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Articolo metodologico

Isolamento e purificazione delle vescicole extracellulari vegetali dalle foglie di Arabidopsis utilizzando un metodo ottimizzato di raccolta apoplastica

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DOI:

10.3791/69715

⸱

24 marzo 2026

 ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology and Microbiology, Texas A&M University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per isolare vescicole extracellulari (EV) dalle foglie di Arabidopsis thaliana al fine di supportare analisi molecolari e funzionali a valle.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV) sono nanoparticelle legate alla membrana secrete da diversi organismi e tipi cellulari e sono sempre più riconosciute come importanti mediatori della comunicazione intercellulare e tra regni. Sebbene la biologia degli EV sia ben stabilita nei sistemi mammiferi, la ricerca sugli EV vegetali è relativamente recente e in rapida espansione, guidata in parte dall'evidenza che gli EV vegetali possono fornire piccoli RNA, mRNA, proteine e altri materiali coinvolti nell'immunità e nelle interazioni pianta-microrganismo. Tuttavia, isolare i veicoli elettrici delle piante ad alta purezza rimane tecnicamente difficile a causa delle pareti cellulari rigide, dell'abbondanza di metaboliti secondari e del rischio di contaminazione citosolica durante la raccolta di liquidi apoplastici. Questo protocollo delinea un flusso di lavoro semplificato per l'isolamento e la purificazione dei veicoli elettrici vegetali provenienti dal tessuto fogliare di Arabidopsis thaliana . Un passaggio delicato di infiltrazione basato su siringa viene utilizzato per minimizzare i danni cellulari e le perdite citosolici, mentre l'uso di singole lame fogliari (senza piccioli/tessuto vascolare) aiuta a ridurre la contaminazione da contenuti vascolari associati e intracellulari. Gli EV sono inizialmente arricchiti tramite centrifugazione differenziale e possono essere ulteriormente purificati utilizzando frazionamento del gradiente di densità di saccarosio o cromatografia a esclusione di dimensioni (SEC). Questo protocollo garantisce EV con integrità strutturale preservata e riduzione della contaminazione cellulare minimizzando i danni cellulari e le perdite citoplasmatiche durante la raccolta del fluido apoplastico, come valutato tramite analisi di tracciamento nanoparticellare e microscopia elettronica a trasmissione. Questi campioni EV sono adatti per applicazioni a valle, inclusi profiling RNA, proteomica e sagaggi funzionali per studi di interazione pianta-microrganismo. Nel complesso, questo metodo offre un approccio riproducibile e adattabile per ottenere veicoli elettrici per piante di alta qualità.

Introduzione

Le vescicole extracellulari (EV) sono particelle di membrana lipidiche legate a due strati secernite da una vasta gamma di organismi, dai batteri agli esseriumani 1,2. Nei sistemi animali, i veicoli elettrici sono comunemente classificati in esosomi, microvescicole e corpi apoptotici in base alle loro vie di biogenesi e alladimensione 3. Gli esosomi (~30-150 nm di diametro) hanno origine dalla fusione di corpi multivescicolari (MVB) con la membrana plasmatica, portando al rilascio di vescicoleintraluminali 4, mentre microvescicole (~100-1000 nm di diametro) germogliano direttamente dalla membranaplasmatica 5. Oltre agli esosomi e alle microvescicole, le cellule mammiferiche producono anche corpi apoptotici, che vengono rilasciati durante la morte cellulareprogrammata 6. Queste vescicole sono state implicate nella modulazione immunitaria, nella progressione tumorale e nella somministrazione terapeutica, rendendole oggetto di intensa ricercabiomedica 7,8. Nelle piante, la classificazione degli EV è meno definita rispetto agli animali. Studi su Arabidopsis thaliana hanno identificato molteplici sottotipi di EV vegetale basandosi su differenze nei marcatori proteici, nella dimensione e nelle presunte vie di biogenesi. Queste includono EV tetraspanin (TET) positive, considerate vescicole simili a esosomi derivate da corpi multivescicolari 9,10,EVs 11 positive per la proteina sintassinica Penetration 1(PEN1), EVs derivate da organi esocistipositivi (EXPO) 12,13, oltre ad altre popolazioni EV come EVs14 correlate all'autofagia epollensomi 15.

Sempre più evidenze suggeriscono che le piante secernono veicoli elettrici come parte della loro strategia di difesa contro i patogeni. I veicoli elettrici vegetali trasportano carichi molecolari diversi, inclusi piccoli RNA, mRNA e altre molecole regolatorie, che sopprimono la virulenza di patogeni fungini eoomiceti 10,16,17,18,19. Questi risultati evidenziano gli EV come veicoli della "guerra a RNA", permettendo alle piante di sopprimere direttamente l'espressione genica dei patogeni, un meccanismo con profonde implicazioni per la protezionedelle colture 20. Oltre all'immunità, gli EV delle piante possono anche contribuire al rimodellamento della parete cellulare, alle risposte allo stress e alla segnalazione dellosviluppo 21. A differenza della ricerca sugli EV sugli animali, dove i protocolli standardizzati di isolamento e caratterizzazione sono ampiamenteconsolidati, il campo degli EV delle piante è ancora nelle sue fasi formative. Ciò limita la riproducibilità e la comparabilità tra gli studi, creando un'urgente necessità di metodologie robuste e standardizzate per isolare e studiare queste vescicole.

Isolare i veicoli elettrici delle piante presenta sfide tecniche uniche che non si incontrano nei sistemi animali. I tessuti vegetali danneggiati contengono abbondanti metaboliti secondari, detriti della parete cellulare e frammenti organellari che possono co-purificarsi con i veicoli elettrici, complicando la caratterizzazione avalle 23. Inoltre, il fluido di lavaggio apoplastico (AWF), comunemente utilizzato come materiale di partenza per l'isolamento e la purificazione degli EV delle piante, spesso produce una miscela eterogenea di vescicole econtaminanti 24. Sebbene la centrifugazione differenziale rimanga un approccio fondamentale ampiamente utilizzato, non può risolvere completamente sottopopolazioni distinte di EV né separare EV da complessi macromolecolarico-isolati 25,26. Revisioni recenti e studi metodologici hanno fornito importanti linee guida e considerazioni di best practice per l'isolamento e la caratterizzazione degli EVdelle piante 27,28,29,30,31. Tuttavia, l'implementazione pratica e l'integrazione di questi approcci restano impegnative, e sono spesso necessari ulteriori passaggi di purificazione come la centrifugazione a gradiente di densità e la cromatografia a esclusione di dimensione per migliorare la purezza e la riproducibilità degli EV tra gli studi.

Qui presentiamo un protocollo semplificato per isolare i veicoli elettrici dal liquido di lavaggio apoplastico Arabidopsis utilizzando una strategia di purificazione in più fasi. A differenza degli approcci di isolamento EV comunemente usati che si basano sull'infiltrazione dell'intera pianta con pompe avuoto 11, questo protocollo evita l'inclusione di piccioli e tessuti vascolari, che possono aumentare la contaminazione da strutture vascolari. Invece, si utilizzano lame fogliari isolate e un delicato metodo di infiltrazione basato su siringa per migliorare la raccolta degli apoplasti minimizzando al contempo il disturbo dei tessuti. Condizioni di gestione attenta delle foglie, orientamento e centrifugazione riducono ulteriormente la contaminazione da componenti intracellulari, fornendo un materiale di partenza più pulito per l'isolamento dei veicoli elettrici. Dopo centrifugazione differenziale, gli EV possono essere ulteriormente purificati utilizzando frazionamento del gradiente di densità del saccarosio o cromatografia a esclusione di dimensione per ottenere una maggiore purezza e risoluzione della vescicola. Le preparazioni EV risultanti sono ben adatte per applicazioni a valle, inclusi sequenziamento dell'RNA, profilazione proteomica e saggio funzionale come l'interazione patogena e studi sull'assorbimento degli EV, migliorando così la riproducibilità e l'interpretabilità nella ricerca sugli EV in piante.

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Protocollo

NOTA: Eseguire i passaggi di centrifugazione in una centrifuga refrigerata a 4 °C per preservare l'integrità degli EV. Dovrebbero essere usati tubi sterili. Tutti i passaggi di manipolazione dei campioni dovrebbero essere eseguiti rapidamente ed efficientemente, idealmente da più persone che lavorano in parallelo, per minimizzare i danni ai tessuti e prevenire contaminazioni che possano compromettere la qualità degli EV.

1. Preparazione e infiltrazione delle foglie

  1. Prepara 1 L di tampone di isolamento della vescicola (VIB) composto da 20 mM di idrato MES, 2 mM diCaCl 2, 0,1 M di NaCl, pH 6.
  2. Raccogli le zone distali delle foglie tagliando alla base della lama per rimuovere il piccololo.
    NOTA: Si raccomandano almeno 100 piante di quattro settimane per trattamento o genotipo per garantire una resa EV sufficiente. Le piante di Arabidopsis sono state coltivate con cicli di 8 ore di luce e 16 ore di scuro. Non usare foglie che mostrano segni visibili di stress, come lo sbiancamento o l'approssimazione delle foglie.
  3. Lava le foglie con acqua a osmosi inversa (RO) tre volte. Mettili su carta assorbente e asciugali delicatamente.
  4. Carica circa 50 mL di foglie in una siringa da 120 mL. Tocca leggermente la siringa per calmare le foglie.
  5. Aggiungi circa 60 mL di VIB nella siringa finché le foglie non sono completamente immerse. Espelle l'aria intrappolata premendo delicatamente lo stantuffo. Premere un pezzo di parafilm piegato quattro volte sulla punta della siringa per evitare perdite.
    NOTA: Quando si effettua l'infiltrazione sotto vuoto con siringa, assicurarsi che siringa e sturalavandini siano ben assemblati prima di applicare il vuoto. Applica la forza gradualmente e mantieni una presa salda sulla siringa per prevenire movimenti improvvisi dello stantuffo o perdita di controllo.
  6. Infiltra le foglie tirando lentamente lo sturalavandini verso l'esterno per creare un vuoto. Tieni lo stantuffo in posizione estesa per 5 secondi, poi rilascia lentamente. Ripeti questo ciclo di infiltrazione 2-3 volte finché le foglie non appaiono più scure e traslucide, indicando un'infiltrazione riuscita e riuscita a ripetere.
  7. NOTA: Tirare lo stantuffo richiede una forza moderata dovuta alla resistenza al vuoto. La siringa deve essere tenuta saldamente mentre lo sturalavandini viene estratto lentamente per mantenere un'infiltrazione controllata.
  8. Una volta che le foglie sono state infiltrate, estrai lo sturalavandini. Versa l'eccesso di buffer nel lavandino.
  9. Ripeti i passaggi 1.4-1.7 finché tutte le foglie raccolte non saranno infiltrate (Figura 1A).

2. Raccolta del liquido per lavaggio apoplastico (AWF)

  1. Taglia una striscia di nastro adesivo da ~12 pollici e mettila con la parte appiccicosa verso l'alto. Fissa un'estremità del nastro avvolgendola attorno a una siringa vuota e inutile da 1 mL appena sotto l'estremità più larga. Disporre con cura circa 50-70 foglie infiltrate in strati sovrapposti lungo la superficie appiccicosa, posizionandole in modo che la base di ciascuna lama sia rivolta verso la siringa inferiore e le punte puntino verso l'alto per la raccolta (Figura 1B).
    NOTA: Stratificare più foglie su una sola striscia di nastro aiuta a prevenire danni. Allinea tutte le foglie con la lama rivolta verso un'estremità e orientata verso il fondo del tubo di raccolta per consentire un recupero efficiente del fluido apoplastico durante la centrifugazione.
  2. Avvolgi le foglie legate con il nastro adesivo saldamente attorno alla siringa, poi fissa la parte superiore del fascio con due strisce di nastro adesivo. Inserisci la siringa avvolta in un tubo da 50 mL con l'estremità tagliata delle foglie e la base della siringa orientata verso il fondo del tubo. Assicurati che le foglie siano ben fasciate con nastro adesivo, poiché un fasciamento allentato può causare danni alle foglie e liberare cellule rotte che contaminano il liquido per il lavaggio dell'apoplasto (Figura 1B).
  3. Centrifugare la siringa avvolta contenente foglie infiltrate a 900 × g per 10 minuti a 4 °C utilizzando una centrifuga refrigerata dotata di un rotore ad angolo fisso. Raccogli il liquido per il lavaggio apoplastico in un nuovo tubo conico da 15 mL e tieni il campione sul ghiaccio. Ripeti i passaggi 2.1-2.3 finché tutte le foglie non sono state usate per raccogliere l'AWF.
    NOTA: L'AWF deve essere trasparente, non verde o nemmeno verde chiaro. Un AWF verde indica la presenza di cloroplasti/clorofilla e può anche indicare la contaminazione cellulare. Per minimizzare i danni alle foglie, usa un rotore ad angolo fisso.

3. Isolamento EV con Arabidopsis dall'AWF tramite centrifugazione differenziale

  1. Centrifugare il fluido di lavaggio apoplastico raccolto a 2.000 g per 20 minuti a 4 °C utilizzando una centrifuga refrigerata dotata di rotore a secchio oscillante, con impostazioni standard di accelerazione e decelerazione. Dopo la centrifugazione, si utilizza un filtro a celle di nylon da 0,45 μm per rimuovere grandi detriti cellulari dal surnatante. Scarta la pallina. Trasferire il surnadante filtrato in nuovi tubi centrifughe (Figura 2).
  2. Centrifugare il sovrantato filtrato a 10.000 × g per 30 minuti a 4 °C utilizzando una centrifuga refrigerata dotata di rotore ad angolo fisso, con impostazioni standard di accelerazione e decelerazione. Scartare il pellet e conservare il surnatante per l'ultracentrifugazione. Questo passaggio rimuove ulteriormente grandi detriti cellulari e grandi vescicole (Figura 2).
  3. Trasferire il soprantantante in tubi ultracentrifughe da 17 mL e in ultracentrifuga a 100.000 × g per 1 ora a 4 °C utilizzando un'ultracentrifuga dotata di rotore a secchio oscillante, con impostazioni standard di accelerazione e decelerazione. Dopo la centrifugazione, si scarta il sovrantato e si risospende il pellet in circa 16 mL di VIB buffer per il lavaggio. Ripeti il giro di ultracentrifugazione per raccogliere i veicoli elettrici (Figura 2).
    NOTA: La centrifugazione a 100.000 x g viene effettuata per la sedimentazione di piccole vescicole come gli esosomi. I passaggi successivi di lavaggio aiutano a eliminare le proteine non EV risospendendo il pellet nel tamponamento. I tubi delle ultracentrifughe devono essere accuratamente bilanciati in base alla massa secondo le specifiche del produttore prima della centrifugazione. Ispezionare tubi e dischi per eventuali difetti prima dell'uso e assicurarsi che il rotore sia ben fissato prima di avviare la riproduzione.
  4. Scarta il soprantantante e sospezioni la pallina in VIB. Usa una punta di pipetta per raschiare delicatamente il fondo del tubo e facilitare il recupero completo del pellet EV (Figura 2).
    NOTA: Il pellet EV è spesso traslucido e potrebbe non essere visibile una volta sospeso. Raschiare delicatamente il fondo del tubo facilita il processo di risospensione degli EV. Regola il volume di risospensione per raggiungere la concentrazione desiderata di EV, poiché volumi di ristampa più piccoli generalmente portano a preparativi EV più concentrati. Tipicamente, la risospensione degli EV in 50 μL produce concentrazioni proteiche di circa 1-1,5 μg/μL e concentrazioni di particelle che si avvicinano a 10 9-10 particelle da10 μL.
  5. Conservare i veicoli elettrici sospesosi a 4 °C per l'uso immediato o a -80 °C per la conservazione a lungo termine senza congelamento improvviso in azoto liquido.
    NOTA: Lo stoccaggio a lungo termine può ridurre l'integrità dei veicoli elettrici. Usa veicoli elettrici appena preparati ogni volta che è possibile.

4. Uso della frazionazione del gradiente di densità di saccarosio per la purificazione degli EV

NOTA: L'ultracentrifugazione da sola co-sedimenta diversi tipi di vescicole. Per ottenere una risoluzione più fine, si può impiegare la frazionazione a gradiente di densità, separando le vescicole in base alla loro densità di galleggiamento e alle proprietà di galleggiamento. In questo approccio, i gradienti di saccarosio vengono utilizzati per arricchire sottopopolazioni definite di EV. In alternativa, si possono utilizzare gradienti di iodisxanolo.

  1. Separazione del gradiente di saccarosio a carico superiore degli EV
    1. Prepara scorte con gradiente di saccarosio dal 10 al 90% composte dalle seguenti concentrazioni: 10%, 16%, 22%, 28%, 34%, 40%, 46%. 52%, 58%, 64%, 70% e 90% usando VIB. Usa un bagno d'acqua a 60 °C per aiutare a sciogliere le scorte al 70% e al 90%.
    2. Preparare un gradiente discontinuo stratificando 1 mL di ciascuna soluzione di saccarosio in un tubo ultracentrifuga da 17 mL, partendo dalla soluzione più concentrata sul fondo e procedendo in sequenza fino alla meno concentrata. Escludi lo strato di saccarosio al 10% quando assembli il gradiente.
      NOTA: Distribuire con attenzione ogni strato di densità lungo la parete interna del tubo per minimizzare la miscelazione tra gli strati adiacenti. Si raccomanda una pipetta automatica impostata a velocità di distribuzione lenta per garantire un flusso continuo e controllato e migliorare la stabilità del gradiente. Se si utilizza una pipetta manuale normale, la dispensazione deve essere eseguita lentamente e costantemente, con la punta della pipetta posizionata appena sopra l'interfaccia dello strato precedente, e con attenzione a evitare la formazione di bolle d'aria.
    3. Mescola il pellet EV sospeso (~100 μg di proteina EV) con 1 mL di soluzione di saccarosio al 10%. Poi, sovrappongi questa miscela come ultimo strato dello strato discontinuo. Il volume totale sarà di ~12,1 mL.
    4. Centrifuga a 100.000 g per 16 ore a 4 °C.
      NOTA: Per corse di ultracentrifugazione prolungate, confermare che tubi, tappi e rotori siano certificati per un funzionamento prolungato ad alta velocità e che siano seguite le procedure di bilanciamento raccomandate dal produttore.
    5. Raccogliere sei frazioni da 2 mL per campione pipettando dalla parte superiore. Trasferire ogni frazione in un nuovo tubo ultracentrifugo da 17 mL.
    6. Sospendere le frazioni raccolte in un tampone VIB da ~16 mL e centrifugare a 100.000 g per 1 ora a 4 °C.
    7. Scartare il soprantantante, poi risospendere ogni pallina a 50 μL di VIB.
      NOTA: Il pellet EV non è visibile. Raschia delicatamente il fondo del tubo con la punta della pipetta per risospendere. Regolare il volume del tampone secondo necessità (ad esempio, 10 μL per concentrazioni più elevate).
  2. Separazione del gradiente di saccarosio a carico inferiore degli EV
    1. Prepara scorte per gradiente di saccarosio dal 10 al 90% composte dalle seguenti concentrazioni: 10%, 16%, 22%, 28%, 34%, 40%, 46%, 52%, 58%, 64%, 70% e 90% utilizzando il VIB buffer. Usa un bagno d'acqua a 60 °C per aiutare a sciogliere le scorte al 70% e al 90%.
    2. Mescola il pellet EV sospeso (~100 μg di proteina EV) con 1 mL di soluzione al 90% di saccarosio. Poi, stratifica questa miscela come primo strato di uno strato discontinuo.
    3. Preparare il gradiente discontinuo residuo di saccarosio sovrapponendo sequenzialmente 1 mL di ciascuna soluzione di saccarosio sopra la miscela EV-90% di saccarosio, partendo dal 70% di saccarosio e procedendo gradualmente verso concentrazioni più basse (64%, 58%, 52%, 46%, 40%, 34%, 28%, 22%, 16% e 10%). Distribuire con cura ogni strato lungo la parete del tubo usando una pipetta per minimizzare la miscelazione tra gli strati adiacenti. Il volume totale sarà di ~12,1 mL.
    4. Centrifuga a 100.000 g per 72 ore a 4 °C.
      NOTA: Per corse di ultracentrifugazione prolungate, confermare che tubi, tappi e rotori siano certificati per un funzionamento prolungato ad alta velocità e che siano seguite le procedure di bilanciamento raccomandate dal produttore.
    5. Raccogliere sei frazioni da 2 mL per campione pipettando dalla parte superiore. Trasferire ogni frazione in un nuovo tubo ultracentrifugo da 17 mL.
    6. Sospendere le frazioni raccolte in un ~16 mL di VIB buffer e centrifugare a 100.000 g per 1 ora a 4 °C.
    7. Scartare il sovrantante, poi sospendere ogni pellet in 50 μL di VIB buffer.
      NOTA: Il pellet EV non è visibile. Raschia delicatamente il fondo del tubo con la punta della pipetta per risospendere. Regolare il volume del tampone secondo necessità (ad esempio, 10 μL per concentrazioni più elevate).

5. Uso della cromatografia a esclusione di dimensione (colonna a 35 nm) per purificare i veicoli elettrici

  1. Preparazione del tampone e bilanciamento della colonna
    1. Prepara il VIB e tutti i buffer aggiuntivi da nuovi. Filtrare tutti i tamponi attraverso una membrana da 0,22 μm e degas sotto vuoto prima dell'uso per prevenire la formazione di bolle d'aria e l'ostruzione dei pori.
      NOTA: Una degassazione incompleta o l'uso di tamponi non filtrati possono introdurre bolle d'aria o particellati nel letto di resina, causando un flusso interrotto e una riduzione dell'efficienza della separazione EV. Se si osservano bolle nella colonna, la corsa dovrebbe essere fermata e la colonna riequilibrata.
    2. Lasciare che la colonna e i tamponi si equilibrino alla temperatura ambiente (18-24 °C) prima di rimuovere i tappi delle colonne.
      NOTA: La colonna e i tamponi dovrebbero essere completamente equilibrati alla temperatura ambiente prima della rimozione del tappo. L'applicazione di un tampone a temperatura ambiente a una colonna fredda può causare la formazione di bolle all'interno della resina, con conseguente distorsione dei profili eluzionali e una ridotta riproducibilità.
    3. Metti la colonna in posizione verticale e rimuovi con cura il cappuccio superiore della colonna.
    4. Rimuovi il tappo inferiore e lascia che il buffer si svuoti completamente fuori dalla colonna.
      NOTA: Assicurarsi che il buffer di stoccaggio sia completamente svuotato dalla colonna prima dell'equilibrio.
    5. Bilanciare la colonna riscasciando con tre volumi della colonna (25,5 mL) di buffer VIB degassato.
  2. Carico EV e raccolta dei campioni
    1. Utilizzare 100 μg di proteina EV totale per ogni purificazione SEC. Prima di caricare sulla colonna SEC, regolare i campioni EV a un volume finale di 500 μL usando VIB.
    2. Applica la sospensione EV da 500 μL direttamente sulla fritta di carico in cima alla colonna.
    3. Lascia che il campione entri completamente nel letto di resina prima di aggiungere il VIB buffer. Mantenere un flusso continuo di colonne durante tutta la separazione per garantire un'eluzione accurata basata sulla dimensione.
      NOTA: Il flusso di colonne deve rimanere continuo durante tutta la separazione. Permettere alla colonna di rimanere a secco o fermare il flusso per periodi prolungati interrompe la separazione basata sulla dimensione e può portare a sovrapposizioni di frazioni e a una riduzione dell'arricchimento EV.
    4. Dopo che il campione EV (500 μL) è entrato completamente nel letto di resina, aggiungere 2 mL di VIB e lasciarlo eluire completamente. Questo eluato corrisponde al volume morto della colonna e dovrebbe essere scartato. Le frazioni di EV venivano poi raccolte aggiungendo sequenzialmente 400 μL di VIB e raccogliendo l'eluato, ripetendo questo processo per ottenere frazioni 1-6 in tubi microcentrifuga da 1,5 mL.
      NOTA: Il volume morto non dovrebbe contenere veicoli elettrici. Sulla base della validazione utilizzando la colonna da 35 nm, i veicoli elettrici vengono tipicamente recuperati nelle frazioni 1-3. Se necessario, il volume morto può essere valutato tramite analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) o immunoblotting per i marcatori EV per confermare l'assenza di EV.
  3. Pulizia e stoccaggio delle colonne
    1. Immediatamente dopo la raccolta delle frazioni, risciacquo la colonna con un volume di colonna (8,5 mL) di 0,5 M NaOH per sanificare la resina. Poi, risciacqua la colonna con 17 mL di VIB per ripristinare il pH neutro. La colonna è quindi pronta per il caricamento del campione successivo.
      NOTA: Lavare la colonna con il solo tampone non è sufficiente per rimuovere proteine o vescicole residue. La fase di pulizia con NaOH è essenziale per prevenire il trasferimento tra campioni, in particolare per analisi successive di acidi nucleici o RNA.
    2. Per la conservazione a lungo termine, si risciacqua la colonna con due volumi di acqua deionizzata dopo la pulizia, seguiti da due volumi di colonna al 20% di etanolo per la conservazione. Ricappucchia la colonna e conservala in posizione verticale.
      NOTA: Risciacquare la colonna con acqua deionizzata prima della conservazione dell'etanolo previene la cristallizzazione del sale all'interno del letto di resina, preservando così le prestazioni della colonna.

6. Validazione, quantificazione e valutazione di dimensioni/morfologie degli EV

  1. Analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA)
    1. Misura la distribuzione delle dimensioni degli EV e la concentrazione delle particelle tramite NTA.
    2. Diluire i campioni EV a 1:100 in VIB sterile e filtrato a 0,2 μm per ottenere una concentrazione delle particelle entro il range ottimale di rilevamento (circa 10⁷-10⁹ particelle/mL).
    3. Mescola delicatamente i campioni diluiti per evitare la formazione di bolle e caricali nello strumento dotato di un laser da 532 nm e di una telecamera sCMOS ad alta sensibilità.
    4. Eseguire acquisizione e analisi dati utilizzando il software NS Xplorer con una soglia di rilevamento di 10 nm (fino a 1.000 nm), applicando un algoritmo dinamico di concentrazione basato sul volume di osservazione.
  2. Analisi del Western blot dei marcatori EV
    1. Per l'analisi Western blot, lavare e risospendere le frazioni EV ottenute dopo la separazione del gradiente di saccarosio in 50 μL di VIB. Miscelare un'aliquota di 10 μL da ciascuna frazione con un tampone di carico SDS, denaturato, e risolto su un gel di trisglicina al 12% prima dell'immunoblotting con anticorpi TET8 del marcatore EV.
    2. Per le frazioni EV derivate dalla SEC, si concentra prima 400 μL di ogni frazione a 50 μL utilizzando un filtro centrifugo a taglio di peso molecolare da 100 kDa. Successivamente, si utilizzano 10 μL del campione concentrato per l'analisi del Western blot come descritto sopra.
  3. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
    1. Depositare 5 μL di veicoli elettrici sospesi in VIB su griglie a carbonio scarico incandescente a 300 megli. Poi, rimuovi il campione in eccesso usando carta filtrante.
    2. Poi, colora negativamente la griglia con 3 μL di tinta da microscopia elettronica, rimuovi la stuccatura con carta filtro e lascia asciugare all'aria prima di fare l'imaging con un TEM a 300 kV.

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Risultati

Per valutare se il protocollo ottimizzato di raccolta AWF riduca i danni tissutali e la contaminazione citoplasmatica, l'AWF ottenuto utilizzando il nostro metodo (Metodo 1) è stato confrontato direttamente con un metodo alternativo (Metodo 2) basato sull'infiltrazione11 della pompa a vuoto dell'intera pianta. Il danno cellulare successivo all'infiltrazione è stato valutato tramite colorazione Trypan Blue, che ha rivelato una colorazione notevolmente ridotta nelle...

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Discussione

I veicoli elettrici delle piante sono emersi come attori chiave nell'immunità delle piante, in particolare nella mediazione della comunicazione tra regni e patogenifungini 32. Evidenze crescenti mostrano che le piante secernono EV nell'apoplasto, dove servono a fornire piccoli RNA (sRNA), mRNA e proteine che possono sopprimere la virulenza in patogeni invasori, come Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani e il patogeno oomiceto Phytophthora caps...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Il B.D. è sostenuto dalla borsa di studio Pathways to the Doctorate della Texas A&M University. B.H. è sostenuto da fondi iniziali della Texas A&M University e del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti HATCH 7009138 progetto numero: TEX08074.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,45 & micro; Filtri in nylon mVWR76479-032
1 ml di siringa inutileBD in Biologia309659
Filtro ultra centrifugo da 100 kDaAmiconUFC 910008
100 ml siringa inutileBD in Biologia551721050
Tubi conici da 15 mlVWR89039-664
Tubi conici da 50 mlVWR89039-656
Arabidopsis thaliana (Col-0)Linee mantenute in laboratorioNon applicabile
Griglie a 300 mesh carbonio-formvarTED PELLA01753-F
Nastro trasparenteNastro magico scozzeseS-9783
ParafilmFisher Scientific13-374-12
Buffer PBSRealizzato in casaNon applicabile
qEV colonna originale Gen2 35 nmIZON ScienceICO-35
Centrifuga refrigerataEppendorf5810R
Rotore a angolo fisso per centrifuga refrigerataEppendorfF-34-6-38
Rotore a canna oscillante per centrifuga refrigerataEppendorfA-4-62
SucrosioVWR470302-810
UltracentrifugaBeckman CoulterXPN-100
Tubi ultracentrifugheBeckman Coulter337986
Colorazione UranyLessScienze della microscopia elettronica250218-01

Riferimenti

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