Articolo metodologico

Test antiproliferativo della placca per lo screening in vitro di molecole bioattive contro i tachizoiti di Toxoplasma gondii

DOI:

10.3791/69725

⸱

23 gennaio 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratório de Quimioterapia de Protozoários Egler Chiari, Departamento de Parasitologia - ICB, Universidade Federal de Minas Gerais

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro mira a descrivere un metodo semplice di analisi delle placche per aiutare nello screening di nuove molecole bioattive contro lo stadio tachizoite del protozoo Toxoplasma gondii.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La toxoplasmosi è un'infezione parassita comunemente correlata a lesioni oculari e malformazioni neonatali. Dall'inizio degli anni '50, il trattamento di prima linea di questa malattia si basa sulla combinazione di sulfadiazina, pirimetamina e acido folinico. In questi anni sono stati introdotti solo pochi regimi alternativi. Questo evidenzia la necessità di scoprire nuove molecole bioattive contro Toxoplasma gondii. Dato che questo patogeno è un parassita intracellulare obbligato, lo screening tradizionale dei farmaci in laboratorio richiede tipicamente materiali e attrezzature costose, come saghi con proteine fluorescenti o parassiti che esprimono β-galactosidasi. Inoltre, metodi come la quantificazione della microscopia ottica possono richiedere tempo. Il test della placca è un metodo che valuta l'intensità della proliferazione intracellulare di patogeni misurando il numero di regioni e l'area di distruzione in uno strato monocellulare danneggiato dal ciclo litico del parassita. Questo lavoro descrive un protocollo ottimizzato per la valutazione della placca progettato per lo screening delle molecole attive contro tachizoiti intracellulari di T. gondii in vitro. Questo protocollo utilizza materiali economici e un impianto di laboratorio semplice, producendo risultati rapidi e riproducibili che facilitano l'identificazione di nuove molecole attive contro questo parassita da parte di vari gruppi di ricerca.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La tossoplasmosi è una malattia zoonotica con una distribuzione eterogenea a livello mondiale, che colpisce circa un terzo della popolazionemondiale 1,2. I sintomi di questa malattia sono associati al grado di immunità dell'ospite e alla replicazione delparassita 3,4. La fase acuta della malattia, caratterizzata dalla replicazione dello stadio tachizoite, è generalmente asintomatica negli individuiimmunocompetenti 5,6. Al contrario, gli individui immunodepressi presentano sintomi più frequenti, inclusi sintomi aspecifici come malessere generale, febbre, nonché encefalite e retinocaroidite 6,7,8. Nonostante la sua importanza clinica, il trattamento attualmente disponibile è inefficace contro lo stadio di Bradyzoite Toxoplasma gondii (in fase cronica) e non porta a una cura parassitologica. Gli eventi avversi ai farmaci attuali riducono anche l'aderenza al trattamento 9,10,11. È quindi necessario trovare nuovi trattamenti, più sicuri ed efficaci per la toscosoplasmosi.

Lo sviluppo di nuovi farmaci richiede un lungo periodo di tempo, miliardi di dollari di investimenti e molteplici fasi di ricerca. Poiché i costi di sviluppo dei farmaci sono elevati, l'industria farmaceutica deve selezionare in anticipo il miglior candidato farmaco12, 13, 14, 15. Per lo screening farmacologico possono essere impiegati diversi approcci, tra cui i metodi in silico, l'uso dell'intelligenza artificiale e l'approccio più comune, i metodibiologici 16,17,18,19. Lo screening biologico in vitro prevede l'uso di librerie di molecole (chemolibrete) per rendere disponibili le molecole per l'identificazione dell'attivitàbiologica 20,21,22. Poiché queste chemiolibrerie contengono una diversità di molecole, è necessario ottimizzare risorse e tempo. Pertanto, il test della placca può essere un metodo per aiutare a selezionare rapidamente nuove molecole bioattive contro vari patogeni, come T. gondii.

Il test della placca è un metodo in vitro che utilizza il ciclo litico dei patogeni intracellulari per quantificare la concentrazione di patogeni in uno strato monocellulare, portando alla formazione di placche necrotiche neltempo 23. Il primo studio con la tecnica del test della placca risale all'inizio della seconda metà del XX secolo, quando il team di Renato Dulbecco utilizzò monostrati di fibroblasti di pollo infettati dal virus dell'encefalomielite equina occidentale per dimostrare la proporzionalità tra il numero di placche necrotiche formate e la concentrazione del virus16. L'uso di questa tecnica in T. gondii è stato anche ben descritto, come già chiarito da Ufermann ecollaboratori 23.

Uno dei primi studi a utilizzare il test della placca per osservare una risposta nell'inibizione di T. gondii contro diverse concentrazioni di molecole fu condotto da Roberts et al. nel 1976. Sebbene il test a placca sia ampiamente utilizzato per la titolazionevirale 16,24, questo metodo è stato impiegato da pochi gruppi di ricerca per valutare l'attività anti-T. gondii delle molecole 21,22,25,26,27. Alla ricerca di un saggio che potesse permettere di testare librerie di composti ad alta capacità e utilizzando materiali economici e un semplice impianto di laboratorio, il test sulla placca fu esplorato come alternativa agli screening di routine di laboratorio per i farmaci. Questo portò all'istituzione di un protocollo ottimizzato che consente la valutazione simultanea dell'attività di diverse molecole utilizzando materiali semplici e un sistema di acquisizione di immagini, producendo risultati rapidi e riproducibili. Pertanto, descriviamo qui il protocollo dettagliato, validato nel nostro laboratorio, per aiutare altri gruppi nello screening di nuove molecole bioattive contro tachizoiti di T. gondii.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La manipolazione di colture di parassiti e cellule, così come lo smaltimento e la destinazione dei rifiuti, sono stati effettuati in conformità con la legislazione brasiliana, come richiesto dall'Agenzia Nazionale di Vigilanza Sanitaria (ANVISA) RDC nº 222/2018. Tutte le procedure sono state supervisionate dal Comitato Interno per la Biosicurezza (CIBio) dell'ICB-UFMG. Questo studio non riguarda l'uso di animali, esseri umani o organismi geneticamente modificati. Sovvenzioni di CNPq, CAPES e FAPEMIG hanno sostenuto questo lavoro. ESMD (CNPq 308082/2023-0) e RWAV (CNPq 305574/2021-3) sono borsisti CNPq per la produttività. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione del mezzo RPMI-1640 integrato

NOTA: Il mezzo RPMI-1640 è stato originariamente sviluppato per la coltivazione di cellule leucemiche umane sia in sospensione che in monostrato. Tuttavia, studi successivi hanno dimostrato la sua idoneità per una varietà di coltivazioni cellulari di mammiferi.

  1. Alla bottiglia contenente 250 mL di RPMI-1640, aggiungi 2,5 mL di 200 mM di L-glutamina (100x).
  2. Aggiungi 2,5 mL di antibiotico-antimicotico (100 volte) al substrato.
  3. Successivamente, aggiungi 5,0 mL o 25 mL di siero fetale bovino (FBS) alla bottiglia con RPMI-1640 (2% o 10% FBS).
  4. Conserva in frigorifero (2-8 °C).

2. Preparazione del PBS (1x)

NOTA: Per preparare 1 L di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a pH 7,2 e 25 °C, segui i passaggi seguenti.

  1. Misurare separatamente le seguenti quantità di sale: 1,4 g di Na2HPO 4, 0,24 g diKH 2PO4 e 8,5 g di NaCl.
  2. Aggiungi i sali pesati separatamente in un becher da 1 L contenente 800 mL di acqua deionizzata. Mescola la soluzione finché tutti i sali non sono completamente dissolti.
  3. Misura il pH della soluzione utilizzando un misuratore di pH. Dovrebbe essere 7.2. Se necessario, si utilizzano 6 M di acido cloridrico o 3 M di idrossido di sodio per portare il pH a 7,2.
  4. Utilizzando una barra di vetro, trasferisci quantitativamente la soluzione sopra in una fiaschetta volumetrica da 1 L.
  5. Aggiungere acqua deionizzata alla fiaschetta volumetrica finché il volume totale non raggiunge 1 L, assicurandosi che il menisco sia al punto corretto.
  6. Mescola la soluzione nella fiaschetta volumetrica, invertendola delicatamente.
  7. Dividere la soluzione finale PBS in bottiglie di vetro più piccole (100-250 mL).
  8. Autoclave le bottiglie a 121 °C, 1,1 kg/cm 2 per 15 minuti.
  9. Conserva la soluzione PBS in frigorifero (2-8 °C).
    NOTA 1: Usa PBS a 37 °C per tutti gli esperimenti.

3. Preparazione di una soluzione di formaldeide al 4%

  1. Mescolare 35,68 mL di 1x PBS e 4,32 mL di formaldeide P.A. al 37%.
  2. Conserva la soluzione in una fiaschetta di plastica a temperatura ambiente (25 °C).

4. Preparazione della soluzione stock delle molecole attive

NOTA: Controlla la solubilità delle molecole in DMSO, DMF, etanolo o acqua e seleziona il solvente più adatto. Per minimizzare i potenziali effetti di tossicità diluente sui parassiti, la soluzione di base dovrebbe essere almeno 1000 volte più concentrata rispetto alla concentrazione più alta del composto da testare. Ad esempio, se la concentrazione massima da testare è 1 μM, la soluzione standard dovrebbe essere almeno 1 mM. Per preparare una soluzione di stock da 10 mM, segui i passaggi seguenti:

  1. Pesa il composto da testare utilizzando una bilancia analitica con una precisione di 0,0001 g.
  2. Determina il volume del diluente necessario per ottenere una soluzione da 10 mM usando la seguente formula:
    V (mL) = (Y MM) x 100
    Dove:
    Y: massa del composto in milligrammi (mg)
    MM: massa molare del composto
    V (mL): volume del solvente
  3. Aggiungi il diluente al recipiente contenente il composto pesato.
  4. Omogeneizzare usando un miscelatore a vortice.
  5. Dividere la soluzione in piccole aliquote e conservarle in un congelatore a -20 °C.
  6. Prima dell'uso, lascia scongelare completamente la soluzione aliquota e poi omogeneizzare di nuovo utilizzando un miscelatore a vortice.
    NOTA: Per preparare soluzioni sub-stock con altre concentrazioni, utilizzare la seguente formula
    V (μL) = x mM × y μL/10 mM
    V (μL) ∶ volume della soluzione stock necessaria per preparare la nuova soluzione
    x mM: concentrazione desiderata della nuova soluzione.
    y (μL): volume desiderato della nuova soluzione.

5. Coltura cellulare

  1. Usa le cellule NHDF facendo roteare delicatamente la fiala nel bagno d'acqua a 37 °C.
    NOTA: Le cellule NHDF possono essere sostituite da fibroblasti umani del prepuzio (HFF) o da altre linee cellulari che formano un monostrato stabile. Il test della placca funziona solo con linee cellulari che formano un monostrato stabile, cioè cellule la cui crescita si interrompe per contatto. Le linee cellulari che non mostrano inibizione della proliferazione, come le linee tumorali, non possono essere utilizzate, poiché le cellule competono con i parassiti per i nutrienti nel mezzo colturale e riempiono l'area della placca formata dai parassiti.
  2. Trasferire immediatamente le cellule scongelate in un tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di mezzo RPMI-1640 integrato (vedi passo 1).
  3. Centrifuga le celle a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Quando il ciclo di centrifuga è terminato, un pellet cellulare dovrebbe essere visibile sul fondo del tubo.
  4. Scartare con cura il soprandanante per preservare la pellet cellulare.
  5. Risospendere il pellet cellulare con 12 mL di mezzo RPMI-1640 integrato contenente il 10% di FBS e seminare tre fiaschetteda 25 cm o unafiaschetta 2 da 75 cm. Dopo 2-3 giorni, esaminare la fiaschetta di coltura utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertita per determinare il recupero della proliferazione cellulare (le cellule dovrebbero mostrare almeno il 40%-50% di confluenza).
  6. Quando le cellule raggiungono un monostrato completo (confluenza al 100%), rimuovere il mezzo dalla fiaschetta con una pipetta Pasteur. Scarta il medium e la pipetta.
  7. Aggiungi 1-2 mL di PBS 1 volta nella fiaschetta, aspetta 1 minuto e rimuovi il PBS.
  8. Aggiungi 1 mL di soluzione di tripsina-versene allo 0,05% alla fiaschetta e mettila nell'incubatrice con il 5% diCO2, umidità e una temperatura di 37 °C per 2 minuti.
  9. Dopo 2 minuti, osserva le cellule con il microscopio rovesciato per confermare che si siano staccate.
  10. Risospendere le cellule staccate con un mezzo RPMI-1640 integrato da 24 mL al 10% di FBS utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL e un distributore automatico di pipette.
    NOTA: Ogni fiaschetta di coltura da 25 o 75 cm² con uno strato monostrato confluente è in grado di replicarsi in 5 o 15 altre bottiglie di coltura da 25 cm², rispettivamente.
  11. Dopo aver aggiunto il volume necessario di mezzo (24 mL), omogeneizzare la sospensione cellulare con la pipetta sierologica.
  12. Trasferire 4 mL della sospensione cellulare in mezzo a ogni fiaschetta da25 cm o da 12 mL a 75 cma 2 fiasche. Ricorda di lasciare 4 mL di sospensione cellulare nella fiaschetta iniziale.
  13. Posizionare le fiaschette in un incubatore con il 5% diCO2, umidità e una temperatura di 37 °C.
  14. Aspettare che si ottenga un monostrato completo di cellule (100% della confluenza).
    NOTA: Identifica ogni fiaschetta con la data e il numero di passaggio.

6. Preparazione delle piastre di coltura

  1. Ispezionare l'integrità del monostrato cellulare (confluenza al 100%) nella fiaschetta di coltura utilizzando un microscopio invertito.
  2. Segui la procedura di tripsinizzazione descritta sopra (passaggi 5.7-5.9).
  3. Utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL, risospendi le cellule staccate con un mezzo RPMI da 4 mL e trasferiscile in un tubo conico da 15 mL.
  4. Centrifuga a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per 5 minuti.
  5. Scartate con cura il soprandanante.
  6. Sospendere la pellet cellulare con 1 mL di nuovo mezzo RPMI-1640.
  7. Omogeneizzare usando un miscelatore a vortice.
  8. Trasferire 10 μL in un tubo da 1,5 mL contenente 490 μL di una soluzione di formaldeide al 4% (diluizione 1:50) utilizzando una micropipetta con punta sterile.
    NOTA: Fattore di diluizione = (Volume totale (μL)) / (Volume campione (μL))
  9. Allesti una camera Neubauer.
  10. Omogeneizzare la soluzione fissativa con i parassiti (preparati nell'articolo 6.8) utilizzando un miscelatore a vortice.
  11. Aggiungere 10 μL della soluzione con i parassiti fissati nella camera di Neubauer.
  12. Contare i quattro quadranti della camera di Neubauer, ciascuno composto da 16 caselle.
  13. Determina il numero di celle per mL:
    Numero di celle (per mL) = [(n° celle per quadrato)/4] x Fd x 104
    Dove:
    Fd (fattore di diluizione) = 50
  14. Seminare ogni pozzetto di una piastra di coltura da 12 o 6 pozzi, con rispettivamente 5 × 10da 4 o 1 x 10da 5 cellule, risospese in 1 o 2 mL di mezzo RPMI-1640 integrato con il 10% di FBS.
  15. Posizionare le piastre in un incubatore con il 5% diCO2, un'atmosfera umida e una temperatura di 37 °C.
  16. Aspetta che il monostrato cellulare raggiunga la confluenza al 100%.

7. Coltivazione in vitro di tachizoite

NOTA: Per il test della targa, consigliamo il ceppo RH di T. gondii.

  1. Scartare il vecchio mezzo da unafiaschetta 2 di 25 cm contenente un monostrato completo (confluenza al 100%) di celle NHDF utilizzando una pipetta Pasteur. Successivamente, aggiungi 4 mL di nuovo medium completo RPMI-1640 alla fiaschetta.
  2. Trasferire 5 μL di un sovrantantante contenente tachizoiti fresche uscite da una fiaschetta precedente con una coltura infetta lisata. Il volume di 5 μL consente un ciclo litico di 6-7 giorni per fiaschetta da 25 cm².
  3. Posizionare la nuova fiaschetta infetta in un incubatore con il 5% diCO2, un'atmosfera umida e una temperatura di 37 °C.

8. Quantificazione del tachizoite

  1. Rimuovere il mezzo dalla fiaschetta di coltura contenente parassiti appena usciti utilizzando una pipetta Pasteur e trasferirla in un tubo conico da 15 mL.
  2. Centrifuga il tubo a 760 x g a temperatura ambiente per 2 minuti. Quando il ciclo di centrifuga termina, si vede un pellet visibile sul fondo del tubo.
  3. Scartate con cura il soprandanante.
  4. Risospendere il pellet parassita con 1 mL di medium RPMI-1640 fresco con FBS al 2%.
  5. Omogeneizzare la sospensione del parassita usando un miscelatore a vortice.
  6. Trasferire 10 μL della sospensione del parassita in un tubo da 1,5 mL contenente 490 μL di soluzione di formaldeide al 4% (diluizione 1:50) con una pipetta a punta sterile.
  7. Segui i passaggi descritti in 6.10 a 6.12.
  8. Determina il numero di tachizoiti per 1 mL.
    NOTA: Numero di tachizoiti (per mL) = [(n° tachizoiti di quadrato)/4] x Fd x 104
    Dove:
    Fd (fattore di diluizione) = 50

9. Preparazione del test della placca per molecole attive di creing S da una chemiobiblioteca

NOTA: Questo saggio mira a identificare molecole che riducono la proliferazione di T. gondii di oltre il 50% a una concentrazione di 1 μM. Prima di iniziare questo saggio, deve essere eseguito un test di citotossicità (ad esempio, metodo MTS o metodo MTT) per assicurarsi che le concentrazioni di composto utilizzate nel test sulla placca non siano tossiche per le cellule ospiti.

  1. Confermare che le colture cellulari hanno raggiunto la confluenza del 100% nelle lastre a 12 o 6 pozzi.
  2. Scartare il vecchio mezzo e aggiungere 1 o 2 mL di medium RPMI-1640 fresco integrato con 2% FBS in ciascun pozzo nelle piastre a 12 e 6 pozzi, rispettivamente.
  3. Aggiungi i composti da testare in ogni pozzo alla concentrazione desiderata. Per lo screening iniziale si raccomanda una concentrazione di 1 μM.
    NOTA: Usa la seguente formula per calcolare il volume da aggiungere a ciascun pozzo.
    V (μL) = (Concentrazione finale nel pozzo (μM) x Volume all'interno del pozzo (μL))/(Soluzione stock (μM))
  4. Aggiungi 600 tachizoiti (per la piastra a 12 pozzi) o 1.000 tachizoiti (per la piastra a 6 pozzi) della deformazione RH a ciascun pozzo della placca.
    NOTA: Variazioni nella proliferazione dei parassiti possono verificarsi a causa di differenze nei fornitori di substrato colturale o FBS, o nelle linee cellulari utilizzate. Pertanto, si raccomanda di condurre un esperimento pilota per determinare il numero ottimale di parassiti per ciascuna condizione di laboratorio. Regolare la quantità di parassita utilizzata per questo esperimento, se necessario.
  5. Mettere le piastre in un incubatore a 37 °C con il 5% diCO2 e un'atmosfera umida per 7 giorni senza alcun disturbo.
    ATTENZIONE: Le piastre non devono essere spostate o toccate durante il periodo di incubazione di 7 giorni. Se ciò accade, l'esperimento sarà rovinato.

10. Colorazione a lastre con viola cristallino e acquisizione di immagini

  1. Dopo 7 giorni, rimuovi il substrato da ogni pozzo.
  2. Lava ogni pozzo con cura con 1x PBS a temperatura ambiente.
  3. Elimina il PBS e aggiungi con attenzione 1 mL di alcol al 70% in ogni pozzo. Lascia a temperatura ambiente per 15 minuti, poi scarta.
  4. Aggiungi la soluzione acquosa di viola cristallina allo 0,5% e lascia riposare per 30 minuti a temperatura ambiente.
  5. Rimuovi la soluzione violetta cristalline.
  6. Lava ogni pozzo con cura, una volta con acqua deionizzata.
    ATTENZIONE: Quando rimuovi il mezzo o PBS durante i passaggi di lavaggio, non toccare il fondo del pozzo con la punta della pipetta, poiché ciò potrebbe danneggiare l'integrità del monostrato. Durante i passaggi di lavaggio, non gettare un getto di PBS o alcol direttamente sulle celle. Aggiungili accuratamente lungo il bordo del pozzo.
  7. Metti il piatto a faccia in giù su carta assorbente per drenare l'acqua in eccesso e lascialo asciugare a temperatura ambiente per 24 ore.
  8. Fotografa le targhe utilizzando uno scanner a pianale ad altadefinizione 28,29 o un sistema di documentazione di immagini configurato per l'opzione Coomassie bluegel 21,22,30.

11. Saggio di reversibilità

NOTA: L'obiettivo principale del saggio di reversibilità con i tachizoiti di T. gondii è determinare se la capacità di proliferazione dei parassiti trattati venga completamente abolita o ridotta dopo la rimozione dei composti dal mezzo dicoltura 31.

  1. Semina una piastra a 6 pozzi con le cellule NHDF come descritto nel passaggio 6. Per ogni pozzo, aggiungere 1 x 105 celle risospese in 2 mL di RPMI-1640 integrato con FBS al 10%.
    NOTA: Una volta che il monostrato cellulare raggiunge il 100% di confluenza in ogni pozzo, la lastra è pronta per il test della placca.
  2. Scartare il substrato e aggiungere 1 x 104 tachizoitesi risospesi in 2 mL di substrato fresco con il 2% di FBS in ogni pozzo.
  3. Dopo aver lasciato che i tachizoiti interagiscano con le cellule NHDF per 1 ora, si aggiungono i composti selezionati a una concentrazione finale vicina al valore inibitorio del 90% (IC90). Un pozzo contenente solo il diluente del farmaco viene utilizzato come controllo positivo.
  4. Trattare i tachizoiti per 4 giorni in incubatore a 37 °C con il 5% diCO2 e un'atmosfera umida.
  5. Dopo il periodo di trattamento di 4 giorni, lava la piastra tre volte con 1x PBS a 37 °C per garantire la completa rimozione dei composti.
  6. Aggiungi a ogni pozzo 2 mL di mezzo fresco senza i composti e tieni la piastra nell'incubatrice per altri 7 giorni.
  7. Tingi la lastra con un colorante viola cristallino e fotografala come descritto nel passo 10.

12. Analisi delle immagini usando il software ImageJ

  1. Apri le immagini usando il softwareImageJ 32.
  2. Seleziona l'area corrispondente a un pozzo usando lo strumento di selezione ovale (Figura 1A,B).
    NOTA: Quando effettui la selezione, ignorare le regioni ai margini del pozzo che presentano difetti. Questi sono comunemente presenti ai bordi del pozzo.
  3. Copia e crea una nuova immagine: copia l'area selezionata premendo Ctrl + C; creare un nuovo file immagine premendo Ctrl + N; incolla l'immagine copiata nella nuova finestra nera usando Ctrl + V.
    NOTA: Quando crei la nuova immagine, usa le impostazioni predefinite: 8-bit, riempire con nero, 512 x 512 pixel e una fetta (Figura 1C).
  4. Naviga a: Immagine > Regola > Soglia, oppure premi Ctrl + Shift + T (Figura 1D).
  5. Nella finestra Soglia, seleziona le opzioni Huang e Red , poi clicca su Auto (Figura 1E).
  6. Clicca su Analizza, poi seleziona Analizza particelle (Figura 1F). Mantieni le opzioni predefinite nella finestra che appare e clicca su OK (Figura 1G).
  7. Si aprirà una nuova finestra. Copia il valore visualizzato in %Area (evidenziato da un rettangolo rosso nella Figura 1H) per calcolare la percentuale di proliferazione o inibizione del parassita.
  8. Ripeti questi passaggi per ogni pozzo sulla piatta.
  9. Per calcolare la percentuale di proliferazione, si utilizza la seguente formula:
    % di proliferazione = (%Area trattata pozzo/%Area controllata) × 100
  10. Per calcolare la percentuale di inibizione, si utilizza la seguente formula:
    % di inibizione = [1- (%Area trattata/%Area di controllo pozzo)] × 100

Figura 1
Figura 1: Analisi passo dopo passo dei risultati nel software ImageJ. (A) Selezione dello strumento "Ovale". (B) Selezione dell'area di interesse nell'immagine. (C) Nuova finestra immagine (Ctrl + N) con impostazioni consigliate. (D) Passaggi per "Analisi della soglia dopo aver incollato l'area di interesse nella nuova finestra dell'immagine. (E) Huang e selezione delle opzioni rosse nella finestra Soglia, facendo sì che tutte le aree bianche vengano riempite in rosso. (F) Sequenza dei passaggi usati per "Analizza le particelle". (G) L'impostazione utilizzata per analizzare le particelle. (H) Il risultato della percentuale dell'area totale distrutta è mostrato nella finestra di riepilogo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

13. Analisi statistica

  1. Organizza i dati in un foglio Excel all'interno del software Office dopo aver calcolato la percentuale di inibizione della proliferazione.
  2. Apri il software GraphPad Prism 5.0 e clicca su XY (Sotto Nuova Tabella & Grafico).
  3. Nella sezione Y (sotto "barra X:error"), inserisci il numero di ripetizioni dei dati (tipicamente tre repliche biologiche). Questo numero può variare a seconda del numero di ripetizioni eseguite.
  4. Seleziona Solo Medio accanto al grafico e NON selezionare "Inserisci e traccia valori di errore già calcolati altrove", poi clicca su Crea.
  5. Posiziona i dati di concentrazione sull'asse X e i dati percentuali di inibizione della proliferazione nelle colonne A, A:Y1, A:Y2, A:Y3, A:Y4, A:Y5.
  6. Clicca su = Analizza, poi su Trasforma, e poi OK. Si aprirà una nuova finestra. In questa nuova finestra, clicca su Trasforma i valori X usando X = Log(X), poi clicca su Crea un nuovo grafico dei risultati, e infine OK.
  7. Clicca su = Analizza e poi su Normalizza. Si aprirà una nuova finestra. Nella sezione Come è definito lo 0%, clicca e imposta Y = 0.0. Nella sezione Come è definito al 100%, clicca e imposta Y = 100; seleziona Percentuali e clicca su Crea un nuovo grafico dei risultati.
  8. Clicca sul simbolo: Adatta una curva con regressione non lineare situata sopra = Analizza. Clicca su Dose-response - Inibizione, poi su log (inibitore) vs. risposta normalizzata - pendenza variabile, e poi clicca su OK.
    NOTA: Si aprirà una finestra che mostrerà i seguenti risultati: l'IC50 (Concentrazione Inibitoria del 50%), l'intervallo di confidenza del 95% e il valore R2. Questi valori sono fondamentali e dovrebbero essere inclusi in una tabella dei risultati all'interno dell'articolo.
  9. Per stimare altre concentrazioni inibitorie, come IC25, IC90 o IC95, si utilizza il link (https://www.graphpad.com/quickcalcs/Ecanything1.cfm), Quick Calcs - GraphPad; EC: concentrazione efficace. Riporta l'IC50 e la HillSlope ottenuta dal software Prism per ciascun farmaco testato.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per valutare il test della placca dopo il trattamento, sono cruciali sia i controlli positivi (cellule infette da tachizoiti e non trattate) sia quelli negativi (cellule non infette con 0,1% di DMSO). Al termine dell'esperimento, il pozzo di controllo positivo dovrebbe mostrare spazi vuoti ben definiti con residui di cellule aderite (Figura 2). Al contrario, il pozzo di controllo negativo dovrebbe mostrare un monostrato intatto senza spazi vuoti. Il controllo negativo è cruciale per conferma...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La standardizzazione dei nuovi protocolli per i test antiproliferativi è un passo fondamentale per far avanzare la ricerca scientifica sull'identificazione di futuri farmaci. Il protocollo qui presentato offre un approccio alternativo alla valutazione in vitro dell'attività delle molecole bioattive contro i tachizoiti di T. gondii. Dato che T. gondii è un parassita intracellulare obbligato che lomota tramite motilità gliante, quando i parassiti escono da una ce...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano inoltre i finanziamenti del Conselho Nacional de Desenvolvimento e Pesquisa (CNPq), della Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG) e di CAPES/PROEX. Gli autori desiderano ringraziare la Pró-Reitoria de Pesquisa dell'Universidade Federal de Minas Gerais per il sostegno a questa ricerca. ESMD (CNPq 308082/2023-0) e RWAV (CNPq 305574/2021-3) sono borsisti CNPq per la produttività.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,05% Tripsina-EDTALife Technologies25300-062
Pipetta sierologica da 10 mLOlenK17-110
Centrifuga Falcon tube da 15mLFanemModello: 206
Pipetta sierologica da 5 mLOlenK17-115
Piastra di coltura a 6 pozziSarstedt833920
Bilanciamento analiticoMettler Toledo Modello: AB204 Numero di serie: 1116473813
Antibiotico-Antimicotico (100X)Life Technologies15240-062
Pipetta automaticaKasviK1-AID
CentrifugaEppendorfModello 5415 R Numero di serie: 0023591
Incubatore CO2PHC CorporationModello N. : MCO-230AICUVL-PA Numero di serie: 210360090
Bottiglia di coltura 25 cm2Sarstedt833910
Dimetil solfossido (DMSO) P.A.Merck 1,02,95,21,000
Ethanol P.AMerck1,00,98,31,000
Siero Fetale Bovino (FBS)Life Technologies12657-029
Formaldeide 37-38%Panreac131328
GraphPad Prism GraphPad Software-Versione 8.0.1
ImageJ  software --Versione 1.52e
Sistemi di documentazione per immaginiBio-RadModello:  Sistema di imaging ChemiDoc MP Numero di serie: 734BR2249
Cappa a flusso laminareVeco do BrasilModello: VLFS-09
L-glutamina 200 mM (100X)Life Technologies25030-081
Microtubo 0,5 mLSarstedt72,699
Fibroblasti Dermici Umani Normali Neonatali (NHDF)LonzaCC-3132Generosamente fornito dalla Dott.ssa Sheila Nardelli, di Fiocruz Paraná, Brasile
Camera di Neubauer 0,100 mm 0,0025 mm2Nuova Ottica7301-1
MetroMicronalModello: B374 Numero di serie: 30/37
Pipette 20-200 & micro; LKasvi base22032893
Pipette 2-20 e micro; LLabmate Pro656630226
Pipette  0.2-2 & micro; LLabmate Pro556610114
Pipette  1000-5.000 & micro; LUniscienzaYM4A021482
Pipette  100-1000 & micro; LEppendorf Research PlusQ34354C
Fosfato di potassio monobasico   (KH2PO4) P.A Synth01F2002.01.AF
RPMI-1640 mediaSigma-Aldrich R0883
Cloruro di sodio (NaCl) P.A. Cromoline Quí mica Fina -
Dibase fosfato di sodio (Na2HPO4) P.A.CRQ Produtos Quimicos EireliR2715920500
Consiglio 1.000 & micro; LSarstedt7,01,186
Consiglio 10 & micro; LSarstedt7,03,010
Consiglio 5.000 & micro; LSarstedt70,11,83,001
Consiglio e consiglio; 200 & micro; LSarstedt7,03,030
Pipetta di trasferimento  (3,5 mL) Sarstedt86,11,71,001
Tubo 15 mLSarstedt6,25,54,502
Cristallo violaMerck101408
Miscelatore a vorticePhoenixModello: AP56 Numero di serie: 6633
Bagno d'acquaHemoquimica do BrasilModello: HM1003 Numero di serie: 700001556

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Molan, A., Nosaka, K., Hunter, M., Wang, W. Global status of Toxoplasma gondii infection: systematic review and prevalence snapshots. Trop Biomed. 36 (4), 898-925 (2019).
  2. Bigna, J. J., et al. Global, regional, and country seroprevalence of Toxoplasma gondii in pregnant women: A systematic review, modelling and meta-analysis. Sci Rep. 10 (1), 12102(2020).
  3. Dian, S., Ganiem, A. R., Ekawardhani, S. Cerebral toxoplasmosis in HIV-infected patients: A review. Pathog Glob Health. 117 (1), 14-23 (2023).
  4. Wang, Z. -D., et al. Toxoplasma gondii Infection in Immunocompromised Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. Front Microbiol. 8, 389(2017).
  5. Layton, J., et al. Clinical spectrum, radiological findings, and outcomes of severe toxoplasmosis in immunocompetent hosts: A systematic review. Pathogens. 12 (4), 543(2023).
  6. Weiss, L. M., Dubey,, Jitender, P. Toxoplasmosis: A history of clinical observations. Int J Parasitology. 39 (8), 895-901 (2009).
  7. Fabiani, S., et al. Ocular toxoplasmosis, an overview focusing on clinical aspects. Acta Trop. 225, 106180(2022).
  8. Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. Ocular toxoplasmosis II: Clinical features, pathology and management. Clin Exp Ophthalmol. 41 (1), 95-108 (2013).
  9. Dunay, I. R., Gajurel, K., Dhakal, R., Liesenfeld, O., Montoya, J. G. Treatment of Toxoplasmosis: Historical perspective, animal models, and current clinical practice. Clin Microbiol Rev. 31 (4), e00057-e00117 (2018).
  10. Wei, H. -X., Wei, S. -S., Lindsay, D. S., Peng, H. -J. A systematic review and meta-analysis of the efficacy of anti-Toxoplasma gondii medicines in humans. PloS One. 10 (9), e0138204(2015).
  11. Shammaa, A. M., Powell, T. G., Benmerzouga, I. Adverse outcomes associated with the treatment of Toxoplasma infections. Sci Rep. 11 (1), 1035(2021).
  12. Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nat Biotechnol. 32 (1), 40-51 (2014).
  13. Paul, S. M., et al. How to improve R&D productivity: The pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 9 (3), 203-214 (2010).
  14. Andrade, E. L., et al. Non-clinical studies required for new drug development - Part I: Early in silico and in vitro studies, new target discovery and validation, proof of principles and robustness of animal studies. Braz J Med Biol Res. 49 (11), e5644(2016).
  15. Brodniewicz, T., Grynkiewicz, G. Preclinical drug development. Acta Poloniae Pharmaceutica. 67 (6), 578-585 (2010).
  16. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 38 (8), 747-752 (1952).
  17. Roberts, C. O., Chaparas, S. D., McLaughlin, D. The use of the plaque assay in chemotherapeutic and dermal hypersensitivity studies on Toxoplasma gondii. Trans Am Microsc Soc. 95 (3), 470(1976).
  18. Mo, J., et al. Effect of the Pseudomonas metabolites HQNO on the Toxoplasma gondii RH strain in vitro and in vivo. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 21, 74-80 (2023).
  19. Barbosa, B. F., et al. Enrofloxacin is able to control Toxoplasma gondii infection in both in vitro and in vivo experimental models. Vet Parasitol. 187 (1-2), 44-52 (2012).
  20. Wall, G., Lopez-Ribot, J. L. Screening repurposing libraries for identification of drugs with novel antifungal activity. Antimicrob Agents Chemother. 64 (9), e00924-e01020 (2020).
  21. dos Santos, M., et al. Medicines for malaria venture pandemic box in vitro screening identifies compounds highly active against the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii. Trop Med Infect Dis. 8 (12), (2023).
  22. Costa, A. L. O., et al. Antiproliferative and morphological analysis triggered by drugs contained in the medicines for malaria venture COVID-box against Toxoplasma gondii tachyzoites. Microorganisms. 12 (12), 2602(2024).
  23. Ufermann, C. -M., Müller, F., Frohnecke, N., Laue, M., Seeber, F. Toxoplasma gondii plaque assays revisited: Improvements for ultrastructural and quantitative evaluation of lytic parasite growth. Exp Parasitol. 180, 19-26 (2017).
  24. Condit, R. C. Principles of virology. Fields Virology. I, 25-57 (2007).
  25. Montazeri, M., et al. In vitro and in vivo evaluation of kojic acid against Toxoplasma gondii in experimental models of acute toxoplasmosis. Exp Parasitol. 200, 7-12 (2019).
  26. Ke, O. Y., Krug, E. C., Marr, J. J., Berens, R. L. Inhibition of growth of Toxoplasma gondii by qinghaosu and derivatives. Antimicrob Agents Chemother. 34 (10), 1961-1965 (1990).
  27. Liu, X., et al. Anti-Toxoplasma gondii effects of lipopeptide derivatives of Lycosin-I. Toxins. 15 (8), 477(2023).
  28. Emi, A., et al. Development of an automated plaque-counting program for the quantification of the Chikungunya virus. Sci Rep. 15 (1), 12429(2025).
  29. Sullivan, K., et al. High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner. J Virol Methods. 179 (1), 81-89 (2012).
  30. Pereira Filho, A. A., et al. In vitro activity of essential oils from piper species (Piperaceae) against tachyzoites of Toxoplasma gondii. Metabolites. 13 (1), 95(2023).
  31. Martins-Duarte, E. S., et al. In vitro activity of N-phenyl-1,10-phenanthroline-2-amines against tachyzoites and bradyzoites of Toxoplasma gondii. Bioorg Medl Chem. 50, 116467(2021).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Subramanian, G., et al. Targeted phenotypic screening in Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii reveals novel modes of action of medicines for malaria venture malaria box molecules. mSphere. 3 (1), e00534(2018).
  34. Dans, M. G., et al. Screening the medicines for malaria venture pathogen box for invasion and egress inhibitors of the blood stage of Plasmodium falciparum reveals several inhibitory compounds. Int J Parasitol. 50 (3), 235-252 (2020).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Screening antiproliferativoparassita intracellularesaggio sui tachizoitiscreening di farmacimonostrato cellulareproliferazione dei parassitiprotocollo in vitro

Articoli correlati