Articolo metodologico

Un modello preclinico di sinovite utilizzando tessuto sinoviale umano ex vivo con funzione e architettura preservate

DOI:

10.3791/69734

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20 marzo 2026

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1Department of Emergency Medicine, University of Iowa Health Care, 2Interdisciplinary Graduate Program in Immunology, University of Iowa, 3Department of Orthopedics and Rehabilitation, University of Iowa Health Care, 4Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Office of Research and Development, Iowa City Veterans Affairs Health Care System, 6Department of Internal Medicine, University of Iowa Health Care, 7Iowa State University, 8Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University

In questo articolo

Sommario

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Abbiamo sviluppato un sistema transwell ex vivo umano in grado di valutare cambiamenti infiammatori acuti, infettivi e strutturali nella sinovia.

Abstract

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L'artrite è uno stato infiammatorio all'interno delle articolazioni che provoca danni alla cartilagine, dolore e perdita di mobilità. I recenti progressi nella ricerca sull'artrite dimostrano specificamente che la capsula articolare (ad esempio, la sinovia) è una fonte importante di questa infiammazione, ma non esistono modelli umani che replichino l'architettura sinoviale essenziale. Per affrontare questo problema, fu creato il Joint Space Analysis System, o JSAS. La sinovia anteriore è stata ottenuta intraoperatoriamente da pazienti sottoposti a artroplastica totale del ginocchio (TKA). Il Synovium è stato dissezionato e sezionato in nuclei biopsici da 3 mm. I carote venivano posizionati nel pozzo superiore di un pozzo da 5 μm o 0,4 μm con 300 μl di DMEM con FBS al 10%. Nel pozzo inferiore venivano aggiunti 600 μL di substrato, scambiati ogni 2-3 giorni. La vitalità è stata misurata fino a 7 giorni in condizioni di incubazione iperossiche (50%), atmosferiche/standard (~21%) e fisiologiche (5%). Gli stimoli nel pozzo inferiore includevano la proteina chemoattrante monocitaria 1 (MCP-1/CCL2), il lipopolisaccaride (LPS), la N-acetilcisteina, S. aureus e B. burgdorferi. Il materiale è stato conservato per ELISA e tessuto è stato conservato per l'analisi con paraffina fissata con formalina (FFPE). In condizioni standard, la sinovia è rimasta completamente vitale per 3 giorni. Lo stimolo ha modificato la struttura e la funzione delle cellule sinoviali intime e sottodotate, inclusa la perdita del bordo residente dei macrofagi, l'espansione del sottorevestimento, la regolazione all'alza dei fibroblasti patogeni e la produzione di citochine IL-1β e TNFα. Cellule immunitarie e fibroblasti migravano nella camera inferiore (pori a 5 μm) per analisi citometrica a flusso. B. burgdorferi mobile è migrato nel tessuto con una dimensione di poro di 0,4 μm, mentre S. aureus non mobile no. Le citochine rilevanti sono state espresse in quantità sufficiente per ELISA. JSAS è un sistema modulare in grado di studiare alterazioni acute della sinovio umana, consentendo la complessità delle strutture 3D in un modello preclinico mantenendo al contempo una struttura e una funzione biologicamente rilevanti.

Introduzione

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L'artrite colpisce oltre il 20% di tutti gli adulti statunitensi e il 50% di coloro che hanno più di 65 anni con condizionicroniche 1. È anche una delle principali cause di disabilità a livellomondiale 2. L'artrite include non solo danni alla cartilagine, ma anche infiammazione della capsula articolare o della sinovia (ad esempio, sinovite). La sinovite cronica è probabilmente una delle principali fonti di citochine pro-infiammatorie che potenziano danni ossei e cartilaginei nell'artrite osteoartrite ereumatoide 3,4. Pertanto, comprendere i cambiamenti mediati dal sistema immunitario all'interno della sinovia è probabilmente essenziale per sviluppare nuove opzioni terapeutiche e possibilmente preventive per i pazienti con artrite.

Il sinovio è una struttura organizzata composta da due strati principali: il rivestimento intimo cellulare (IntL) e il sottorivestimento (SubL). L'IntL interfaccia con il fluido sinoviale (SF), e il SubL produce componenti SF e contiene strutturevascolari 5. All'interno dell'IntL si trovano sia macrofagi che sinoviociti simili a fibroblasti (FLS). I macrofagi dell'IntL sono cellule residenti, localmente rinnovate da macrofagi interstiziali all'interno del SubL6. Questi macrofagi sinoviali residenti (RSM) sono distorti in M2 dall'espressione di CD206 e TREM2, epitelizzati ed esprimono marcatori di giunzione stretta. Questa sottostruttura dell'IntL potrebbe essere fondamentale per mantenere funzionalmente e fisicamente l'omeostasi dello spazioarticolare 5,6. Questo è stato osservato nell'artrite reumatoide (AR). Ad esempio, quando l'IntL si rompe, i pazienti con artrite reumatoide sperimentano sintomi di riacutizzazione, che si risolvono quando il rivestimentosi ricostruisce 6,7. La remissione spontanea dell'AR è specificamente associata a MerTK +CD206+ macrofagisinoviali 7. Le RSM sono state inoltre identificate nelle SF di pazienti con dolore articolare acuto, trovando che la gravità della malattia infettiva o infiammatoria correlata alla quantità di RSM e citochineinfiammatorie 8. Purtroppo, la relazione tra le strutture IntL e SubL, le alterazioni funzionali degli RSM e FLS, e la produzione di mediatori infiammatori che potrebbero danneggiare cartilagine e/o ossa è difficile da interrogare, specialmente negli esseri umani.

Per interrogare i meccanismi sottostanti della sinovite in molteplici contesti clinicamente rilevanti, è stato sviluppato un modello umano ex vivo chiamato Joint Space Analysis System (JSAS). Questo sistema produce risultati riproducibili con elementi modulari per consentire una valutazione ampia dell'artrite infiammatoria e infettiva. Questo articolo descrive i processi di acquisizione tissutale derivanti da chirurghi articolari aperti comuni, come la sostituzione totale dell'articolazione, la progettazione JSAS, l'istomorfometria necessaria per quantificare le alterazioni strutturali acute nella sinovia e le risposte funzionali del tessuto, inclusi tramite immunofluorescenza (IF), RNAscopio e saggio immunosorbente legato a enzimi (ELISA). JSAS si differenzia dai modelli umani in vitro comuni mantenendo le strutture IntL e SubL, permettendo informazioni quasi in vivo su sinovite acuta o acuta che porta a danni alla cartilagine. Mantenendo la struttura nativa della sinovia, è possibile dissezionare le capacità intrinseche di RSM e FLS per attenuare o perpetuare l'infiammazione. Come modello ex vivo , non richiede né la differenziazione delle cellule immunitarie periferiche in macrofagi sinoviali né la semplificazione eccessiva della sinovia a 1-2 tipi cellulari distinti solamente. Si differenzia dai modelli animali come l'Artrite Indotta dal Collagene (CIA) utilizzando tessuto umano naturalmente malato, consentendo una valutazione specifica del patogeno rilevante per l'uomo. Infine, è possibile simulare molteplici infezioni, permettendo un modello di artrite settica oltre all'osteoartrite e all'artrite infiammatoria. La principale limitazione è la coltura per 3 giorni in condizioni standard prima dell'insorgenza dell'apoptosi.

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Protocollo

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Il consenso del paziente e il protocollo di elaborazione dei tessuti sono stati approvati dal locale Institutional Review Board (IRB). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Acquisizione tissutale e biopsia

  1. Identificare i pazienti preoperatori in base agli orari del chirurgo. Reclutare pazienti di età compresa tra i 18 e i 65 anni che stanno subendo interventi chirurgici all'articolazione aperta, come l'artroplastica totale del ginocchio (TKA) o l'osteotomia del tubercolo tibiale (TTO, nota anche come Fulkerson), e che non assumono farmaci immunomodulatori sistemici.
    NOTA: Idealmente, escludere i pazienti che hanno sottoposto a più di un'artroscopia o a più di un'iniezione di glucocorticoidi, poiché questi pazienti hanno avuto un fallimento intraoperatorio dell'acquisizione tissutale più elevato rispetto ad altre popolazioni dovuto alla fibrosi. Dato il rischio di trasmissione di infezioni, si rimanda il reclutamento di pazienti con storia di Epatite C o Virus dell'Immunodeficienza Umana (HIV) a meno che ciò non sia pertinente agli esiti. Pratica sempre pratiche di maneggiamento sicura con tessuti umani freschi, indipendentemente dallo stato di malattia infettiva.
  2. I chirurghi ortopedici eseguono artrotomia e dissezione come parte della procedura operativa standard. Identificare la sinovia anteriore immediatamente prossimale al solco trocleare e utilizzare l'elettrocauterizzazione per estrarre la sinovia in blocco, evitando la dissezione del muscolo articolare del genere o vicino agli epicondili mediali e laterali. La sinonovectomia è relativamente neutra per gli esiti della TKA e, in condizioni infiammatorie, può essere benefica 9,10. Passa la sinovia sterilmente al membro del team di ricerca e mettila in un contenitore sterile per campioni con la soluzione salina fosfatata di Dulbecco fredda (DPBS) su ghiaccio.
    NOTA: Interrompere l'acquisizione tissutale se il team chirurgico ha rilevato anomalie o se la sinonovectomia comprometterebbe la chiusura o l'esito chirurgico. Quest'ultima in particolare sarebbe molto rara nella TKA, poiché l'escissione della sinovia può essere utilizzata come procedura estensile per allentare articolazioni strette. La quantità di escissione dipende dalla dimensione dell'esperimento. È possibile ottenere circa quattro carote di biopsia da 3 mm per ogni 1 cm2 di tessuto. In molti casi, è possibile ottenere 24cm 2 o più di tessuto. Il peso del tessuto dipende fortemente dalla dissezione chirurgica, quindi non è affidabile quanto l'area superficiale per determinare l'adeguatezza dell'esperimento. La Figura 1 illustra i passaggi 1.2-1.7.
  3. Riporta la sinovia in laboratorio e lava due volte in DPBS freddo per 10 minuti su un rocker a piastra.
  4. Trasferire la sinovia in una piastra di Petri sterile di 10 cm o più in condizioni sterili in un armadietto di biosicurezza certificato livello 2 (BSL2). Aggiungi il medium Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco's freddo, sterile e a basso contenuto di glucosio, contenente piruvato di sodio e L-glutamina, abbastanza da riempire la ciotola a metà. Identificare il rivestimento sinoviale tramite lo strato IntL perlacevole (Figura 2A), in contrapposizione al lato cauterizzato (Figura 2B).
    NOTA: L'IntL è fragile. Fai attenzione a non staccarlo, altrimenti si dissocerà dalla sotto-muchiera (Figura 2A, stretto dall'emostato). La perlescenza può essere alterata da una storia precedente di emartrosi (che appare giallo-arancione a causa dell'emosiderina), un BMI elevato (coperto da adiposi) o da infiammazione (rossa, friabile e villosa). È assolutamente essenziale identificare correttamente l'IntL prima di procedere. Esamina attentamente la presenza di segni di escissione chirurgica, cauterizzazione, sanguinamento e coagulazione per determinare che i seguenti passaggi non stanno avvenendo sull'IntL.
  5. Dissezionare via i tessuti adiposi e stromici estranei sul lato cauterizzato per isolare la sinovia, mantenendo circa 4-5 mm di profondità tissutale in tutte le aree. Forbici o bisturi per iris possono essere usati a seconda delle preferenze personali. Cambia il supporto della piastra di Petri secondo necessità per mantenere il campo visivo.
    NOTA: Il tessuto stromale posteriore o adiposo si può facilmente escassere. Tuttavia, difficoltà nella dissezione o la percezione di grande resistenza indicano legamenti trattenuti, metaplasia tissutale come deposizione inappropriata di cartilagine o taglio attraverso l'IntL.
  6. Una volta sezionata alla profondità appropriata, ottenere carote biopsiche di 3 mm secondo necessità per un minimo di 2 repliche tecniche per condizione testata. Esegui con il rivestimento sinoviale rivolto verso lo strumento di carotaggio invece che contro la superficie della piastra di Petri. Un punch per biopsia di qualità può essere usato circa 10-15 volte prima di dover essere sostituito a causa di un effetto smussato, poiché un punch di biopsia opaco causerà danni alla struttura intima del rivestimento.
    1. Eseguire il carotaggio con carico perpendicolare forte e torsione delicata. Se questo distorce il tessuto, lo strumento biopsico è diventato opaco e necessita di essere sostituito. Stabilizza con la mano non dominante usando pinze o emostati.
      NOTA: sono stati utilizzati nuclei da 3 mm per massimizzare la perfusione tissutale così come il numero di carote per paziente e garantire un numero sufficiente di repliche tecniche per questi esperimenti. Possono essere utilizzati nuclei di dimensioni alternative, ma solo 3 mm sono stati testati per questo protocollo.
      NOTA: Un eccesso di adiposo trattenuto da una dissezione insufficiente può causare il galleggiamento del nucleo in JSAS, il che è subottimale. Se i carote galleggiano in superficie invece di rimanere sommersi, si torna alla dissezione oppure si sceglie un nucleo sommerso.
  7. Apri una seconda piastra di Petri e riempi con 5-10 mL di mezzo riscaldato (37 °C) con il 10% di FBS. Con pinze piatte o non dentate, trasferisci i nuclei a questa piastra per lavare via i detriti con 1-2 secondi di delicata agitazione meccanica. Non pizzicare strettamente i nuclei, altrimenti potrebbe danneggiare la fodera intima.
    NOTA: Posso fare una pausa qui per ≤24 ore posizionando carote tissutali nell'incubatrice alla regolazione standard di 37 °C e 5% diCO2.

2. Istituzione del Sistema di Analisi Spaziale Congiunto (JSAS)

  1. Preparare il pozzo di fondo del JSAS con 600 μL di DMEM a basso contenuto di glucosio riscaldato (37 °C) con FBS al 10%. Sebbene la penicillina-streptomicina all'1% sia stata testata senza effetti negativi evidenti in questo sistema, gli antibiotici non vengono tipicamente aggiunti al substrato se la sterilità è stata adeguatamente mantenuta.
    NOTA: Se si co-coltiva con batteri o una linea cellulare che richiede un mezzo diverso, il pozzo di fondo potrebbe essere un mezzo diverso. Evita i substrati antibiotici se si co-coltiva con batteri.
  2. Al fondo del pozzo, aggiungi il trattamento preferito. Ad esempio, lipopolisaccaride (LPS). Per evitare differenze di osmolarità, si raccomanda che il volume del trattamento non superi il 2,5% del volume totale (ad esempio, ≤15 μL per 600 μL). Mitiga eventuali variazioni di pH derivanti dai trattamenti per mantenere il pH 7,0-7,4. Altrimenti, utilizza i controlli del veicolo.
  3. Scegliere la dimensione dei pori del transwell in base all'esito sperimentale desiderato (Figura 3).
  4. Aggiungi 300 μL di DMEM a basso contenuto di glucosio con FBS al 10% al pozzo di trans.
  5. Trasferire delicatamente i singoli nuclei con pinze sterili nel mezzo del pozzetto. L'orientamento del tessuto non può essere controllato; tuttavia, l'adiposità e la galleggiabilità naturale del tessuto stromale rendono naturale il rivestimento intimo verso il basso per la maggior parte dei nuclei tissutali.
    1. Visualizza attentamente i carote, poiché il processo di carotaggio potrebbe disturbare il rivestimento intimo, ed evita di usare nuclei che appaiono sfilacciati all'inizio dell'esperimento. Se il nucleo galleggia, migliora la dissezione e scegli un nucleo alternativo.
      NOTA: Considera una matrice di collagene se l'orientamento dei tessuti è importante; Tuttavia, questo influenzerà il tempo necessario per sviluppare un gradiente chimico con il pozzo di fondo.
  6. Inserite nell'incubatrice a 37 °C e 5% diCO2 per il tempo desiderato.
    NOTA: Il momento più precoce raccomandato per i cambiamenti biologici è di 8 ore. L'ultimo momento convalidato per l'attività biologica è di 3 giorni.

3. Rimozione e analisi sperimentale

  1. Per l'istologia, si utilizzano le pinze sterili e senza denti per trasferire il tessuto a 3-5 mL di formalina tamponata neutra al 10% (NBF) per l'analisi con fissaggio di formalina, incorporata in paraffina (FFPE). Conserva in NBF per 3-7 giorni prima di incastonare e sezionare.
    1. Non lasciare che il tessuto rimanga a lungo, poiché questo peggiora l'autofluorescenza. Eseguire analisi istologiche, inclusa colorazione con ematossilina ed eosina (H&E)11 per istomorfometria, immunofluorescenza (IF)12 e/o RNAscopio con IF13 secondo i metodi standard.
      NOTA: Fai attenzione a non perforare il transwell con la pinza quando rimuovi il tessuto. Sii estremamente delicato nel trasferire il core, altrimenti il rivestimento intimo potrebbe dissociarsi. Posiziona delicatamente il nucleo nel fissativo e non agitare. Il NBF deve essere utilizzato all'interno di una cappa chimica certificata, deve essere smaltita secondo le linee guida locali per la salute ambientale e la sicurezza ambientale (EHS) e non può essere versato nei lavandini. Il tessuto umano non utilizzato dall'esperimento viene messo in candeggina al 10% in eccesso per 30 minuti, poi collocato in contenimento secondario secondo i requisiti locali dell'EHS, e quindi smaltito in contenitori etichettati per la biohazard per l'incenerimento. La soluzione di candeggina può essere versata nel lavandino se approvata dall'EHS locale. Segui le linee guida locali, che possono variare a seconda dell'istituzione.
  2. Incorporare le repliche tecniche nello stesso blocco FFPE. Usa cassette schermate per evitare la perdita del campione. Sezione sull'asse longitudinale a uno spessore di 5 μm. Posiziona tre sezioni seriali su una diapositiva (Figura supplementare 1).
  3. Immagini delle diapositive H&E a 10x e 40x usando microscopia a campo chiaro. Identificare l'IntL come lo strato cellulare organizzato all'interfaccia tra tessuto e spazio vuoto.
    1. Acquisire 3 sezioni rappresentative 10x e 10 sezioni rappresentative 40x su un minimo di 2 repliche tecniche per condizione di trattamento, mantenendo l'IntL nel campo visivo. Acquisire immagini come TIFF ad alta risoluzione. Eseguire analisi istomorfometrica:
    2. Esegui misurazioni in ImageJ/FIJI. Per prima cosa, imposta la scala usando il menu Analizza → imposta la scala. Set Scale richiede l'uso di un vetrino di calibrazione fotografiato su ciascun microscopio rispettivo a ogni obiettivo. Per prima cosa, usa lo strumento linea retta per creare una linea di lunghezza nota basata sull'immagine della diapositiva di calibrazione. Assegna la scala globalmente.
      NOTA: A 10x, la scala è 3 px/μm. A 40x, la scala è 12 px/μm.
    3. Misura lo spessore SubL usando le immagini 10x con lo strumento linea reta. Misurare lo spessore come profondità a piombo dalla superficie IntL fino al fondo del SubL (μm). Dopo aver disegnato ogni linea, usa la scorciatoia da tastiera m per misurare la lunghezza della linea.
      1. Ottieni in media almeno 5 misurazioni per ogni immagine 10x (Figura 4A,B). La transizione tra tessuto SubL e stromale è delimitata da una transizione verso aree meno organizzate e meno cellulari contenenti collagene e adiposo (Figura 4B). Divide il punto di transizione tra i compartimenti tissutali.
    4. Per misurazioni 40x dello spessore IntL, della cellularità IntL, dell'integrità IntL e della cellularità SubL, inizia aprendo il TIFF 40x in Adobe Photoshop (o in qualsiasi editor di immagini simile). L'IntL è definito come uno strato spesso ~1-5 cellule, organizzato in uno strato cellulare distinto all'interfaccia tra tessuto e spazio vuoto (ad esempio, fluido sinoviale) (Figura 4C).
    5. Crea un nuovo livello. Seleziona lo strumento Lazo Poligonale . Utilizzando un clic del mouse per avviare il lazo e ancorare le inflessioni nella linea, si divide in due la transizione tra l'IntL e il SubL per tutta l'immagine. Poi, continua il lazo appena fuori dall'IntL nello spazio vuoto.
      1. Chiudi il lazo con un doppio clic. Inverti l'area selezionata (seleziona → inverso), poi riempi lo spazio con il nero usando lo strumento a secchio di vernice . Questo coprirà tutte le aree che non sono l'IntL. Salva questa immagine come un JPG ad alta risoluzione che rappresenta l'IntL, poi nascondi il livello.
    6. Crea un nuovo livello. Sotto le impostazioni del lazo poligonale, seleziona la caratteristica di intersezione , che selezionerà solo dove si intersecano le nuove aree del lazo e quelle vecchie. Spassa il lazo attorno al livello di sotto-lining cliccando attraverso il centro dell'IntL, intorno ai bordi sinistro e destro dell'immagine fino alla tela di sfondo, e poi dividi in due la transizione tra SubL e tessuto acellulare che si trova dietro di essa.
      1. Se la parte inferiore del SubL supera le dimensioni dell'immagine a 40x, basta selezionare la tela di sfondo attorno al bordo rimanente. Ancora una volta, seleziona l'inverso di quest'area come sopra, poi usa lo strumento secchio per vernice per riempire di nero. Salva questa immagine come JPG ad alta risoluzione che rappresenta il SubL. Salva questa immagine stratificata come PSD per riferimento futuro.
        NOTA: Gli eritrociti sono comuni in questi vetrini e potrebbero interferire con le future misurazioni del conteggio cellulare. Se ci sono vaste aree di vascolatura, usa lo strumento a lazo poligonale, lo strumento pennello o altri strumenti preferiti per creare maschere su uno strato separato che copra queste aree.
    7. In FIJI, apri l'immagine della maschera  IntL. Misura lo spessore IntL (μm) come media di almeno 5 misurazioni sull'immagine a 40x usando lo strumento a linea retta come nel passo 3.3.2-3.3.3.
    8. Misura la lunghezza totale (μm) dell'IntL usando lo strumento a linea segmentata. Poi misura la lunghezza solo delle aree intatti, sempre con lo strumento a linea segmentata (Figura 4D,E). Le sezioni IntL non intatte sono delimitate da spazi tra le cellule, un aspetto consumato dalla falena e la rottura o la staccatura o sfaldamento dell'IntL dai tessuti.
      1. Calcola la percentuale di confine intatta di IntL in come (IntL intatto/totale IntL)*100. Questo deve essere confrontato con i controlli degli stessi punti temporali per compensare eventuali artefatti di sezionamento.
    9. Misura la cellularità dell'IntL usando l'immagine della maschera IntL. Prima trasforma a 8 bit (Immagine → Tipo → 8 bit). Poi soglia (Immagine → Soglia) per minimizzare il rumore e massimizzare l'identificazione della cella. Nel menu soglia, deseleziona sfondo scuro e usa il toggle inferiore per le regolazioni.
      1. Determinare manualmente la soglia per ogni immagine, aiutato dalla scomparsa del rumore (ad esempio, artefatto di fondo) mantenendo però il numero originale di corpi nucleari. Confronta frequentemente l'immagine originale per mantenere la fedeltà. Quando il rumore è minimizzato (falso positivo) ma il segnale dell'ematossilina è massimizzato (vero positivo nucleare), è opportuno fissare la soglia (Figura Supplementare 2).
        NOTA: La soglia sarà coerente su una singola scansione delle diapositive, ma varierà tra le scansioni delle diapositive e anche tra qualsiasi singola immagine 10x o 40x. Varierà anche tra i lotti di H&E, poiché la profondità del colore difficilmente sarà costante. Pertanto, macro semplici sono inappropriate se ci sono differenze in una delle seguenti categorie tra immagini: paziente, lotto H&E, spessore della sezione, condizioni di illuminazione (luminosità della luce della stanza o del microscopio/temperatura del colore), software utilizzato per acquisire l'immagine, microscopio usato per acquisire l'immagine e uso di algoritmi di bilanciamento del bianco o bilanciamento del colore. Questa lista non è esaustiva. Utilizzando il microscopio AmScope T390B-3M con una fotocamera e software compatibili, con luce massima al microscopio in una stanza poco illuminata, utilizzando impostazioni automatiche di bilanciamento del bianco, 10 immagini casuali 40x che comprendono 3 pazienti, la soglia variava da 96 a 182, con una media di 137. Questo ampio intervallo riflette le differenze negli istogrammi sottostanti a 8 bit, non l'incoerenza dell'utente. Pertanto, garantire la fedeltà visiva tra l'immagine originale e l'immagine soglia è essenziale, non il numero esatto della soglia. Automatizzare questo processo è fuori dalla portata tipica degli scienziati da banco e richiederebbe la programmazione da parte di un professionista dell'analisi delle immagini.
    10. Usa Analizza le particelle (Analizza → analizza particelle) con una dimensione cellulare 8-150μm2 per identificare e contare i nuclei come surrogato del numero cellulare. Seleziona le maschere sovrapposte nelle impostazioni per visualizzare le celle identificate, confrontando ancora con l'immagine originale. Poiché l'IntL è principalmente una struttura lineare, non volumetrica, normalizzate questi 100 μm di lunghezza IntL (ad esempio, #cells/100 μm). Questo ha rappresentato in media circa 13,19 cellule (intervallo 5,4-21,9, DS 3,9) per 100 μm nel tessuto sinoviale appena recuperato.
      NOTA: L'intervallo 8-150μm 2 è stato determinato sulla base della scala impostata e del confronto visivo iterativo dell'immagine con soglia con l'immagine originale. I limiti determinati empiricamente attraverso il dataset corrispondono a assunzioni di forma basate su macrofagi con un diametro cellulare che può variare da circa 8-20μm 14,15. Sono state escluse dimensioni maggiori poiché spesso rappresentavano più nuclei discreti in prossimità che venivano letti come un'unica cella.
      NOTA: Flussi di lavoro simili possono essere stabiliti, ad esempio, in QuPath.
    11. Apri la maschera SubL con gli eritrociti esclusi (Figura 4G). Eseguire trasformazione a 8 bit, soglia e Analisi delle particelle come menzionato nei passaggi 3.3.9-10. Poiché il SubL è uno strato volumetrico, si normalizza il numero di celle conteggiate a 100μm2 dell'area del SubL (ad esempio, misurazione di aree non mascherate) (Figura 4H).
  4. Per l'analisi della citometria a flusso delle cellule migratorie nel pozzo di fondo, centrifugare a 300 x g a 4 °C per 10 minuti e tenere la pellet cellulare sul ghiaccio. Aspettatevi ~20.000 cellule vive e migratorie per ogni nucleo di biopsia di 3 mm a 24 ore. I metodi di citometria a flusso sono stati pubblicati inprecedenza 8.
  5. Per ELISA, centrifugare il mezzo alla velocità massima (>5000 x g) per 5 minuti a 4 °C per pelletare eventuali cellule o detriti cellulari. Conserva alla temperatura desiderata. I metodi ELISA sono stati pubblicatiin precedenza 8.

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Risultati

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Ottimizzazione delle condizioni di coltura dell'ossigeno

La perfusione fisiologica del tessuto è circa al 6%-8% di ossigeno, mentre le condizioni standard di incubazione per la coltura cellulare sono ai livelli di ossigeno atmosferico (~21%)16. In confronto, l'iperossigenazione può migliorare la vitalità delle colture cellulari o esseretossica 17. L'adeguato utilizzo del JSAS ha reso necessaria la determinazione precoce della vit...

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Discussione

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Questo lavoro ha dimostrato le capacità del JSAS, in particolare il mantenimento del tessuto sinoviale vivente con architettura sinoviale intatta e funzionalmente reattiva. La morte cellulare è stata minima fino a 72 ore di coltura nella maggior parte delle condizioni di incubazione. Per valutare i cambiamenti microscopici della struttura sinoviale, è stato descritto un sistema di misurazione istologica unico, che quantifica le alterazioni strutturali dell'IntL e del SubL. Tali cambiamen...

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Dichiarazioni

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Non ci sono conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo protocollo non sarebbe possibile senza la generosità dei pazienti che hanno donato i loro tessuti e l'abilità dei nostri colleghi di chirurgia ortopedica, disposti ad acquisire tessuto in sicurezza per conto del lavoro. K.I.C. è supportata da NIAMS K08 AR084605, mentre C.P.P. è supportata dal Veterans Affairs Career Development Program [IK2BX004532]. Questo gruppo riconosce l'uso della University of Iowa Central Microscopy Research Facility, una risorsa centrale supportata dal Vicepresidente per la Ricerca dell'Università dell'Iowa e dal Carver College of Medicine. I dati della citometria a flusso sono stati ottenuti presso la Flow Cytometry Facility, che è una struttura di ricerca centrale del Carver College of Medicine / Holden Comprehensive Cancer Center presso l'Università dell'Iowa. La struttura è finanziata tramite le tariffe degli utenti e il generoso sostegno finanziario del Carver College of Medicine, del Holden Comprehensive Cancer Center e dell'Iowa City Veteran's Administration Medical Center. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata da: il National Center for Research Resources dei National Institutes of Health nell'ambito del Premio Numero 1 S10 OD034193-01; e il National Cancer Institute dei National Institutes of Health con il Premio Numero P30CA086862.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10 cm Petri dishesCorningCLS430167
23srRNA RNAscope probeACD/Biotechne468211
24 well platesLife Sciences3524
3 mm biopsy punchesIntegra12460406
50 mL conicalsN/A
70% ethanol (for sterilization)N/A
Borrelia burgdorferiATCC35210 deve essere utilizzato nella fase di crescita esponenziale tardiva per la massima patogenicità
BSK-HSigma-AldrichB8291
CD68 antibodyInvitrogen14-0688-821:1000
CO2 tank (standard conditions)N/A
Dulbecco's Phosphate buffered saline (Ca-/Mg-)Thermofisher14190144
fetal bovine serumBiotechneS11150Heat inactivated Lot: F22100
forceps (non-toothed)N/A
hemostatN/A
Humidified cell incubator (standard conditions)N/A
Hypoxia incubatorN/A
hypoxia tank (5% O2, 5% CO2, remainder N2, physiologic conditions)N/A
IL-4 antibodyThermofisherMA5-424701:100
iNOS antibodyThermofisherPA1-0361:100
Iris scissorsN/A
LipopolysaccharideSigma-AldrichL2630
low glucose DMEM (+Sodium pyruvate, +L-glutamine)Life Technologies11885084
MMP9 antibodyThermofisherMA5-327051:1000
Modular incubator chamber (hyperoxic conditions)Emrbient, IncMIC-101
Monocyte chemoattractant protein 1Peptrotech300-04-20UG
N-acetyl cysteineSigma-AldrichA9165Deve essere preparato fresco per ogni esperimento e tamponato in bicarbonato di sodio equimolare a un pH di 7-7.4
OPG ELISAMilliporeRAB04841:1 dilution
Oxygen tank with liter per minute flow regulatorN/A
PDPN antibodyInvitrogen14-9381-821:100
Propidium IodideThermofisherJ66764.MC
RNAscope multiplex fluorescent V2 assayACD/Biotechne323100
sRANKL ELISAMyBioSourceMBS2626241:1 dilution
Staphylococcus aureus USA 300 MRSAATCCBAA-1717
SYBR GreenThermofisherS756310,000X stock
TNF antibodyThermofisherPA5-198101:100
transwell inserts - 0.4 um sizeMillicellPICM01250
transwell inserts - 5 um sizeCorningCLS3421

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fallon, E. A., et al. Prevalence of diagnosed arthritis - United States, 2019-2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 72 (41), 1101-1107 (2023).
  2. Allen, K. D., Thoma, L. M., Golightly, Y. M. Epidemiology of osteoarthritis. Osteoarthritis Cart. 30 (2), 184-195 (2022).
  3. Alivernini, S., Firestein, G. S., Mcinnes, I. B. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. Immunity. 55 (12), 2255-2270 (2022).
  4. Mathiessen, A., Conaghan, P. G. Synovitis in osteoarthritis: Current understanding with therapeutic implications. Arthritis Res Ther. 19 (1), 18(2017).
  5. Culemann, S., Grüneboom, A., Krönke, G. Origin and function of synovial macrophage subsets during inflammatory joint disease. Adv Immunol. 143, 75-98 (2019).
  6. Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572 (7771), 670-675 (2019).
  7. Alivernini, S., et al. Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis. Nat Med. 26 (8), 1295-1306 (2020).
  8. Cyndari, K. I., Scorza, B. M., Zacharias, Z. R., Pessôa-Pereira, D., Strand, L. Resident synovial macrophages in synovial fluid: Implications for immunoregulation. Clin Immunol. 271, 110422(2024).
  9. Kooner, S. S., Clark, M. The effect of synovectomy in total knee arthroplasty for primary osteoarthritis: A meta-analysis. J Knee Surg. 30 (4), 289-296 (2017).
  10. Lipina, M., et al. Arthroscopic synovectomy of the knee joint for rheumatoid arthritis. Int Orthop. 43 (8), 1859-1863 (2019).
  11. Rosas, L., Mora, A. L., Rojas, M. Osu tristate sennet H&E staining of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue sections. protocols.io. , (2023).
  12. Biologicals, N. Immunofluorescent IHC staining of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue protocol. , https://www.novusbio.com/support-by-application/Fluorescent-IHC-Staining-of-FFPE-Tissue (2025).
  13. Rnascope multiplex fluorescent reagent kit v2 with sample preparation and pretreatment. , Advanced Cell Diagnostics Inc. https://acdbio.com/rnascope-multiplex-fluorescent-v2-assay (2022).
  14. Fakoya, A. O., Naeem, A., Pierre, L. Statpearls. 20235, Treasure Island (FL). Internet (2024).
  15. Crapo, J. D., Barry, B. E., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. Am Rev Respir Dis. 126 (2), 332-337 (1982).
  16. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 15 (6), 1239-1253 (2011).
  17. Pilarek, M., Grabowska, I., Ciemerych, M. A., Dąbkowska, K., Szewczyk, K. W. Morphology and growth of mammalian cells in a liquid/liquid culture system supported with oxygenated perfluorodecalin. Biotechnol Lett. 35 (9), 1387-1394 (2013).
  18. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Curr Issues Mol Biol. 42, 473-518 (2021).
  19. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  20. Arvikar, S. L., Steere, A. C. Lyme arthritis. Infect Dis Clin North Am. 36 (3), 563-577 (2022).
  21. RNAscope multiplex fluorescent reagent kit v2 user manual. , Advanced Cell Diagnostics Inc. Newark, CA. (2022).
  22. Feng, J., Wang, T., Zhang, S., Shi, W., Zhang, Y. An optimized SYBR Green i/pi assay for rapid viability assessment and antibiotic susceptibility testing for Borrelia burgdorferi. PLoS One. 9 (11), e111809(2014).
  23. De Buys, M., Moodley, K., Cakic, J. N., Pietrzak, J. R. T. Staphylococcus aureus colonization and periprosthetic joint infection in patients undergoing elective total joint arthroplasty: A narrative review. EFORT Open Rev. 8 (9), 680-689 (2023).
  24. Ross, J. J. Septic arthritis of native joints. Infect Dis Clin North Am. 31 (2), 203-218 (2017).
  25. Kwon, H. -K., Yu, K. E., Lee, F. Y. Construction and evaluation of a clinically relevant model of septic arthritis. Lab animal. 52, 11-26 (2022).
  26. Carrel, M., Perencevich, E. N., David, M. Z. USA300 methicillin-resistant Staphylococcus aureus, United States, 2000-2013. Emerg Infect Dis. 21 (11), 1973-1980 (2015).
  27. Parlet, C. P., Brown, M. M., Horswill, A. R. Commensal staphylococci influence Staphylococcus aureus skin colonization and disease. Trends Microbiol. 27 (6), 497-507 (2019).
  28. Bünter, J. P., et al. Wild-type AGR-negative livestock-associated MRSA exhibits high adhesive capacity to human and porcine cells. Res Microbiol. 168 (2), 130-138 (2017).
  29. Patel, H., Rawat, S. A genetic regulatory see-saw of biofilm and virulence in MRSA pathogenesis. Front Microbiol. 14, 1204428(2023).
  30. Soong, G., et al. Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus adaptation to human keratinocytes. mBio. 6 (2), e00289-e00315 (2015).
  31. Ni, F., Zhang, Y., Peng, X. Correlation between osteoarthritis and monocyte chemotactic protein-1 expression: A meta-analysis. J Orthop Res. 15, 516(2020).
  32. Tsai, P. H., Liou, L. B. Effective assessment of rheumatoid arthritis disease activity and outcomes using monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) and disease activity score. Int J Mol Sci. 25 (21), 11374(2024).
  33. Boyce, B. F., Xing, L. Biology of rank, rankl, and osteoprotegerin. Arthritis Res Ther. 9 (Suppl 1), S1(2007).
  34. Asano, T., et al. Soluble RANKL is physiologically dispensable but accelerates tumour metastasis to bone. Nat Metab. 1 (9), 868-875 (2019).
  35. Kanzaki, H., et al. Soluble RANKL cleaved from activated lymphocytes by tnf-α-converting enzyme contributes to osteoclastogenesis in periodontitis. J Immunol. 197 (10), 3871-3883 (2016).
  36. Zahan, O. M., Serban, O., Gherman, C., Fodor, D. The evaluation of oxidative stress in osteoarthritis. Med Pharm Rep. 93 (1), 12-22 (2020).
  37. Ozcamdalli, M., et al. Comparison of intra-articular injection of hyaluronic acid and N-acetyl cysteine in the treatment of knee osteoarthritis: A pilot study. Cartilage. 8 (4), 384-390 (2017).
  38. Kim, H. R., Kim, K. W., Kim, B. M., Lee, K. A., Lee, S. H. N-acetyl-l-cysteine controls osteoclastogenesis through regulating Th17 differentiation and RANKL production in rheumatoid arthritis. Korean J Intern Med. 34 (1), 210-219 (2019).
  39. He, T., et al. Efficacy of n-acetylcysteine as an adjuvant therapy for rheumatoid arthritis: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Br J Hosp Med (Lond). 85 (11), 1-16 (2024).
  40. Tsikas, D., Mikuteit, M. N-acetyl-l-cysteine in human rheumatoid arthritis and its effects on nitric oxide (NO) and malondialdehyde (mda): Analytical and clinical considerations. Amino Acids. 54 (9), 1251-1260 (2022).
  41. Yeh, Y. T., Liang, C. C., Chang, C. L., Hsu, C. Y., Li, P. C. Increased risk of knee osteoarthritis in patients using oral N-acetylcysteine: A nationwide cohort study. BMC Musculoskelet Disord. 21 (1), 531(2020).
  42. Kaneko, Y., et al. Oral administration of N-acetyl cysteine prevents osteoarthritis development and progression in a rat model. Sci Rep. 9, 18741(2019).
  43. Coleman, M. C., et al. Sci Transl Med. 10 (427), eaan5372(2018).
  44. Drehmer, D., et al. Nitric oxide favours tumour-promoting inflammation through mitochondria-dependent and -independent actions on macrophages. Redox Biol. 54, 102350(2022).
  45. Fang, F. C., Vázquez-Torres, A. Reactive nitrogen species in host-bacterial interactions. Curr Opin Immunol. 60, 96-102 (2019).
  46. Winyard, P. G., et al. Measurement and meaning of markers of reactive species of oxygen, nitrogen and sulfur in healthy human subjects and patients with inflammatory joint disease. Biochem Soc Trans. 39 (5), 1226-1232 (2011).
  47. Xue, M., et al. Endogenous MMP-9 and not MMP-2 promotes rheumatoid synovial fibroblast survival, inflammation and cartilage degradation. Rheumatology (Oxford). 53 (12), 2270-2279 (2014).
  48. Piacenza, L., Zeida, A., Trujillo, M., Radi, R. The superoxide radical switch in the biology of nitric oxide and peroxynitrite. Physiol Rev. 102 (4), 1881-1906 (2022).
  49. Dikalov, S. I., Mayorov, V. I., Panov, A. V. Physiological levels of nitric oxide diminish mitochondrial superoxide. Potential role of mitochondrial dinitrosyl iron complexes and nitrosothiols. Front Physiol. 8, 907(2017).
  50. Krenn, V., et al. Grading of chronic synovitis: A histopathological grading system for molecular and diagnostic pathology. Pathol Res Pract. 198 (5), 317-325 (2002).
  51. Caplazi, P., et al. Mouse models of rheumatoid arthritis. Vet Pathol. 52 (5), 819-826 (2015).
  52. Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: Classification, update, and measurement of outcomes. J Orthop Surg Res. 11, 19(2016).
  53. Felson, D. T., et al. Essential fatty acids and osteoarthritis. Arthritis Care Res (Hoboken). 76 (6), 796-801 (2024).
  54. Jarraya, M., et al. Prevalence of intra-articular mineralization on knee computed tomography: The multicenter osteoarthritis study. Osteoarthritis Cartilage. 31 (8), 1111-1120 (2023).
  55. Rai, M. F., Cai, L., Zhang, Q., Townsend, R. R., Brophy, R. H. Synovial fluid proteomics from serial aspirations of ACL-injured knees identifies candidate biomarkers. Am J Sports Med. 51 (7), 1733-1742 (2023).
  56. Rivellese, F., et al. Rituximab versus tocilizumab in rheumatoid arthritis: Synovial biopsy-based biomarker analysis of the phase 4 R4RA randomized trial. Nat Med. 28 (6), 1256-1268 (2022).
  57. Paggi, C. A., Teixeira, L. M., Le Gac, S., Karperien, M. Joint-on-chip platforms: Entering a new era of in vitro models for arthritis. Nat Rev Rheumatol. 18 (4), 217-231 (2022).
  58. Li, Z. A., et al. Synovial joint-on-a-chip for modeling arthritis: Progress, pitfalls, and potential. Trends Biotechnol. 41 (4), 511-527 (2023).
  59. Thompson, C. L., et al. Human vascularised synovium-on-a-chip: A mechanically stimulated, microfluidic model to investigate synovial inflammation and monocyte recruitment. Biomed Mater. 18 (6), acf976(2023).
  60. Thangadurai, M., Sethuraman, S., Subramanian, A. A 2d inflammatory co-culture model for investigating synovial fibroblast and macrophage interactions in rheumatoid arthritis. Sci Rep. 15 (1), 30105(2025).
  61. Rosso, F., Rossi, R., Cottino, U., Bonasia, D. E. Tibial tubercle osteotomy for patellofemoral malalignment and chondral disease provided good outcomes: A systematic review. J ISAKOS. 7 (2), 78-86 (2022).
  62. Kleuskens, M. W. A., Van Donkelaar, C. C., Kock, L. M., Janssen, R. P. A., Ito, K. An ex vivo human osteochondral culture model. J Orthop Res. 39 (4), 871-879 (2021).
  63. Schwab, A., et al. Ex vivo culture platform for assessment of cartilage repair treatment strategies. ALTEX. 34 (2), 267-277 (2017).

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