È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Gavage orale nei cuccioli neonatali di topo e valutazione funzionale dell'integrità della barriera intestinale utilizzando camere di uso

1.2K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/69751

⸱

9 gennaio 2026

 ,  ,  , 
1INSERM U1149, Center of Research on Inflammation, Université Paris Cité, 2CHRU Nancy, IHU Infiny

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive: (1) somministrazione orale tramite gavage di molecole di prova ai topi neonatali già a partire dal DOL 6; e (2) valutazione ex vivo della funzione della barriera epiteliale del colon nelle biopsie dai cuccioli DOL 10 allo svezzamento (DOL 20) valutando la permeabilità paracellulare e transcellulare con camere di Ussing.

Abstract

Le crescenti evidenze sottolineano l'importanza dei primi 1.000 giorni di vita nel plasmare l'asse intestino-microbioma. Questa finestra di vita precoce è fondamentale per l'instaurazione di traiettorie fisiologiche a lungo termine e adattamenti immunologici, influenzando potenzialmente la suscettibilità alle malattie legate alla disbiosi e alla disfunzione della barriera. Una comprensione più approfondita dei meccanismi sottostanti richiede una valutazione completa dei parametri fisiologici chiave, inclusa la permeabilità paracellulare e transcellulare dell'intestino neonatale. Valutare questi parametri è essenziale per chiarire come le esposizioni precoci a molecole esogene possano influenzare l'integrità intestinale e gli esiti di salute a lungo termine. Pertanto, la prima parte di questo articolo descrive la somministrazione orale di molecole di interesse nei cuccioli di topo già dal giorno di vita, minimizzando allo scoperto stress, al contempo il rischio di infortuni e il cannibalismo. Aghi da alimentazione lubrificati e con punta arrotondata da 24 G vengono utilizzati per far sparire i cuccioli di topo che pesano almeno 2,5 g. La seconda parte delinea la valutazione ex vivo della permeabilità paracellulare e transcellulare utilizzando saggi in camera di Ussing su campioni di colon di cuccioli tra DOL-10 e lo svezzamento. I cursori senza perni adattati per piccole biopsie vengono utilizzati in combinazione con camere di Ussing per montare campioni di colon neonatale. La sonda paracellulare FITC-Dextrano 4 kDa e il marcatore transcellulare perossidasi rafano 44 kDa Tipo VI vengono aggiunti al compartimento apicale del sistema all'inizio del saggio. I campioni vengono raccolti nel compartimento basolaterale a 0 min, 30 min, 60 min, 90 min e 120 min per quantificare il passaggio della sonda. Il passaggio di entrambi i marcatori viene quantificato direttamente (FITC) e indirettamente (HRP) da un lettore di lastre, calcolato usando curve standard ed espresso come flusso.

Introduzione

L'integrità della barriera intestinale svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento della salute generale coordinando la risposta immunitaria mucosa e regolando la permeabilità selettiva dell'epitelio intestinale. Questo sistema barriera controlla il passaggio dei nutrienti impedendo al contempo la traslocazione di patogeni, antigeni e tossine nella circolazionesistemica 1. La rottura cronica di questa interfaccia, associata a un aumento della permeabilità intestinale, comunemente chiamata "intestino permeabile", è ora identificata non solo come conseguenza ma anche come un fattore che causa gli stati infiammatori cronici e una serie di patologieextra-intestinali 2.

Ad esempio, è stato dimostrato che la compromessa della funzione della barriera intestinale è una componente chiave di disturbi autoimmuni e metabolici come la malattia infiammatoria intestinale (IBD), l'artrite idiopatica giovanile (JIA) e il diabete di tipo 1 (T1D). Questo mette in evidenza lo stato della barriera intestinale come biomarcatore chiave, ma anche come bersaglio terapeutico per prevenire l'inizio dei processi fisiopatologici il prima possibile e per prevenire la progressione dell'infiammazione acuta verso uno statocronico 3,4,5,6.

In questo contesto, il periodo neonatale rappresenta una finestra di sviluppo unica e altamente sensibile durante la quale l'instaurazione e la maturazione dell'interfaccia intestino-microbiota influenzano profondamente la salute intestinale e sistemicaper tutta la vita 7. In questa fase iniziale, l'epitelio intestinale e il sistema immunitario mostrano una sensibilità aumentata sia ai fattori endogeni che a quelli esogeni, subendo una rapida crescita e differenziazione mentre si adattano contemporaneamente alla colonizzazione microbica e ai cambiamenti alimentari. Le interruzioni che compromettono l'integrità della barriera intestinale durante questa finestra di sviluppo critica possono svolgere un ruolo fondamentale nell'insorgenza di un ampio spettro di disturbi acuti e cronici in età avanzata nella vita. Queste condizioni includono malattie immunomediate come allergie alimentari, e malattie croniche più gravi, come IBD, JIA e T1D 7,8,9. Queste malattie sottolineano come i processi fisiopatologici spesso abbiano origine precoce, poiché l'esordio primario avviene generalmente tra l'infanzia e la prima etàadulta 10,11. Pertanto, comprendere i meccanismi che regolano la funzione della barriera intestinale nei neonati è essenziale per sviluppare strategie preventive e terapeutiche volte a ridurre il carico di molte malattie croniche.

In questo contesto, c'è un bisogno urgente di strumenti affidabili e fisiologicamente rilevanti per studiare l'integrità della barriera intestinale, i meccanismi delle malattie croniche e l'infiammazione, in particolare nel contesto neonatale. Tali strumenti devono consentire la replicazione di saggi sperimentali già dimostrati nel contesto adulto senza sacrificare precisione ed efficacia. Inoltre, sta diventando sempre più urgente indagare sia gli effetti a breve che a lungo termine di molti candidati molecolari di interesse, che si prevede possano avere effetti benefici o dannosi sull'omeostasi intestinale nel contesto neonatale. Tra gli strumenti disponibili, l'amministrazione orale di gata nei cuccioli neonati rappresenta un metodo più che affidabile per somministrare molecole di interesse in una fase di sviluppo definita. Consente indagini controllate sugli effetti di vari composti bioattivi, farmaci o metaboliti microbici sulla maturazione intestinale e sulla funzione della barriera.

La prima parte di questo articolo descrive un metodo per la garvage dei cuccioli di topo già dal Giorno della Vita (DOL) 6, permettendo lo studio degli interventi prima, durante e dopo la massiccia espansione del numero di specie del microbiota intestinale indotta dalla diversificazione alimentare. Pertanto, questa tecnica consente analisi longitudinali degli effetti del trattamento sulla salute intestinale durante la crescita e lo sviluppo dei cuccioli.

Nella seconda parte di questo articolo e a complemento di questo approccio, la valutazione ex vivo della funzione della barriera epiteliale del colon utilizzando camere di Ussing fornisce una misura sensibile e quantitativa delle caratteristiche di permeabilità. La valutazione sia della permeabilità paracellulare che transcellulare nelle biopsie del colon da topi neonatali (ad esempio, cuccioli DOL 10) consente di determinare con precisione l'impatto di diversi candidati chiave sull'integrità e la funzione della barriera epiteliale. Il trasporto paracellulare è un meccanismo essenzialmente passivo che avviene attraverso lo spazio intercellulare dello strato epiteliale. Permette il passaggio di piccoli soluti guidati da gradienti elettrochimici e osmotici dal lume al lato basolaterale. Questo meccanismo è regolato principalmente da proteine della famiglia delle giunzioni strette, come Claude e Occludin. Il trasporto transcellulare, al contrario, è un meccanismo attivo, che consente l'assorbimento di soluti più grandi e avviene attraverso le cellule epiteliali tramite canali specifici, portatori e pompe.

L'isotiocianato di fluoresceina (FITC)-dextrano (4 kDa) subisce principalmente un trasporto paracellulare a causa delle sue dimensioni, mentre la perossidasi di rafano (HRP; 44 kDa) viene selettivamente trasportata al lato basolaterale tramite vie transcellulari. La quantificazione di questi marcatori non endogeni consente quindi una valutazione distinta della permeabilità paracellulare e transcellulare, rispettivamente. Il saggio in camera di Ussing con FITC e HRP preserva l'architettura tissutale e consente la misurazione in tempo reale rispettivamente della permeabilità paracellulare e transcellulare di qualsiasi segmento del tratto intestinale. Questa combinazione di analisi della gavage neonatale e della camera di Ussing offre una strategia potente per studiare come molecole specifiche influenzino il funzionamento della barriera intestinale sia in modo immediato che su lunghi periodi di tempo, informando strategie per mitigare l'infiammazione e prevenire le malattie croniche fin dalle prime fasi della vita.

In sintesi, questo protocollo descrive due procedure sperimentali complementari che permettono di: (1) somministrazione di molecole di interesse nel primo periodo neonatale ai cuccioli di topo (passo 1); (2) valutazione sia della permeabilità para che transcellulare nei segmenti del tratto intestinale dai cuccioli neonatali a quelli in fase di svezzamento utilizzando camere di Ussing (passaggi 2-6).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con le normative nazionali applicabili e approvate dal Ministero francese dell'Istruzione Superiore, della Ricerca e dell'Innovazione tramite la piattaforma APAFIS (Numero di autorizzazione: APAFIS#23855) e sovvenzioni dell'Agence Nationale pour la Recherche (ANR): 11-IDEX-0005-02, ANR-24-CE15-7152 e 18-IDEX-0001. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Gavage dei cuccioli di topo neonati

NOTA: Il seguente metodo è adattato da Francis et al.12. Sebbene il protocollo originale consenta il gavage dei cuccioli di topo già dal DOL 2, qui il gavage non veniva eseguito prima del DOL 6, poiché le esigenze tecniche a età più precoci rendono la procedura molto più impegnativa. Inoltre, l'utilizzo di cuccioli più giovani complica gli studi perché aumenta il rischio di perdita di animali nei primi giorni di trattamento, richiedendo così coorti più ampie.

  1. Preparazione e configurazione delle soluzioni Gavage
    1. Pesa ogni cucciolo singolarmente.
    2. Regolare la concentrazione e il volume della soluzione gavage in modo che il volume totale somministrato non superi 20 μL per grammo di peso corporeo.
      NOTA: In condizioni standard, i cuccioli di topo raramente pesano meno di 2,5 g al DOL 6.
    3. Lava un ago da 24 G a punta rotonda risciacquandolo accuratamente con acqua deionizzata, seguito da etanolo al 70% con una siringa, poi autoclava.
      NOTA: Si raccomanda di utilizzare un ago di alimentazione separato per ogni gruppo di trattamento per prevenire la contaminazione incrociata.
    4. Metti carta assorbente pulita su una borsa riscaldante disinfettata impostata a ~38 °C.
    5. Lava i guanti con etanolo al 70% prima di aprire le gabbie per limitare il trasferimento di odori ai cuccioli e ridurre il rischio di cannibalizzazione.
    6. Trasferire la madre in una gabbia separata in un'altra stanza per limitare lo stress causato dalle possibili vocalizzazioni dei cuccioli.
    7. Strofinare i guanti puliti con materiali per il nido per limitare il rischio di trasmissione di odori esterni ai cuccioli durante il vavaglio.
    8. Misurare la lunghezza tra il processo xifoide (estremità inferiore dello sterno) e il muso di un cucciolo per segnare la lunghezza massima di inserimento sull'ago di alimentazione (Figura 1A,B).
  2. Gavage intra-esofageo dei cuccioli di topo
    1. Attacca la punta dell'ago a una siringa in modo sterile e preleva più di quanto desiderato di soluzione per il gavage per somministrare l'intero volume richiesto senza alcun rischio di somministrare bolle d'aria, poiché aumentano notevolmente il rischio di aspirazione.
    2. Usando il pollice e l'indice della mano non dominante, pizzica delicatamente la pelle tra le scapole per sollevare il cucciolo.
      NOTA: Non togliere troppa pelle dalla schiena del cucciolo, poiché potrebbe causare soffocamento.
    3. Tieni il cucciolo in posizione quasi orizzontale e inserisci delicatamente l'ago di alimentazione nella cavità orale, avanzandolo perpendicolarmente alla faringe fino a raggiungere la parte posteriore della gola (Figura 1C).
    4. Mantenendo lo stesso angolo e profondità, fai scorrere l'ago verso la parte destra o sinistra della cavità orale per evitare la lingua.
    5. Regolare lentamente l'angolo dell'ago inclinando delicatamente la testa del cucciolo all'indietro, finché siringa, testa e schiena non sono allineate, con la testa leggermente inclinata verso la schiena (Figura 1D).
    6. Senza applicare alcuna pressione, si lascia scendere lentamente la siringa sotto il proprio peso finché il segno massimo di inserimento non è vicino o raggiunge il livello del muso (Figura 1E).
      NOTA: Se si riscontra resistenza, ruota delicatamente la siringa facendola rotolare avanti e indietro tra le dita per facilitare la discesa. Se la siringa non avanza ancora, prova a regolare l'angolo di inserimento o riavvia la procedura usando un ago di alimentazione lubrificato con la soluzione di gavage. L'ago non dovrebbe rimanere inserito per più di 20 secondi per evitare l'asfissia.
    7. Una volta raggiunto o chiuso il segno massimo di inserimento, si somministra rapidamente il volume desiderato. Se si incontra resistenza durante la distribuzione del volume, controlla l'allineamento siringa-testa-indietro e regola leggermente la profondità di inserimento.
      NOTA: Si raccomanda una rapida erogazione del volume, poiché l'inserimento prolungato dell'ago aumenta significativamente il rischio di soffocamento, difficoltà e potenziali lesioni all'animale.
    8. Una volta somministrato il volume corretto, ritira delicatamente l'ago lungo lo stesso angolo usato per l'inserimento.
    9. Metti il cucciolo sul tovagliolo di carta precedentemente posizionato sulla borsa dell'acqua calda e monitora il recupero. Un ritmo respiratorio normale dovrebbe tornare in meno di 20 secondi.
      NOTA: L'apparizione di bolle dal muso o dalla bocca dell'animale indica aspirazione e richiede un'eutanasia immediata nei cuccioli più giovani del DOL 14. La presenza di una quantità molto piccola di sangue nella bocca dell'animale, causata da una lesione tra orofaringe ed esofago, richiede un monitoraggio dell'animale, ma non un'eutanasia sistematica. Se il recupero del cucciolo è incerto, mettilo su un fianco. Se non tenta di rimettersi in piedi, sopprimi immediatamente.
    10. Una volta confermata la guarigione dell'animale, rimetti il cucciolo nel nido e riorganizzalo con la madre.
      NOTA: Fino al DOL 10, i cuccioli hanno poca mobilità e possono rimanere sul cuscino riscaldante fino a quando il passaggio di ogni cucciolo nella gabbia non è completato. I cuccioli più grandi non devono essere lasciati incustoditi sul tappetino, poiché potrebbero tentare di fuggire.

Figura 1
Figura 1: Gavage del cucciolo neonato di topo al DOL 10. La distanza tra il muso e il processo xifoide viene misurata (A), permettendo di segnare la lunghezza massima di inserimento sull'ago di alimentazione (B). L'ago per l'alimentazione viene inserito nella parte sinistra o destra della cavità orale (C). Una volta raggiunta la parte posteriore della gola, l'angolo dell'ago viene regolato fino a quando la siringa, la testa e la schiena dell'animale non sono allineate (D). L'ago viene lasciato scivolare delicatamente verso il basso senza resistenza fino a quando il segno massimo di inserimento è quasi raggiunto o raggiungibile (E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Eutanasia neonatale di topo e prelievo del colon

  1. Effettuare l'eutanasia utilizzando il metodo appropriato previsto dalla legislazione nazionale.
    NOTA: Si raccomanda la decapitazione dei cuccioli fino al DOL 10 e la lussazione cervicale dei cuccioli di età superiore al DOL 10. L'eutanasia con CO2 o anestetici non è consigliata, poiché i cuccioli mostrano una grande tolleranza a questi metodi.
  2. Metti l'animale soppresso sotto un microscopio binoculare.
  3. Applica il 70% di etanolo sull'addome dell'animale.
  4. Con la pinza, pizzica la pelle addominale e il peritoneo sottostante e realizza una grande incisione trasversale addominale con forbici fini (perpendicolari all'asse rostralo-caudale) senza tagliare l'intestino.
  5. Inserisci delicatamente le forbici fini nell'incisione ed estendi il taglio lateralmente attraverso il peritoneo su entrambi i lati.
  6. Utilizzando pinze e forbici sottili, si aprono sia le parti superiori che inferiori del peritoneo, dalla regione toracica fino all'area pelvica inferiore (Figura 2A).
  7. Identifica la parte distale del colon e fai un'incisione parallela al suo asse, verso il retto.
  8. Fai un'incisione nella porzione terminale/rectale del colon per mobilitarlo.
  9. Tira delicatamente il colon e procedi verso il ceco, rimuovendo eventuali pezzi di tessuto connettivo o adiposo.
  10. Liberare il colon dall'addome tagliando alla giunzione ileocecale, sopra il ceco (Figura 2B).
  11. Scartare il ceco e i primi pochi millimetri del colon prossimale, poi raccogliere uno o due campioni dal colon prossimale che siano più grandi della dimensione dell'apertura dello slider di Ussing (Figura 2C).
    NOTA: Si consiglia di effettuare due biopsie sovradimensionate, poiché il colon neonatale è estremamente fragile e può essere facilmente strappato, lacerato o perforato durante la pulizia e il montaggio.
  12. Con le forbici chiuse, rimuovere delicatamente il contenuto fecale dalla biopsia appiattita applicando una leggera pressione e scivolando dall'estremità prossimale a quella distale.
  13. Metti il pezzo del colon svuotato in un buffer KRB gelido.

Figura 2
Figura 2: Dissezione del colon del cucciolo DOL 10. L'epidermide e il peritoneo del cucciolo vengono tagliati e aperti in due passaggi per evitare un'incisione involontaria del colon, fino a quando la totalità della cavità addominale non viene esposta (A). Il colon viene liberato dall'addome tramite un primo taglio della sezione distal/rettale, seguito da un secondo taglio sopra il ceco (B). I primi millimetri del colon prossimale vengono scartati e vengono raccolti uno o due campioni di colon più grandi della dimensione dell'apertura degli slider di Ussing (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Saggio di permeabilità del colono utilizzando biopsie di topo in camere di Ussing

  1. Preparazione del saggio
    1. Il giorno prima dell'esperimento di Ussing. Per garantire condizioni ottimali per il saggio, si raccomanda la preparazione di diverse soluzioni il giorno precedente all'esperimento. Queste soluzioni sono preparate come indicato nella Tabella 1.
      NOTA: le seguenti tabelle indicano gli importi richiesti per 12 camere Ussing, con il KRB 10 volte in grande eccesso per consentire l'allicitazione.
      NOTA: La soluzione KRB 10x può essere conservata a 4 °C per un massimo di 6-12 mesi.
    2. Il giorno dell'esperimento, 30 minuti prima dell'eutanasia degli animali:
      1. Preparare 400 mL di buffer KRB, come indicato nella Tabella 2.
        NOTA: Il KRB 10x, l'acqua deionizzata e il bicarbonato devono essere premiscelati e fatti bollire usando gas carbogeno (95%O 2; 5% CO2) per 15 minuti prima di aggiungere CaCl2 per evitare precipitazioni.
      2. Utilizzando un sistema a carbogeni (95%O 2; 5% CO2), far bollire il nuovo buffer KRB per 15 minuti.
      3. Dividere i 400 mL del buffer KRB in due e preparare 200 mL di Krebs-Glucosio, 200 mL di Krebs-Mannitol e la soluzione HRP come descritto nella Tabella 3.
    3. Configurazione del sistema di ussing
      1. Preriscalda il sistema di utilizzo a 37 °C.
      2. Pre-assemblare le camere come segue:
        1. Alza le chiusure di ogni scanalatura.
        2. Posiziona le camere nelle loro scanalature senza stringere il sistema.
        3. Inserire i due tubi di alimentazione del gas in ciascuna parte delle camere.
        4. Introdurre i quattro elettrodi nelle aperture anteriori (se disponibili - non trattate qui) oppure sigillare le quattro aperture usando coni da 200 μL riempiti con colla prima dell'esperimento.
        5. Metti i vassoi sotto le camere in previsione di eventuali perdite.
      3. Montaggio di tessuto
        1. Asciuga leggermente il campione di colon precedentemente pulito con un tovagliolo di carta per rimuovere l'eccesso di umidità.
        2. Metti il pezzo di colon sotto una lente d'ingrandimento e inserisci molto delicatamente una delle lame di forbici fini nella parte luminale per aprirla (Figura 3A).
          NOTA: Il taglio può essere eseguito in un solo movimento una volta che le forbici sono completamente inserite. La sezione del colon utilizzata deve essere il più dritta possibile evitando la torsione.
        3. Utilizzando pinze fine, montare il tessuto sulla parte bianca dello slider mantenendo la parte luminale verso l'alto, verso l'operatore. Il tessuto deve essere privo di tracce di grasso, feci, rughe, perforazioni e lacerazioni, e deve coprire ampiamente l'apertura (Figura 3B).
        4. Chiudi il cursore sotto il microscopio binoculare e controlla eventuali spostamenti del tessuto. Una lieve deformazione del tessuto deve essere visibile quando viene applicata pressione sullo slider, il che indica che il slider è ben chiuso.
          NOTA: Installare i cursori nella camera di Ussing (Figura 4) e iniziare il passaggio di equilibrio individualmente non appena è pronto, per prevenire la disidratazione del campione.
        5. Mantenendo una leggera pressione sul cursore per tenerlo chiuso, inserisci il cursore nella camera di Ussing, assicurandoti che il lumen (la parte trasparente dello slider) sia rivolto a sinistra.
        6. Chiudi entrambe le chiusure e stringi la vite situata a destra finché la camera non sarà ermetica e il cursore non potrà muoversi.
      4. Configurazione finale e bilanciamento
        1. Aggiungere 4 mL di Krebs-Mannitolo al compartimento sinistro (apicale) della camera.
        2. Aggiungere 4 mL di Krebs-Glucosio nel compartimento destro (basolaterale) della camera.
        3. Posiziona un piccolo pezzo di parafilm tra entrambi i compartimenti per evitare contaminazioni incrociate.
        4. Apri l'ingresso di gas (95%O 2 / 5% CO2) e imposta l'uscita tra 1-2 bolle/s.
        5. Elimina eventuali bolle grandi situate sul tessuto o nel sistema utilizzando una pipetta Pasteur.
        6. Lascia che il sistema si bilanci per un massimo di 20-30 minuti.
        7. Prepara la soluzione FITC 4kDa + HRP + Mannitolo come descritto nella Tabella 4.
  2. Inizio del saggio sulla permeabilità del colon
    1. Una volta raggiunto l'equilibrio del sistema, si sostituiscono 200 μL di Krebs-Mannitolo dal compartimento apicale (a sinistra) con 200 μL di soluzione FITC 4Kd + HRP + Mannitolo e si avvia immediatamente un timer. Lava la punta facendo delicati saliti e discesi nel compartimento e scarta la punta tra una camera e l'altra.
    2. Per ogni camera, raccogliere 2 duplicati da 100 μL dal compartimento basale (destro) e depositare i volumi in una piastra nera a 96 pozzi. Copri la piastra con carta stagnola per evitare la fotodegradazione del FITC presente nella piastra della piastra.
    3. Sostituire immediatamente i 200 μL precedentemente raccolti con 200 μL di Krebs-Glucosio fresco.
    4. Ripeti i passaggi (2) e (3) ogni 30 minuti fino a raggiungere il punto temporale delle 2 ore, per ottenere i punti temporali: T0, T30, T60, T90 e T120.
    5. Sigilla la piastra con carta stagnola per evitare la fotodegradazione del FITC e procedi alla quantificazione del FITC.
MgCl2 1M
MW (g/mol)Volume finale = 20 mLConcentrazione finale
milli-Q H2OPorta al volume finale
MgCl2, 6H2O203.34,066 g1 M
KRB 10X
MW (g/mol)Volume finale = 1LConcentrazione finale
milli-QH 20Porta al volume finale
NaCl58.4470 g1.198 M
KCl74.553,4 g45,6 mM
Na2HPO 4,2H 2O177.991 g5,62 mM
NaH 2PO4,2H 2O156.012,3 g14,7 mM
MgCl2 1M5 mL5 mM
Bicarbonato 750 mM
MW (g/mol)Volume finale = 250 mLConcentrazione finale
milli-Q H2OPorta al volume finale
NaHCO38415,75 g750 mM
CaCl2 2M
MW (g/mol)Volume finale = 50 mLConcentrazione finale
milli-Q H2OPorta al volume finale
CaCl211111,098 g2 M

Tabella 1: Preparazione della soluzione il giorno prima dell'esperimento di Ussing.

Buffer KRB (400 mL)
VolumeConcentrazione finale
KRB 10X40 mL1X
H2O (milli-Q)352 mL
Bicarbonato 750 mM8 mL15 mM
CaCl2 2M240 μL1,2 mM

Tabella 2: Preparazione del buffer KRB il giorno dell'esperimento Ussing.

Krebs-Glucosio/Mannitolo (200 mL ciascuno)
Volume finale = 200 mLConcentrazione finale
KRB BufferPorta al volume finale
Glucosio360 mg10 mM
oppure
Mannitolo364 mg10 mM
Soluzione HRP
Volume finale = 1480 μLConcentrazione finale
Krebs-MannitolPorta al volume finale
HRP13 mg8,8 mg/mL

Tabella 3: Preparazione di soluzioni di Krebs-glucosio/mannitolo e HRP il giorno dell'esperimento di Ussing.

Soluzione FITC 4kDa + HRP + Mannitolo
Per 12 camereVolumeConcentrazione finale
HRP (8,8mg/ml)1345 μL
Krebs-Mannitol1155 μL
FITC 4Kd166,6 mg16,66 mM

Tabella 4: Preparazione della soluzione FITC 4 kDa + HRP + mannitolo il giorno dell'esperimento di Ussing.

Figura 3
Figura 3: Montaggio di un campione di colon da un pup DOL 9. Una lama di un paio fine di forbici viene inserita nel segmento luminale del campione per tagliarlo in un unico movimento (A). Il campione aperto è montato sull'apertura cursore di Ussing con il lato luminale rivolto verso l'operatore (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Immagine di camere Ussing completamente preparate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Valutazione della permeabilità paracellulare del colono tramite quantificazione FITC

  1. Preparazione degli standard FITC
    1. Diluire la soluzione FITC 4Kd + HRP + Mannitolo nel Krebs-Glucosio per preparare le diluizioni standard descritte nella Tabella 5 e nella Figura 5.
    2. Depositare 2 x 100 μL (duplicati) di ogni diluizione standard da n°1 a n°7 nella placca. Sigilla la piastra con carta stagnola per proteggerla dalla luce fino all'inizio della lettura della placca.
  2. Acquisizione dati: Utilizzando un lettore di piastre, imposta la lunghezza d'onda di eccitazione a 485 nm e l'emissione a 535 nm, e leggi la lastra il prima possibile.
    NOTA: Si consiglia di leggere la piastra sia al guadagno ottimale che a un guadagno impostato manualmente per facilitare il confronto tra i valori tra placche e permettere l'interpolazione dei dati in caso di errore durante le diluizioni standard.
  3. Stoccaggio delle lastre: una volta memorizzati i dati di quantificazione FITC, conservare le lastre sigillate con carta stagnola di alluminio a 4 °C durante la notte se la quantificazione HRP deve essere effettuata nei giorni successivi, oppure congelate a -80 °C per una conservazione più lunga.

Figura 5
Figura 5: Rappresentazione visiva della preparazione standard delle diluizioni FITC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Diluizioni standard FTIC
N°1234567
Diluizione1:10000 di soluzione stock FITC1:2 di diluizione n°11:2 di diluizione n°21:10 di diluizione n°11:2 della diluizione n°41:2 della diluizione n°5
Krebs-Glucosio
FITC (μM)1.660.830.4150.1660.0830.04150

Tabella 5: Preparazione delle diluizioni standard FITC il giorno dell'esperimento Ussing.

5. Valutazione della permeabilità transcellulare del colono tramite quantificazione HRP

  1. Il giorno precedente al giorno del test di quantificazione HRP:
    1. Garantire condizioni ottimali il giorno del saggio; La preparazione di diverse soluzioni è necessaria il giorno precedente all'esperimento. Queste soluzioni sono preparate come descritto nella Tabella 6.
      NOTA: Le seguenti tabelle indicano le quantità richieste per una piastra a 96 pozzi. Gli standard HRP possono essere allicitati e conservati a -20 °C o -80 °C per un massimo di diversi mesi. A causa dell'instabilità, usa solo tamponi a carbonato/bicarbonato fresco.
    2. Dopo la preparazione della soluzione anticorpale anti-HRP, rivestire immediatamente una micropiastra Clear Flat Bottom High Binding a 96 pozzi con 100 μL per pozzo. Avvolgilo nella carta stagnola e incuba tutta la notte a 4 °C.
  2. Il giorno del test di quantificazione HRP:
    1. Preparare il buffer di blocco BSA al 5% come descritto nella Tabella 7.
    2. Scartare il contenuto del piatto e lavare con 280 μL di PBS Tween 4 volte, con 1 minuto di agitazione a 350 giri/min tra un lavaggio e l'altro.
    3. Aggiungi 200 μL di buffer di blocco BSA a ciascun pozzo.
    4. Sigilla la piastra con carta stagnola e incuba su uno shaker a 500 giri/min per almeno 1 ora. Nel frattempo, scongelare e diluire i campioni (1:10 o 1:50) e preparare le diluizioni standard come descritto nella Tabella 8.
    5. Scartare il contenuto del piatto e lavare con 280 μL di PBS Tween 4 volte, con 1 minuto di agitazione a 350 giri/min tra un lavaggio e l'altro.
    6. Aggiungere 50 μL di campioni standard o diluiti, sigillare la piastra e incubare a 300 giri/min per 1 ora a RT.
    7. Durante l'incubazione, portare i reagenti QuantaBlu in RT e preparare la soluzione operativa come descritto nella Tabella 9.
    8. Scartare il contenuto del piatto e lavare con 280 μL di PBS Tween 4 volte, con 1 minuto di agitazione a 350 giri/min tra un lavaggio e l'altro.
    9. Aggiungi 100 μL di QuantaBlu Working Solution in ciascun pozzo a RT o 37 °C (1,5-90 min, 30 min in media).
      NOTA: Il progresso del saggio può essere seguito dalla comparsa di una forte fluorescenza blu sotto una sorgente di luce UV.
    10. Aggiungere 100 μL di QuantaBlu Stop Solution in ogni pozzo per fermare l'attività della perossidasi. Sigilla la piastra e incuba per 10 minuti a RT sotto agitazione a 350 giri/min.
    11. Utilizzando un lettore di placche, imposta la lunghezza d'onda di eccitazione a 315 nm e l'emissione a 470 nm. Leggi la targa il prima possibile.
      NOTA: Si consiglia di leggere la piastra sia al guadagno ottimale che a un guadagno impostato manualmente per facilitare il confronto tra i valori tra placche e permettere l'interpolazione dei dati in caso di errore durante le diluizioni standard. In alternativa al kit QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate, si possono utilizzare altri substrati perossidasi come la Tetrametilbenzidina (misurati a 450 o 650 nm con o senza l'uso di soluzione stop, rispettivamente), ma l'uso di questa alternativa comporta una sensibilità inferiore.
Soluzione BSA
MW (g/mol)Volume finale = 12,7 mLConcentrazione finale
Milli-QH 2OPorta al volume finale
BSA664301,27 g100 mg/mL
Krebs-Glucosio + BSA
MW (g/mol)Volume finale = 30 mLConcentrazione finale
Krebs-GlucosioPorta al volume finale
Soluzione BSA60 μL0,2 mg/mL
PBS Tween
MW (g/mol)Volume finale = 500 mLConcentrazione finale
PBS 1XPorta al volume finale
Preadolescente-20500 μL0.1%
Carbonato di sodio sol.
MW (g/mol)Volume finale = 3,22 mLConcentrazione finale
Milli-QH 2OPorta al volume finale
Na2CO3105.9934,13 mg0,1 M
Sol di bicarbonato di sodio.
MW (g/mol)Volume finale = 12,7 mLConcentrazione finale
Milli-QH 2OPorta al volume finale
NaHCO384106,68 mg0,1 M
Buffer di rivestimento pH 9,6
Volume finale ≈ 11 mL
Carbonato di sodio sol.2,58 mL
Sol di bicarbonato di sodio.Aggiungi fino a pH = 9,6 (~8,4 mL)
Standard HRP a 10 μM
Concentrazione inizialeVolume finale = 5 mLConcentrazione finale
Krebs-GlucosioPorta al volume finale
Soluzione HRP8,8 mg/mL50 μL0,088 mg/mL
Soluzione BSA100 mg/mL10 μL0,2 mg/mL
Standard HRP 1,5 nM
Concentrazione inizialeVolume finale = 15 mLConcentrazione finale
Krebs-GlucosioPorta al volume finale
Standard HRP a 2,0 μM0,088 mg/mL2,25 μL13,2 ng/mL
Soluzione BSA0,2 mg/mL3 μL40 ng/mL
Soluzione anticorpale anti-HRP
Concentrazione inizialeVolume finale = 10 mLConcentrazione finale
Buffer di rivestimentoPorta al volume finale
Anticorpo anti-HRP5,6 mg/mL8,93 μL5 μg/mL

Tabella 6: Preparazione della soluzione il giorno precedente all'esperimento HRP.

Buffer di blocco BSA
Concentrazione inizialeVolume finale = 25 mLConcentrazione finale
PBS 1X12,5 mL
Soluzione BSA100 mg/mL12,5 mL50 mg/mL

Tabella 7: BSA bloccando la preparazione del buffer il giorno dell'esperimento HRP.

StandardKrebs-Glucosio + BSAStandard HRP 1,5 nMFmol HRP/50 μL
Blank1000 μL0 μL0
1993,75 μL6,25 μL0.09375
2987,5 μL12,5 μL0.1875
3975 μL25 μL0.375
4950 μL50 μL0.75
5900 μL100 μL1.5
6850 μL150 μL2.25
7800 μL200 μL3
8700 μL300 μL4.5
9600 μL400 μL6
10400 μL600 μL9
11200 μL800 μL12

Tabella 8: Preparazione standard HRP il giorno dell'esperimento HRP.

Soluzione funzionante QuantaBlu
Volume finale = 12 mL
Soluzione substratale QuantaBlu10,8 mL
Soluzione stabile di perossido QuantaBlu1,2 mL

Tabella 9: Preparazione della soluzione operativa QuantaBlu il giorno dell'esperimento HRP.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Quantificazione standard della curva e della concentrazione del pozzo
Il valore medio dei blank veniva sottratto da ogni pozzo della placca. Con valori di assorbanza sull'asse Y e concentrazioni sull'asse X, è stata creata una curva standard utilizzando la funzione "Interpolate a standard curve" da GraphPad Prism. Se tutti i punti standard sono allineati, il modello "Line" fornisce i migliori risultati. In alternativa, il modello "Sigmoidale, 4 PL, X è la concentrazione" offre grande flessibilità e pr...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Il gavage orale consente la somministrazione ripetuta di una dose luminale precisa e definita a singoli topi neonatali. Al contrario, l'alimentazione volontaria, sebbene un'alternativa valida, richiede un tempo di somministrazione prolungato per ogni animale per somministrare una quantità di composto inferiore con precisione di dosaggioridotta 12. Inoltre, il gavage orale consente di gestire volumi maggiori rispetto a quelli possibili tramite via iniettab...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato svolto con il sostegno finanziario di ANR-11-IDEX-0005-02 Laboratoire d'excellence INFLAMEX, un premio della Fondation de l'avenir (2025, AP-RM-24-012) e delle sovvenzioni ANR Diab1GUT (ANR-24-CE15-7152). Lo studio è stato condotto nel contesto del consorzio INFIBREX e ha beneficiato del sostegno del piano di investimento "France 2030", lanciato dal governo francese e attuato dall'Université Paris Cité nell'ambito del programma "Iniziativa di Eccellenza" IdEx (ANR-18-IDEX-0001). Ringraziamo con gratitudine la Piattaforma Tecnica della Camera Ussing presso l'Inflammation Research Center per il loro prezioso supporto e rivolgiamo un ringraziamento speciale ad Alexandra Willemtz e Maude Le Gall per il loro aiuto esperto. Desideriamo inoltre esprimere la nostra sincera gratitudine alla Piattaforma delle Strutture Animali del Centro di Ricerca sull'Infiammazione per il loro supporto essenziale, con un ringraziamento speciale a Isabelle Renault e Guillaume Anselmet.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10x DPBS senza Ca & Ca MgDulbeccos14200091
Anticorpo anti-HRPNordic BiositeGTX10183Perossidasi Monoclonale di Rafano Picante IgG [2H11]
Luva binoculareOlympus SZ61Nessuna specifica richiesta.
Piastra nera a 96 pozzoli a fondo piattoThermoFisher Scientific137101Le placche devono essere nere e adattate alle letture di fluoresenza. Il coperchio deve essere tolto durante la lettura.
BSAMerckA4503
Topi C57BL/6JFiume Charles632C57BL/6J 
CaCl2Merck2382
Rilegatura trasparente a fondo piatto alto a 96 pozziCorning9018
D-(+)-GlucosioMerckG8270 
H< 2/sub>O distillato
D-MannitolMerckM4125
Pinze FineFST11445-12
Forbici FineFST14058-09
FITC-Dextran 4KdFD4TdB LabsSensibile alla fotodegradazione.
Cuscina riscaldanteMinerve20 031 01
HRPMerckP8375
MgCl2, 6H2OMerckM2670 
Milli-Q H2O
Sistema di utilizzo P2300 EasyMount & CamereStrumenti fisiologiciEM6-C-CESistemi, camere e cursori devono essere tutti compatibili.
P2306 Ussing Chamber SliderStrumenti fisiologiciPI-P2306Sono disponibili diversi modelli di slider per dimensioni e tipi di tessuti differenti.
Kit per substrati di perossidasi fluorogenica QuantaBluThermoFisher Scientific15169
Aghi da alimentazione riutilizzabili punta rotondaFST18061-24Calibro 24, punta di diametro 1,25mm, punta rotonda. Deve essere lavato con acqua sterile, etanolo al 70% e autoclavato prima dell'uso.
Bicarbonato di sodioMerckS6297
Carbonato di sodioMerckS7795
SpettrofotometroTECAN Spark 10MSe si utilizzano le 137101 piastre nere, è necessario un lettore di piastre con l'acquisizione superiore.
Preadolescente-20MerckP7949

Riferimenti

  1. Di Vincenzo, F., Del Gaudio, A., Petito, V., Lopetuso, L. R., Scaldaferri, F. Gut microbiota, intestinal permeability, and systemic inflammation: A narrative review. Intern Emerg Med. 19 (2), 275-293 (2024).
  2. Mu, Q., Kirby, J., Reilly, C. M., Luo, X. M. Leaky gut as a danger signal for autoimmune diseases. Front Immunol. 8, 598(2017).
  3. Sorini, C., et al. Loss of gut barrier integrity triggers activation of islet-reactive T cells and autoimmune diabetes. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (30), 15140-15149 (2019).
  4. An, J., et al. The role of intestinal mucosal barrier in autoimmune disease: a potential target. Front Immunol. 13, 871713(2022).
  5. Picco, P., et al. Increased gut permeability in juvenile chronic arthritides: a multivariate analysis of the diagnostic parameters. Clin Exp Rheumatol. 18 (6), 773-778 (2000).
  6. Dunleavy, K. A., Raffals, L. E., Camilleri, M. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel disease: underpinning pathogenesis and therapeutics. Dig Dis Sci. 68 (12), 4306-4320 (2023).
  7. Borrego-Ruiz, A., Borrego, J. J. Early-life gut microbiome development and its potential long-term impact on health outcomes. Microbiome Res Rep. 4 (2), 20(2025).
  8. Di Costanzo, M., De Paulis, N., Biasucci, G. Butyrate: A link between early life nutrition and gut microbiome in the development of food allergy. Life (Basel). 11 (5), 384(2021).
  9. Kindgren, E., Ahrens, A. P., Triplett, E. W., Ludvigsson, J. Infant gut microbiota and environment associate with juvenile idiopathic arthritis many years prior to disease onset, especially in genetically vulnerable children. eBioMedicine. 93, 104654(2023).
  10. Borowitz, S. M. The epidemiology of inflammatory bowel disease: clues to pathogenesis. Front Pediatr. 10, 1103713(2023).
  11. Leete, P., et al. The effect of age on the progression and severity of type 1 diabetes: potential effects on disease mechanisms. Curr Diab Rep. 18 (11), 115(2018).
  12. Francis, F., et al. Probiotic studies in neonatal mice using gavage. J Vis Exp. (143), e59074(2019).
  13. McClain, R. M., et al. Neonatal mouse model: review of methods and results. Toxicol Pathol. 29 (Suppl), 128-137 (2001).
  14. Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterol. 19, 98(2019).
  15. Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
  16. Westerhout, J., Wortelboer, H., Verhoeckx, K. Ussing chamber. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , (2015).
  17. Hempstock, W., Ishizuka, N., Hayashi, H. Functional assessment of intestinal tight junction barrier and ion permeability in native tissue by Ussing chamber technique. J Vis Exp. (171), e62468(2021).
  18. Sjögren, E., Eriksson, J., Vedin, C., Breitholtz, K., Hilgendorf, C. Excised segments of rat small intestine in Ussing chamber studies: A comparison of native and stripped tissue viability and permeability to drugs. Int J Pharm. 505 (1), 361-368 (2016).
  19. Moussaoui, N., et al. Changes in intestinal glucocorticoid sensitivity in early life shape the risk of epithelial barrier defect in maternal-deprived rats. PLoS One. 9 (2), e88382(2014).
  20. Gleeson, J. P., et al. The enhanced intestinal permeability of infant mice enables oral protein and macromolecular absorption without delivery technology. Int J Pharm. 593, 120120(2021).
  21. Birchenough, G. M. H., et al. Postnatal development of the small intestinal mucosa drives age-dependent, regio-selective susceptibility to Escherichia coli K1 infection. Sci Rep. 7 (1), 83(2017).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Permeabilità colicasaggio FITC-destranoperossidasi di rafanopermeabilità paracellularepermeabilità transcellulareterapie a microRNA
Gavage orale nei cuccioli neonatali di topo e valutazione funzionale dell'integrità della barriera intestinale utilizzando camere di uso
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.