Metodi per la quantificazione in situ della morfologia mitocondriale nelle cellule muscolari e terminali di Schwann di topi

Summary

Iniezioni locali di un colorante mitocondriale con etichetta di dotante terminale di cellula di Schwann in vivo per microscopia confocale. Questo metodo utilizza prove di concetto dimostrate su tessuto muscolare scheletrico di topi con muscoli sani o malati per fornire una visualizzazione mitocondriale ad alta risoluzione.

Abstract

La morfologia della rete mitocondriale è ampiamente utilizzata come indicatore della salute cellulare; tuttavia, quantificare l'architettura mitocondriale all'interno di tessuti intatti rimane tecnicamente difficile. Le cellule di Schwann terminali (tSC), essenziali per il mantenimento e la rigenerazione delle giunzioni neuromuscolari, sono particolarmente difficili da analizzare in situ a causa della loro posizione anatomica e della sensibilità alla disgregazione tissutale. Questo protocollo descrive un approccio riproducibile per etichettare e quantificare la morfologia della rete mitocondriale tridimensionale nel muscolo scheletrico a montaggio intero e nelle tSC nei topi utilizzando la microscopia confocale standard. Il metodo impiega la somministrazione in vivo di un colorante mitocondriale sensibile al potenziale alla membrana, seguita da un rapido processo tissutale e immagini confocali ad alta risoluzione. Gli stack di immagini vengono analizzati per quantificare la connettività della rete mitocondriale, l'area e la frammentazione. Il protocollo viene inizialmente convalidato in muscoli scheletrici distrofici e sani per confermare le differenze attese nella morfologia mitocondriale e viene successivamente adattato per visualizzare e quantificare le reti mitocondriali nelle tSC identificate con topi reporter S100β. Questo approccio consente l'analisi della morfologia mitocondriale all'interno di tessuti neuromuscolari intatti senza richiedere reporter mitocondriali transgenici o piattaforme di imaging specializzate. Il protocollo richiede solo attrezzature comunemente disponibili nelle strutture universitarie e può essere adattato ad altri tessuti sottili o superficialmente accessibili.

Introduction

I mitocondri sono straordinariamente organelli plastici che agiscono come polmoni della cellula, consumando ossigeno durante la respirazione cellulare per supportare la produzione di trifosfato di adenosina (ATP) in risposta alla domanda^{metabolica 1}. Sebbene un tempo fossero considerati organelli discreti, ora si comprende che i mitocondri sono altamente^{integrati 2,3,4}, condividendo substrati energetici in tutta la rete in accordo con le esigenze locali. L'integrazione offre un vantaggio distinto rispetto all'isolamento: i mitocondri connessi sostengono deficit energetici, mantenendo gradienti elettrochimici per la fosforilazione ossidativa durante una domanda metabolica elevata. Infatti, la distribuzione, il volume e la morfologia dei mitocondri si adattano ai bisogni energetici nelle loro^{vicinanze 5}. In salute, il ricambio regolare delle reti mitocondriali viene mantenuto tramite biogenesi mitocondriale, eventi di fusione e fissione, e^{mitofagia 2,3}. La biogenesi mitocondriale è necessaria per mantenere ed espandere i mitocondri sani. La domanda metabolica, come l'esercizio fisico, aumenta l'espressione del recettore attivato dal proliferatore di perossisomi γ coattivatore 1α (PGC-1α)⁵. Questo processo avviene tramite segnali di resistenza primari, in particolare l'elevazione indotta dall'esercizio della proteina chinasi attivata da AMP (AMPK), calcio e specie reattive di^{ossigeno 6,7}. La fusione espande le reti, promuovendo la sopravvivenza e integrando i deficit, mentre la fissione mitiga ulteriori danni mitocondriali attraverso l'esclusione preferenziale della regione ^{disfunzionale 2,3,8}. Una volta rimossi, le regioni escluse devono subire mitofagia, prevenendo l'accumulo di organelli e proteine^{disfunzionali 6,9}.

Il muscolo scheletrico costituisce circa il 40% della massa corporea e si basa sui mitocondri per il metabolismo aerobico e la segnalazione cellulare per mantenere^{l'omeostasi 10}. Collettivamente, nelle condizioni di disfunzione muscolare scheletrica, i meccanismi di controllo della qualità mitocondriale sono compromessi^. Le indagini sulla disfunzione muscolare misurano tipicamente la respirazione mitocondriale, il volume, la morfologia e la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) per valutare la qualità mitocondriale ^3,10. A tal proposito, durante una disfunzione muscolare prolungata, la respirazione mitocondriale si riduce, mentre le ROS aumentano e le reti sono^{frammentate 3,10}. Le perturbazioni nella morfologia mitocondriale derivano principalmente dall'attivazione delle proteine di fissione mitocondriale, della proteina correlata alla dinamina 1 (DRP1) e della fissione mitocondriale 1 (FIS1)^2,8,11. In risposta all'atrofia muscolare, FIS1, che risiede sulla superficie della membrana mitocondriale esterna, recluta DRP1 per oligomerizzare con più dimeri DRP1 per creare un filamento attorno ai mitocondri, riducendosi di dimensioni fino a quando una determinata sezione di mitocondri viene "pizzicata", favorendo la^{frammentazione 3,11}. Insieme, l'iperattività della fissione mitocondriale, le riduzioni nella fusione dei nuovi mitocondri e la mitofagia disfunzionale sono responsabili dell'aspetto frammentato delle reti mitocondriali disfunzionali, come quelle descritte nel muscolo inattivo^{o malato 2,12}.

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è il sito dell'eccitazione muscolare. I potenziali d'azione avviati nel soma si propagano lungo gli assoni, rivestiti da cellule di Schwann mielinizzanti (SC), e terminano nelle NMJ, che sono incapsulate da cellule di Schwann terminali (tSC). I NMJ possono rigenerarsi dopo un infortunio. Tuttavia, la probabilità e la velocità di rigenerazione diminuiscono man mano che la distanza tra il sito della lesione e il NMJ aumenta^{di 13,14}. Dopo una lesione nervosa tramite transezione, schiacciamento o allungamento, le SC si dedifferenziano in uno stato demielinizzato simile a un^{progenitore 15,16}. Gli SC demielinizzati proliferano e lavorano in concerto con i macrofagi per rimodellare l'ambiente locale per la rigenerazione, rimuovendo i detriti tra il sito della lesione e il moncone assonale prossimale attraverso la degenerazione^{walleriana 17,18}. Le SC migranti segnalano una risposta infiammatoria che rimodella l'ambiente per una rigenerazione nervosa^{efficace 18}. La rigenerazione nervosa avviene all'interno della guaina neurale formata dalle SC simili a progenitori, che formano bande di Bunger, attraverso le quali gli assoni^{rigenerano 19}. Il moncone assonale poi estende i filopodi per iniziare la^{reinnervazione 14}. Dopo la reinnervazione, la presinapsi può rigenerarsi completamente, a condizione che le tSC reinvestano al^{NMJ 20}.

La morfologia mitocondriale varia notevolmente tra i tipi cellulari, conformandosi alla funzione^{tissutale 21}. I referti dei tessuti epatici suggeriscono che i mitocondri sono più compatti e sferici, mentre quelli nella sostanza bianca del cervello sono più allungati e^{tubolari 22}. Al momento della sofferenza, come in condizioni di invecchiamento e stress ossidativo, i mitocondri in questi tessuti mostrano un fenotipo simile a una ciambella. Tuttavia, negli osteoblasti, la formazione e frammentazione delle ciambelle mitocondriali sono state collegate all'aumento della secrezione di mitocondri e vescicole derivate mitocondriali, e alla maturazione degli^{osteoblasti 23}. Sebbene le reti mitocondriali dei muscoli scheletrici siano state ampiamente esaminate in più specie, persistono limitazioni nelle reti mitocondriali di imaging provenienti dalle tSC del sistema nervoso periferico. Questi sono difficili da catturare nei loro ambienti naturali, poiché l'ultrastruttura cellulare viene significativamente alterata dopo l'isolamento, e questi tessuti sono difficili da colpire con colorante in vivo senza caricare anche i muscoli scheletrici associati.

Le tecniche di imaging utilizzate per catturare la morfologia mitocondriale nei sistemi viventi possono essere classificate come microscopia a luce o^{elettronica 5}. Con la microscopia tradizionale di cattura della luce, i coloranti possono etichettare cellule vive, le cellule fisse possono essere immunomarcate e i mitocondri possono essere geneticamente^{marcati 5,24}. L'imaging delle cellule vive richiede tipicamente l'incubazione delle cellule per 20–60 minuti prima dell'analisi di fluorescenza. I coloranti sono indirizzati ai mitocondri tramite potenziale di membrana e, di conseguenza, possono essere alterati in condizioni di potenziale di^{membrana alterato 5}. La cattura della morfologia mitocondriale delle tSC all'interno del muscolo scheletrico tramite il carico di coloranti è teoricamente possibile; tuttavia, richiederebbe l'imaging dei tessuti interi e tecniche dettagliate di marcatura. In particolare, cattura i mitocondri all'interno di strutture intate, senza interferenze da parte della marcatura dei muscoli scheletrici. Per superare queste limitazioni, la colorazione fluorescente mitocondriale è stata utilizzata per etichettare il muscolo scheletrico vivente in topi sani e distrofici, seguita dalla marcatura dei mitocondri tSC per immagini in vivo e in situ. Il muscolo tibiale anteriore (TA) è stato selezionato per ottimizzare l'imaging muscolare scheletrico grazie alla sua posizione anatomica superficiale, al volume di iniezione ben caratterizzato e alla dispersione^miofasciale 25,26,27, e all'idoneità per misurazioni funzionali concomitanti. Il muscolo gluteo massimo (GM) è stato selezionato per l'imaging tSC basandosi sulla sua procedura di iniezione^{consolidata 28,29}, sulla sua architettura sottile, che minimizza la fluorescenza di fondo, e sulla posizione ventrale superficiale delle giunzioni neuromuscolari tra GM e gluteo medio, consentendo una marcatura preferenziale delle tSC prima delle fibre muscolari scheletriche.

Protocol

Maschio adulto DBA/2J [Wild-type (WT)] 000671 IMSR_JAX di sei mesi (n=3) e D2.B10-DMD^D2.mdx/J [D2.mdx (mdx)] (RRID: IMSR_JAX:013141), mentre maschio e femmina da tre a cinque mesi (n=8) maschio e femmina B6; D2-Tg(S100-EGFP)^1Wjt/J (S100B) (RRID: IMSR_JAX:005621) [anch'essi aggregati con WT dato che non si differenziano dal DBA] sono stati utilizzati da una colonia in corso di topi mantenuti da investigatori. Il flusso di lavoro sperimentale complessivo per iniezioni TA e GM, elaborazione dei tessuti e imaging è riassunto nella Figura 1. Un ulteriore D2. MDX mouse è stato donato dall'investigatore per l'imaging tSC in mdx (n=1). Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali della Texas A&M University (AUP 2022-0215) e sono state condotte in conformità con la Guida del National Research Council for the Care and Use of Laboratory Animals (8ª edizione⁾³⁰. L'eutanasia è stata eseguita tramite lussazione cervicale sotto un'overdose anestetica di isoflurano.

1. Preparazione di una soluzione di lavorazione con colorazione mitocondriale fluorescente di 2 μM

1. Sospendere la colorazione mitocondriale (50 μg) in 322 μL di dimetilsolfossido (DMSO) secondo le istruzioni del produttore per preparare una soluzione stock da 200 μM.
2. Per preparare 30 mL di soluzione lavorativa da 2 μM, trasferire 300 μL di soluzione stock da 200 μM in 29,7 mL di soluzione salina sterile. Mescola bene.
3. Una quota di 250 μL della soluzione di lavoro da 2 μM in tubi microcentrifughe e conservata a -80 °C fino all'uso.
   NOTA: Non è stata osservata alcuna degradazione rilevabile del segnale dopo 3 anni di conservazione a -80 °C.

2. Coloranti e preparazione animale

1. Scongela una aliquota congelata 15 minuti prima dell'esperimento. Preleva la soluzione in una siringa da 30 G, 1 cc di insulina.
2. Anestesiare l'animale con isoflurano. Applica unguenti oftalmici, rasa il sito di iniezione e mantieni la temperatura corporea usando una lampada riscaldante con una sonda termica posizionata tra l'animale e la fonte di calore.
3. Pulisci il sito di iniezione rasata con alcol isopropilico al 70%.

3. Amministrazione e funzione del colorante mitocondriale muscolare tibiale anteriore (TA)

1. Amministrazione dei coloranti TA
   1. Iniettare 50 μL di colorazione mitocondriale 2 μM nel muscolo TA destro di topi anestetizzati WT e D2.mdx.
   2. Inserisci l'ago nel tendine distale verso il ginocchio e premi lo sturalavandini mentre si ritira l'ago lungo il percorso di iniezione.
   3. Incubare il colorante in vivo per 1 ora prima della dissezione.
2. Misurazioni della funzione muscolare TA
   1. Dopo 45 minuti di incubazione del colorante, anestetizzare il topo usando isoflurano (induzione 2%–3%, 1,5%–2% di mantenimento in ossigeno).
   2. Espone chirurgicamente il muscolo TA sinistro preservando i tessuti circostanti. Lega il tendine distale alla trave di carico del sistema di test muscolare.
   3. Avvolgere il muscolo esposto con una salvietta da laboratorio e irrigare a 3 mL min⁻¹ con soluzione salina sterile allo 0,9% riscaldata a 40 °C. Mantieni la temperatura muscolare a 32 °C usando una lampada termica.
   4. Posiziona elettrodi in filo di platino/iridio lungo la pancia muscolare per stimolazione diretta.
   5. Collega il fascio di carico a un micrometro e regola la lunghezza ottimale (L₀) usando contrazioni a contrazione (T_w) a 1 Hz. Registra L₀ con un calibro digitale.
   6. Indurre le contrazioni tetaniche massime (P₀) tre volte a 140 Hz con 60 secondi di riposo tra una contrazione e l'altra. Registra il valore di forza più alto (g). Acquisisci dati utilizzando il sistema di funzione muscolare con software di ricerca.
3. Elaborazione del tessuto TA
   1. Dopo l'incubazione, isolare e dissezionare il muscolo TA prima dell'eutanasia.
   2. Posiziona fasci isolati di fibre muscolari nel paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 15 minuti, mentre li stuzzichi delicatamente sotto uno stereomicroscopio.
      ATTENZIONE: Il paraformaldeide è tossico e deve essere maneggiato in una cappa chimica mentre si indossa l'attrezzatura di protezione personale adeguata (camice da laboratorio, guanti e protezione per gli occhi).
   3. Aggiungere la colorazione degli acidi nucleici permanenti cellulari a una concentrazione finale di 5–10 μg/mL per marcare i nuclei.
   4. Lavare i campioni tre volte in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 5 minuti ciascuna per rimuovere il colorante in eccesso.
   5. Disidratare i campioni in quantità di etanolo al 50%, 75% e 100% per 5 minuti ciascuno.
   6. Incubare i campioni in modo sequenziale in soluzioni di pulizia tessutale I e II per 30 minuti ciascuno a temperatura ambiente, utilizzando un volume sufficiente per immergere completamente il tessuto.
   7. Posizionare i fasci di TA sganciati su un copertino e appiattire delicatamente usando un blocco di vetro (2,5 cm × 2 cm × 1 cm; massa 7,8 g)²⁶.

4. Imaging di campioni di muscolo TA

1. Visualizzare i campioni muscolari con un microscopio confocale per ottenere sezioni ottiche tridimensionali (3D) ad alta risoluzione.
2. Acquisire immagini Z-stack a una profondità di circa 100 μm per i muscoli utilizzando un obiettivo con ingrandimento 63x (N.A. 1.40).
3. Utilizzare il software confocale del sistema di imaging con una lunghezza d'onda di eccitazione di 646 nm per fornire la massima chiarezza con il minor fondo possibile.
4. Acquisire immagini usando la modalità deconvoluzione, utilizzando parametri "System Optimized" con dimensioni di passo di 1 μm.
   NOTA: Per combattere la disidratazione e il fotosbiancamento, trasferire i tessuti nella soluzione detergente II e posizionarli su una copertura. Posiziona due gocce di soluzione di clearing 2 direttamente sul tessuto prima dell'immagini.

5. Carico di coloranti e imaging GM muscolo tSC

1. Usa topi S100β per l'identificazione specifica con fluorescenza dei tSC.
2. Esegui una piccola incisione cutanea sopra il muscolo GM. Iniettare 75 μL di una colorazione mitocondriale fluorescente rosso lontano di 2 μM sotto il GM, prima della chiusura della^{ferita 25}.
3. Chiudi la ferita e lascia incubare il colorante per 45 minuti per contrassegnare selettivamente le tSC senza una marcatura significativa delle fibre muscolari sottostanti.
4. Disseziona i muscoli GM e mettili subito in soluzione salina sterile al 0,9%. Taglia rapidamente il grasso e i tessuti connettivi in eccesso.
5. Trasferire i GM dissezionati su un coperto per l'immaginione.
6. Solo se si usano topi D2.mdx, si aggiunge il colorante fluorescente del recettore dell'acetilcolina (AChR) a diluizione 1:500 nel bagno di microdisseczione. Incubare il tessuto per 30 minuti per visualizzare le componenti postsinaptiche della giunzione neuromuscolare (NMJ).
7. Utilizzare questo approccio a doppia marcatura per differenziare i mitocondri postsinaptici dai mitocondri specifici per tSC.
   ATTENZIONE: Limitare la dissezione e la pulizia del GM a non più di 10 minuti prima di essere inserito su un coperto per l'imaging al minimo dei cambiamenti morfologici dopo la dissezione. Questo limite di tempo è fondamentale per minimizzare i cambiamenti morfologici post-dissezione e il degrado mitocondriale.
8. Eseguire microscopia confocale per ottenere sezioni ottiche tridimensionali (3D) ad alta risoluzione.
9. Acquisire immagini Z-stack a una profondità di circa 16 μm per tSC utilizzando un obiettivo a ingrandimento 20x (N.A. 0,75). Acquisire immagini rappresentative ad alta risoluzione di singoli tSC utilizzando un obiettivo a ingrandimento 63x.
10. Implementare procedure di montaggio per minimizzare la disidratazione dei tessuti e il fotosbiancamento durante la sessione di imaging.
    ATTENZIONE: Trasferire i tessuti in soluzione salina su un copertore, assicurandosi che il lato ventrale sia rivolto verso il basso per la microscopia invertita.
11. Applicare 2 μL di mezzo di montaggio generale sulla superficie dorsale del GM.
12. Appiattire delicatamente il tessuto utilizzando un blocco di vetro calibrato (2,5 cm × 2 cm × 1 cm; massa 7,8 g) per garantire un piano di imaging uniforme.

6. Microscopia a fascio ionico focalizzato

1. Eseguire microscopia elettronica a fascio di ioni focalizzato (FIB-SEM) secondo i protocolli^{precedentemente stabiliti 26}.
   1. Applicare FIB-SEM specificamente per confermare e visualizzare nuove caratteristiche morfologiche identificate durante l'imaging confocale.

7. Analisi delle immagini

1. Campioni di muscolo TA
   1. Effettuare analisi quantitative delle sezioni ottiche confocali (1 μm) delle scansioni TA (circa 75–112 μm di spessore) utilizzando software di analisi delle immagini basato su IA.
      NOTA: Eseguire più sessioni di formazione supervisionate prima della segmentazione automatica per migliorare l'adattamento degli algoritmi.
   2. Importare singole sezioni ottiche (Z-slices) per insegnare al software a trattenere informazioni pixelate che rappresentano il colore bianco mitocondriale, escludendo però lo sfondo nero.
   3. Sviluppare maschere d'immagine per la revisione da parte degli investigatori per garantire un'analisi di alta qualità e accuratezza.
   4. Separare gli stack di immagini 3D in singole sezioni ottiche dopo l'ottimizzazione degli algoritmi.
   5. Seleziona ogni quinta Z-slice da ogni immagine 3D per l'analisi, con ogni punto dato che rappresenta la media di queste singole sezioni per campione.
   6. Quantificare la morfologia mitocondriale per derivare metriche di distribuzione spaziale e connettività di rete.
   7. Standardizzare le soglie di intensità, le impostazioni di rilevamento dei bordi e la calibrazione delle dimensioni dei voxel su tutti i campioni per minimizzare la variabilità sperimentale.
2. TSC sui campioni GM
   1. Assemblare sezioni ottiche da 1 μm in pile Z (circa 6–25 μm di spessore) e separare le immagini in singoli canali di colore utilizzando software di analisi 2D delle immagini.
   2. Calibrare il software usando scale bar e applicare la soglia per ottimizzare la visualizzazione dei mitocondri tSC con interferenze di fondo minime.
   3. Eseguire la binarizzazione e rimuovere il rumore di fondo per isolare i mitocondri o tSC per la misurazione dell'area e del conteggio delle particelle.
   4. Salva immagini binarie per garantire un'elaborazione coerente e esegui tutti gli esperimenti di imaging in condizioni identiche per garantire la riproducibilità tra repliche biologiche.

8. Immunoistochimica

1. Inserire campioni di muscolo TA sinistro in un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) per valutare l'area della sezione trasversale (CSA).
   1. Campioni a sezione a uno spessore di 10 μm usando un criostato impostato a -17°C e raccolti su vetrine al microscopio.
   2. Sezioni trasversali muscolari per la laminina per identificare i bordi delle miofibre utilizzando anticorpo primario anti-laminina del coniglio (1:400) e anticorpo secondario anti-coniglio della Rodamina (1:400).
   3. Montare le vetri utilizzando un supporto di montaggio appropriato prima dell'immagini.
2. Immagini vetrine utilizzando un microscopio confocale selezionando casualmente 2–3 regioni di interesse (580 x 580 μm) per campione con un obiettivo 20x (N.A. 0,75).
3. Valori medi per ogni regione per muscolo e analisi di circa 400 miofibre per sezione muscolare TA.
4. Utilizza un software semi-automatico di segmentazione muscolare per determinare la CSA (μm²) mascherando le miofibre.

9. Analisi statistica

1. Riporta i dati sommari come media ± errore standard della media (S.E.M.).
2. Eseguire analisi statistiche utilizzando un software statistico dedicato, utilizzando test t di Studente parametrici e non accoppiati per determinare la significatività tra le differenze medie dei gruppi.
3. Condurre regressioni lineari semplici su CSA e forza muscolare dai muscoli TA, utilizzando questi come marcatori della patologia DMD per confrontare la morfologia mitocondriale tra muscoli TA e tSC GM.
4. Valutare i coefficienti di correlazione Pearson r per determinare la correlazione tra patologia DMD e patologia mitocondriale. Definisci la significanza statistica come P ≤ 0,05.

Results

Le reti mitocondriali hanno mostrato riduzioni attese nella connettività
Sono presentate immagini 3D fluorescenti rappresentative delle scansioni confocali muscolare TA in due gruppi, WT e mdx (Figura 2). Rispetto al gruppo WT, la connettività mitocondriale appare ridotta nei topi mdx rispetto ai WT (Figura 2A–D). Sono stati osservati un numero maggiore di piccoli frammenti mitocondriali nei ...

Discussion

La localizzazione dei mitocondri all'interno delle strutture cellulari, così come la loro morfologia, è correlata con la salute mitocondriale e la domanda^{metabolica 21}. Data la rilevanza clinica della salute mitocondriale, unita alla cinetica respiratoria divergente e alle morfologie di diversi tipi cellulari, è stato sviluppato un metodo facilmente applicabile basato su microscopia confocale per la valutazione delle morfologie mitocondriali nelle tSC dopo aver in...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-in-1 Whole Animal System	Aurora Scientific, Ontario, Canada	1300A	Muscle funciton system with analysis software
AIVIA	Leica Microsystems, Bellevue, WA, USA	15	AI driven image analysis software
anti-laminin	MilliporeSigma	L9393-.2mL	myofiber boarder label
B6; D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J Mouse Strain	Jackson Labs, Bar Harbor, ME	JAX:005621	S100β
Cryostar NX50 Cryostat	Epredia, Kalamazoo, MI, USA	https://www.epredia.com/products/histology-instruments/cryotomy/cryostar-nx50	Cryostat
D2.B10-DMDD2.mdx/J Mouse Strain	Jackson Labs, Bar Harbor, ME	JAX:13141	D2.mdx
DBA/2J Mouse Strain	Jackson Labs, Bar Harbor, ME	JAX:00671	WT
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific; Hampton, NJ, USA	BP231-100	Mitochondrial stain reconstitution reagent
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H1399	Cell-permeant nucleic acid stain
ImageJ/Fiji	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	SCR_002285	2D analysis software
Invitrogen ProLong Gold antifade reagent with DAPI	Fisher Scientific, Hampton, NJ, USA	P36941	Mounting medium
KimWipe	Kimberly-Clark, Irving, TX, USA	06-666A	Laboratory wipes
Leica LAS_X software	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	SCR_013673	Confocal software
MitoView Fix 640	Biotium	70075-50ug	Far-red fluorescent mitochondrial stain
NIS-Elements Advanced Research software	Nikon, Melville, NY, USA	SCR_014329	Cross sectional area analysis software
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific, Waltham, MA 02454, USA	#SP15-100	General mounting media
Prism 9 software	GraphPad Software, La Jolla, CA, USA	RRID: SCR_002798	Statistical analysis software
Rhodamine (TRITC)	Fisher Scientific; Hampton, NJ, USA	AP132RMI	Secondary antibody
Stellaris 5 White Light Confocal Microscope and corresponding deconvolution software	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	158301313:158201310:158004752: 158301312:158301314:158401100: 158209011:158301130:158204510: 158301120:158401140:158204511: 15500332:15506428:15506517:155 13859:15521522:15525226:155252 32:15525314:15555009:15555017: 15555046:27100022:155933660: 155933666:155933668:158000640 :158002407:158003150:158004141 :158004201:158004421:158004423 :158200681:158202140:158203114: 158203200:158203220:158204201: 158204510:158204709:158301200: 9I_LL_STELLARIS_C:9T-CLSM-APP _CLASSC:9WE_LAS_405:9WE_ LAS_WLL:9WE_LL_STELLARIS_C	Confocal microscope
SZ61	Olympus, Breinigsville, PA, USA	sz61	Stereo microscope
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Scigen, Fischer Scientific, Hampton, NJ, USA	23-730-571	Optimal cutting temperature compound
Visikol I	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H1-30	Tissue clearing solution 1
Visikol II	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H2-30	Tissue clearing solution 2
α-bungarotoxin 552	Biotrend, Koln, Germany	00014	Acetylcholine receptor dye