Questo protocollo descrive la fabbricazione di cerotti a microago risolvibili che incorporano nanomicelle di α-lattalbumina caricate di capsaicina. Il metodo offre un approccio riproducibile e minimamente invasivo per la somministrazione transdermica mirata di bioattivi idrofobici al tessuto adiposo, facilitando una riduzione locale del grasso efficiente e potenzialmente ampliando le applicazioni nella gestione dell'obesità.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Fabbricazione di cerotti microagoli dissolubili caricati di nanomicelle α-lattialbumina per l'erogazione transdermica di capsaicina e la riduzione del tessuto adiposo
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo descrive la fabbricazione e l'applicazione di cerotti microago risolvibili (MN) contenenti nanomicelle di α-lattalbumina per la somministrazione transdermica mirata della capsaicina al tessuto adiposo. Il processo inizia con l'idrolisi enzimatica parziale della α-lattalbumina, che dà origine a peptidi anfifilici che si auto-assemblano in nanomicelle che racchiudono il composto idrofobo capsaicina. Le nanomicelle cariche di capsaicina vengono miscelate con una matrice di acido ialuronico (HA) e alcol polivinilico (PVA), fondute in stampi di polidimetilsossiano (PDMS) e centrifugate per produrre array da 10 × 10 MN. Dopo l'asciugatura sotto vuoto, i MN mostrano una resistenza meccanica adeguata per la penetrazione della pelle e si sciolgono entro circa 30 minuti dall'applicazione. I risultati rappresentativi includono microscopia elettronica a scansione, che conferma la morfologia uniforme delle MN, microscopia confocale, che verifica la penetrazione della pelle e il rilascio del farmaco, e esperimenti in vivo su topi con dieta ad alto contenuto di grassi (HFD) che mostrano riduzione della massa grassa, aumento dell'attività metabolica e induzione di brunimento adiposo. Questo protocollo fornisce un metodo riproducibile e minimamente invasivo per la somministrazione transdermica di bioattivi idrofobi, offrendo un approccio terapeutico promettente per la gestione dell'obesità. Questo protocollo è ottimizzato per la riproducibilità ed è adatto all'adattamento ad altri bioattivi idrofobi.
Introduzione
L'obesità è diventata una delle sfide sanitarie globali più urgenti, con una prevalenza in costante aumento sia nei paesi sviluppati che in quelli in via di sviluppo. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità, nel 2016 più di 650 milioni di adulti erano classificati come obesi e nel 2022 circa il 43% degli adulti di età ≥18 anni era sovrappeso e il 16% viveva conobesità 1. L'obesità è strettamente associata a sindrome metabolica, malattie cardiovascolari, diabete di tipo 2 e diversi tipi di cancro, imponendo ingenti oneri socioeconomici esanitari 2,3. Le strategie terapeutiche attuali, tra cui la restrizione alimentare, l'esercizio fisico, la farmacoterapia e la chirurgia bariatrica, offrono benefici solo parziali e spesso transitori. Questi approcci soffrono frequentemente di scarsa aderenza del paziente, efficacia limitata a lungo termine, alta invasività e effetti avversiindesiderati 4,5. Di conseguenza, c'è un'urgente necessità di terapie localizzate sicure, efficaci e conformi ai pazienti per la gestione dell'obesità.
I composti bioattivi naturali hanno suscitato un crescente interesse come agenti anti-obesità grazie alle loro azioni multi-mirate e ai loro profili di sicurezza generalmente favorevoli. Ad esempio, la rutina, un glicosido flavonoide, mostra effetti anti-lipogenici e regolatori metabolici sopprimendo i fattori di trascrizione adipogenica e promuovendo la biogenesimitocondriale 6. La capsaicina, il componente pungente del peperoncino, è stata segnalata come potenziata del dispendio energetico, inducendo l'arrossimento del tessuto adiposo bianco e inibindo l'accumulo lipidico tramite l'attivazione del potenziale transitorio del recettore vanilloide 1 (TRPV1) che segnala 7,8. Tuttavia, la traduzione clinica di questi composti è ostacolata da scarsa solubilità acquosa, bassa biodisponibilità orale, metabolismo rapido e, nel caso della capsaicina, irritazione gastrointestinale all'ingestione9.
I sistemi di somministrazione di farmaci basati su nanotecnologia offrono soluzioni promettenti a queste limitazioni. Liposomi, nanoparticelle polimeriche e nanoportatori a base di proteine possono migliorare notevolmente la solubilità, la stabilità e l'assorbimento cellularedei farmaci 10. In particolare, la α-latalbumina, una proteina del latte derivata dagli alimenti, può essere parzialmente idrolizzata in peptidi anfifilici che si auto-assemblano in nanomicelle capaci di incapsulare molecole idrofobe come lacapsaicina 11. Queste nanostrutture α-lattalbumina hanno dimostrato di migliorare la solubilità, la stabilità e la biodisponibilità di diversi bioattivi idrofobici nelle matrici alimentari efarmaceutiche 12,13. Tuttavia, la somministrazione sistemica di nanoportatori può ancora portare a una distribuzione dei tessuti fuori bersaglio e a una potenziale tossicitàsistemica 14.
La tecnologia a microago (MN) si è emersa come una piattaforma minimamente invasiva e a misura di utilizzo per i pazienti per la somministrazione transdermica di farmaci. Le MN risolvibili preparate con polimeri biocompatibili come l'acido ialuronico (HA) e l'alcol polivinilico (PVA) possono penetrare senza dolore nello strato corneo, dissolversi dopo l'inserimento e consentire una deposizione locale precisa di farmaci nei tessuti target15,16. La combinazione di nanoportatori con MN aumenta ulteriormente l'accumulo di farmaci nel tessuto adiposo sottocutaneo, riducendo al contempo l'esposizione sistemica e gli effetticollaterali 17. È importante sottolineare che i cerotti MN a base di HA e PVA sono in fase di sviluppo verso l'uso clinico per la somministrazione transdermica di vaccini e biofarmaci, dimostrando sicurezza favorevole, accettazione da parte dei pazienti e fabbricabilità suscala 18.
Sulla base di questi progressi, il presente studio descrive la fabbricazione di patch di MN dissolubili caricati di nanomicelle di α-lattalbumina che incapsulano la capsaicina. In questo protocollo, la α-latalbumina viene disciolta a 6 mg/mL e idrolizzata enzimaticamente per generare peptidi anfifilici che si auto-assemblano in nanomicelle cariche di capsaicina. Le nanomicelle vengono incorporate in una matrice HA/PVA (5% w/v ciascuna) e fondute in stampi di polidimetilsilossano (PDMS) per formare array da 10 × 10 MN con un'altezza dell'ago di 600 μm, una configurazione compatibile con i processi standard di micro-stampaggio e facilmente scalabile a patch più grandi di dimensioni umane. Questo disegno integrato dovrebbe migliorare la solubilità e la stabilità della capsaicina, fornire un rilascio pH-responsivo all'interno del tessuto adiposo e aumentare l'efficacia locale anti-obesità in vivo , promuovendo l'incoloramento del tessuto adiposo, sopprimendo la lipogenesi e migliorando i parametri metabolici sistemici. Sfruttando α-lattalbumina di grado alimentare e materiali di dissoluzione MN clinicamente avanzati, questa piattaforma offre una strategia traslazionalmente rilevante e minimamente invasiva che potrebbe essere adattata a cerotti su scala umana per una terapia localizzata e autosomministrata contro l'obesità.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con la Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio e sono stati approvati dal Comitato Etico degli Animali Sperimentali di Pechino. Il numero di approvazione assegnato al laboratorio/investigatore è AW03019102-3. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Preparazione di nanomicelle α-lattialbumina che racchiudono capsaicina 12
- Sciogliere α-latalbumina in acqua deionizzata fino a una concentrazione di 6 mg/mL e regolare il pH a 7,4. Mescola la soluzione con un mescolatore magnetico a 8-28 × g finché la α-lattalbumina non si dissolve completamente (tipicamente 20-30 minuti).
- Aggiungi la proteasi di Bacillus licheniformis (BLP) con un rapporto enzima-substrato di 1:100 (w/w).
- Incubare la miscela a 50 °C per 30 minuti per generare peptidi anfifilici.
- Terminare la reazione riscaldando la soluzione a 95 °C per 5 minuti, poi raffreddare a temperatura ambiente e filtrare attraverso una membrana da 0,22 μm.
- Sciogliere la capsaicina nell'etanolo fino a una concentrazione di 1 mg/mL. Aggiungi la soluzione di capsaicina a goccia nella soluzione peptidica sotto una mescolata delicata.
- Continuare a mescolare per 2 ore per permettere l'auto-assemblaggio dei nanomicelli.
- Rimuovere la capsaicina libera dialisando la miscela (MWCO 3,5 kDa) contro l'acqua deionizzata per 12 ore, sostituendo l'acqua ogni 4 ore.
- Liofilizzare (liofilizzare) le nanomicelle di α-latalbumina preparate.
- Caratterizzare le nanomicelle utilizzando analisi del potenziale TEM, DLS e zeta.
2. Fabbricazione di cerotti microago dissolubili 11
- Preparare la soluzione polimerica dissolvendo HA (5% p/v) e PVA (5% p/v) in acqua deionizzata a 60 °C e mescolare finché la soluzione non diventa limpida.
- Raffreddare la soluzione polimerica a temperatura ambiente e mescolarla con le nanomicelle cariche di capsaicina (M(Cap)) in un rapporto 4:1.
- Degassare la miscela sotto vuoto in un essiccatore collegato a una pompa a vuoto (circa −80 kPa) per 10 minuti per rimuovere le bolle d'aria prima di colarla in stampi PDMS.
- Carica 200 μL della miscela in stampi PDMS (10 × 10 aghi a matrice, altezza 600 μm).
- Centrifugare gli stampi a 1800 × g a RT per 10 minuti per garantire il riempimento completo delle cavità dei microaghi.
- Ripeti il riempimento una volta, seguita da una seconda centrifugazione nelle stesse condizioni del passaggio 2.5, e poi asciuga gli stampi sotto vuoto (circa −80 kPa) a temperatura ambiente per 12 ore.
- Spegna con cura le toppe a microago dagli stampi.
- Esamina la morfologia dei microaghi tramite SEM.
3. Test meccanico dei microaghi 19
- Posiziona la patch a microago sul palco di un analizzatore di texture con gli aghi rivolti verso l'alto.
- Comprimere il patch usando una sonda a una velocità di 20 μm/s fino a raggiungere uno spostamento di 0,7 mm.
- Annota la forza della frattura e conferma che sia ≥0,15 N per ago per garantire la capacità di penetrazione della pelle.
4. Test di inserzione e dissoluzione in vitro 11
- Rasi la pelle addominale dei topi e spolla per i test ex vivo .
- Posiziona la pelle escamada su un supporto gel di agarosio.
- Premi saldamente la toppa a microago sulla pelle per 30 secondi.
- Mantieni il contatto tra la cerotta e la pelle per 30 minuti.
- Osserva la dissoluzione dell'ago.
- Tingi la pelle con colorazioni H&E e visualizza i siti di inserimento sotto CLSM.
5. Studio di rilascio in vitro 11
- Immergi le patch a microago in un buffer PBS (pH 6,5 o 7,4) a 37 °C.
- A intervalli definiti, preleva i campioni del buffer e rifornisci immediatamente con un volume uguale di nuovo buffer.
- Determinare la concentrazione di capsaicina nei campioni raccolti utilizzando HPLC.
- Confronta i profili di rilascio a diverse condizioni di pH usando HPLC.
6. Applicazione in vivo in topi obesi indotti da HFD 11
- Indurre l'obesità nei topi C57BL/6N alimentando una dieta ricca di grassi (HFD, 60% kcal da grassi) per 8 settimane.
- Dividere casualmente i topi in cinque gruppi: controllo normale, controllo HFD, cerottura microagola micella vuota (MP-M), iniezione nanomicelle caricata di capsaicina (InJ-M(Cap)) e microneedle microneedle carico di capsaicina (MP-M(Cap)).
- Depilare la regione inguinale di ogni topo.
- Applica un cerotto microago sull'area depilata ogni 2 giorni per 28 giorni e tieni il cerotto fermo per 30 minuti.
- Registra il peso corporeo e l'apporto alimentare ogni 2 giorni durante il periodo di trattamento.
- Analizza la composizione del grasso e dei tessuti magri tramite risonanza magnetica al termine del trattamento.
- Valuta l'attività fisica, il consumo di ossigeno, la produzione di CO₂ e il quoziente respiratorio (RQ) nelle gabbie metaboliche secondo le istruzioni del produttore.
- Raccogliere iWAT, sBAT e organi principali, fissare, inserire, sezionare e colorare i tessuti con H&E, e valutare le modifiche istologiche tramite microscopia optica.
- Eseguire Western blotting per TRPV1, PPARγ, C/EBPα, UCP1 e Cyt C utilizzando procedure standard.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Morfologia e caratterizzazione delle nanomicelle
La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) ha mostrato che le nanomicelle α-lattulbumina erano particelle sferiche uniformemente disperse con una distribuzione di dimensioni ridotta (Figura 1). Dopo l'incapsulamento della capsaicina, il diametro medio delle particelle è aumentato da ~22 nm a ~30 nm, indicando un carico riuscita del farmaco nel nucleo micellare. Costantemente, il potenz...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo studio dimostra che i cerotti a microago risolvibili (MN) caricati con nanomicelle di α-latalbumina che incapsulano capsaicina (M(Cap)) possono ottenere effetti anti-obesità localizzati e minimamente invasivi. α-Lactalbumina nanomicelle incapsulava efficacemente la capsaicina idrofobica, ne migliorava la dispersibilità acquosa e aumentava l'assorbimento cellulare, portando a una maggiore inibizione dell'adipogenesi e a una biogenesi mitocondriale più prominente negli adipociti 3T3...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Non ci sono dichiarazioni.
Ringraziamenti
Questo progetto è stato sostenuto dal Fondo per i Giovani Scienziati della National Natural Science Foundation of China (n. 32202024), dal Fondo per i Giovani Scienziati della Fondazione Provinciale per le Scienze Naturali dello Shandong (n. ZR2024QC103), il Piano Chiave di Ricerca e Sviluppo della Provincia di Shandong (2025CXGC010803, 2022CXPT022), il Sistema Tecnologico per l'Industria Avicola della Provincia di Shandong (SDAIT-11-10) e il Programma di Collaborazione Università-Industria finanziato dall'Ufficio dell'Istruzione di Yantai City, Cina (Sviluppo della Piattaforma di Vaccini di Nuova Generazione per Animali da Compagnia).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Preadipociti 3T3-L1 | ATCC | CL-173 | Linea cellulare per studi sull'adipogenesi |
| Proteasi di Bacillus licheniformis (BLP) | Sigma-Aldrich | P5380 | Idrolisi enzimatica della &alfa;-latalbumina |
| Capsaicina (≥ 98%) | Sigma-Aldrich | M2028 | Composto attivo da incapsulare |
| Centrifuga (≥ 4000 rpm) | Eppendorf | 5810R | Per riempire gli stampi |
| Microscopio a scansione laser confocale (CLSM) | Zeiss | LSM 900 | Visualizzare la distribuzione e la penetrazione delle micelle |
| Colorante fluorescente Cy3 | GE Healthcare | PA23001 | Per la marcatura delle nanomicelle |
| Coloranti fluorescenti Cy5 o Cy7 | Fanbo Biochemical, Pechino, Cina | N/A | Per l'imaging della biodistribuzione |
| Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium (DMEM) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 11965-092 | Per la coltura cellulare |
| Etanolo (≥ 99.7%) | Reagente chimico Sinopharm | 100092683 | Solvente per la capsaicina |
| Siero fetale bovino (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 16000-044 | Per la coltura cellulare |
| Dieta ad alto contenuto di grassi (60% kcal grassi, D12492) | Diete di ricerca, USA | D12492 | Per indurre l'obesità nei topi |
| Acido ialuronico (HA, Mw 100– 300 kDa) | Aladdin Biochemical Technology Co., Cina | H108124 | Polimero per la fabbricazione di microaghi |
| Isoflurano | RWD, Cina | R510-22-10 | Anestetico |
| Sistema metabolico della gabbia | Panlab, USA | N/A | Valutare attività, consumo di ossigeno e QR |
| Acqua deionizzata Milli-Q | Millipore | N/A | Solvente |
| Sistema MRI | NiuMag, Cina | MesoQMR23-060H-I | Per misurare la composizione corporea grassa/magra |
| Stampi a microaghi PDMS (10 e volte 10.600 e mu; m altezza) | Blueacre Tecnologia o personalizzazione | N/A | Fabbricazione di microaghi |
| Penicillina e dash; Streptomicina | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 15140-122 | Per la coltura cellulare |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Buffer per studi in vitro e in vivo |
| Polivinilico (PVA, Mw 30– 70 kDa) | Aladdin Biochemical Technology Co., Cina | P109389 | Polimero per la fabbricazione di microaghi |
| Microscopio elettronico a scansione (SEM) | FEI Tecnai | G2 F30 | Per caratterizzare la morfologia dei microaghi |
| Analizzatore di texture | BosinTech, Shanghai, Cina | TCAO. XTC-20 | Per testare la resistenza dei microago |
| Soluzione blu di tripano (0,4%) | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Per visualizzare i siti di inserimento del microago |
| UV– Spettrofotometro a vis. | PerkinElmer | Lambda 35 | Per i saggi di rilascio di farmaci |
| Forno/essiccatore a vuoto | Thermo Fisher Scientific | N/A | Per asciugare i microaghi |
| Apparecchiatura Western blotting | Bio-Rad | Tetra Mini-PROTEANO | Analisi proteica |
| α-Lactalbumin (≥ 95%) | Sigma-Aldrich | L6010 | Fonte proteica per la formazione di nanomicelle |
Riferimenti
- Obesity and overweight. WHO Fact Sheets. , World Health Organization. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/obesity-and-overweight (2025).
- Bray, G. A., Kim, K. K., Wilding, J. P. H. Federation, W. O. Obesity: A chronic relapsing progressive disease process. A position statement of the World Obesity Federation. Obes Rev. 18 (7), 715-723 (2017).
- Hruby, A., Hu, F. B. The epidemiology of obesity: A big picture. Pharmacoeconomics. 33 (7), 673-689 (2015).
- Dietrich, M. O., Horvath, T. L. Limitations in anti-obesity drug development: The critical role of hunger-promoting neurons. Nat Rev Drug Discov. 11 (9), 675-691 (2012).
- Garvey, W. T., et al. American Association of Clinical Endocrinologists and American College of Endocrinology comprehensive clinical practice guidelines for medical care of patients with obesity. Endocr Pract. 22, 1-203 (2016).
- Li, Z., Liang, S., Sun, H., Bao, C., Li, Y. Antilipogenesis effect of rutin-loaded liposomes using a microneedle delivery system. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (47), 54294-54303 (2023).
- Hsu, C. L., Yen, G. C. Effects of flavonoids and phenolic acids on the inhibition of adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes. J Agric Food Chem. 55 (21), 8404-8410 (2007).
- Zhang, L. L., et al. Activation of transient receptor potential vanilloid type-1 channel prevents adipogenesis and obesity. Circ Res. 100 (7), 1063-1070 (2007).
- Zheng, J., Zheng, S., Feng, Q., Zhang, Q., Xiao, X. Dietary capsaicin and its anti-obesity potency: from mechanism to clinical implications. Biosci Rep. 37 (3), BSR20170286(2017).
- Negahdari, R., et al. Therapeutic benefits of rutin and its nanoformulations. Phytother Res. 35 (4), 1719-1738 (2021).
- Bao, C., et al. Microneedle patch delivery of capsaicin-containing α-lactalbumin nanomicelles to adipocytes achieves potent anti-obesity effects. Adv Funct Mater. 31 (20), 2011130(2021).
- Hu, Y., et al. The construction of enzymolyzed α-lactalbumin-based micellar nanoassemblies for encapsulating various kinds of hydrophobic bioactive compounds. Food Funct. 10 (12), 8263-8272 (2019).
- Wang, Q., et al. The stability and bioavailability of curcumin-loaded α-lactalbumin nanocarriers formulated in functional dairy drink. Food Hydrocoll. 131, 107807(2022).
- Luo, T., et al. Adipose tissue-targeted drug delivery for treating obesity: Current opportunities and challenges. Drug Deliv. 32 (1), 2547751(2025).
- Patel, D., Patel, N., Parmar, M., Kaur, N. Transdermal drug delivery system: An overview. Int J Toxicol Pharmacol Res. 1, 61-80 (2011).
- Singh, P., et al. Single-administration self-boosting microneedle patch for the treatment of obesity. Adv Ther. 7 (9), 2400028(2024).
- Than, A., et al. Transdermal delivery of anti-obesity compounds to subcutaneous adipose tissue with polymeric microneedle patches. Small Methods. 1 (11), 1700269(2017).
- Nguyen, H. X., Nguyen, C. N. Microneedle-mediated transdermal delivery of biopharmaceuticals. Pharmaceutics. 15 (1), 277(2023).
- Chu, L. Y., Choi, S. O., Prausnitz, M. R. Fabrication of dissolving polymer microneedles for controlled drug encapsulation and delivery: Bubble and pedestal microneedle designs. J Pharm Sci. 99 (10), 4228-4238 (2010).
- Richmond, W., Wogan, M., Isbell, J., Gordon, W. P. Interstrain differences of in vitro metabolic stability and impact on early drug discovery. J Pharm Sci. 99 (11), 4463-4468 (2010).
- Amini-Nik, S., Yousuf, Y., Jeschke, M. G. Scar management in burn injuries using drug delivery and molecular signaling: Current treatments and future directions. Adv Drug Deliv Rev. 123, 135-154 (2018).
- Prausnitz, M. R., Langer, R. Transdermal drug delivery. Nat Biotechnol. 26 (11), 1261-1268 (2008).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
