazioni microbiche in ambienti come giacimenti petroliferi, siti agricoli o ecosistemi remoti. Preservando l'integrità del DNA nel momento del campionamento e generando risultati in loco, questo approccio riduce le barriere logistiche, migliora la qualità dei dati e consente decisioni rapide. Le applicazioni future potrebbero includere la sorveglianza dei patogeni nella sanità pubblica, il monitoraggio dei progressi della biorisanizzazione o la valutazione del rischio microbico nei sistemi idrici. Con modifiche minori, la piattaforma può essere continuamente adattata per ulteriori bersagli molecolari e per i nuovi saggi qPCR.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubi in silicone 5/16"	Amazon (www.amazon.com)	796753613221	Modelli alternativi possono essere accettabili
Raffreddatori	Staples (www.staples.com)	24299978	Modelli alternativi possono essere accettabili
Kit di isolamento del DNA	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/bio-extract/	Proprietario
Unità qPCR da campo con accessori	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/fieldquant/	Proprietario
Guanti	Amazon (www.amazon.com)	Dipende dalla dimensione	Modelli alternativi possono essere accettabili
Filtri di falda	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/wp-content/uploads/2025/08/MI-Sampling-US-01.02-bio-flo_dna_mi.pdf
Ghiaccio	Negozio di alimentari locale	NA
Pompa peristaltica Kamoer DIP1500 24 V 1500 mL/min hig	Amazon (www.amazon.com)	701705886813	Modelli alternativi possono essere accettabili
Pinze a becco a filo	Amazon (www.amazon.com)	762983170575	Modelli alternativi possono essere accettabili
Asciugamani di carta	Staples (www.staples.com)	2126874	Modelli alternativi possono essere accettabili
Occhiali di sicurezza	Amazon (www.amazon.com)	B0BNHKWR6W	Modelli alternativi possono essere accettabili
Pennarello Pennarello Fine	Amazon (www.amazon.com)	71641300033	Modelli alternativi possono essere accettabili